CN105567762A - 一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法。该工艺流程特征在于利用微波辅助提取浒苔硫酸多糖，经脱脂及除蛋白和色素后，依次添加多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶和木聚糖酶进行酶解，灭酶活后，采用乙醇去除酶和未降解多糖，离心上清液过分子筛，截留物冷冻干燥后得到浒苔活性寡糖。经动物药效学证实，浒苔寡糖能够显著降低高血糖模型小鼠血糖值。本发明采用非特异性商业化酶，工艺路线简单，高效且环境友好，既提高了寡糖的制备量，同时又降低了酶的消耗和生产成本，是一种制备浒苔活性寡糖的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体关于一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷及（或）其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的全身代谢紊乱性疾病，其发病率逐年增加。浒苔多糖属于绿藻多糖，多为水溶性的硫酸多糖，主要是葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物具有降低胆固醇、降血糖和调节血脂等方面的作用。与多糖相比，寡糖具有易溶于水、无抗原性，以及在宿主体内具有较弱的积累效应等优点。目前研究主要集中在浒苔多糖方面，尚未见浒苔寡糖降血糖及其制成辅助治疗2型糖尿病保健品的报道。
寡糖在规模化应用上受到很大的限制，主要原因是对寡糖制备技术的研究尚不够深入。寡糖的酶法制备是利用特定的酶对多糖进行降解的方法，其反应条件温和，无其他副反应，产品均一性好。微波具有强大的穿透能力，细胞经微波处理会吸收能量，细胞内部的高温高压会使多糖内部糖苷键断裂，引起分子聚合度的改变，从而提高了糖类的产量。微波辅助分步酶解法制备浒苔寡糖，具有操作方便、提取时间短、效率高、无污染的优点。在目前所公开的海藻寡糖相关专利中，CN101891904B公开了海带寡糖在制备防治植物病害药物方面的应用；CN102827899B公开了一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与其在制备抗氧化、抗紫外线保健品和化妆品中的应用；CN100508985C公开了一种低分子量褐藻胶寡糖，虽然提到了其在糖尿病防治方面的应用，但该专利所述低分子量褐藻胶寡糖，是利用酸水解海藻酸钠所得。本发明中所述浒苔寡糖为利用分步酶解的绿色制备方法制得，具有不会发生副反应、条件温和、环境友好等优点。本发明中通过微波辅助分步酶解制备绿藻浒苔寡糖及其降血糖活性均未见其它研究报道或专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法。制备工艺路线简单合理，降低了酶的消耗和生产成本，提高了制备产量，是一种绿色高效制备浒苔活性寡糖的有效方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入60-80%乙醇回流提取1-2小时，干粉重量与乙醇体积比（g/mL）为1:20-30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末；
（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/mL）为1:25-30，60-70℃萃取温度下480-600W微波辅助提取2-3min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入3-4倍体积95%乙醇，4-10℃静置沉淀8-12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖；
（3）向步骤（2）所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏水体积比为1:10-20，进行搅拌复溶。用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白5-8次；
（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:30-50,于摇床中60-80r/min振荡1-2h，6000-8000rpm离心20-30min，收集上清液；
（5）利用截留分子量8000-14000以上规格透析袋，去除小分子、色素。截留液在50-60℃及转速为40-60r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸多糖粉末；
（6）将步骤（5）中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比（mg/mL）1:0.5-1.5，调节pH为6.5-8.0，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于32-40℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.5h后取出，沸水加热5-10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用；
（7）将步骤（6）离心所得上清液调节pH为5.0-6.5，加入á-L-鼠李糖苷酶后置于35-50℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解1-1.2h后取出，沸水加热5-10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用；
（8）将步骤（7）离心所得上清液调节pH为4.5-6.0，加入木聚糖酶后置于50-60℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1h后取出，沸水加热10-15min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。至室温，离心取上清液备用；
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:3-4的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，4-10℃静置沉淀4-6h后，离心收集上清，即为浒苔寡糖粗品溶液；
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，4-10℃静置沉淀1.5-2.5h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用；
（10）向步骤（9）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2-3的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，4-10℃静置沉淀8-10h后，离心收集上清，在37-40℃及转速为60-80r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5-1/4；即为浒苔寡糖粗品溶液；
（11）将步骤（10）中浒苔寡糖粗品溶液，采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液；
（12）将步骤（11）中溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到浒苔活性寡糖。
（13）所述多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤（6）中精浒苔硫酸多糖粉末的质量比分别为1:10-15、1:15-25、1:20-40。
本发明的优点在于：目前研究主要集中在浒苔多糖，尚未见浒苔寡糖降血糖及其制成辅助治疗2型糖尿病保健品的报道。本发明采用微波辅助，依次利用多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶分步酶解浒苔硫酸多糖，能较充分酶切浒苔多糖复杂键合结构，大幅提高酶解效率并降低酶用量，具有操作方便、效率高、无污染的优点。
具体实施方式
实施例1
（1）将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入60%乙醇回流提取1小时，干粉重量与乙醇体积比（g/mL）为1:20，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末；
（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/mL）为1:25，60-70℃萃取温度下480W微波辅助提取2min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入3倍体积95%乙醇，4℃静置沉淀8小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖。
（3）向步骤（2）所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏水体积比（mg/mL）为1:0.8，进行搅拌复溶。用三氯乙酸法除蛋白5次。
（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:30，于摇床中60r/min振荡1h，6000rpm离心20min，收集上清液。
（5）利用截留分子量8000以上规格透析袋，去除小分子及色素。截留液在50℃及转速为40r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸多糖粉末。
（6）将步骤（5）中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比1:10，调节pH为6.5，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于32℃，速度为65r/min水浴摇床中酶解0.5h后取出，沸水加热5min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（7）将步骤（6）离心所得上清液调节pH为5.0，加入á-L-鼠李糖苷酶后置于35℃，速度为65r/min水浴摇床中酶解1h后取出，沸水加热5min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（8）将步骤（7）离心所得上清液调节pH为4.5，加入木聚糖酶后置于50℃，速度为65r/min水浴摇床中酶解0.5h后取出，沸水加热10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。至室温，离心取上清液备用。
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，4℃静置沉淀1.5h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用。
（10）向步骤（9）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，4℃静置沉淀8h后，离心收集上清，在37℃及转速为60r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5，即为浒苔寡糖粗品溶液。
（11）将步骤（10）中浒苔寡糖粗品溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液。
（12）将步骤（11）中透析液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到浒苔活性寡糖。
（13）所述多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤（6）中精浒苔硫酸多糖粉末的质量比分别为1:10、1:15、1:20。
实施例2
（1）将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入80%乙醇回流提取2小时，干粉重量与乙醇体积比（g/mL）为1:30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末；
（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/mL）为1:30，70℃萃取温度下600W微波辅助提取3min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入4倍体积95%乙醇，10℃静置沉淀12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖。
（3）向步骤（2）所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏水体积比（mg/mL）为1:1，进行搅拌复溶。用三氟三氯乙烷法除蛋白8次。
（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:50，于摇床中70r/min振荡2h，7000rpm离心22min，收集上清液。
（5）利用截留分子量14000以上规格透析袋，去除小分子及色素。截留液在60℃及转速为50r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸多糖粉末。
（6）将步骤（5）中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比1:25，调节pH为8.0，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于40℃，速度为90r/min水浴摇床中酶解1.5h后取出，沸水加热10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（7）将步骤（6）离心所得上清液调节pH为6.5，加入á-L-鼠李糖苷酶后置于50℃，速度为90r/min水浴摇床中酶解1.2h后取出，沸水加热10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（8）将步骤（7）离心所得上清液调节pH为6.0，加入木聚糖酶后置于60℃，速度为90r/min水浴摇床中酶解1h后取出，沸水加热15min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。至室温，离心取上清液备用。
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，10℃静置沉淀2.5h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用。
（10）向步骤（9）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:3的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，10℃静置沉淀9h后，离心收集上清，在39℃及转速为70r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/4，即为浒苔寡糖粗品溶液。
（11）将步骤（10）中浒苔寡糖粗品溶液，采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液。
（12）将步骤（11）中透析液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到浒苔活性寡糖。
（13）所述多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤（6）中精浒苔硫酸多糖粉末的质量比分别为1:15、1:25、1:40。
实施例3
（1）将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入50%乙醇回流提取1.5小时，干粉重量与乙醇体积比（g/mL）为1:25，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末；
（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/mL）为1:28，65℃萃取温度下520W微波辅助提取2min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入4倍体积95%乙醇，8℃静置沉淀10小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖。
（3）向步骤（2）所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏水体积比（mg/mL）为1:1.5，进行搅拌复溶。用三氯乙酸法除蛋白6次。
（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:40，于摇床中80r/min振荡1.5h，7800rpm离心28min，收集上清液。
（5）利用截留分子量8000-14000以上规格透析袋，去除小分子及色素。截留液在55℃及转速为30r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸多糖粉末。
（6）将步骤（5）中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比1:20，调节pH为7.5，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于36℃，速度为80r/min水浴摇床中酶解1h后取出，沸水加热7min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（7）将步骤（6）离心所得上清液调节pH为6，加入á-L-鼠李糖苷酶后置于45℃，速度为80r/min水浴摇床中酶解1.1h后取出，沸水加热7min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
（8）将步骤（7）离心所得上清液调节pH为5.0，加入木聚糖酶后置于55℃，速度为80r/min水浴摇床中酶解1h后取出，沸水加热15min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。至室温，离心取上清液备用。
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，6℃静置沉淀2h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用。
（10）向步骤（9）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2.5的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，6℃静置沉淀10h后，离心收集上清，在40℃及转速为80r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/4，即为浒苔寡糖粗品溶液。
（11）将步骤（10）中浒苔寡糖粗品溶液，采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液。
（12）将步骤（11）中透析液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到浒苔活性寡糖。
（13）所述多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤（6）中精浒苔硫酸多糖粉末的质量比分别为1:12、1:20、1:30。
实施例4四氧嘧啶高血糖模型小鼠降血糖试验
用健康成年雄性ICR小鼠建立高血糖模型。造模前随机取10只小鼠禁食3h测血糖，作为基础血糖。小鼠禁食24h（自由饮水）后，尾静脉注射四氧嘧啶75mg/kg，7天后禁食3h筛选血糖值大于10mmol/L的小鼠20只，按血糖水平随机分为1个高血糖模型对照组和1个寡糖组，每组10只，寡糖组给予150mg/kg的受试物，高血糖模型对照组给予蒸馏水，连续灌胃4周，测空腹血糖值（禁食同试验前），比较各组动物血糖值，观察浒苔寡糖对四氧嘧啶高血糖模型小鼠空腹血糖的影响。
表1本发明功能性浒苔寡糖对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响
本发明寡糖对四氧嘧啶高血糖模型小鼠空腹血糖的影响：造模前随机取10只动物测空腹血糖为5.6±0.4mmol/L，由表1可见，造模后各组动物空腹血糖明显升高，与造模前比较差异有显著性（p＜0.01），说明造模成功。给予150mg/kg的寡糖组能降低血糖值，特别是本发明寡糖28天后，寡糖组小鼠空腹血糖显著低于模型组（p＜0.01），说明浒苔活性寡糖对四氧嘧啶高血糖模型小鼠有显著降低空腹血糖值作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入60-80%乙醇回流提取1-2小时，干粉重量g与乙醇体积mL比为1:20-30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末；
（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量g与蒸馏水mL体积比为1:25-30，60-70℃萃取温度下480-600W微波辅助提取2-3min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入3-4倍体积95%乙醇，4-10℃静置沉淀8-12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖；
（3）向步骤（2）所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量mg与蒸馏水mL体积比为1:0.5-1.5，进行搅拌复溶；用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白5-8次；
（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量g与洗脱液mL按重量体积比1:30-50，于摇床中60-80r/min下振荡1-2h，6000-8000rpm离心20-30min，收集上清液；
（5）利用截留分子量8000-14000以上透析袋，去除小分子及色素；截留液在50-60℃及转速为40-60r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸多糖粉末；
（6）将步骤（5）中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比1:10-25，调节pH为6.5-8.0，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于32-40℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.5h后取出，沸水加热5-10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用；
（7）将步骤（6）离心所得上清液调节pH为5.0-6.5，加入α-L-鼠李糖苷酶后置于35-50℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解1-1.2h后取出，沸水加热5-10min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用；
（8）将步骤（7）离心所得上清液调节pH为4.5-6.0，加入木聚糖酶后置于50-60℃，速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1h后取出，沸水加热10-15min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用，至室温，离心取上清液备用；
（9）向步骤（8）中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，4-10℃静置沉淀1.5-2.5h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用；
（10）向步骤（9）中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2-3的95%乙醇沉降除去反应液中未降解多糖，4-10℃静置沉淀8-10h后，离心收集上清，在37-40℃及转速为60-80r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5-1/4，即为浒苔寡糖粗品溶液；
（11）将步骤（10）中浒苔寡糖粗品溶液，采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液；
（12）将步骤（11）中透析液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到浒苔活性寡糖。
2.根据权利要求1所述的一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖制备方法，其特征在于：所述多聚半乳糖醛酸酶、α-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤（6）中精浒苔硫酸多糖粉末的质量比分别为1:10-15、1:15-25、1:20-40。
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