CN101343310B

CN101343310B - 一次柱层析制备高纯度藻胆蛋白的方法

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Publication number: CN101343310B
Application number: CN2008101341224A
Authority: CN
Inventors: 冯亚非; 李先文; 温燕梅; 部音利
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2008-07-16
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2028-07-16
Also published as: CN101343310A

Abstract

本发明涉及从藻类中同时制备高纯度藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，属于生物工程提取分离技术。以红藻或蓝藻为原料，用磷酸缓冲液为提取剂，将藻细胞破碎后，经硫酸铵分级盐溶、盐析、透析后得藻胆蛋白粗提物。粗提物经一次羟基磷灰石柱层析，磷酸盐缓冲液梯度洗脱，冷冻干燥，得到高纯度的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。本发明前期采用有效的方法制备的藻胆蛋白粗提物，纯度达到药品级标准(A₆₂₀/A₂₈₀＞2.0)，从而简化了后续的纯化步骤，只需一次柱层析即可分别得到高纯度的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。本方法从鲜藻和干藻中提取高纯度藻胆蛋白，工艺流程简单，生产成本低，蛋白得率高，适合大规模生产。

Description

一次柱层析制备高纯度藻胆蛋白的方法

技术领域

本发明提供一种从蓝藻和红藻中同时提取分离高纯度藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白的简单、快捷的方法。属于生物工程提取分离技术领域。

背景技术

藻胆蛋白(Phyeobilipmteins，PBP)是存在于某些藻类(主要是红藻、蓝藻)的藻胆体(Phycobili-somes，PBS)中的一类色素复合蛋白。藻胆体是红藻和蓝藻所特有的一种超分子捕光色素复合体，通过锚定蛋白固着在类囊体膜外表面。藻胆蛋白具有强烈的荧光性，发橙红色荧光，而其本身则呈红色、紫色或蓝色等，故为有色多肽。它和连接多肽一起构成藻胆体，两者分别占藻胆体的80％和20％。按光谱特性藻胆蛋白分四类：藻红蛋白(Phycoerythrins，PE)，藻蓝蛋白(Phycocyanins，PC)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanins，PEC)和别藻蓝蛋白(Allophycoeyanins，APC)。藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和藻蓝素(开链的四吡咯发色团)通过一个或两个硫醚键共价连接而成的结(缀)合蛋白。每种藻胆蛋白由等摩尔量的α和β亚基构成，α亚基的大小约为13kD-20kD，β亚基约为14kD-24kD。藻蓝蛋白的α亚基含1个藻蓝素，β亚基含2个藻蓝素，而别藻蓝蛋白的每个亚基中皆只有1个藻蓝素。藻胆蛋白是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高，占氨基酸总量的37.42％。它可以帮助调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，还具有明显的抗氧化、抗炎症作用，能清除辐射以及选择性的抑制加氧酶-2的活性，同时还能调节人体免疫系统，增强免疫系统功能，提高人体对疾病的抵抗能力，所以藻胆蛋白可以制成食品和药品用于医疗保健；同时，藻胆蛋白也是一种很好的可以取代人工合成色素的天然色素，用作食品和化妆品的添加剂，不仅可以避免人工色素对人体可能的副作用，而且藻胆蛋白本身就有极强的保健功能；此外，高纯度的藻胆蛋白又可制成荧光试剂和生化试剂，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域；藻胆蛋白还是一种具有开发潜力的光敏剂，用于肿瘤的光动力治疗。所以藻胆蛋白的应用范围广阔，具有很高的开发、利用价值。但是，藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度(A_620nm/A_280nm)要达到4.0以上才能用作生化试剂和临床药物。因此，对藻胆蛋白粗提物进一步分离纯化，清除杂蛋白、提高纯度是目前藻胆蛋白开发利用亟待解决的关键技术。

已报道的有关制备藻胆蛋白的专利技术都是从螺旋藻中提取单一的藻蓝蛋白或是藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合物，并且分离技术也尚存在一些缺陷：工艺简单的，制得的藻胆蛋白纯度低；产物纯度高者，工艺复杂，得率亦不高。例如：中国专利CN1106414A和CN1130028A介绍了从螺旋藻中分离藻蓝蛋白的方法，工艺简单，但所得藻蓝蛋白纯度极低；中国专利CN101003565A公布了螺旋藻中同时制备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，但得到的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白纯度低，仅能作为食品添加剂；中国专利CN00117512.2介绍了以新鲜钝顶螺旋藻为原料制备高纯度藻蓝蛋白的方法，但需要经过四次柱层析，操作繁琐，提取率低。

发明内容

针对现有的高纯度藻胆蛋白制备方法复杂、生产成本过高、无法大量制备等缺陷，本发明的目的在于提供一种简单有效的适合大量制备高纯度藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从蓝藻和红藻中分别制备藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白的技术，其方法简单、快捷、高效，运行成本低，所得的藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白具有较高的提取率、纯度和生物活性，原料既可采用鲜藻也可采用干藻粉，有效地解决了藻类资源利用的问题。

解决本发明的技术问题所采用的方案如下步骤：(1)粗藻胆蛋白的制备和初步纯化，使纯度达到A₆₂₀/A₂₈₀＞2.0；(2)羟基磷灰石柱层析；(3)分别洗脱分离藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白；(4)洗脱液的脱盐，冷冻干燥，最终获得高纯度和高提取率的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。

所述的方案，步骤1中，对于微藻的细胞破壁，采用pH＝7的浓度范围在0.02～0.5M的磷酸缓冲液(PBS)作提取剂，藻粉或鲜藻与磷酸缓冲液的固液比为1∶1～1∶10，搅拌均匀后，置-10℃至-20℃下冷冻一定时间后，室温融解，如此反复冻融4-6次；对于大型海藻的细胞破壁，以10000-12000转/分组织捣碎机捣碎。细胞破壁并加入提取剂后以转速4800-10000r/min离心10-30min，取上层清液，加入20～60％硫酸铵分级多次盐析，以转速4800-10000r/min离心10-30min，得蓝色沉淀即为已初步纯化的藻蓝粗提物，然后透析脱盐，得到纯度在2.0以上的藻胆蛋白。

所述的方案，步骤2中羟基磷灰石采用如下方法制备：在适当的搅拌下，以5-15mL/min的流速，将等量的0.05-2MCaCl₂和Na₂HPO₄溶液加到容器中，加完后静置沉淀，倾去上清液，以自来水洗涤沉淀。在沉淀中加入40％NaOH溶液80℃水浴2h后，以同温度自来水洗至中性，再加入0.001-0.01M，pH＝7.0的磷酸缓冲液80℃下水浴1h，冷却后倾去上清液即可装柱，以0.001-0.01M的磷酸缓冲液平衡。

所述的方案，步骤2中，将羟基磷灰石加到层析柱内，观察到柱底有少量羟基磷灰石沉积时打开柱开关，继续装柱，使之自然沉降，直至达到所需的高度为止。羟基磷灰石沉积后，将多余的缓冲液放出，使液面刚好与柱床表面一致，藻胆蛋白粗提液加入量约为柱床体积的1/10。

所述的方案，步骤3中，待藻胆蛋白粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0.005～0.45M的磷酸缓冲液(含0.1～0.5M氯化钠)梯度洗脱，分别收集藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液。

所述的方案，步骤4中，将收集的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液透析脱盐，最后冷冻干燥，即获得高纯度的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白粉末。

本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：

1、按流程：微藻或大型藻→细胞破碎→盐溶→盐析→透析→离心(除变性蛋白)→粗藻胆蛋白→冷冻干燥，粗藻蓝的纯度已达到药品级(A₆₂₀/A₂₈₀＞2.0)要求，提取率和纯度显著地得到提高。

2、自制的柱层析用羟基磷灰石，生产成本低，粒度适中，分离纯化藻胆蛋白效率高，适用于大规模工业化应用。

3、经硫酸铵分级盐析后的粗藻胆蛋白，仅一次羟基磷灰石柱层析可同时获得藻红蛋白(A₅₆₄/A₂₈₀＞5.0)、藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀＞5.0)和别藻蓝蛋白(A₆₅₀/A₂₈₀＞4.0)，均高于生化试剂级的纯度要求，此方法简单方便，减少了多次层析的繁琐操作，避免了产品损失。

4、制备藻胆蛋白的原料可以是蓝藻或红藻，也可以是鲜藻或干藻粉，有效地解决藻类资源的利用和高值化问题。

具体实施方式

实施实例1

1、藻胆蛋白粗提物的制备

取产于海南三亚的钝顶螺旋藻干粉，用pH＝7，0.02～0.5M的磷酸缓冲液作提取剂，藻粉与磷酸缓冲液的固液比为1∶10，搅拌均匀后冷冻一定时间，室温融解，如此反复冻融数次，然后以4800r/min转速离心10min，取其上清液，加入20％～60％硫酸铵分四次盐溶、盐析、离心，得蓝色沉淀即为藻蓝粗提物，透析脱盐后，得到纯度为A₆₂₀/A₂₈₀＝2.06的藻胆蛋白。

2、羟基磷灰石的制备

(1)溶液的配制：分别配制0.01M，pH＝7.0的磷酸缓冲液，1MCaCl₂和1MNa₂HPO₄溶液。

(2)制备羟基磷灰石：以12mL/min的滴加速度将500mL 1MCaCl₂溶液和500mL 1MNa₂HPO₄溶液加到烧杯中并搅拌，滴加完毕后，静止磷酸氢钙沉淀。倾去上清液，以约3L自来水洗涤沉淀，加入25mL 40％NaOH液80℃水浴2h，静止后的沉淀以同温度自来水洗至中性。

(3)平衡：羟基磷灰石加0.01mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液80℃下水浴1h，静止冷却后倾去上清液即可装柱，以0.01mol/L的磷酸缓冲液平衡。

3、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化

将羟基磷灰石加到层析柱内，观察到柱底有少量羟基磷灰石沉积时打开柱开关，继续装柱，使之自然沉降，直至达到所需的高度为止。羟基磷灰石沉积后，将多余的缓冲液放出，使液面刚好与柱床表面一致。加藻胆蛋白粗提物，所加粗提液的量约为柱床体积的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4M磷酸缓冲液(含0.2M氯化钠)梯度洗脱，分别收集藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液。收集的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液透析脱盐，最后冷冻干燥，得藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀＝5.05)和别藻蓝蛋白(A₆₅₀/A₂₈₀＝4.13)。

实施实例2

1、藻胆蛋白粗提物的制备

取产于广东湛江的新鲜鱼腥藻，加入磷酸缓冲液作提取剂，固液比为1∶6，以实施实例1同样步骤方法制备藻胆蛋白粗提物，粗提物纯度达A₆₂₀/A₂₈₀＝2.19。

2、羟基磷灰石的制备

3、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化

将羟基磷灰石加到层析柱内，观察到柱底有少量羟基磷灰石沉积时打开柱开关，继续装柱，使之自然沉降，直至达到所需的高度为止。羟基磷灰石沉积后，将多余的缓冲液放出，使液面刚好与柱床表面一致。加藻胆蛋白粗提液的量约为柱床体积的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4M磷酸缓冲液(含0.2M氯化钠)梯度洗脱，分别收集藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液。收集的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液透析脱盐，最后冷冻干燥，得藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀＝5.36)和别藻蓝蛋白(A₆₅₀/A₂₈₀＝4.03)。

实施实例3

1、藻胆蛋白粗提物的制备

取产于广东汕头的新鲜坛紫菜，以12000转/分组织捣碎机捣碎。细胞破壁并加入提取剂后以转速4800r/min离心20min，取上层清液，加入20～60％硫酸铵分级多次盐析，以转速10000r/min离心min，沉淀即为藻胆蛋白粗提物，然后透析脱盐，得到纯度A₆₂₀/A₂₈₀＝2.02的藻胆蛋白。

2、羟基磷灰石的制备

3藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化

将羟基磷灰石加到层析柱内，观察到柱底有少量羟基磷灰石沉积时打开柱开关，继续装柱，使之自然沉降，直至达到所需的高度为止。羟基磷灰石沉积后，将多余的缓冲液放出，使液面刚好与柱床表面一致。藻胆蛋白粗提液加入量约为柱床体积的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3M磷酸缓冲液(含0.2M氯化钠)梯度洗脱，分别收集藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的洗脱液。将收集的三种藻胆蛋白洗脱液透析脱盐，最后冷冻干燥，得藻红蛋白(A₆₅₄/A₂₈₀＝5.14)、藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀＝5.38)和别藻蓝蛋白(A₆₅₀/A₂₈₀＝4.20)。

Claims

1.一次柱层析制备高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于采用pH＝7浓度范围在0.02～0.5M的磷酸缓冲液作提取剂，将藻细胞破碎后，离心分离，去除沉淀，收集上清液，用20％～60％硫酸铵分级多次盐析后收集藻胆蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液后经一次羟基磷灰石柱层析，使用浓度范围为0.005～0.45M的磷酸缓冲液，含0.1～0.5M氯化钠梯度洗脱，控制流速在1～15mL/min，收集各组分洗脱液，冷冻干燥，得到纯度A_620nm/A_280nm＞5.0的藻红蛋白、藻蓝蛋白和A_650nm/A_280nm＞4.0的别藻蓝蛋白；藻类细胞破碎并加入提取剂后以4800r/min转速离心10～30min，弃沉淀取上清液，以20％～60％的硫酸铵重复四次盐析、透析脱盐，得纯度A_620nm/A_280nm＞2.0的藻胆蛋白；羟基磷灰石采用如下方法制备：在适当的搅拌下，以5-15mL/min的流速，将等量的0.05-2M的CaCl₂和Na₂HPO₄溶液加到容器中，加完后静置沉淀，倾去上清液，以自来水洗涤沉淀，在沉淀中加入40％NaOH溶液80℃水浴2h后，以同温度自来水洗至中性，再加入0.001-0.01M，pH＝7.0的磷酸缓冲液80℃下水浴1h，冷却后倾去上清液即可装柱，以0.001-0.01M的磷酸缓冲液平衡。

2.根据权利要求1所述的一次柱层析制备高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于在羟基磷灰石柱层析时，藻胆蛋白粗提液加入量为柱床体积的1/10，用浓度范围为0.005～0.45M的磷酸缓冲液，含0.1～0.5M氯化钠多级梯度洗脱，流速控制在1～15mL/min。

3.根据权利要求1所述的一次柱层析制备高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于，将洗脱收集所得的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白脱盐、冷冻干燥，可使藻胆蛋白得到进一步的纯化，藻胆蛋白容易变性，结晶后的固体更利于保存。