CN105085697A - 一种小球藻多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小球藻多糖的提取方法，涉及海洋生物技术领域。通过交替冻融使细胞壁完全破碎，同时联合超声波辅助提取方法，避免了高温对原料所造成的营养损失、有效成分破坏严重的不良影响。而且促使小球藻细胞内多糖物质快速溶出。与传统多糖提取相比，本发明的方法具有能耗低、多糖提取率、回收率高，生产成本低的特点。通过本发明冻融联合超声波提取方法，小球藻多糖提取率、回收率分别是传统提取方法的1.34～1.39倍以及1.1～1.58倍。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种小球藻多糖的提取方法。
背景技术
小球藻(Chlorellaspp.)为一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorphyta)绿藻纲(Chlo—rophyceae)绿球藻目(ChlorocOccales)卵囊藻科(Oocystaceae)球藻属(Chlorella)。现世界上已知的小球藻有15种之多。小球藻体内含有丰富的生物活性物质，如不饱和脂肪酸、色素、蛋白质、多糖等，具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒，防治消化性溃疡和缺铁性贫血、抗高血脂症和动脉粥样硬化、抗辐射、解毒保肝和降低血压等多种功能。小球藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，具有很高的应用价值。目前小球藻已经广泛地应用在动物饲料、食品添加剂、医药制剂、美容产品等方面。大量研究证明，小球藻多糖的生物活性多样，具有抗菌、增强免疫力功能、降血糖以及较为显著的抗癌、抗肿瘤活性已成为关注的热点。传统的多糖提取方法主要有：水提醇沉法、酸提法和碱提法、热水抽提法，传统高温、酸性、碱性提取条件下，可导致多糖降解，并且会使粗多糖的样品颜色变深，杂质较多。近年来超临界流体萃取法成为一种新的提取分离技术，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。但是设备复杂，运行成本高，提取范围窄。因而没有被广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于现有技术的不足，提供一种能耗低、生产成本低、小球藻多糖提取率、回收率高的提取方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种小球藻多糖的提取方法，其提取方法如图1。
一种小球藻多糖的提取方法，其具体操作步骤如下：
1、预处理：将小球藻粉加水配制成浓度为5％～10％混悬液，置于60℃水浴箱中1h并不断搅拌；
2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经～20℃冷冻，室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h；后加入3～5mL、pH7.0、浓度为0.01mol/L磷酸缓冲液，超声波处理(400～600W，时间4～6min)，于2000～2500r/min条件下离心5min,过滤，滤液备用；
3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加水配制成10～20％溶液，加入胰蛋白酶，酶解温度均为50～60℃，酶解时间2h；离心，转速控制为3000～4000r/min，时间为10min，过滤，滤液备用；所述的胰蛋白酶活性为3000U/mg；所述的滤液：胰蛋白酶重量之比为100:0.5；
4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并混匀，减压浓缩至滤液体积的十分之一，即得浓缩液，加入95％的无水乙醇混合均匀，置于摇床30～45min；，4000～5000r/min条件下离心10min,弃去上清液，即得粗多糖；所述的浓缩液：95％无水乙醇重量比为1:2；
5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值为4.0～6.0，静置12～18h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
本发明的优势在于：本发明采用冻融法是低温冷冻与室温融化交替进行的一种破壁方法，促使细胞完全破裂的同时避免了高温对原料所造成的营养损失、有效成分破坏严重的不良影响。同时超声波辅助提取小球藻多糖，机械作用也加速细胞壁的破碎，促进胞内多糖活性物质的快速溶出。与传统多糖提取相比，交替冻融破壁和超声波辅助提取有效结合，具有能耗低、多糖提取率、回收率高，生产成本低的特点。通过本发明冻融联合超声波提取方法，小球藻多糖提取率、回收率分别是传统提取方法的1.34～1.39倍以及1.1～1.58倍。
附图说明
图1为本发明提取小球藻多糖的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
1、预处理：称取100g小球藻粉溶于500ml蒸馏水中配制成浓度为5％混悬液，置于60℃水浴箱中1h并不断搅拌；
2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经～20℃冷冻，室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h；后加入3mL、pH7.0、浓度为0.01mol/L磷酸缓冲液，超声波处理(400W，时间4min)，于2000r/min超速离心机中离心5min,过滤，滤液备用；
3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加蒸馏水200ml配制成10％溶液，加入胰蛋白酶1.0ml，酶解温度60℃，酶解时间2h，离心，转速控制为4000r/min，时间为10min，过滤，滤液备用；
4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并减压浓缩至70ml，加入140ml95％的无水乙醇混合均匀，置于摇床30min；，5000r/min条件下离心10min,弃去上清液，即得粗多糖；
5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值为6.0，静置16h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
小球藻多糖不同提取方法提取率测定试验
1、材料与方法
小球藻藻粉：江苏明天生物科技有限公司
2、小球藻多糖提取方法
取100g小球藻粉，以蒸馏水500ml，分别采用如下：
1)、连续加热回流提取(索氏提取器)：每次提取2h，提取2次，合并提取液；
2)、超声波提取：超声30min，热水回流提取2h，提取2次，合并提取液；
3)、闪式提取器提取：闪式破碎10min，提取2次，合并提取液；
4)、冻融+超声波提取：提取方法同本发明实施例1一致；
3、小球藻多糖含量测定方法
3.1粗多糖提取率测定
采用苯酚～硫酸法测定，用葡萄糖为标准物，在490nm波长处测定标准物质量浓度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定。用牛血清蛋白作为标准物，在595nm波长测定标准物质量浓度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。
3.1.1粗多糖提取率％＝(粗多糖质量/小球藻粉质量)×100％
3.2多糖纯化
取1.0g粗多糖，溶入200mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值6，静置12h，离心，取上清液，计算多糖回收率。
3.2.1多糖回收率＝(纯化后多糖含量/粗多糖含量)×100％
4、测定结果
4.1葡萄糖标准曲线的绘制回归方程为，y＝9.7986x+0.035相关系数r＝0.9995，根据回归方程测得各种提取方法小球藻多糖的提取率如表1
表1不同提取方法对小球藻粗多糖提取率的影响
4.2根据小球藻粗多糖的质量测得多糖回收率如表2
表2不同提取方法小球藻多糖回收率
5、结论
由表1可知，前3种方法提取的多糖提取率都相差无几，但是经过冻融法处理结合超声波提取多糖的提取率提高了1.4倍。因此可以确定冻融法+超声波提取为最适合提取小球藻多糖。由于小球藻细胞壁的主要成分是纤维素与果胶，纯粹的物理机械破碎的方法，难以将所有的细胞壁进行破碎。冻融法是在～20℃冷冻、室温缓慢融化的一种方法，是一种比较温和的破壁方式，可以避免高温对原料所造成的营养损失等不良影响，可使细胞破裂较为彻底细胞壁超声波提取法是在传统水提法的基础上，辅助超声波处理，利用超声波产生的空化作用、机械作用加速细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出从而提高了多糖提取率且所得小球藻多糖较其他提取方法纯净度高。
实施例2
1、预处理：称取200g小球藻粉溶于1000ml蒸馏水中配制成浓度为5％混悬液，置于60℃水浴箱中1h并不断搅拌；
2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经～20℃冷冻，室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h；后加入5mL、pH7.0、浓度为0.01mol/L磷酸缓冲液，超声波处理(500W，时间5min)，于2000r/min条件下离心5min,过滤，滤液备用；
3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加蒸馏水300ml配制成15％溶液，加入胰蛋白酶1.5ml，酶解温度55℃，酶解时间2h，离心，转速控制为3500r/min，时间为10min，过滤，滤液备用；
4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并减压浓缩至130ml，加入260ml95％的无水乙醇混合均匀，置于摇床40min；，5000r/min条件下离心10min,弃去上清液，即得粗多糖；
5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值为6.0，静置18h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
制得的粗多糖的质量为11.560g,多糖提取率为5.78％，多糖纯化率为78.94％
实施例3
1、预处理：称取50g小球藻粉溶于500ml蒸馏水中配制成浓度为10％混悬液，置于60℃水浴箱中1h并不断搅拌；
2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经～20℃冷冻，室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h；后加入4.5mL、pH7.0、浓度为0.01mol/L磷酸缓冲液，超声波处理(600W，时间6min)，于2500r/min条件下离心5min,过滤，滤液备用；
3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加蒸馏水100ml配制成20％溶液，加入胰蛋白酶0.5ml，酶解温度55℃，酶解时间2h，离心，转速控制为4000r/min，时间为10min，过滤，滤液备用；
4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并减压浓缩至60ml，加入120ml95％的无水乙醇混合均匀，置于摇床38min；，5000r/min条件下离心10min,弃去上清液，即得粗多糖；
5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值为6.0，静置12h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
制得的粗多糖的质量为3.49g,多糖提取率为6.98％，多糖纯化率为76.96％。
Claims (4)
1.一种小球藻多糖的提取方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
1)、预处理：将小球藻粉加水配制成浓度为5％～10％混悬液，置于60℃水浴箱中1h并不断搅拌；
2)、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经(－20℃)冷冻，室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h；后加入3～5mL、pH7.0、浓度为0.01mol/L磷酸缓冲液，超声波处理(400～600W，时间4～6min)，于2000～2500r/min条件下离心5min,过滤，滤液备用；
3)、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加水配制成10～20％溶液，加入胰蛋白酶，酶解温度均为50～60℃，酶解时间2h；离心，转速控制为3000～4000r/min，时间为10min，过滤，滤液备用；
4)、减压浓缩与醇析：将步骤2)与步骤3)中滤液合并混匀，减压浓缩至滤液体积的十分之一，即得浓缩液，加入95％的无水乙醇混合均匀，置于摇床30～45min；，4000～5000r/min条件下离心10min,弃去上清液，即得粗多糖；
5)、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80％的三氯乙酸调节pH值为4.0～6.0，静置12～18h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
2.根据权利要求1所述的一种小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步骤3)中胰蛋白酶活性为3000U/mg。
3.根据权利要求1所述的一种小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步骤3)中滤液：胰蛋白酶重量之比为100:0.5。
4.根据权利要求1所述的一种小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步骤4)中浓缩液：95％无水乙醇重量比为1:2。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151125 |