CN103613661A - 一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，在螺旋藻粉中加入缓冲溶液，搅匀后冻藏、解冻，再进行高压匀质破壁，得到螺旋藻破壁液，经离心分离后取上清液，分别用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜进行过滤，得藻蓝蛋白粗提取液，过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，再经羟基磷灰石色谱柱进行纯化得藻蓝蛋白精提取液，最后经脱盐及浓缩后进行高速离心喷雾干燥，即得高纯度藻蓝蛋白。通过本发明能最大限度地提取藻蓝蛋白，且产品不会被二次污染，提取螺旋藻中高纯度藻蓝蛋白的提取率为80.0%以上，产品纯度达到A620/A280>4.0。

Description

一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，属于生物制品技术领域。
背景技术
藻蓝蛋白是以螺旋藻等藻类为主要原料分离出的一种深蓝色粉末。它既是一种蛋白质，又是一种极好的天然食用色素，同时又是良好的保健食品。藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
目前，螺旋藻中藻蓝蛋白的提取方法很多，但对藻蓝蛋白的损失太多，提取率较低，很难进行大量提取，且容易造成产品二次污染，不宜推广应用。因此，有必要研发一种提取率高、操作方便的藻蓝蛋白提取方法。
发明内容
为解决现有技术中藻蓝蛋白提取率低、难以推广等问题，本发明提供一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，通过下列技术方案实现。
本发明提供的是这样一种技术方案：一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将新鲜或干燥的钝顶螺旋藻的藻体制成螺旋藻粉；
（2）按螺旋藻粉:缓冲溶液 = 1:0.8～1:1.2的质量比，在步骤（1）的螺旋藻粉中加入缓冲溶液，搅匀，于-10～-20℃下冻藏12～24h，再在20～25℃下解冻完全后，在压力为40～70MPa下进行高压匀质破壁2～5次，得到螺旋藻破壁液；
（3）将步骤（2）所得螺旋藻破壁液经离心分离，取上清液，依次用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜过滤上清液，得藻蓝蛋白粗提液；
（4）将步骤（3）的藻蓝蛋白粗提液以5～30mL/min的流速，通过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的0.8～2.0倍；
（5）用羟基磷灰石体积的6～8倍量、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤（4）所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附20～30min后，用羟基磷灰石体积的5～6倍量、浓度为0.03mol/L、流速为2～5mL/min的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的4～5倍量、浓度为0.03～0.045mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白精提液；
（6）将步骤（5）所得藻蓝蛋白精提液用通透量为30～50KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提液浓缩物，然后将该浓缩物进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白。
所述步骤（2）的缓冲溶液是pH为6～7、浓度为0.1M的磷酸钾。
所述步骤（2）的高压匀质破壁是在常规的高压匀质机上完成的。
所述步骤（3）的离心分离是在转速为3500～5000r/min的条件下离心分离20～30min。
所述步骤（4）的组合型树脂为D900型离子交换树脂、HPD-300L型树脂、BEHP-3型大网孔非极性吸附树脂、BEHP-4型大网孔非极性吸附树脂、D112阳树脂中的一种或几种，且几种的组合是任意的。
所述步骤（5）的磷酸盐缓冲溶液是pH为6.75～6.95、含有0.05～0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液。
所述步骤（6）的高速离心喷雾干燥是在加液速度为2～8L/h、进风温度为180～320℃、出风温度为80～90℃、干燥温度为160～220℃的条件下进行的。
本发明具备的优点和效果：通过本发明能最大限度地提取藻蓝蛋白，且产品不会被二次污染，本发明从破壁、分离纯化，到干燥等步骤的操作均方便易行，操作性、可行性强，能实现规模化生产，生产过程中不排放污染物，是一种对环境友好的藻蓝蛋白提取方法。藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量一般仅为3～10%，采用本发明从螺旋藻中提取高纯度藻蓝蛋白时，提取率为80.0%以上，产品纯度达到A620/A280>4.0。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）将新鲜的优质钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis）的藻体除去杂质后，按常规制成螺旋藻粉；
（2）按螺旋藻粉:缓冲溶液=1:1的质量比，在步骤（1）的螺旋藻粉中加入pH为6.8、浓度为0.1M的磷酸钾缓冲溶液，搅匀后，于-18℃下冻藏20h，再在20℃下解冻完全，然后送入高压匀质机中，在55MPa压力下进行高压匀质破壁2次，得到螺旋藻破壁液；
（3）将步骤（2）所得螺旋藻破壁液在转速为5000r/min的条件下进行离心分离25min后，取上清液，然后将上清液依次用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜进行过滤，过滤后得到藻蓝蛋白粗提液；
（4）将步骤（3）所得藻蓝蛋白粗提液，以20mL/min的流速通过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，其中：该组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的1.5倍，该组合型树脂是：D900型离子交换树脂:BEHP-3型大网孔非极性吸附树脂:D112阳树脂=3:2:2的体积比；
（5）用羟基磷灰石体积的6倍量、浓度为0.1mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤（4）所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附20min后，用羟基磷灰石体积的5倍量、浓度为0.03mol/L、流速为2mL/min、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的4倍量、浓度为0.03mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，该洗脱液为深蓝色液体，即为藻蓝蛋白精提液；
（6）将步骤（5）所得藻蓝蛋白精提液用通透量为45KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提液浓缩物，然后将该浓缩物在加液速度为6L/h、进风温度为220℃、出风温度为85℃、干燥温度为170℃的条件下，进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白，其提取率为80.0%以上，纯度为A620/A280﹥4.0。
实施例2
（1）将干燥的优质钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis）的藻体除去杂质后，按常规制成螺旋藻粉；
（2）按螺旋藻粉:缓冲溶液=1:0.8的质量比，在步骤（1）的螺旋藻粉中加入pH为6.0、浓度为0.1M的磷酸钾缓冲溶液，搅匀后，置于-10℃下冻藏24h，再在25℃下解冻完全，送入高压匀质机中，在压力为40MPa下进行高压匀质破壁3次，得到螺旋藻破壁液；
（3）将步骤（2）所得螺旋藻破壁液在转速为4000r/min的条件下进行离心分离30min后取上清液，然后将上清液分别用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜进行过滤，过滤后得到藻蓝蛋白粗提取液；
（4）将步骤（3）所得藻蓝蛋白粗提液，以30mL/min的流速通过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，其中：该组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的0.8倍，该组合型树脂是：HPD-300L型树脂:BEHP-4型大网孔非极性吸附树脂=1:1的体积比；
（5）用羟基磷灰石体积的8倍量、浓度为0.1mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤（4）所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附30min后，用羟基磷灰石体积的6倍量、浓度为0.03mol/L、流速为5mL/min、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的5倍量、浓度为0.045mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，该洗脱液为深蓝色液体，即为藻蓝蛋白精提液；；
（6）将步骤（5）所得藻蓝蛋白精提取液用通透量为30KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提取液浓缩物，然后将藻蓝蛋白精提取液浓缩物在加液速度为8L/h、进风温度为320℃、出风温度为80℃、干燥温度为220℃的条件下进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白，其提取率为80.0%以上，纯度为A620/A280﹥4.0。
实施例3
（1）以新鲜的优质钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis）的藻体除去杂质后，按常规制成螺旋藻粉；
（2）按螺旋藻粉:缓冲溶液=1:1.2的质量比，在步骤（1）的螺旋藻粉中加入pH为7、浓度为0.1M的磷酸钾缓冲溶液，搅匀后，置于-20℃下冻藏12h，再在23℃下解冻完全，送入高压匀质机中，在压力为70MPa下进行高压匀质破壁5次，得到螺旋藻破壁液；
（3）将步骤（2）所得螺旋藻破壁液在转速为3500r/min的条件下进行离心分离20min后，取上清液，然后将上清液依次用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜进行过滤，过滤后得到藻蓝蛋白粗提液；
（4）将步骤（3）所得藻蓝蛋白粗提液，以5mL/min的流速通过D900型离子交换树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，其中：该组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的2.0倍；
（5）用羟基磷灰石体积的7倍量、浓度为0.1mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤（4）所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附25min后，用羟基磷灰石体积的5倍量、浓度为0.03mol/L、流速为3mL/min、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的5倍量、浓度为0.035mol/L、pH为6.85、含有0.1mol/L氯化钠的的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，该洗脱液为深蓝色液体，即为藻蓝蛋白精提液；
（6）将步骤（5）所得藻蓝蛋白精提取液用通透量为50KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提取液浓缩物，然后将该浓缩物在加液速度为2L/h、进风温度为180℃、出风温度为90℃、干燥温度为160℃的条件下进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白；其提取率为80.0%以上，纯度为A620/A280﹥4.0。

Claims (6)

1.一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将新鲜或干燥的钝顶螺旋藻的藻体制成螺旋藻粉；
（2）按螺旋藻粉:缓冲溶液 = 1:0.8～1:1.2的质量比，在步骤（1）的螺旋藻粉中加入缓冲溶液，搅匀，于-10～-20℃下冻藏12～24h，再在20～25℃下解冻完全后，在压力为40～70MPa下进行高压匀质破壁2～5次，得到螺旋藻破壁液；
（3）将步骤（2）所得螺旋藻破壁液经离心分离，取上清液，依次用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜过滤上清液，得藻蓝蛋白粗提液；
（4）将步骤（3）的藻蓝蛋白粗提液以5～30mL/min的流速，通过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的0.8～2.0倍；
（5）用羟基磷灰石体积的6～8倍量、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤（4）所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附20～30min后，用羟基磷灰石体积的5～6倍量、浓度为0.03mol/L、流速为2～5mL/min的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的4～5倍量、浓度为0.03～0.045mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白精提液；
（6）将步骤（5）所得藻蓝蛋白精提液用通透量为30～50KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提液浓缩物，然后将该浓缩物进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白。
2.根据权利要求1所述的提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（2）的缓冲溶液是pH为6～7、浓度为0.1M的磷酸钾。
3.根据权利要求1所述的提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（3）的离心分离是在转速为3500～5000r/min的条件下离心分离20～30min。
4.根据权利要求1所述的提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（4）的组合型树脂为D900型离子交换树脂、HPD-300L型树脂、BEHP-3型大网孔非极性吸附树脂、BEHP-4型大网孔非极性吸附树脂、D112阳树脂中的一种或几种，且几种的组合是任意的。
5.根据权利要求1所述的提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（5）的磷酸盐缓冲溶液是pH为6.75～6.95、含有0.05～0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的提取高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（6）的高速离心喷雾干燥是在加液速度为2～8L/h、进风温度为180～320℃、出风温度为80～90℃、干燥温度为160～220℃的条件下进行的。
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