CN102618514B - 超滤提取辣根过氧化物酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从辣根中分离提取辣根过氧化物酶的方法。本发明的技术方主要包括以下步骤：（1）将辣根破碎、浸提、离心得到辣根过氧化物酶粗提液；（2）将辣根过氧化物酶粗提液用截留分子量为70kDa-100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到辣根过氧化物酶超滤液；（3）将辣根过氧化物酶超滤液用截留分子量为1-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到辣根过氧化物酶浓缩液；（4）将辣根过氧化物酶浓缩液脱水得到辣根过氧化物酶。本发明具有操作简单、分离浓缩同步进行、产品回收率高、产品纯度达85%以上、并利于工业放大等特点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从辣根中分离提取辣根过氧化物酶的方法。
背景技术
辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7）是由酶蛋白和铁卟啉结合而成的一种糖蛋白，该酶由多个同功酶组成，分子量为40kDa，等电点为pH3.0-9.0。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别在403nm和275nm，所以人们通常采用RZ值（即OD403nm /OD275nm的比值）来表示该酶的纯度， RZ值越大，纯度越高。
HRP是最重要的医疗诊断用酶之一（J. Chromat. B 2004,803:237-241），该酶不但用于多个生化检测项目，还广泛运用于免疫类试剂盒。除此之外，HRP还可用于工业废水的脱色（Chem. Technol. Biotechnol. 2009,84:126–132），过氧化物的去除以及含酚污水的处理（Biotechnol. Bioprocess Eng. 2006,11:462–465）等。
在自然界中，辣根是HRP含量最高的植物，因此也成为生产HRP最具吸引力的原料。目前，从辣根中分离提取HRP的主要方法有：双水相萃取技术（Appl. Biochem. Biotechnol. 1995, 53:147-154）、反胶束萃取技术（Enzyme Microb. Technol. 1996,18:332-339）、电泳技术（J. Biol. Chem. 1966,241:2166-2172）及层析技术（J. Membr. Sci. 2003,211:101-111）等。然而这些技术均存在一定的缺陷，其中，双水相萃取技术和反胶束萃取技术获得的产品纯度较低，且容易引起HRP的失活和变性；电泳技术和层析技术的成本昂贵，且难于工业放大。
膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。
超滤膜是指膜孔径在1-100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化（Food Chem. 2010,122: 747-752）。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模（J. Membr. Sci. 2010,352:231-238）。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种操作简单、易于放大、产品纯度高的辣根过氧化物酶的超滤提取方法。
本发明的技术方主要包括以下步骤：
（1）、将辣根破碎、浸提、离心得到辣根过氧化物酶粗提液；
（2）、将辣根过氧化物酶粗提液用截留分子量为70kDa-100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到辣根过氧化物酶超滤液；
（3）、将辣根过氧化物酶超滤液用截留分子量为1-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到辣根过氧化物酶浓缩液；
（4）、将辣根过氧化物酶浓缩液脱水得到辣根过氧化物酶。
为了达到最佳的提取效果，还包括以下技术方案：
步骤（1）中的浸提为将破碎后辣根的在水或 Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，缓冲液的浓度可以选择不大于5M, 并调节ph为4-11,离子强度不大于1M，然后在0-10oC搅拌 3小时；步骤（1）中的最佳离心温度为4oC，离心力大于5000g，离心时间大于10分钟。步骤（2）和（3）中的过氧化物酶粗提液和超滤液在超滤处理前调节ph为4-11，离子强度不超过1M。步骤（4）中的脱水为冷冻干燥。
在本发明的步骤（2）和（3）中超滤膜的组件形式选择为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜，超滤效果较好。
本发明具有操作简单、分离浓缩同步进行、产品回收率高、产品纯度达85%以上、并利于工业放大等特点，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明。
实施例1
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤：
（1）取1.0kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在1.5L 100mM的Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，用1M的HCl调匀浆液pH值为5.0；
（2）将步骤（1）得到的匀浆液在4oC下充分搅拌8小时，离心取上清液1.21L。离心条件为：4oC，8000g，25min；
（3）利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（2）获得的1.21L上清液进行超滤分离，获得滤出液0.96L。分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.4L/h；
（4）利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（3）获得的0.96L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.24L。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1L/h；
（5）将步骤（4）获得0.24L截留液冷冻干燥后，得HRP1.63g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为91%。
实施例2
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤：
（1）取1.5kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在2.5L 20mM的Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，用1M的HCl调匀浆液pH值为5.5；
（2）将步骤（1）得到的匀浆液在4oC下充分搅拌8小时，离心取上清液2.27L。离心条件为：4oC，8000g，20min；
（3）利用截留分子量为100kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（2）获得的2.27L上清液进行超滤分离，获得滤出液1.84L。分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.8L/h；
（4）利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（3）获得的1.84L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.25L。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.4L/h；
（5）将步骤（4）获得0.25L截留液冷冻干燥后，得HRP2.52g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为89.3%。
实施例3
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤：
（1）取1.0kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在1.5L 水下匀浆，用1M的HCl调匀浆液pH值为4.0；
（2）将步骤（1）得到的匀浆液在10oC下充分搅拌3小时，离心取上清液1.18L。离心条件为：4oC，5000g，30min；
（3）利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（2）获得的1.18L上清液进行超滤分离，获得滤出液0.94L。分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.4L/h；
（4）利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（3）获得的0.94L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.23L。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1L/h；
（5）将步骤（4）获得0.23L截留液冷冻干燥后，得HRP1.60g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为88.7%。
实施例4
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤：
（1）取1.0kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在1.5L 水下匀浆，用氢氧化钠调匀浆液pH值为11；
（2）将步骤（1）得到的匀浆液在0oC下充分搅拌3小时，离心取上清液1.15L。离心条件为：4oC，6000g，30min；
（3）利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（2）获得的1.15L上清液进行超滤分离，获得滤出液0.93L。分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.4L/h；
（4）利用截留分子量为1kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（3）获得的0.93L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.27L。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1L/h；
（5）将步骤（4）获得0.23L截留液冷冻干燥后，得HRP1.64g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为88.5%。
实施例1-4中步骤（3）和（4）中超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。本发明经操作条件改进及超滤膜优化，也可用于分离和纯化其它过氧化物酶。
Claims (1)
1.一种超滤提取辣根过氧化物酶的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取1.0kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在1.5L 100mM的Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，用1M的HCl调匀浆液pH值为5.0；
（2）将步骤（1）得到的匀浆液在4oC下充分搅拌8小时，离心取上清液1.21L；离心条件为：4oC，8000g，25min；
（3）利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜对步骤（2）获得的1.21L上清液进行超滤分离，获得滤出液0.96L；分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.4L/h；
（4）利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜对步骤（3）获得的0.96L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.24L；分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1L/h；
（5）将步骤（4）获得0.24L截留液冷冻干燥后，得辣根过氧化物酶1.63g，经SDS-PAGE电泳分析，辣根过氧化物酶纯度为91%。
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