CN106905442A - 一种用于提高肝炎患者免疫力的小分子β‑1,3‑葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高肝炎患者免疫力的小分子β‑1,3‑葡聚糖制备方法，其技术方案为：(1)以不溶性大分子微生物多糖β‑1,3‑葡聚糖可得然胶为原料，将其碱溶后进行微波强化溶解，然后进行超声降解得到β‑1,3‑葡聚糖降解液；(2)将β‑1,3‑葡聚糖降解液中和后进行凝胶色谱分级纯化，得完全水溶性的小分子β‑1,3‑葡聚糖溶液；(3)采用膜处理所得目的小分子β‑1,3‑葡聚糖溶液，脱盐并浓缩，用水洗涤β‑1,3‑葡聚糖浓缩液脱盐；(4)醇沉脱盐浓缩后的β‑1,3‑葡聚糖溶液，并洗涤，干燥后得到低分子量β‑1,3‑葡聚糖产品。它解决了现有技术中低分子量β‑1,3‑葡聚糖制备工艺中无法同时实现高纯度和高收率的问题，同时具有高收率和高纯度效果。

Description

一种用于提高肝炎患者免疫力的小分子β-1,3-葡聚糖的制备 方法

技术领域

本发明涉及一种用于提高肝炎患者免疫力的小分子β-1,3-葡聚糖制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

肝炎是肝脏炎症的统称，通常是指由多种致病因素如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物、酒精、自身免疫等因素使肝脏细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，表现为肝功能指标的异常，并引起身体一系列不适症状。提高自身免疫力可以减缓肝炎病情的进展，从而有效减免病情恶化为肝硬化甚至肝癌。

目前提高肝炎患者免疫力的药物主要有胸腺肽、胸腺五肽等。胸腺肽有效成分不明确，含量低、含致敏大分子蛋白，不符合WHO对免疫调节剂的五项标准，因而疗效低、安全性差，不良反应尤其是严重过敏反应频繁发生。虽然胸腺五肽的效果比较优异，但是其合成的方法相对复杂，价格昂贵。

β-1,3葡聚糖是一类以β-1,3糖苷键连接的具有多种生物活性的葡萄糖聚合物。大量研究表明，β-1,3-葡聚糖具有特殊的生物活性：其能够活化巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等，能够提高白细胞介素、干扰素及肿瘤坏死因子α的含量，全面刺激机体的免疫系统，从而提高机体的免疫力。β-1,3-葡聚糖能使受伤机体的淋巴细胞产生细胞因子IL-1的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能，还能够促进体内IgM抗体的产生，提高体液免疫能力。β-1,3-葡聚糖能够有效激活机体非特异性防御机制，故应用在肿瘤、感染病和治疗创伤方面深受瞩目，近几年研究发现，β-1,3-葡聚糖在治疗肿瘤、心血管、糖尿病等病症以及降血脂、抗衰老方面效果显著。

目前市场上的β-1,3-葡聚糖产品几乎都是从酵母细胞中提取，而酵母细胞中葡聚糖含量低，且主要集中在细胞壁中，提取过程相当繁琐，产品纯度又低，生产成本极高。因此，医学领域亟需一种高活性、高纯度、低成本的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，以期能够显著提高患者的自身免疫力。利用微生物代谢生产的可得然胶是一种水不溶性大分子β-1,3-葡聚糖，已被卫生部公告为一种可以在食品中添加的添加剂。天然的大分子可得然胶虽然由β-1,3-葡聚糖组成，但由于其不溶于水，导致其不具有显著的生物活性，但其水溶性衍生物(如硫酸酯化物等)、小分子量可得然胶或可得然胶寡糖则具有非常显著的生物活性，能够显著提高机体免疫力，特别是对于提高肝炎患者的免疫力具有较好的效果。因此通过降解可得然胶获得小分子β-1,3-葡聚糖，并将其用于提高患者特别是肝炎患者的免疫力具有重要的意义。

专利《一种用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖》采用了一系列的物理方法对可得然胶进行处理，但所采用的高压均质技术效率低、能耗高，得到的目标产品小分子β-1,3-葡聚糖的产品收率较低，仅为60～70％，并且得到的目标产物分子量均一性也较低。

综上所述，利用现有技术制备小分子β-1,3-葡聚糖存在纯度低、收率低，以及产品质量不稳定的问题，需要一种高效的小分子β-1,3-葡聚糖纯化方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的β-1,3-葡聚糖纯度低和提取收率低的不足，本发明提供了一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，通过该方法不仅能够获得质量稳定的小分子β-1,3-葡聚糖，还能显著提高其收率。

一种高纯度小分子β-1,3-葡聚糖产品的制备方法，包括以下步骤：

(1)以不溶性大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶为原料，将其碱溶后进行微波加热，然后利用超声波降解β-1,3-葡聚糖溶液；

其中，所述微波加热的工艺参数为：微波频率900～2000MHz，处理2～5次，间隔3～5min，每次25～45s；超声波降解的工艺参数为：超声波工作频率范围45～200KHz，处理时间为15～30min。

(2)将上述步骤(1)中β-1,3-葡聚糖溶液中和后进行凝胶色谱分级纯化，获得水溶性小分子β-1,3-葡聚糖溶液，分离得到的大分子β-1,3-葡聚糖溶液回到步骤(1)再次降解；

(3)利用纳滤膜过滤步骤(2)所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，浓缩脱盐；

(4)乙醇沉淀，向步骤(3)中所得浓缩液中加入1～3倍体积的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，过滤或离心得沉淀后再用1～3倍体积的乙醇洗涤两次，再次通过过滤或离心得到的沉淀即为目标产物；

(5)将步骤(4)中所得沉淀干燥，干燥条件为60～80℃，时间2～4h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。

本发明中，所述高纯度是指小分子β-1,3-葡聚糖的纯度大于等于90％，优选的为等于95.0％。

本发明中，所述高收率是指所述产品中的小分子量β-1,3-葡聚糖的收率大于等于90％。

步骤(1)中，为了能够高效的获取小分子β-1,3-葡聚糖，本发明所选原料的纯度为85％以上。

所述碱溶的具体步骤为：向β-1,3-葡聚糖可得然胶原料中加入碱溶液，使可得然胶终浓度为1.0～1.5％(w/v)，OH^-终浓度为0.1～0.5mol/L。优选的碱是NaOH或KOH。

加入碱对β-1,3-葡聚糖可得然胶原料进行物理稀释和溶解，使可得然胶溶解于碱溶液中，原理是在一定pH范围下，破坏了可得然胶大分子之间的氢键，破坏可得然胶分子所形成的三螺旋稳定结构，从而使可得然胶溶解，而选择OH^-浓度的原则是：在溶解良好且溶液粘度不高的同时保证所得产品具有较好的质量。经过试验验证，本发明选择OH^-浓度为0.1～0.5mol/L，可得然胶浓度为1.0～1.5％(w/v)，确保了产品的高纯度和高收率。

优选的，所述微波加热的工艺参数为：微波频率为950～1800MHz，处理2～3次，间隔3～5min，每次15～30s。

在提高产品纯度和收率上，同时便于β-1,3-葡聚糖降解，本发明采用了微波加热溶解，一方面，微波辐射能穿透稀释碱溶后的可得然胶溶液，达到物料内部，使其内部温度迅速上升，快速提高物质在介质中的溶解度，从而有利于提纯可得然胶；另一方面，微波能够透射到生物组织内部使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，加之在碱溶液的作用下，能够降解破坏溶液中的杂蛋白，使其降解为小分子多肽，以便有利于后续醇沉的操作，在醇沉过程中，小分子多肽不会被絮凝沉淀。从产品纯度和收率的效果来讲，本发明选取了合适的微波加热参数：微波频率为900～2000MHz，处理2～5次，间隔3～5min，每次15～30s。优选的，微波频率为950～1800MHz，处理2～3次，间隔3～5min，每次15～30s。

本发明中，在采用碱溶微波加热后，为了使大分子β-1,3-葡聚糖降解为较为均一的小分子量目标产物，采用了超声波作用降解的处理方法，超声波的空化作用会产生局部高温、高压或强冲击波和微射流，当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈震动，会在液体内部产生小空洞，这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的撞击作用，微粒间的这种剧烈的相互作用，会弱化高分子量的β-1,3-葡聚糖内部之间的化学键，进一步使化学键断裂，从而降低了大分子β-1,3-葡聚糖分子量。本发明发现可得然胶碱溶液经过超声波作用，能够有效的降解β-1,3-葡聚糖的分子量，并且分子量的分布较为均一，分子量变化范围在500Da以内。

为有效降低β-1,3-葡聚糖的分子量并使其目标产物的分子量较为均一，本发明优化了超声波降解的条件，超声波频率范围是45～200KHz，处理时间为15～30min。

步骤(2)中，将β-1,3-葡聚糖降解液中和后便于凝胶色谱分级纯化，在不降解可得然胶之前，若是中和可得然胶的碱溶液，会形成中和凝胶，但是降解之后，并不形成凝胶，便于后续的分级纯化。根据β-1,3-葡聚糖的理化性质，优选的，分级纯化体系为葡聚糖凝胶色谱分级体系；优选的，采用水作为流动相，进行洗脱，获得不同的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并将大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回超声波降解步骤重复降解3～5次；进一步优选的，流动相流速范围是0.025-0.200m/h。

步骤(3)中，将步骤(2)中获得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液进行纳滤浓缩并脱盐，优选的，纳滤膜截留分子量范围是150～500Da，并控制温度在35℃以下；优选的，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的β-1,3-葡聚糖溶液稀释后再浓缩，达到脱盐的目的，控制过程温度在35℃以下。

步骤(4)中，向步骤(3)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖浓缩液中加入乙醇溶液，沉淀β-1,3-葡聚糖。

优选的，乙醇溶液的体积分数为75～85％(v/v)，沉淀30～60min，5000～8000g离心5-15min后，得沉淀再采用体积分数为85～95％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，5000～8000g离心5-10min后所得沉淀即为目标小分子β-1,3-葡聚糖。

采用75～85％(v/v)的乙醇溶液进行醇沉，既可以将小分子量的β-1,3-葡聚糖沉淀出来，又可以使杂质溶解在乙醇液相中，从而提高产品的纯度和收率。

步骤(5)中将步骤(4)获得的沉淀干燥，即获得目的小分子量的β-1,3-葡聚糖产品。

为了克服现有技术中小分子量β-1,3-葡聚糖的品质较低，例如，产品的纯度较低、产品的均一度不高，本发明提供了一种采用上述方法制备得到的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖产品，其是由大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶降解并分级纯化制得，属于完全水溶性β-葡聚糖，所述β-1,3-葡聚糖的平均分子量为8000～12000Da，其分子均一度高，分子量变化范围在500Da以内。

为了克服现有技术中小分子量β-1,3-葡聚糖的活性较低的问题，本发明还提供了上述β-1,3-葡聚糖产品在制备具有提高生物体免疫活性、抗炎活性或抗肿瘤活性功效的药物或食品中的应用，其具有显著生理活性特别是在提高生物体免疫活性、抗炎活性、抗肿瘤活性方面具有非常显著的效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种能够获得高品质β-葡聚糖产品的制备技术，对于提高β-葡聚糖的品质具有显著作用。

(2)通过本发明一系列的物理方法处理(碱溶无化学反应属于物理溶解过程)，建立了一条稳定高效的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖制备工艺，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，所得目标产品小分子β-1,3-葡聚糖纯度高达95％以上。

(3)由于采用了碱溶微波加热以及超声波降解技术手段，目标产品小分子β-1,3-葡聚糖产品对于原料大分子β-1,3-葡聚糖的收率高达到90％以上，显著提高了小分子β-1,3-葡聚糖的产率。

(4)本发明的方法步骤不引入化学或有害其他杂质，确保所得产品的生物安全。

(5)由于采用了超声波降解和后续的凝胶色谱分级纯化技术手段，本发明得到的目标产物为均一小分子β-1,3-葡聚糖，属于完全水溶性β-葡聚糖，具有显著生理活性特别是提高生物体免疫活性、抗炎活性、抗肿瘤活性具有非常显著的效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤和/或它们的组合。

本发明中，产品收率(％)＝本发明目的分子量β-1,3-葡聚糖产品的质量/原料中β-1,3-葡聚糖可得然胶的质量×100％。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在可溶性小分子β-1,3-葡聚糖收率较低以及得到的目标产物分子量均一性不足的问题，为解决如上的技术问题，本发明提出了一种高纯度高收率小分子量可溶性β-1,3-葡聚糖产品的制备方法，包括以下方法：

工序一：以不溶性大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶为原料，将其碱溶后进行微波加热，然后进行超声降解得到β-1,3-葡聚糖降解液；

其中，为了能够高效的获取小分子β-1,3-葡聚糖，本发明所选原料的纯度为85％以上。

所述碱溶的具体步骤为：向β-1,3-葡聚糖可得然胶原料中加入NaOH或KOH碱溶液，使得可得然胶终浓度为1.0～1.5％(w/v)，碱终浓度为0.1～0.5mol/L。加入碱对可得然胶原料进行物理稀释和溶解，使得可得然胶溶解于碱溶液中，降低原理是在一定pH范围下，破坏了可得然胶大分子之间的氢键。

在提高产品纯度和收率上，本发明采用了微波加热，一方面，微波辐射能穿透稀释碱溶后的可得然胶溶液，达到物料内部，物料吸收微波能，内部温度迅速上升，增大被分离物质在介质中的溶解度，从而有利于提纯可得然胶；另一方面，微波能够透射到生物组织内部使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，加之碱溶液的作用下，能够降解破坏溶液中的杂蛋白，使其降解为小分子多肽，以更有利于后续醇沉的操作，在醇沉过程中，小分子多肽不会被絮凝沉淀。从产品纯度和收率的效果来讲，本发明选取了间歇式微波强化溶解工艺参数：微波频率为950～1800MHz，处理2～3次，间隔3～5min，每次15～30s。采用间歇式的微波强化加热方法，不仅能够提高可得然胶的溶解效率，便于β-1,3-葡聚糖降解，而且能够最大限度保持β-1,3-葡聚糖分子的理化性质，同时降低能耗。在提高目标产物的纯度和收率的效果上，该技术手段也为本发明的关键技术之一。

在碱溶和微波强化溶解的基础上，本发明采用了超声波降解技术，采用此技术的原因是：一是能够有效降低β-1,3-葡聚糖的分子量，二是通过控制超声波的工艺条件，能够使β-1,3-葡聚糖的分子均一降解。经过优化，采用的超声波频率范围是45～200KHz，处理时间为15～30min。该技术手段也是本发明的关键技术之一。

工序二：将β-1,3-葡聚糖降解液中和后进行凝胶色谱分级纯化，得完全水溶性的β-1,3-葡聚糖溶液；

通过进一步的凝胶色谱分级纯化，能够得到特定分子量的目标产物，并进一步使得其产品的分子量范围更加均一。为达到此目的，优选葡聚糖凝胶色谱分级体系，采用蒸馏水作为流动相，流动相流速范围是0.025-0.200m/h，洗脱后，获得不同的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并将大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回超声波降解步骤重复降解，一般采用以上工艺参数后，重复降解的次数为3～5次。该技术手段也是本发明的关键技术之一。

工序三：采用膜处理所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，浓缩脱盐；

该工序中，采用纳滤膜过滤浓缩所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，该纳滤膜截留分子量范围是150～500Da，并控制温度在35℃以下；并采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的β-1,3-葡聚糖溶液稀释后再浓缩，达到脱盐的目的。纳滤膜过滤不仅能够起到脱盐的效果，还能起到脱除小分子单糖的作用，进一步去除了产品的杂质，提高了产品的纯度。

工序四：乙醇沉淀脱盐浓缩后的β-1,3-葡聚糖溶液；

工序五：60～80℃干燥沉淀后的小分子量β-1,3-葡聚糖并获得成品。

醇沉的目的主要是能够沉淀目标分子量的β-1,3-葡聚糖，同时进一步去除杂质，醇沉处理中使用的乙醇的体积分数和沉淀时间对于提纯的效果有重要的影响，若是乙醇的体积分数不合适，会沉淀出非目标产物。本发明经过工艺参数优化，当乙醇溶液的体积分数为75～85％(v/v)、沉淀30～60min时，获得的小分子β-1,3-葡聚糖的纯度较高。

本发明通过控制一系列的物理工序步骤和工艺参数，得到了较高品质的β-1,3-葡聚糖，所述β-1,3-葡聚糖的平均分子量为8000～12000Da，由于具有较低的分子量且水溶性较好，具有显著的生物活性。这种小分子量和均一度较高的β-1,3-葡聚糖产品，用于提高生物体免疫活性、抗炎活性、抗肿瘤活性，特别是对于提高肝炎患者免疫力具有非常显著的效果。

以下通过具体实施例进行描述：

实施例1

一种高效的高纯度小分子β-1,3-葡聚糖产品的具体制取工艺步骤内容如下：

(1)原料：大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶产品，纯度87％；

(2)碱溶：可得然胶终浓度1.0％(w/v)，NaOH的终浓度为0.2mol/L；

(3)微波加热：微波频率在950MHz，处理3次，间隔5min，每次25s；

(4)超声波降解，将步骤(3)中完全溶解的β-1,3-葡聚糖溶液进行超声波处理，以降低大分子β-1,3-葡聚糖的分子量，超声波频率是60KHz，处理时间为25min；

(5)将步骤(4)获得小分子β-1,3-葡聚糖采用葡聚糖凝胶色谱分级体系分级，采用蒸馏水作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.1m/h，获得不同分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并将大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回步骤(4)进行重复降解三次；

(6)纳滤浓缩脱盐：将步骤(5)中获得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是200Da，控制温度在35℃以下，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖3倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的小分子β-1,3-葡聚糖溶液稀释再纳滤浓缩脱盐，并控制温度在35℃以下；

(7)乙醇沉淀：向步骤(6)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀小分子β-1,3-葡聚糖，乙醇体积分数为80％(v/v)，沉淀30min，8000g离心10min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，8000g离心10min后所得沉淀即为目标小分子可溶性β-1,3-葡聚糖产物；

(8)干燥：将步骤(7)中所得65℃干燥，即获得了目的分子量β-1,3-葡聚糖。经检测，小分子β-1,3-葡聚糖的纯度为96.5％，产品收率为91％，平均分子量为9300Da，分子量变化范围在500Da以内。

实施例2

一种高效的高纯度小分子β-1,3-葡聚糖产品的具体制取工艺步骤内容如下：

(1)原料：大分子量β-1,3-葡聚糖可得然胶产品，纯度86％以上；

(2)碱溶：可得然胶终浓度1.2％(w/v)，KOH的终浓度为0.35mol/L；

(3)微波加热：微波频率在1200MHz，处理3次，间隔5min，每次20s；

(4)超声波降解：将步骤(3)中完全溶解的β-1,3-葡聚糖溶液进行超声波处理，以降低大分子β-1,3-葡聚糖的分子量，超声波频率是120KHz，处理时间为25min；

(5)将步骤(4)获得小分子β-1,3-葡聚糖采用葡聚糖凝胶色谱分级体系分级，采用蒸馏水作为流动相，进行洗脱，流动相流速为0.15m/h，获得不同分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并将大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回步骤(4)进行重复降解三次；

(6)纳滤浓缩脱盐：将步骤(5)中获得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液纳滤浓缩并脱盐，纳滤膜截留分子量范围是400Da，并控制温度在35℃以下，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液3倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩液稀释再纳滤浓缩脱盐，并控制温度在35℃以下；

(7)乙醇沉淀：向步骤(6)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀小分子β-1,3-葡聚糖，乙醇体积分数为85％(v/v)，沉淀30min，6000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为92％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，6000g离心10min后所得沉淀即为目标小分子β-1,3-葡聚糖产物；

(8)干燥：将步骤(7)中所得沉淀干燥，干燥条件为72℃，干燥3h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。经检测，小分子β-1,3-葡聚糖的纯度为97.8％，产品收率为93％，重均分子量为10500Da，分子量变化范围在500Da以内。

实施例3

取实施例1中制备得到的β-1,3-葡聚糖，辅料为药用淀粉、糊精和质量分数为50％的乙醇，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成片状，便于患者服用。

实施例4

取实施例2中制备得到的β-1,3-葡聚糖，辅料为药用糊精，混合后装成胶囊，便于患者服用。

实施例5

无菌条件下取实施例1中制备得到的β-1,3-葡聚糖，加入纯净水溶解后，分装灭菌，制得口服液，便于患者服用。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1)通过本发明一系列的物理方法处理(碱溶无化学反应属于物理溶解过程)，建立了一条稳定高效的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖制备工艺，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，所得目标产品小分子可溶性β-1,3-葡聚糖纯度高达95％以上。

2)由于本发明采用了碱溶微波加热以及超声波降解技术手段，使得小分子β-1,3-葡聚糖的收率较高。

3)由于采用了超声波降解和后续的凝胶色谱分级纯化技术手段，本发明得到的目标产物为均一小分子β-1,3-葡聚糖。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高纯度小分子β-1,3-葡聚糖产品的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)以不溶性大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶为原料，将其碱溶后进行微波加热，然后利用超声波降解β-1,3-葡聚糖溶液；

其中，所述微波加热的工艺参数为：微波频率900～2000MHz，处理2～5次，间隔3～5min，每次25～45s；超声波降解的工艺参数为：超声波工作频率范围45～200KHz，处理时间为15～30min。

(2)将上述步骤(1)中β-1,3-葡聚糖溶液中和后进行凝胶色谱分级纯化，获得水溶性小分子β-1,3-葡聚糖溶液，分离得到的大分子β-1,3-葡聚糖溶液回到步骤(1)再次降解；

(3)利用纳滤膜过滤步骤(2)所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，浓缩脱盐；

(4)乙醇沉淀，向步骤(3)中所得浓缩液中加入1～3倍体积的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，过滤或离心得沉淀后再用1～3倍体积的乙醇洗涤两次，再次通过过滤或离心得到的沉淀即为目标产物；

(5)将步骤(4)中所得沉淀干燥，干燥条件为60～80℃，时间2～4h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所选原料的纯度为85％以上；

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，微波频率为950～1800MHz，处理2～3次，间隔3～5min，每次15～30s。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，分级纯化体系为葡聚糖凝胶色谱分级体系，采用水作为流动相，进行洗脱，获得不同的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并将大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回超声波降解步骤重复降解。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是：流动相流速范围是0.025-0.200m/h。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(3)中，采用纳滤膜进行脱盐浓缩，纳滤膜截留分子量范围是150～500Da，并控制温度在35℃以下。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(3)中，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对纳滤浓缩的β-1,3-葡聚糖溶液稀释后再浓缩，达到脱盐的目的，控制过程温度在35℃以下。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(4)中，乙醇溶液的体积分数为75～85％(v/v)，沉淀30～60min，5000～8000g离心5-15min后，得沉淀再采用体积分数为85～95％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，5000～8000g离心5-10min后所得沉淀即为目标小分子β-1,3-葡聚糖。

9.采用权利要求1～8中任一项所述的方法制备得到的高纯度小分子β-1,3-葡聚糖产品，其特征是：所述β-1,3-葡聚糖的重均分子量为8000～12000Da，其分子均一度高，分子量变化范围在500Da以内。

10.权利要求9所述的β-1,3-葡聚糖产品在制备具有提高生物体免疫活性、抗炎活性或抗肿瘤活性功效的药物或食品中的应用。