CN101402946A - 提取大蒜超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents

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刘建国
王晶冰
汪利平
杨娟
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Abstract

本发明提供了一种提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过粉碎、热击、离心和超滤四个简单步骤，即可从大蒜中提取高纯度的超氧化物歧化酶，在提取过程中，未使用有机溶剂，有效避免了有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了溶剂残留造成的产品安全隐患，可生产无任何化学添加的高纯度超氧化物歧化酶，环境污染小，分离效率高、产品纯度可调控、便于工业推广。

Description

提取大蒜超氧化物歧化酶的方法
技术领域
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从大蒜中分离提取超氧化物歧化酶的方法，单步操作即可获得纯度达95％的超氧化物歧化酶，进一步超滤纯化可获得纯度高达99％且收率达96％的超氧化物歧化酶。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当生物体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，具有广泛的医用价值。
自1938年Mannn和Keilin从牛血红细胞中分离发现该蛋白以来，长期使用有机溶剂沉淀、离子交换、疏水色谱、凝胶过滤和金属螯合亲和层析法等技术从动物血液中提取SOD。这些方法步骤复杂，SOD损失率高，易失活。1997年1月，受疯牛病的影响，欧盟规定不准使用牛血SOD作为食品添加剂。另外，由于动物血液和内脏器官来源有限，且成分复杂，易受污染，在储存运输等方面存在诸多不便。因此人们转而寻求从植物中提取SOD。
大蒜是超氧化物歧化酶(SOD)含量最高的植物之一，其含量可达20,000～30,000U/100g。根据文献报道，目前从大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)多采用分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析法等传统分离纯化技术。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，盐析法和有机溶剂沉淀法容易引起蛋白质的失活和变性；层析法则成本高，处理量小，难于工业放大，目前都仅局限于实验室规模的制备。
膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。
超滤膜是指膜孔径在1～100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，而使小分子溶质透过，有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于纯化和浓缩蛋白质，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模。
发明内容
本发明的目的是提供一种环境友好、操作简单、易于工业应用的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)超滤提取方法，且所得产品纯度高、收率高。
本发明实现其目的所采取的技术路线是：
1.将去皮大蒜匀浆1～2分钟，向取出的匀浆液中加入3～5倍体积的去离子水或磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液由0～300mM NaCl(最佳为50～200mM)和20～300mM磷酸盐(最佳为50～150mM)组成、pH6.0～8.5，充分搅拌10～30分钟；
2.将上述溶液在30～70℃(最佳为50～65℃)下恒温15～30分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；
3.将上述溶液进行离心操作，条件：室温，转速为5000～8000rpm，弃去沉淀，取上清液；
4.利用截留分子量为10～50kDa的市售超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，条件：室温、pH6.0～8.5，所得截留液为超氧化物歧化酶溶液；
5.再利用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜在室温下对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液做进一步纯化，条件：室温、pH6.0～8.5，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶(SOD)溶液；
6.将所得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-60℃冷阱中冻干8～10小时，即获超氧化物歧化酶(SOD)干粉。
本发明直接应用超滤分离技术，只用粉碎、热击、离心和超滤四个步骤就可从大蒜溶液中提取获得纯品超氧化物歧化酶(SOD)，与文献报道的盐析法相比，使用相同原料和缓冲溶液条件时，本发明所获得的产品活性约为2500U/mg，高于盐析法(2300U/mg)；收率为6.32mg/100g大蒜鲜重，是盐析法(0.87mg/100g大蒜鲜重)的7倍；且纯度可达99％，较盐析法(83％)高。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步描述本发明。
实施例1：从白皮大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步骤：
1.取白皮大蒜去皮后250g，利用匀浆机匀浆1分钟，再向取出的匀浆液中加入750mL的pH6.0、由50mM氯化钠和50mM磷酸盐组成的缓冲溶液，充分搅拌10分钟。
2.将上述所得溶液在50℃下恒温15分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；
3.将步骤2得到的溶液在室温下进行离心操作，转速为5000rpm。弃去沉淀，取上清液；
4.利用市售截留分子量为10kDa的超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，分离条件为：室温，pH6.0，所得截留液即为超氧化物歧化酶溶液，纯度93.8％，活性2180U/mg；
5.使用市售截留分子量为70kDa的超滤膜对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液进一步纯化，条件同步骤4，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶溶液，纯度97.9％，活性2370U/mg；
6.将得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-60℃冷阱中冻干8小时，即获超氧化物歧化酶(SOD)干粉15.8mg。
实施例2：从紫皮大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步骤：
1.取市售紫皮大蒜去皮后200g，利用匀浆机匀浆2分钟，再向取出的匀浆液中加入1000mL的pH8.5、由200mM氯化钠和150mM磷酸盐组成的缓冲溶液，充分搅拌30分钟；
2.将上述步骤所得溶液在65℃下恒温30分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；
3.将步骤2得到的溶液在室温下进行离心操作，转速为8000rpm。弃去沉淀，取上清液；
4.利用市售截留分子量为50kDa的超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，分离条件为：室温，pH8.5，所得截留液即为超氧化物歧化酶溶液，纯度95.8％，活性2430U/mg；
5.使用市售截留分子量为150kDa的超滤膜对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液进一步纯化，条件同步骤4，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶溶液，纯度99.2％，活性2540U/mg；
6.将得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-60℃冷阱中冻干10小时，即获超氧化物歧化酶(SOD)干粉12.2mg。
实施例3：从大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步骤：
1.用匀浆机将300g去皮大蒜匀浆2分钟，再向取出的匀浆液中加入1000mL去离子水，充分搅拌15分钟；
2.将步骤1所得溶液在60℃下恒温20分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；
3.将步骤2所得溶液进行离心操作，条件：室温，转速为8000rpm。弃去沉淀，取上清液；
4.利用市售截留分子量为50kDa的超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，分离条件为：室温，pH7.0，所得截留液即为超氧化物歧化酶溶液，纯度92.7％，活性2010U/mg；
5.使用市售截留分子量为100kDa的超滤膜对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液进一步分离，分离条件同步骤4，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶溶液，纯度97.0％，活性2240U/mg；
6.将所得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-60℃冷阱中冻干10小时，即获超氧化物歧化酶(SOD)干粉14.8mg。
本发明工艺仅涉及粉碎、热击、离心和超滤四个简单步骤，即可从大蒜溶液中提取获得纯品超氧化物歧化酶(SOD)，相对于目前的工业、实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓缩同步进行、活性损失小、回收率高的特点，且未使用有机溶剂，可有效避免传统提取方法中有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了有机溶剂残留造成的产品安全隐患；能耗低、环境污染小、分离效率高、产品纯度可调控、控制因素单一，便于工业放大。

Claims (3)

1.一种提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是按如下步骤进行：
①用匀浆机将去皮大蒜匀浆1～2分钟，再向取出的匀浆液中加入3～5倍体积的去离子水或磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液由0～300mM NaCl和20～300mM磷酸盐组成、其pH6.0～8.5，充分搅拌10～30分钟；
②将上述溶液在30～70℃下恒温15～30分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；
③将上述溶液进行离心操作，条件：室温，转速为5000～8000rpm，弃去沉淀，取上清液；
④利用截留分子量为10～50kDa的市售超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，条件为：室温、pH6.0～8.5，所得截留液为超氧化物歧化酶溶液；
⑤使用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜在室温下对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液做进一步纯化，条件为：室温、pH6.0～8.5，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶溶液；
⑥将所得到的超氧化物歧化酶溶液冻干8～10小时，即获超氧化物歧化酶干粉。
2.依据权利要求1所述的提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是所说的磷酸盐缓冲溶液是由50～200mM NaCl和50～150mM磷酸盐组成。
3.依据权利要求1所述的提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是大蒜匀浆液与去离子水或与磷酸盐缓冲液的混合液是在50～65℃恒温15～30分钟，析出不耐热的蛋白质。
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