CN104341473A - 一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物有效成分的分离纯化领域，特别公开了一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法。本发明将牡丹鲜花低温烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸铵构成的双水相体系，并添加蔗糖和有机酸作为花色苷的稳定剂，冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心得上相、下相以及牡丹花残渣，进一步对残渣和下相进行多次萃取，然后合并上相进行醇沉除杂和萃取除杂，真空浓缩得牡丹花色苷。本发明采用双水相体系条件温和，提取时间短，有机相易回收，提取成本低，易于工业化放大生产。
Description
（一） 技术领域
本发明属于天然产物有效成分的分离纯化领域，特别涉及一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法。
（二） 背景技术
牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr）又名鹿韭、白术、木芍药，属芍药科、芍药属的多年生落叶灌木。菏泽市是著名的牡丹之乡，是全国乃至全世界最大的牡丹栽培中心和种质资源中心，栽培面积达0.8万公顷。伴随着牡丹产业的迅速发展，对花卉种植地区的旅游业和经贸业起到一定的促进作用，但是受到花期和气候条件的限制，形成了花开时经贸和旅游活动繁荣，花落时惨淡经营的不良局面，并且由于深加工技术的落后，每年有成千上万吨的牡丹花被白白地浪费在田间地头。
花色苷是花色素与糖以糖苷键结合形成的一种化合物，其广泛存在于植物的花、果实、茎、叶等组织器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。牡丹花瓣中含有丰富的花色苷类成分，经鉴定主要为：矢车菊-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3,5-O-二葡萄糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、天竺葵-3,5-o-二葡萄糖苷、芍药-3-O-葡萄糖苷和芍药-3,5-O-二葡萄糖苷。大量文献研究表明花色苷类成分具有多种生理药理功效，包括清除自由基、抗突变、抗发炎、抗癌、抗病毒、抗菌、抗过敏、防止血管舒张、预防糖尿病、保护胃黏膜、缓解眼疲劳、抑制脂质过氧化和血小板凝集等。花色苷作为一种安全、无毒的天然色素，对人体具有多种保健功能，被广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。
花色苷易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，传统提取方法包括水提、有机溶剂浸提，或以超声、微波、酶法进行辅助提取，但此类方法所需溶剂量大、提取时间长，设备要求高，提取物中杂质较多，还需进一步分离纯化，不利于工业化放大生产，此外，花色苷稳定性差，提取过程中易受温度、pH、金属离子等外界因素的影响而褐变或降解，导致提取率相对较低。
双水相萃取技术始于20世纪60年代，传统的双水相包括双聚合物体系、聚合物/葡萄糖体系、聚合物/无机盐体系等，但由于高聚物价格昂贵、粘度大、回收处理困难，无法适应工厂化大规模生产，近年来，小分子亲水醇/盐双水相萃取在生物分离纯化方面成为研究的热点，相对于传统高聚物双水相萃取其具有分相快、效果好、有机相易回收、成本低等优点，此外双水相萃取条件温和，有利于分离过程中花色苷的结构稳定性。
（三） 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种条件温和、提取时间短、成本低的双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种双水相分离富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鲜花为原料，包括如下步骤：
（1）将牡丹鲜花于35-40℃下低温烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉；
（2）将硫酸铵溶于蒸馏水中，然后添加无水乙醇，充分震荡混匀，构成双水相体系；
（3）在双水相体系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有机酸，调节pH为3-4，在冰水浴条件下进行磁力搅拌，冷冻离心，得到上相、下相以及牡丹花残渣，取牡丹花残渣，重复上述步骤；
（4）取分离所得的下相溶液和牡丹花残渣，分次添加无水乙醇进行多级萃取，调节pH为3-4，在冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心，合并多级萃取和首次萃取所得的上相溶液；
（5）在上相溶液中添加5倍体积的无水乙醇，0-4℃避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖以及残留在上相中的杂质；
（6）真空浓缩除去上相中的乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，用乙醇和正丁醇的混合溶液对牡丹花色苷进行萃取，最后得到产品。
本发明将牡丹鲜花低温烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸铵构成的双水相体系，并添加蔗糖和有机酸作为花色苷的稳定剂，冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心得上相、下相以及牡丹花残渣，进一步对残渣和下相进行多次萃取，然后合并上相进行醇沉除杂和萃取除杂，真空浓缩得牡丹花色苷。
本发明包括原料预处理、建立双水相体系、萃取分离牡丹花色苷、多级萃取、醇沉除杂、萃取除杂等步骤。
本发明的更优技术方案为；
步骤（2）中，无水乙醇和蒸馏水的体积比为1:1.5-2.5，硫酸铵在双水相体系中的质量分数为10-14%。
步骤（2）中，震荡次数为3次，每次30s。
步骤（3）中，牡丹花干粉与双水相体系的料液比为1g:30-50mL，蔗糖在双水相体系中的浓度为20-50mg/mL，有机酸的浓度为0.05-0.1mol/mL，有机酸为丙二酸、单宁酸和草酸中的一种或多种。
步骤（3）和（4）中，磁力搅拌时间为1.5-3h，冷冻离心温度为4℃，转速为5000r/min，时间为5min。
步骤（3）中，牡丹花残渣重复萃取的次数为2-3次。
步骤（4）中，多级萃取过程中，无水乙醇的添加量与下相溶液的体积比为0.5-0.75:1，萃取次数为2-4次。
步骤（6）中，蒸馏水的添加量为固形物质量的40倍，萃取相混合溶液中乙醇和正丁醇的体积比为1:3，萃取相与水相的体积比为1:1，萃取次数为2-3次。
本发明花色苷含量的测定采用分子示差法。
本发明的有益效果是：
（1）采用双水相体系对牡丹花色苷进行分离富集，使花色苷类成分集中在上层有机相，而多糖等杂质主要集中下层水相，达到边提取边纯化的目的；
（2）花色苷在溶解状态下稳定性较差，在提取过程中易受温度、pH、金属离子等外界因素的影响而降解，在双水相体系中添加稳定剂可最大程度保证花色苷的稳定性，提高花色苷得率。糖可通过减小水分活度或水分可利用程度而稳定花色苷，起到护色作用，有机酸作为辅色剂可通过离子相互作用、疏水作用及范德华力与花色苷形成稳定性强的复合物，防止亲核集团的攻击而褪色；
（3）通过改变上相的极性对下相和牡丹花残渣进行多级萃取，可获得不同极性的花色苷，使花色苷的萃取更加完全；
（4）双水相体系条件温和，提取时间短，有机相易回收，提取成本低，易于工业化放大生产。
（四） 具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。
实施例1：
（1）乙醇与水添加比例的选择
考察有机相添加量时，一般要求最后形成的双水相体系相比接近于1，这样有利于物质的分离。分别添加体积比1:1.5、1:1.75、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.75、1:3的乙醇和水混合溶液，硫酸铵添加量接近饱和状态，充分振荡摇匀，构成双水相体系，按原料与体系之比为1:40（g/mL）加入牡丹花干粉，添加蔗糖、丙二酸、单宁酸作为稳定剂，使其浓度分别为20mg/mL、0.075mol/L、0.075mol/L，调节pH为3，冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4℃条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率分别为1.70wt%，1.68wt%，1.65wt%，1.56wt%，1.44wt%，1.25wt%。实验结果表明，随着乙醇与水体积比的减小，上相中花色苷提取率逐渐减小。原因可能是由于乙醇比例较低时，形成的双水相体系相比较小，不利于花色苷的萃取。考虑乙醇使用成本以及实际萃取效果，选择乙醇与水体积比为1:2进行后续实验。
（2）硫酸铵添加量的选择
在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，添加不同质量的硫酸铵作为分相盐，使其在整个体系中的浓度分别为10%（g/mL），11%（g/mL），12%（g/mL），13%（g/mL），14%（g/mL），15%（g/mL），充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料和稳定剂添加量同（1），调节pH为3，冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4℃条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率分别1.57wt%，1.64wt%，1.73wt%，1.74wt%，1.69wt%，1.65wt%。实验结果表明，随着硫酸铵添加量的增加，花色苷提取率先增加后减少，硫酸铵浓度为12%（g/mL）和13%（g/mL）时，提取率最高，且相差不大。原因是由于随着分相盐添加量的增加，双水相体系的分相能力逐渐增强，上下相物理化学性质的差别趋于显著，有利于花色苷与多糖等杂质的分离；但分相盐添加量过大时，下相易析出晶体，双水相体系不稳定，影响花色苷的萃取。
（3）双水相体系pH值的选择
在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸铵为分相盐，使其在体系中的浓度为12%（g/mL），充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料和稳定剂添加量同（1），分别调节pH至3、4、5、6、7，冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4℃条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率分别为1.73wt%，1.72wt%，1.56wt%，1.50wt%，1.44wt%。实验结果表明随着pH值升高，花色苷提取率逐渐降低，pH值为3和4条件下，花色苷提取率最高，且相差不大，原因可能是花色苷在强酸性条件下以黄烊盐阳离子状态存在，呈稳定的红色，随着pH增加，花色苷会形成无色的甲醇碱。
（4）稳定剂添加量的选择
在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸铵为分相盐，使其在体系中的浓度为12%（g/mL），充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料添加量同（1），稳定剂的添加比例及添加量如下表所示，调节pH至4，冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4℃条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率，实验结果如表所示，蔗糖、丙二酸、单宁酸的添加量分别为30mg/mL、0.050mol/L、0.100mol/L时，花色苷提取率最高，为1.81wt%。
稳定剂对花色苷提取率的影响
（5）多级萃取
取上步分离所得的下相溶液和牡丹花渣，分次添加不同比例的无水乙醇进行多级萃取，共萃取3次，每次无水乙醇的添加量与下相体积比分别为1:1，0.75:1，0.5:1，调节pH至4，冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4℃条件下冷冻离心5min，合并多级萃取和首次萃取所得上相溶液，测定花色苷含量，计算花色苷的总提取率为2.31wt%。
（6）醇沉除杂
在上相溶液中添加入5倍体积的无水乙醇，4℃避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖，以及残留在上相中的多糖、蛋白等杂质。
（7）萃取除杂
真空浓缩回收乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，蒸馏水的添加量为固形物质量的40倍。用乙醇和正丁醇的混合溶液对牡丹花色苷进行萃取，萃取相中乙醇和正丁醇的体积比为1:3，萃取相与水相的体积比为1:1，共萃取3次，测定萃取液中花色苷含量，计算花色苷萃取率为98.55wt%。减压浓缩得牡丹花色苷，纯度为42.12wt%。
实施例2：
（1）原料预处理
取-20℃保存的牡丹鲜花，于35℃低温烘干至恒重，粉碎至40-60目，得牡丹花干粉。
（2）双水相体系的建立
在圆底烧瓶中添加体积比为1:2.5的无水乙醇和蒸馏水，以硫酸铵为分相盐，使其在整个体系中的浓度为10%（g/mL），充分振荡摇匀，构成双水相体系。
（3）双水相体系萃取分离牡丹花色苷
按原料与体系之比为1:50（g/mL）加入牡丹花干粉，添加蔗糖、草酸、单宁酸作为稳定剂，使其浓度分别为30mg/mL、0.05mol/L、0.1mol/L，调节pH为3，冰水浴条件下磁力搅拌2 h，然后4℃条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率为1.71wt%。
（4）多级萃取
取上步分离所得的下相溶液和牡丹花残渣，分次添加不同比例的无水乙醇进行多级萃取，共萃取3次，每次无水乙醇的添加量与下相的体积比分别为1:1，0.75:1，0.5:1。调节pH至3，冰水浴条件下磁力搅拌2.5 h，然后4℃条件下冷冻离心5 min，合并多级萃取和首次萃取所得上相溶液，测定花色苷含量，计算花色苷的总提取率为2.07wt%。
（5）醇沉除杂
在上相溶液中添加5倍体积的无水乙醇，0-4℃避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖，以及残留在上相中的多糖、蛋白等杂质。
（6）萃取除杂
真空浓缩回收乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，蒸馏水的添加量为固形物质量的40倍。用乙醇和正丁醇的混合溶液对牡丹花色苷进行萃取，萃取相中乙醇和正丁醇的比例为1:3，萃取相与水相之比为1:1，共萃取2次，测定萃取液中花色苷含量，计算花色苷萃取率为98.01wt%。减压浓缩得牡丹花色苷，纯度为39.31wt%。
Claims (8)
1.一种双水相分离富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鲜花为原料，其特征为，包括如下步骤：（1）将牡丹鲜花于35-40℃下低温烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉；（2）将硫酸铵溶于蒸馏水中，然后添加无水乙醇，充分震荡混匀，构成双水相体系；（3）在双水相体系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有机酸，调节pH为3-4，在冰水浴条件下进行磁力搅拌，冷冻离心，得到上相、下相以及牡丹花残渣，取牡丹花残渣，重复上述步骤；（4）取分离所得的下相溶液和牡丹花残渣，分次添加无水乙醇进行多级萃取，调节pH为3-4，在冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心，合并多级萃取和首次萃取所得的上相溶液；（5）在上相溶液中添加5倍体积的无水乙醇，0-4℃避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖以及残留在上相中的杂质；（6）真空浓缩除去上相中的乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，用乙醇和正丁醇的混合溶液对牡丹花色苷进行萃取，最后得到产品。
2.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（2）中，无水乙醇和蒸馏水的体积比为1:1.5-2.5，硫酸铵在双水相体系中的质量分数为10-14%。
3.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（2）中，震荡次数为3次，每次30s。
4.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（3）中，牡丹花干粉与双水相体系的料液比为1g:30-50mL，蔗糖在双水相体系中的浓度为20-50mg/mL，有机酸的浓度为0.05-0.1mol/mL，有机酸为丙二酸、单宁酸和草酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（3）和（4）中，磁力搅拌时间为1.5-3h，冷冻离心温度为4℃，转速为5000r/min，时间为5min。
6.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（3）中，牡丹花残渣重复萃取的次数为2-3次。
7.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（4）中，多级萃取过程中，无水乙醇的添加量与下相溶液的体积比为0.5-0.75:1，萃取次数为2-4次。
8.根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（6）中，蒸馏水的添加量为固形物质量的40倍，萃取相混合溶液中乙醇和正丁醇的体积比为1:3，萃取相与水相的体积比为1:1，萃取次数为2-3次。
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