CN115991796B - 一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法，该低分子量海带多糖是以海带为原料，通过超微粉碎制海带粉，经超声辅助热提取、超滤、浓缩和乙醇分级沉淀、酶解法、酸解法降解而得到的多种低分子量海带多糖的混合物，所述低分子量海带多糖的分子量为1‑15 kDa，固态粉末呈白色，其提取分离方法绿色健康，得到低分子量的多糖在降血糖方面具有一定的功效，可作为一种良好的降血糖产品。
Description
技术领域
本发明属于海带精深加工技术领域，具体涉及一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法。
背景技术
海带(Laminariajaponica aresch)，又名昆布、海草、江白菜，属褐藻门、褐藻纲、海带目、海带科、海带属，是一种药食两用的大型海洋植物。海带作为我国重要的经济藻类，营养价值丰富，如蛋白质、氨基酸、纤维素、维生素和碘、铁、锌等60多种营养成分都存在于海带组织中。据研究，海带中含量丰富的碘，80％都是可被人体直接吸收利用的有机活性碘，经常食用海带有促进智力发育、预防和治疗甲状腺肿、降血压、降血脂等功效。海带多糖是一种从海带中提取出的天然有效植物多糖，拥有独特的硫酸化结构及多种生物活性。研究发现，多糖分子量和生物活性之间有很强的相关性。由于其巨大的分子量和不能积极参与复杂的细胞代谢过程，多糖一直受到限制。多糖的分子量越大，就越不利于多糖在生物体内发挥生物活性；降低分子量有时可以提高多糖的溶解性，从而增强其生物活性。目前，低分子量海带多糖的制备方法可分为物理法、化学法、生物酶解法，生物酶解法条件温和且分子量较易控制，但酶制剂价格昂贵且不易获得。
在本发明中，开发的一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法。其制备的低分子量海带多糖还具有一定的降血糖功效，通过辅助摄入功能性的食品及中药可以提高糖尿病治疗效果，甚至能减少药物的服用量。天然功能性食品及中药资源丰富、毒副作用小、食用简单，容易被人们所接受，是自我调理、日常保健和辅助治疗的最佳手段，对糖尿病防治具有很大的作用。本发明获得的海带精深加工制品，为海带资源的充分利用提供新思路。
发明内容
本发明目的在于提供一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以海带为原料，通过超微粉碎制备海带粉；
(2)称取一定量干燥海带粉，按照1:20-60g/ml的料液比加入40-80℃热水进行水提，同时采用超声进行辅助提取，超声机参数设置为70kHz、100W并保持温度恒定，超声辅助提取30-120min，离心取上清液，料渣再按1:20-60g/ml的料液比，超声辅助提取30-120min，重复提取1-4次，最后将所有提取液进行混合离心取上清；
(3)对上清进行抽滤，进一步除去细微杂质，经过滤膜过滤的上清置于旋转蒸发仪中进行浓缩旋蒸，旋蒸浓缩到初始体积的1/5，加乙醇至乙醇终浓度达到70％-85％(v/v)，4℃醇沉8-24h；
(4)过滤离心收集沉淀，进行冻干备用，此为粗多糖；
(5)称取粗多糖适量，按照料液比1:80-120g/ml的比例加水于50-80℃水浴锅中加热溶解30-120min，同时搅拌助溶直至全部溶解；溶解后加中性蛋白酶酶解1-5h，然后在90-100℃下进行10-20min的灭酶活处理，其后，离心除去蛋白，置于8-15kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜中过滤2-72h，得多糖溶液；
(6)将上述多糖溶液加入浓硫酸，每1L多糖溶液加2.7ml浓硫酸，于100-120℃下水浴酸解1-2.5h，离心；而后加1.0mol/LNaOH溶液调节为中性再浓缩，利用1-15kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜进行分级，收集分级后的多糖液体进行浓缩，最后冻干，分别获得不同分子量的低分子量海带多糖。
进一步的，所述海带粉为60-400目；
进一步的，步骤(2)中提取方式为热水辅助超声提取，同时可以扩展至大型超声提取罐中进行大量提取；
进一步的，步骤(2)中提取过程为重复多次提取，将海带多糖进行充分提取；
进一步的，步骤(3)中乙醇浓度达到70％-85％(v/v)4℃醇沉8-24h；
进一步的，步骤(4)中的粗多糖用冻干机进行冻干，保证了粗多糖的品质；
进一步的，步骤(5)中加中性蛋白酶进行酶解后再置于8-15kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜中过滤2-72h去蛋白，是一种安全绿色的去蛋白方式；
进一步的，步骤(5)中，中性蛋白酶加入的终浓度为0.1-2wt％；
进一步的，步骤(6)用浓H2SO4降解粗多糖，保证多糖降解更加充分；
进一步的，步骤(6)利用1-15kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜对酸解物进行分级，更加灵活选取不同分子量的低分子海带多糖。
进一步的，步骤(6)也可以利用大型超滤设备对酸解物进行分级，更加大批量提取不同分子量的低分子海带多糖从而进行工业化生产。
进一步的，所述低分子量海带多糖的分子量为1-15kDa，固态粉末呈白色。
通过发明获得具有降血糖低分子量海带多糖的海带精深加工制品，且后续处理工艺简易，为海带资源的充分利用提供新思路。
与现有技术相比，本发明的显著优点在于：
本发明开发的一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法。其制备的低分子量海带多糖还具有一定的降血糖功效，通过辅助摄入功能性的食品及中药可以提高糖尿病治疗效果，甚至能减少药物的服用量。天然功能性食品及中药资源丰富、毒副作用小、食用简单，容易被人们所接受，是自我调理、日常保健和辅助治疗的最佳手段，对糖尿病防治具有很大的作用。本发明获得的海带精深加工制品，为海带资源的充分利用提供新思路。
附图说明
图1为低分子多糖进行成分分析(A)和结构表征(B)图；
图2为不同组小鼠各体重参数的影响；
图3为不同组小鼠各血糖参数(FBG)的影响。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹列举以下实施例，详细说明如下。
实施例1
所述方法步骤如下：
(1)以海带为原料，通过超微粉碎制海带粉；
(2)称取100g干燥海带粉，按照1:40g/ml的料液比加入60℃热水进行水提，同时采用超声进行辅助提取，超声机参数设置为70kHz、100W并保持温度恒定，超声辅助提取30min,离心取上清液,料渣再加水3000ml,超声辅助提取30min,最后将所有提取液进行混合离心取上清液。
(3)对上清进行抽滤，进一步除去细微杂质。经过滤膜过滤的上清置于旋转蒸发仪中进行浓缩旋蒸，旋蒸浓缩到初始体积的1/5,加乙醇至终浓度达到80％(v/v)，4℃醇沉24h。
(4)过滤离心收集沉淀，进一步地将沉淀物离心收集进行冻干备用，此为粗多糖。
(5)称取备用粗多糖10g，按照料液比1:100g/ml的比例加水于60℃水浴锅加热，加快多糖溶解30min左右，再搅拌助溶直至全部溶解。溶解后加中性蛋白酶(常温放置)，终浓度约0.2wt％(混匀),酶解2h(水浴),酶解最适温度(55℃),然后100℃水浴10min,灭酶活。其后，离心除去蛋白，置于10kDa的透析袋中过滤48h。
(6)将上述多糖溶液加入浓硫酸，每1L多糖溶液加2.7ml浓硫酸，于100℃下水浴酸解1.5h，离心。而后加1.0mol/LNaOH溶液调节为中性再浓缩至100ml左右，利用15kDa透析袋透析，透析袋外面溶液(＜15kDa)旋蒸浓缩用10kDa透析袋继续透析24h后，里面溶液(10-15kDa)旋蒸浓缩，收集透析后的多糖液体进行旋蒸最后冻干，获得分子量大小为10-15kDa的低分子量海带多糖。
对提取得到的10-15kDa低分子多糖进行成分分析和结构表征结果如下：单糖组成中的蛋白质和硫酸根浓度分别为0.92％和1.92％。
单糖组成如图1中A所示：主要成分为岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖胺盐酸盐(GlcN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、古洛糖醛酸(GulA)和甘露糖醛酸(ManA)。摩尔组分的比例为0.238、0.018、0.026、0.372、0.074、0.062、0.037、0.016和0.158。红外结构表征如图1中B所示：3445.04cm-1处的强吸收峰描绘了组成糖残基中的O-H拉伸振动。2928.33cm-1处的吸收峰(在3000-2800cm-1的范围内)说明了糖残基的甲基或亚甲基C-H的拉伸振动。类似地，1631.22和1421.06cm-1处的吸收峰分别是由于去质子化羧基(COO-)和C-H键的拉伸振动。在1254.89cm-1处的吸收峰是从C-H拉伸振动获得的，这是寡糖的特征指纹。C-O-S拉伸振动在610.08cm-1处产生吸收峰。
应用例1
本发明应用例提供一种辅助降血糖低分子量海带多糖功能试验，通过小鼠实验研究10-15kDa低分子量海带多糖对T2DM作用具体操作如下：
(1)2型糖尿病模型建立及分组
购置一批ICR小鼠，体重20-22g，在50～70％湿度和25℃温度下，一天光照12h适应一周后，进行分组，分别为空白组(NC)、糖尿病模型组(Model)和实验组。其中空白组给予普通饲料，模型组和实验组给予高糖高脂饲料(猪油15％、蔗糖15％、胆固醇1％、蛋黄粉10％、胆盐0.2％、基础饲料58.8％)，造模开始每周测定体重，进食量(换算热量)，饮水量，每周收集每组粪便。术前12h禁食，清理垫料。模型组小鼠按照小剂量组(45mg/kg STZ，隔天注射5次)，对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，保证自由饮水充分，每天都禁食清理垫料。STZ注射3d后，测空腹血糖(血糖仪和血糖试纸)，选择血糖高于11.1mmol/L纳入正式实验，剩余的继续注射至5d，再测空腹血糖高于11.1mmol/L。将实验组按照血糖值相近的原则进行分组，分为以下4组：二甲双胍阳性组(MET，100mg/kg·bw)、Model(超纯水，100mg/kg·bw)，10-15kDa(LJOTL，100mg/kg·bw,LJOTH 200mg/kg·bw)，每组10只小鼠。
(2)10-15kDa低分子量海带多糖对T2DM干预作用
造模成功后，正常进食、进水和干预。干预结束周，测空腹血糖(FBG)
(3)10-15kDa低分子量海带多糖对模型动物空腹血糖的影响
由图2可知，灌胃两周至四周后，Model组小鼠体重持续下降，而LJOTL、LJOTH和MET组小鼠体重持续增加且高于Model组。如图3所示，给药组血糖值具有不同程度的改善，10-15kDa低分子量海带多糖低、高剂量组血糖都有很大的改善。结果表明，实施例1中10-15kDa低分子量海带多糖具有降血糖作用。
通过本发明应用例可以看到，低分子量海带多糖在改善链脲佐菌素腹腔注射联合高脂饲料喂养诱导的Ⅱ糖尿病小鼠模型糖脂代谢方面有积极作用，在降糖降脂功能性产品开发方面具有很好的应用前景。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种辅助降血糖低分子量海带多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以海带为原料，通过超微粉碎制备海带粉；
（2）称取一定量干燥海带粉，按照1:20-60 g/ml的料液比加入40-80℃热水进行水提，同时采用超声进行辅助提取，超声机参数设置为70 kHz、100W并保持温度恒定，超声辅助提取30min，离心取上清液，料渣再按1:20-60 g/ml的料液比，超声辅助提取30min，重复提取1-4次，最后将所有提取液进行混合离心取上清；
（3）对上清进行抽滤，进一步除去细微杂质，经过滤膜过滤的上清置于旋转蒸发仪中进行浓缩旋蒸，旋蒸浓缩到初始体积的1/5，加乙醇至乙醇终浓度达到70%-85%(v/v) ，4℃醇沉8-24h；
（4）过滤离心收集沉淀，进行冻干备用，此为粗多糖；
（5）称取粗多糖适量，按照料液比1:80-120 g/ml的比例加水于50-80℃水浴锅中加热溶解30-120 min，同时搅拌助溶直至全部溶解；溶解后加中性蛋白酶酶解1-5h，然后在90-100℃下进行10-20 min的灭酶活处理，其后，离心除去蛋白，置于8-15 kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜中过滤2-72 h，得多糖溶液；
（6）将上述多糖溶液加入浓硫酸，每1L多糖溶液加2.7 ml浓硫酸，于100-120 ℃下水浴酸解1-2.5 h，离心；而后加1.0mol/L NaOH溶液调节为中性再浓缩，利用10-15 kDa的透析袋或陶瓷超滤膜或超滤膜或纳滤膜进行分级，收集分级后的多糖液体进行浓缩，最后冻干，分别获得不同分子量的低分子量海带多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海带粉为60-400目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的粗多糖用冻干机进行冻干。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，中性蛋白酶加入的终浓度为0.1-2wt%。
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