CN1796405A - 一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法。现有的藻胆蛋白一般都是从螺旋藻中分离，并且分离技术也尚存在一些缺陷，使制得的藻胆蛋白纯度低，得率亦不高，以使高纯度藻胆蛋白的价格高昂。本发明的主要特征是采用从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，主要包括以下步骤：在低温下高速捣碎紫菜，离心得上清夜，硫酸铵多次盐析法制备藻胆蛋白初提液，再经透析和高速离心，将得到的溶液上羟基磷灰石柱，用低浓度分步洗脱分别得到藻红蛋白和藻蓝蛋白，再用高浓度洗脱可得到变藻蓝蛋白。本发明的从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法工艺简单，成本低廉，方便实用。

Description

一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法。特别是涉及一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法。
背景技术：
藻红蛋白、藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白是一种很好的纯天然色素，有鲜艳的颜色，可用作食物色素，也可用于化妆品工业，不会造成人为伤害，是理想的安全的添加剂，同时，藻红蛋白、藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白也是活性物质，均具有稳定的荧光现象和产生自由基作用，可以作为抗体荧光标记物质以替代合成荧光物质，因而已有生产藻蓝蛋白和藻红蛋白荧光标记免疫抗体试剂，用于医学疾病临床分子诊断和生命科学分子检测，除了用于荧光检测外，近年来，根据藻红蛋白、藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻红蛋白、藻蓝蛋白均可作为光敏剂，在光动力学治疗肿瘤方面的前景不断被越来越多的人看好，它以高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂，在光学信息存储与处理，快速光电探测、人工神经网络等方面具有潜在的应用前景。目前，已可从数种海洋红藻中提取藻胆蛋白，但高纯度的藻胆蛋白价格十分昂贵，且价格还在迅速上涨，
关于藻胆蛋白提取纯化方面，虽然方法各异，但大多数是从螺旋藻中提取藻蓝蛋白，而且，有的工艺简单，所取蛋白纯度极低，有的工艺过于复杂，且易使蛋白变性，不适合大量提取，还有些在提取过程中，要添加食用稳定剂、糖类、无机盐类、pH调节剂等，一般只能制得药品级(A615nm/A280nm＞2)的藻蓝蛋白，很难达到试剂级(A615nm/A280nm＞4)，正是由于上述这些分离技术存在的这些缺陷，使得制得的藻胆蛋白纯度低，得率亦不高，以使高纯度藻胆蛋白的价格高昂，最后，大大影响了高纯度藻胆蛋白的广泛应用，因此，降低藻胆蛋白纯化成本是关键。
发明内容：
本发明的目的是要提供一种改进的从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，它不但能有效地从紫菜中提取高纯度藻胆蛋白，而且，工艺简单，成本低廉，得率较高。
本发明的目的是这样实现的：本发明的原料为紫菜，从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的步骤：在低温4℃条件下，先采用间隙方式，以10000～12000转/分高速捣碎紫菜，低速离心得到紫菜最初提取液，接着将上述溶液加硫酸铵至20％饱和度，中速离心后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，中速离心后取沉淀，将上述沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解，再加硫酸铵至10％饱和度，接着中速离心后取上清液，继续加硫酸铵至40％饱和度，再中速离心后取沉淀，将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解后高速离心，接着上清液脱盐，脱盐液再高速离心后上羟基磷灰石柱，用0.010M至0.030M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集，用0.04M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集，用0.100M至0.120M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集，得到的藻红蛋白纯度达到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻蓝蛋白纯度达到4-6(A615nm/A280nm)。
由于本发明以大型海藻紫菜为材料，通过细胞破碎方法、硫酸铵多次盐析方法、柱层析方法等方法提取和纯化藻胆蛋白，因此具有以下优点：
1、采用多次硫酸铵盐析法，使得藻类中的脂肪和多糖在初提阶段就已全部除去，既防止了初提物中残渣和粘性多糖堵塞层析柱，又克服了低渗法降低得率的缺点；
2、一次过柱就可得到高纯度的藻胆蛋白，解决了大规模提取纯化藻胆蛋白的瓶颈；
3、一次过柱就可得到三种藻胆蛋白(藻红蛋白、藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白)；
4、我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg 30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此，本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；
5、所用材料硫酸铵价格便宜，羟基磷灰石可重复使用，再生方便；
6、成本低，如果不包括劳动力成本，初步估算仅为同类产品的四十至五十分之一；
7、得率高，可以达到0.2％左右，是目前常用的藻胆蛋白分离方法的20倍。
具体实施方式：
以下将对本发明的一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法的实施例作进一步详细的描述。
本实施例中所用的材料为大型海藻紫菜，具体步骤如下：
一、进行高速捣碎加5000转/分的低速离心15分钟的方法得到紫菜最初提取液，高速捣碎以间隙捣碎方式进行，以免温升超过4℃以上，捣碎转速为10000～12000转/分；
二、将上述所提取溶液加硫酸铵至20％饱和度，后以10000转/分中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，再以中速10000转/分离心15分钟后取沉淀；
三、将沉淀用0.001M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)溶解，加硫酸铵至10％饱和度，以10000转/分中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至40％饱和度，再以中速为10000转/分离心15分钟后取沉淀；
四、再次将沉淀用0.001M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)溶解后高速离心，转速为15000转/分，30分钟后，上清液脱盐，再以转速为15000转/分高速离心30分钟，后上羟基磷灰石柱；
五、用0.010M至0.030M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；
六、用0.040M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；
七、用0.100M至0.120M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集，得到的藻红蛋白纯度达到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻蓝蛋白纯度达到4-6(A615nm/A280nm)。
上述各步均在温度为4℃下进行。

Claims (1)

1.一种从紫菜中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，其特征在于选取原料为紫菜，在温度为4℃下进行以下各项操作步骤：
(1)、进行高速捣碎，高速捣碎以间隙捣碎方式进行，以免温升超过4℃以上，高速捣碎转速为10000～12000转/分，后以5000转/分低速离心15分钟的方法得到紫菜最初提取液；
(2)、将上述所提取溶液加硫酸铵至20％饱和度，接着以10000转/分中速离心15分钟后取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，再以10000转/分中速离心15分钟后取沉淀；
(3)、将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解，加硫酸铵至10％饱和度，中速离心取上清液，继续加硫酸铵至40％饱和度，中速离心取沉淀，中速离心都取为10000转/分，中速离心时间均是15分钟；
(4)、再将沉淀用极低浓度磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解后以15000转/分，高速离心30分钟，上清液脱盐，再以15000转/分高速离心30分钟后上羟基磷灰石柱；
(5)、用0.010M至0.030M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；
(6)、用0.040M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集；
(7)、用0.100M至0.120M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将变藻蓝蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来并收集，得到的藻红蛋白纯度达到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻蓝蛋白纯度达到4-6(A615nm/A280nm)。
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