CN101519425A

CN101519425A - 一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法

Info

Publication number: CN101519425A
Application number: CN200810033874A
Authority: CN
Inventors: 蔡春尔; 何培民; 周铭; 李晨; 李春霞
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2009-09-02

Abstract

一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法。其特征该方法在温度为4℃条件下进行以下各步骤：取螺旋藻，先进行超声波破碎螺旋藻体，超声时间10分钟，间隙破碎，再高速离心30分钟得螺旋藻最初提取液；接着将上述所提取溶液加硫酸铵至40％饱和度，中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，中速离心15分钟后取沉淀；再接着将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液溶解后高速离心30分钟，所得上清液用低孔径微孔滤膜过滤，滤液脱盐，脱盐液上羟基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；用0.10M至0.12M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集。

Description

一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法

技术领域：

本发明涉及一种分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，特别是涉及一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法。

背景技术：

藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白是一种很好的纯天然色素，有鲜艳的颜色，可用作食物色素，也可用于化妆品工业，不会造成人为伤害，是理想的安全的添加剂，同时，藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白也是活性物质，均具有稳定的荧光现象和产生自由基作用，可以作为抗体荧光标记物质以替代合成荧光物质，因而，已有生产藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白荧光标记免疫抗体试剂，用于医学疾病临床分子诊断和生命科学分子检测，除了用于荧光检测外，近年来，根据藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白均可作为光敏剂，在光动力学治疗肿瘤方面的前景不断被越来越多的人看好，它以高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂，在光学信息存储与处理，快速光电探测、人工神经网络等方面具有潜在的应用前景。目前，已可从数种海藻中提取藻胆蛋白，但高纯度的藻胆蛋白价格十分昂贵，且价格还在迅速上涨。

关于藻胆蛋白提取纯化方面，虽然研究较多，且大多数是从螺旋藻中提取藻蓝蛋白，但有的工艺简单，所取蛋白纯度极低，有的工艺过于复杂，且易使蛋白变性，不适合大量提取，有的涉及到了超滤法，极易使溶质粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓度极化和堵塞，还有些在提取过程中，要添加食用稳定剂、糖类、无机盐类、pH调节剂等，一般只能制得药品级(A_615nm/A_280nm>2)的藻蓝蛋白，用低渗的办法制备藻类的抽提物，通过两次离子交换层析才使藻蓝蛋白纯度达到试剂级(A_615nm/A_280nm>4)。正是由于上述这些分离技术存在的这些缺陷，使得制得的藻胆蛋白纯度低，得率亦不高，以使高纯度藻胆蛋白的价格高昂，最后，大大影响了高纯度藻胆蛋白的广泛应用，因此，降低藻胆蛋白纯化成本是关键。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，它不但能有效地从螺旋藻中提取高纯度藻胆蛋白，而且，工艺简单，成本低廉，得率较高。

本发明的目的是这样实现的：本发明的一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法是在温度为4℃条件下进行以下各步骤：取螺旋藻，先进行超声波破碎螺旋藻体，超声时间10分钟，超声波破碎以间隙破碎方式进行，再高速离心30分钟得到螺旋藻最初提取液；接着将上述所提取溶液加硫酸铵至40％饱和度，中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，中速离心15分钟后取沉淀；再接着将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液溶解后高速离心30分钟，所得上清液用低孔径微孔滤膜过滤，滤液脱盐，脱盐液上羟基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；用0.10M至0.12M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；所得到的藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_615nm/A_280nm)，变藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_652nm/A_280nm)。

所述的高速离心为15000转/分，所述的中速离心为10000转/分。所述的极低浓度磷酸盐缓冲液为0.001M磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/LEDTA)。所述的低孔径微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。

由于本发明以螺旋藻为材料，通过超生波破碎方法、硫酸铵多次盐析方法、柱层析方法等方法提取和纯化藻胆蛋白，因此，具有以下优点：

1、采用超声波破碎藻体，克服了低渗法降低得率的缺点；

2、采用两次硫酸铵盐析法，既使得藻类中的脂肪和多糖在初提阶段就已全部除去，防止了初提物中残渣和粘性多糖堵塞层析柱，又在不明显降低产率的情况下显著提高了粗提液的纯度，减轻了后期纯化的压力；

3、一次过柱就可得到高纯度的藻胆蛋白，解决了大规模提取纯化藻胆蛋白的瓶颈；

4、一次过柱就可得到两种藻胆蛋白(藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白)；

5、在所有海藻中以螺旋藻的藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白含量最为丰富，以此为原料最合适不过；

6、所用材料硫酸铵价格便宜，羟基磷灰石可重复使用，再生方便；

7、成本低，如果不包括劳动力成本，初步估算仅为同类产品的四十至五十分之一；

8、得率高，可以达到0.5％左右，是目前常用的藻胆蛋白分离方法的10倍以上。

具体实施方式：

以下将对本发明的一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法的实施例作进一步详细的描述。

本实施例中所用的材料为螺旋藻，具体步骤如下：

(1)、用0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)以物液比(g/ml)1:8浸泡新鲜螺旋藻体，在温度为4℃条件下，进行超声破碎，超声时间10分钟，超声波破碎以间隙破碎方式进行，以免温升超过4℃以上，再高速离心(15000转/分，30分钟)得到螺旋藻最初提取液；

(2)、在温度为4℃条件下，将上述所提取溶液加硫酸铵至40％饱和度，中速离心(10000转/分，15分钟)后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，中速离心(10000转/分，15分钟)后取沉淀；

(3)、在温度为4℃条件下，将沉淀用0.001M磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)溶解后高速离心(15000转/分，30分钟)，所得上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液脱盐，脱盐液上羟基磷灰石柱；

(4)、在温度为4℃条件下，用0.040M至0.060M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；

(5)、在温度为4℃条件下，用0.10M至0.12M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；最后，得到的藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_615nm/A_280nm)，变藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_652nm/A_280nm)。

Claims

1、一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于该方法在温度为4℃条件下进行以下各步骤：取螺旋藻，先超声波破碎螺旋藻体，超声时间10分钟，超声波破碎以间隙破碎方式进行，再高速离心30分钟得到螺旋藻最初提取液；接着将上述所提取溶液加硫酸铵至40％饱和度，中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，中速离心15分钟后取沉淀；再接着将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液溶解后高速离心30分钟，所得上清液用低孔径微孔滤膜过滤，滤液脱盐，脱盐液上羟基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/LEDTA)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；用0.10M至0.12M的磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；所得到的藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_615nm/A_280nm)，变藻蓝蛋白吸收光谱纯度达到4-6(A_652nm/A_280nm)。

2、一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于所述的高速离心为15000转/分，所述的中速离心为10000转/分。

3、一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于所述的极低浓度磷酸盐缓冲液为0.001M磷酸盐缓冲液(pH7.0，含1mmol/LEDTA)。

4、一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于所述的低孔径微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。