CN106866834B - 一种制备高效定制分子量的褐藻糖胶的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备高效定制分子量的褐藻糖胶的方法及其应用，包括：以海带褐藻糖胶为原料，将其微波溶解、超声降解得褐藻糖胶降解液；将褐藻糖胶降解液利用高流速琼脂糖凝胶色谱分级，收集获得目的分子量的低分子量褐藻糖胶溶液，并将其它高分子量褐藻糖胶溶液再次进行超声波降解，利用高流速琼脂糖凝胶色谱分级，收集目的分子量的低分子量褐藻糖胶溶液，合并所有目的褐藻糖胶溶液；利用纳滤膜过滤所得目的褐藻糖胶溶液，脱盐并浓缩，再次稀释褐藻糖胶浓缩液再纳滤浓缩脱盐；乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，洗涤，干燥获得低分子量褐藻糖胶产品。该方法最大限度的保留了褐藻糖胶的活性成分，所得目标产品高纯均一小分子量褐藻糖胶产品纯度高达95％以上。

Description

一种制备高效定制分子量的褐藻糖胶的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种制备高效定制分子量的褐藻糖胶的方法及其应用，属于多糖生产技术领域。

背景技术

褐藻糖胶是存在于褐藻或一些海洋无脊椎动物中的一种含有硫酸基团的阴离子水溶性杂多糖，其主要成分除了L-岩藻糖和硫酸根外，还含有半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和蛋白质等。研究表明褐藻糖胶具有广泛的生物活性，如降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、调节免疫等作用，其活性与其分子量及分子组成密切相关。

褐藻糖胶作为一种独特的生物活性多糖，目前是海洋药物开发领域的一个研究热点。但长期以来，由于提取技术的限制，国内外研究生产的褐藻糖胶大多为大分子的杂多糖，成分复杂，结构不清，这限制了褐藻糖胶研究和市场开发进展。近年来，随着现代膜技术和色谱技术的快速发展，国内外学者逐渐将注意力转移到相对低分子量的褐藻糖胶(LowMolecular Weight Fucoidan，LMWF)的研究上来。LMWF具有分子均一度高，结构特征清晰，生理副作用低等特点。目前对于低分子量褐藻糖胶的相关研究还处于实验室探索阶段，尚无工业制备技术，更没有高品质的商业产品投放市场，因此实现褐藻糖胶分子量高效定制是目前褐藻糖胶产业亟待解决的难题。

发明内容

天然提取的褐藻糖胶分子组成极为复杂，分子量跨度大，且根据原料的不同差异也较大，因此通过分子降解技术和分级纯化技术获得高纯度分子量均一的褐藻糖胶，有利于其市场推广。本发明从褐藻糖胶的物理化学性质出发，通过大量的研究开发了一种高效的褐藻糖胶分子量控制技术，获得了高纯度及结构均一的褐藻糖胶产品，创新了一条高品质褐藻糖胶产品工业制备技术，该产品应用于高血脂动物模型表明其降血脂效果显著。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种制备褐藻糖胶产品的方法，通过该方法制备的褐藻糖胶分子量低且均一，纯度高。该方法主要包括以下步骤：

(1)以海带大分子褐藻糖胶为原料，将其通过微波强化溶解、超声波降解获得褐藻糖胶降解液；

(2)将褐藻糖胶降解液利用凝胶过滤色谱分级，收集目的分子量的低分子量褐藻糖胶溶液，并将其它高分子量褐藻糖胶溶液返回步骤(1)再次进行超声波降解，色谱分级，收集目的分子量的低分子量褐藻糖胶溶液，合并所有目的褐藻糖胶溶液；

(3)采用纳滤膜过滤所得目的褐藻糖胶溶液，脱盐并浓缩，然后再次稀释褐藻糖胶浓缩液再纳滤浓缩脱盐；

(4)采用乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，洗涤，干燥获得低分子量褐藻糖胶产品。

本发明中，低分子量且均一高纯度的褐藻糖胶产品中的低分子量是指分子量范围为2000～10000Da；均一是指分子量均一，得到的产品分子量变化范围在500Da以内；高纯度是指低分子量的褐藻糖胶的纯度大于等于90％，优选的为等于95.5％等。

步骤(1)中，本发明海带大分子褐藻糖胶是由海带为原料获得的大分子褐藻糖胶粗品，它是指以海带为原料通过传统热水法提取或通过生物酶法提取获得的褐藻糖胶产品固体或其提取液，在微波强化溶解前，将大分子褐藻糖胶粗品配制成浓度为2～5％(w/v)的溶液；该产品固体或提取液已经获得目标产物褐藻糖胶，但是该褐藻糖胶并未经过纯化分级，是含有不同分子量的褐藻糖胶的混合物，但一般以大分子褐藻糖胶为主，或者经过纯化分级后，得到的仍以大分子褐藻糖胶为主，大分子褐藻糖胶是指分子量大于等于50kDa。

由海带为原料获得的大分子褐藻糖胶粗品可以有由现有技术中的多种方法制备得到，可以由以下方法制备得到但不仅仅限于以下方法，例如，专利CN106008730A中实施例1中步骤(9)中制备得到的褐藻糖胶粗品；或者是，专利CN103387622A中实施例1中得到的乳白色褐藻糖胶固体粉末；或者是，市售褐藻糖胶产品；也可以是通过现有技术中的其他方法制备得到的褐藻糖胶粗品，该方法并没有特别限定，以海带为原料，用热水、稀酸或氯化钙溶液提取，然后向提取液中加入乙醇、氢氧化铅或氢氧化铝等表面活性剂，使褐藻糖胶沉淀出来，即为本发明的原料；也可以选择以下技术方案制备得到：取海带粉碎，采用5～26g/L的氯化钙溶液，使料液比为1:8～10，调节pH至2，于50～60℃水浴中浸提1～2h，离心，上清液用体积分数为70～80％的乙醇溶液沉淀，再离心、干燥，得褐藻糖胶粗品。

本发明中，采用微波强化溶解和超声波降解是使得褐藻糖胶分子量较均一的关键物理技术，微波强化溶解能够使得粗品中的杂质与褐藻糖胶得到有效分离，超声波降解降低了大分子褐藻糖胶的分子量，超声空化作用适当，使得褐藻糖胶分子量均一度高。

本发明的褐藻糖胶原料采用来源于海带的褐藻糖胶产品，主要原因是海带褐藻糖胶含量高，且原料产量高，目前的褐藻糖胶产品绝大部分都来源于海带。

微波强化溶解：固体褐藻糖胶产品在水溶液中溶解较慢且不彻底，在采用固体褐藻糖胶产品时通过微波作用强化其溶解，微波辐射能穿透液体，达到物料内部，物料吸收微波能，内部温度迅速上升，快速提高褐藻糖胶的溶解度，使得褐藻糖胶快速完全溶解。从溶解的效果来看，优选的，微波频率为800～2000MHz，处理3～5次，间隔3～5min，每次2～10s。采用间歇式的微波强化溶解工艺参数，能够提高溶解的效率，降低能耗。

超声波降解：超声波的空化作用会产生局部高温、高压或强冲击波和微射流，当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈震动，会在液体内部产生小空洞，这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的撞击作用，从而产生几千到上万个大气压的压强，微粒间这种剧烈的相互作用，会弱化高分子量的褐藻糖胶内部之间的化学键，进一步使化学键断裂，从而降低了大分子褐藻糖胶分子量。本发明发现褐藻糖胶经过超声波降解，能够有效的降解褐藻糖胶的分子量，并且分子量的分布较为均一，分子量变化范围在500Da以内。

将微波强化溶解后的褐藻糖胶溶液，进行超声波处理，以降低大分子褐藻糖胶的分子量，从降解效果来看，优选的，超声波频率范围是45～200KHz，处理时间为5～30min。

步骤(2)中，褐藻糖胶依据分子量分级，根据褐藻糖胶分子的理化性质，优选的，分级体系为高流速琼脂糖凝胶色谱分级体系(DEAE-Sepharose Fast Flow，常规市售产品)；采用不同浓度的无机盐作为流动相，进行洗脱，获得不同分子量的褐藻糖胶溶液，收集目的分子量的褐藻糖胶溶液，并将大分子量的褐藻糖胶溶液返回超声波降解步骤重复降解2～3次；优选的，无机盐包括NaCl、KCl中的任意一种或两种；优选的，流动相的浓度范围是0～3mol/L；优选的，流动相流速范围是0.05～0.25m/h。

步骤(3)中，将步骤(2)中获得的目的分子量的褐藻糖胶溶液进行纳滤浓缩并进一步脱盐，优选的，纳滤膜截留分子量范围是200～500Da，并控制温度在35℃以下。优选的，采用目的分子量褐藻糖胶溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的褐藻糖胶溶液稀释，并再次纳滤浓缩达到脱盐目的。

步骤(4)中，向步骤(3)中所得目的分子量褐藻糖胶浓缩液中加入乙醇溶液，沉淀褐藻糖胶。

醇沉的体积分数对褐藻糖胶的纯度具有一定的影响，当醇浓度不合适时，会掺入其它杂质，比如少量的未去除的褐藻淀粉等。优选的，乙醇溶液的体积分数为75～85％(v/v)，沉淀30～60min，5000～8000g离心5-15min后，得沉淀再采用体积分数为75～85％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，5000～8000g离心5-10min后所得沉淀即为目标褐藻糖胶产物。

将所得沉淀加热或冷冻干燥，即获得目的分子量(低分子量)褐藻糖胶产品。

本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的褐藻糖胶产品，其是由大分子褐藻糖胶降低分子量并分级纯化制得，所述褐藻糖胶的重均分子量为2000～10000Da，其分子均一度高，分子量变化范围在500Da以内。

本发明的第三个目的是提供上述褐藻糖胶产品在制备具有降低高血脂功效的药物或食品中应用。

未分级纯化的褐藻糖胶是生物大分子，其分子结构和分子量呈现很大的不均一性，而不同分子结构和不同分子量的褐藻糖胶的生理功能也不相同。经过动物实验验证，本发明的低分子量的褐藻糖胶对高血脂动物模型具有非常明显降低效果，这说明采用本发明的方法制备得到的低分子量褐藻糖胶具有较高的生物活性。

本发明的第四个目的是提供一种组合物(如保健食品组合物或潜在药物组合物)，其由所述的褐藻糖胶产品和药学上或食品学上可接受的或药学上赋形剂组成。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)目前市场的褐藻糖胶产品主要为国外进口的含量偏低的大分子褐藻糖胶，且主要以功能性保健食品出现，售价高，市场扩大困难，而本发明提供了一套能够获得高品质高活性的褐藻糖胶产品工业制备技术，对于促进褐藻糖胶产业和市场的发展具有显著作用。

(2)针对特定的海带大分子褐藻糖胶，通过本发明一系列的物理方法处理，建立了一条稳定高效的小分子量褐藻糖胶分子量定制技术，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，最大限度的保留了褐藻糖胶的活性成分，所得目标产品高纯均一小分子量褐藻糖胶产品纯度高达95％以上，能够实现大规模的工业生产。

(3)目标产品小分子量褐藻糖胶产品收率高达到80％以上。

(4)本发明的技术步骤为不引入任何化学或有害其他杂质，确保所得产品的生物安全。

(5)本发明的目标产物为均一小分子量褐藻糖胶，完全水溶，高活性硫酸根含量，高生理活性特别是可以提高生物体免疫活性，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤等效果，在降血脂方面表现的尤为突出。

(6)本发明制备得到褐藻糖胶具有显著的降低高血脂作用，因此在医学领域的应用中具有重要意义。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本发明中，产品收率(％)＝本发明目的分子量褐藻糖胶产品的质量/原料中褐藻糖胶的质量×100％。

实施例1

一种高效的高纯度均一小分子量褐藻糖胶产品的具体制取工艺步骤内容如下：

(1)原料：从海带提取获得的褐藻糖胶产品固体，具体方法如下：

取海带粉碎，使料液比为1:15～20，90℃水浴4h，离心分离后，取上清液用20％(w/v)氯化钙溶液沉淀30min，离心，上清液用体积分数为70～80％的乙醇溶液沉淀，再离心、干燥，得褐藻糖胶粗品。将其按质量浓度3％(w/v)配制成溶液；

(2)微波强制溶解，微波频率在1500MHz，处理4次，间隔5min，每次8s；

(3)超声波降解，将步骤(2)中完全溶解的褐藻糖胶溶液进行超声波处理，以降低大分子褐藻糖胶的分子量，超声波频率是120KHz，处理时间为15min；

(4)褐藻糖胶分级，采用高流速琼脂糖凝胶色谱(DEAE-Sepharose Fast Flow)分级体系，采用0～2.5mol/L的KCl溶液作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.10m/h，获得不同分子量的褐藻糖胶溶液，收集目的分子量的褐藻糖胶溶液，并将大分子量的褐藻糖胶溶液返回步骤(3)重复降解两次；

(5)纳滤浓缩脱盐，将步骤(4)中获得的目的分子量的褐藻糖胶溶液进行纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是300Da，并控制温度在35℃以下，采用目的分子量褐藻糖胶溶液体积3倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的褐藻糖胶溶液稀释，并再次纳滤浓缩达到脱盐目的；

(6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得目的分子量褐藻糖胶浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀褐藻糖胶，乙醇体积分数为80％(v/v)，沉淀40min，8000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为85％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，8000g离心10min后所得沉淀即为目标褐藻糖胶产物；

(7)冷冻干燥，将步骤(6)中所得沉淀冷冻干燥，即获得了目的分子量褐藻糖胶产品。经检测，小分子量褐藻糖胶的纯度为97.5％，产品收率为87％，分子量为4300±250Da。

实施例2

一种高效的高纯度均一小分子量褐藻糖胶产品的具体制取工艺步骤内容如下：

(1)原料：从海带提取获得的褐藻糖胶产品固体，其来源于专利CN106008730A中实施例1中步骤(9)中制备得到的褐藻糖胶粗品，将按质量浓度4％(w/v)配制成溶液；

(2)微波强制溶解，微波频率在1000MHz，处理5次，间隔5min，每次10s；

(3)超声波降解，将步骤(2)中完全溶解的褐藻糖胶溶液进行超声波处理，以降低大分子褐藻糖胶的分子量，超声波频率是60KHz，处理时间为20min；

(4)褐藻糖胶分级，采用高流速琼脂糖凝胶色谱(DEAE-Sepharose Fast Flow)分级体系，采用0～1.5mol/L的NaCl溶液作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.12m/h，获得不同分子量的褐藻糖胶溶液，收集目的分子量的褐藻糖胶溶液，并将大分子量的褐藻糖胶溶液返回步骤(3)进行重复降解三次；

(5)纳滤浓缩脱盐，将步骤(4)中获得的目的分子量的褐藻糖胶溶液进行纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是200Da，并控制温度在35℃以下，采用目的分子量褐藻糖胶溶液体积2倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的褐藻糖胶溶液稀释，并再次纳滤浓缩达到脱盐目的；

(6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得目的分子量褐藻糖胶浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀褐藻糖胶，优选的乙醇体积分数为75％(v/v)，沉淀60min，5000g离心10min后，得沉淀再采用体积分数为85％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，5000g离心10min后所得沉淀即为目标褐藻糖胶产物；

(7)通风加热干燥，将步骤(6)中所得沉淀75℃通风干燥，即获得了目的分子量褐藻糖胶产品。

经检测，小分子量褐藻糖胶的纯度为98.5％，产品收率为90％，分子量为6500±350Da。

实施例3

一种高效的高纯度均一小分子量褐藻糖胶产品的具体制取工艺步骤内容如下：

(1)原料：从海带提取获得的褐藻糖胶溶液，具体制备方法如下：

取海带粉碎，采用5～26g/L的氯化钙溶液，使料液比为1:8～10，调节pH至2，于50～60℃水浴中浸提1～2h，离心得上清液即为待处理的褐藻糖胶溶液；

(2)微波强制溶解，微波频率在1000MHz，处理5次，间隔5min，每次5s；(3)超声波降解，将步骤(2)中完全溶解的褐藻糖胶溶液进行超声波处理，以降低大分子褐藻糖胶的分子量，超声波频率是45KHz，处理时间为30min；

(4)褐藻糖胶分级，采用高流速琼脂糖凝胶色谱(DEAE-Sepharose Fast Flow)分级体系，采用0～3mol/L的NaCl+KCl(物质的量比为3:2)溶液作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.15m/h，获得不同的分子量的褐藻糖胶溶液，收集目的分子量的褐藻糖胶溶液，并将大分子量的褐藻糖胶溶液返回步骤(3)进行重复降解三次；

(5)纳滤浓缩脱盐，将步骤(4)中获得的目的分子量的褐藻糖胶溶液进行纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是500Da，并控制温度在35℃以下，采用目的分子量褐藻糖胶溶液体积4倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的褐藻糖胶溶液稀释，并再次纳滤浓缩达到脱盐目的；

(6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得目的分子量褐藻糖胶浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀褐藻糖胶，优选的乙醇体积分数为85％(v/v)，沉淀30min，6000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为85％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，6000g离心5min后所得沉淀即为目标褐藻糖胶产物；

(7)冷冻干燥，将步骤(6)中所得沉淀冷冻干燥，即获得了目的分子量褐藻糖胶产品。经检测，小分子量褐藻糖胶的纯度为95.9％，产品收率为88％，分子量为9200±350Da。

实施例4

褐藻糖胶产品高血脂动物模型试验应用。

将40只小鼠随机分笼适应性饲养1周，饲喂正常饲料，自由饮水。1周后按质量均衡分成4组，每组10只：对照组，高血脂模型组，市售褐藻糖胶产品、本发明实施例2中的褐藻糖胶产品分子量6500Da(100mg/kg·d)。除对照外，其余各组于实验第1天开始给与高血脂化饲料。从第2周开始除对照组和高血脂模型组外，其余各组分别灌喂相应剂量的不同褐藻糖胶。实验期间，小鼠自由摄食和饮水，持续喂养4周后，各组小鼠禁食12h，眼球取血，分离血清，-80℃保存待测。

在进行了五周饲喂后，分别采血测定其TC、TG、HDL-C和LDL-C含量，结果见表1。高血脂小鼠模型血清中TC、TG和LDL-C含量分别提高了32.0％、21.4％和41.7％，HDL-C含量则降低了28.4％，因此高血脂小鼠模型构建成功(P＜0.01)。在高血脂化饲喂的基础上，补充饲喂不同的褐藻糖胶试样后，高血脂模型小鼠TC、TG和LDL-C都降低，而HDL-C水平上升；本发明制得的低分子量高纯褐藻糖胶产品与市售褐藻糖胶产品比较其降血脂的效果更为显著，与高血脂模型组比较其TC、TG和LDL-C水平分别降低了29.5％、25.4％和35.5％，HDL-C水平提高了19.6％，都显著高于市售褐藻糖胶实验组。因此本发明所生产的褐藻糖胶产品与市售产品相比具有显著应用优势。

表1

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种制备褐藻糖胶产品的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）原料：从海带提取获得的褐藻糖胶产品固体，其来源于专利CN106008730A中实施例1中步骤（9）中制备得到的褐藻糖胶粗品，将按质量浓度4%（w/v）配制成溶液；

（2）微波强制溶解，微波频率在1000MHz，处理5次，间隔5min，每次10s；

（3）超声波降解，将步骤（2）中完全溶解的褐藻糖胶溶液进行超声波处理，以降低大分子褐藻糖胶的分子量，超声波频率是60KHz，处理时间为20min；

（4）褐藻糖胶分级，采用高流速琼脂糖凝胶色谱分级体系，采用0~1.5mol/L的NaCl溶液作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.12m/h，获得不同分子量的褐藻糖胶溶液，收集目的分子量的褐藻糖胶溶液，并将大分子量的褐藻糖胶溶液返回步骤（3）进行重复降解三次；

（5）纳滤浓缩脱盐，将步骤（4）中获得的目的分子量的褐藻糖胶溶液进行纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是200Da，并控制温度在35℃以下，采用目的分子量褐藻糖胶溶液体积2倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的褐藻糖胶溶液稀释，并再次纳滤浓缩达到脱盐目的；

（6）乙醇沉淀，向步骤（5）中所得目的分子量褐藻糖胶浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀褐藻糖胶，乙醇体积分数为75%（v/v），沉淀60min，5000g离心10min后，得沉淀再采用体积分数为85%（v/v）乙醇溶液洗涤两次，5000g离心10min后所得沉淀即为目标褐藻糖胶产物；

（7）通风加热干燥，将步骤（6）中所得沉淀75℃通风干燥，即获得了目的分子量褐藻糖胶产品，该产品的纯度为 98.5%，产品收率为90%，分子量为 6500±350 Da。

2.采用权利要求1所述的方法制备得到的褐藻糖胶产品。

3.权利要求2所述的褐藻糖胶产品在制备具有降低高血脂功效的药物或食品中的应用。

4.一种组合物，其特征是：其由权利要求2所述的褐藻糖胶产品和药学上或食品学上可接受的或药学上赋形剂组成。