CN111732673B - 一种沙棘多糖、制备方法及其在沙棘干膏中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种沙棘多糖、制备方法及其在沙棘干膏中的用途，属于沙棘多糖及藏药提取技术领域，沙棘多糖的制备方法包括：对沙棘进行脱脂处理；对处理后的沙棘采用超声结合酶法提取多糖；对所得提取液进行脱蛋白处理，上述脱蛋白处理在3‑羟基己酸和1,3‑二羟基丙酮的介入下进行；并对脱蛋白处理所得提取液进行醇沉和干燥，得到沙棘多糖；上述沙棘多糖为水溶性多糖。本发明提供的制备方法能降低多糖扩散阻力，提高提取效率和原料利用率，降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，提升多糖的生理活性和抗疲劳效果；产物具有提高机体抗疲劳能力；所制沙棘干膏能替代浸膏使用，提高藏药药材稳定性和有效性。

Description

一种沙棘多糖、制备方法及其在沙棘干膏中的用途
技术领域
本发明属于沙棘多糖及藏药提取技术领域，具体涉及一种沙棘多糖、制备方法及其在沙棘干膏中的用途。
背景技术
沙棘（学名：Hippophae rhamnoides Linn.），别名醋柳、黑刺，是胡颓子科沙棘属植物，国内分布于华北、西北、西南等地，其耐旱、抗风沙。沙棘果实中维生素C含量高，被称为“维生素C之王”，且沙棘果实富含多糖、蛋白质、矿物质、维生素、脂肪酸、玉米黄素、蕃茄红素、黄酮和酚类等营养成分，具有较高的营养价值和保健功效。成熟果实呈橙黄色或棕红色，皱缩，果肉油润，质柔软。沙棘化学成分主要有多糖、蛋白质和氨基酸及微量元素等。
现代医学研究，沙棘果和油具有很高的药用价值，可降低胆固醇，治愈心绞痛等作用，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用；有祛痰、止咳、平喘和治疗慢性气管炎的作用；能治疗胃和十二指肠溃疡以及消化不良等，对慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、结肠炎等病症疗效显著；对烧伤、烫伤、刀烧、冻伤有很好的治疗作用；对妇女宫颈糜烂有良好的治疗效果。
目前沙棘的药用方式主要是用煎煮法制备沙棘浸膏，再使用沙棘浸膏与其他药材进行混合制药。例如用沙棘浸膏制备藏药二十五味竺黄散。然而现有技术中提取的沙棘浸膏储存麻烦，容易滋生微生物，易变质，不利于储存运输及对用药量的把控，药物的稳定性和有效性有待提高。因此，如何提高沙棘药物的稳定性与有效性，使其制品便于储存运输，是目前有待解决的技术问题。
沙棘多糖（Polysaccharides from Hippophae rhamnoides）为沙棘中的重要化学成分，是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。研究表明，沙棘果实中的多糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、增强免疫力等生物活性，同时对于肝炎、心血管系统疾病、动脉粥样硬化、过敏、促进新陈代谢等也起到了治疗作用。既可以作为药物临床治疗，也可作为功能食品。
近年来对多糖的研究已经深入到各个应用领域，沙棘中多糖的提取和开发利用是一项长期的任务。沙棘水溶性多糖可作为食品、保健品或药物使用而具有开发的潜力。因此，对沙棘多糖的提取研究和进一步开发具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能降低多糖扩散的阻力，提高提取效率和原料利用率；能降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，提升多糖的生理活性和抗疲劳效果，产物具有提高机体抗疲劳能力的沙棘多糖的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种沙棘多糖的制备方法，包括：
对上述沙棘进行脱脂处理；
对上述脱脂处理后的沙棘进行多糖提取，上述提取采用超声结合酶法提取；
对提取所得提取液进行脱蛋白处理，上述脱蛋白用Sevage试剂为正丁醇和三氯乙酸；上述脱蛋白处理在3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的介入下进行；以及，
对脱蛋白处理所得提取液进行醇沉和干燥，得到沙棘多糖；
上述沙棘多糖为水溶性多糖。该制备方法采用超声结合酶法提取沙棘多糖，能利用酶和超声波的共同作用，对细胞进行破坏，降低多糖扩散的阻力，提高提取效率和原料利用率，同时该制备方法还能降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，提升多糖的生理活性和抗疲劳效果，所得沙棘多糖无细胞毒性，且具有提高机体抗疲劳能力的功效，对预防和消除运动性疲劳有重要作用。
对本发明而言，上述提取步骤操作条件为：加酶量为2-3%，温度为40-55℃，pH为4.5-7.0，超声功率为100-300W，超声辅助时间为15-30min，超声结束后再酶提15-20min。
对本发明而言，上述提取用酶为木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶，其重量比为1:0.5-1:0.8-1.3。
对本发明而言，上述脱蛋白步骤用Sevage试剂中正丁醇和三氯乙酸的体积比为1:4。
由于多糖在植物中除以纯糖链的形式存在外，还以糖链与肽链结合形成糖蛋白或糖肽的形式存在，但在脱蛋白过程中，试剂去除蛋白的同时也会造成部分多糖的损失，为了更好的控制多糖损失率和蛋白去除率而将脱蛋白步骤进行了优化，具体的，上述脱蛋白步骤中3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的添加量分别为Sevage试剂重量的0.05-0.1%和0.05-0.2%。由于3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮协同存在于含有Sevage试剂的提取液体系中，可能降低了糖链和肽链的链接结合紧密度，同时与糖链中剩余的羟基等基团形成氢键，使得蛋白质在Sevage试剂中变性形成胶状物时，糖链与肽链更易脱离，从而降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，明确地，能使多糖损失率降低至不超过10%，蛋白质去除率提升至不低于85%，提取得率从63.65mg/g提高至不低于89.50mg/g，提高了生产效率和原料利用率；意外的，制得的沙棘多糖的活性也能更多地得到激发，使得多糖的生理活性和抗疲劳效果得到一定提升和增益。
本发明还提供了上述的制备方法制得的沙棘多糖，上述沙棘多糖包括由摩尔比为1:3.6:2.4:4.1:7.8的木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成的杂多糖，上述杂多糖的平均分子量为7.49×104Da。该沙棘多糖的物理性质为：多糖干品呈淡黄色晶体状，无味，溶于水，易溶于热水，难溶于高浓度的乙醇、苯、甲苯、氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂。完全溶解后的水溶液呈半透明状；碘-碘化钾反应呈阴性，说明无淀粉存在；硫酸苯酚反应呈阳性，表示有糖存在。
由于现有技术中存在根据沙棘提取的沙棘浸膏不利于储存运输及对用药量的把控的技术问题，本发明提供了一种包含上述沙棘多糖的沙棘干膏，上述沙棘干膏通过以下步骤制备：
S1. 将沙棘药材加水进行煎煮过滤，得到过滤药液；
S2. 将上述过滤药液进行搅拌浓缩，得到浸膏；
S3. 将上述浸膏进行煎煮浓缩，并根据上述浸膏的密度变化控制煎煮温度，得到干膏半成品；
S4. 将上述干膏半成品静置后取出，进行干燥，得到沙棘干膏；
在上述S3中，将上述浸膏进行煎煮浓缩，当浸膏的密度达到1.21g/ml时，向浸膏中搅拌加入沙棘多糖。该方法制得的沙棘干膏能够极大程度方便储存，增加储存时间，提高原药材的利用率；方便运输，降低在运输过程中的损耗，也在保证药材质量的前提下增加运输距离与运输时长；能做到按处方精确用药，精准控制用药量，用药浓度等各种参数，以保证药品质量均一与稳定；能代替现有技术中的沙棘浸膏使用或与其他药物进行混合制药。
对本发明而言，在上述S2中，将上述过滤药液进行搅拌浓缩，检测上述过滤药液的密度，当上述过滤药液的密度不低于1.12g/ml时，浓缩完成。
对本发明而言，上述S3中煎煮浓缩的初始温度为180-200℃；上述根据浸膏的密度变化控制煎煮温度，具体步骤为：
当浸膏的密度不低于1.14g/ml时，控制煎煮温度下降15-20℃；
当浸膏的密度不低于1.15g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃；
当浸膏的密度不低于1.17g/ml时，控制煎煮温度下降5-15℃；
当浸膏的密度不低于1.20g/ml时，控制煎煮温度下降5-15℃；
当浸膏的密度不低于1.21g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃；
当浸膏的密度不低于1.23g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃。
作为优选，煎煮浓缩步骤中，当浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成。采用煎煮浓缩后再干燥，能在不添加粉状药用辅料的情况下直接制成干膏，能直接压片、填充胶囊或制粒，有利于精准控制用药量，具有广阔的市场前景。
作为优选，上述沙棘多糖的添加量为S2所得浸膏重量的1-10%。沙棘多糖在沙棘干膏中的添加，能增加沙棘干膏中的多糖含量，增加干膏产品质量，提升活性成分功效，并使得干膏具有自防腐功能。
对本发明而言，在上述S4中，干膏半成品的静置时间为15-25h，干燥方式为电热鼓风干燥或真空干燥或自然阴干。优选的，干燥方式为电热鼓风干燥或真空干燥。
本发明的有益效果为：
1）本发明中采用超声结合酶法提取沙棘多糖，能利用酶和超声波的共同作用，对细胞进行破坏，降低多糖扩散的阻力，提高提取效率和原料利用率，还能降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，提升多糖的生理活性和抗疲劳效果；2）所得沙棘多糖为水溶性多糖，无细胞毒性，且具有提高机体抗疲劳能力的功效，对预防和消除运动性疲劳有重要作用；3）沙棘多糖在沙棘干膏中的添加，能增加沙棘干膏中的多糖含量，增加干膏产品质量，提升活性成分功效，并使得干膏具有自防腐功能；4）本发明制备的沙棘干膏的制备采用煎煮浓缩后再干燥，能在不添加粉状药用辅料的情况下直接制成干膏，能直接压片、填充胶囊或制粒，能替代沙棘浸膏使用，且方便储存运输，有利于精准控制用药量，且制备方法简单易推广，且能提高藏药药材的稳定性和有效性。
本发明采用了上述技术方案提供一种沙棘多糖、制备方法及其在沙棘干膏中的用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为实施例1得到的沙棘多糖在DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上的洗脱曲线图；
图2为实施例1得到的沙棘多糖在葡聚糖凝胶G-100柱上的洗脱曲线图；
图3为实施例1得到的沙棘多糖经水解后的HPAEC图谱；
图4为本发明实施例中浸膏制备的工艺流程图；
图5为本发明实施例中干膏制备的工艺流程图；
图6为实施例2中浸膏的密度随温度变化曲线图；
图7为试验例1测定多糖损失率和蛋白质去除率的结果示意图；
图8为沙棘多糖对小鼠负重游泳时间的影响示意图；
图9为沙棘多糖对疲劳小鼠血清中LA乳酸、BUN尿素含量的影响示意图；
图10为沙棘多糖对疲劳小鼠肝脏中糖原含量的影响示意图。
附图中，D1代表实施例1，D2代表对比例1，D3代表对比例2，D4代表对比例3，D5代表空白组；
图1中，横坐标为收集管数，纵坐标为吸光度（490nm）；
图2中，横坐标为收集管数，纵坐标为吸光度（490nm）；
图3中，横坐标为时间（单位：min），纵坐标为相对丰度（Relative Abundance）；
图6中，横坐标为密度（单位：g/ml），纵坐标为煎煮温度（单位：℃）；
图7中，a代表多糖损失率，b代表蛋白质去除率，左侧纵坐标为多糖损失率（单位：%），右侧纵坐标为蛋白质去除率（单位：%）；
图8中，纵坐标为游泳时间（单位：min）；
图9中，A代表LA乳酸含量，B代表BUN尿素含量，左侧纵坐标为LA乳酸含量（单位：mmol/L），右侧纵坐标为BUN尿素含量（单位：mmol/L）；
图10中，纵坐标为肝糖原量（单位：mg/g）。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
一种沙棘多糖的制备方法，包括：
对上述沙棘进行脱脂处理；
对上述脱脂处理后的沙棘进行多糖提取，上述提取采用超声结合酶法提取；
对提取所得提取液进行脱蛋白处理，上述脱蛋白用Sevage试剂为正丁醇和三氯乙酸；上述脱蛋白处理在3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的介入下进行；以及，
对脱蛋白处理步骤所得提取液进行醇沉和干燥，得到沙棘多糖；
上述沙棘多糖为水溶性多糖。该制备方法采用超声结合酶法提取沙棘多糖，能利用酶和超声波的共同作用，对细胞进行破坏，降低多糖扩散的阻力，提高提取效率和原料利用率，同时该制备方法还能降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，提升多糖的生理活性，所得沙棘多糖无细胞毒性，且具有提高机体抗疲劳能力的功效，对预防和消除运动性疲劳有重要作用。
在一些实施方案中，脱脂操作如下：取沙棘药材洗净，粉碎至过200目筛，然后添加3-5倍重量的石油醚进行搅拌脱脂，脱脂时间为6-10h，温度为50-65℃，然后抽滤回收石油醚，然后将滤渣用水冲洗2-3次，抽滤，收集滤渣备用。
在一些实施方案中，上述提取步骤操作条件为：加酶量为2-3%，温度为40-55℃，pH为4.5-7.0，超声功率为100-300W，超声辅助时间为15-30min，超声结束后再酶提15-20min。优选的，提取操作可重复提取1-2次，合并提取后过滤所得滤液为提取液。
在一些实施方案中，上述提取用酶为木瓜蛋白酶和果胶酶、纤维素酶，其重量比为1:0.5-1:0.8-1.3。
在一些实施方案中，上述脱蛋白步骤用Sevage试剂中正丁醇和三氯乙酸的体积比为1:4。
具体的，脱蛋白步骤如下：将提取液旋转蒸发，浓缩至原重量的1/4-1/3，得到提取液浓缩液，然后向其中添加3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮，搅拌均匀后，再向其中添加体积占比为20-30%的Sevage试剂（V正丁醇:V三氯乙酸=1:4），在1500-2500r/min条件下混合15-30min，然后于3000-4000r/min条件下离心10-20min，收集上清液，得到脱蛋白的提取液，备用。
由于多糖在植物中除以纯糖链的形式存在外，还以糖链与肽链结合形成糖蛋白或糖肽的形式存在，但在脱蛋白过程中，试剂去除蛋白的同时也会造成部分多糖的损失，为了更好的控制多糖损失率和蛋白去除率而将脱蛋白步骤进行了优化，具体的，上述脱蛋白步骤中3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的添加量分别为Sevage试剂重量的0.05-0.1%和0.05-0.2%。由于3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮协同存在于含有Sevage试剂的提取液体系中，可能降低了糖链和肽链的链接结合紧密度，同时与糖链中剩余的羟基等基团形成氢键，使得蛋白质在Sevage试剂中变性形成胶状物时，糖链与肽链更易脱离，从而降低多糖损失率，提高多糖得率和蛋白质去除率，明确地，能使多糖损失率降低至不超过10%，蛋白质去除率提升至不低于85%，提取得率从63.65mg/g提高至不低于89.50mg/g，提高了生产效率和原料利用率；意外的，制得的沙棘多糖的活性也能更多地得到激发，使得多糖的生理活性和抗疲劳效果得到一定提升和增益。
在一些实施方案中，醇沉和干燥步骤如下：向所得脱蛋白的提取液中加入5-7倍体积的无水乙醇，置于4℃环境下冷藏10-12h后取出，于3500-5000r/min条件下离心，取沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次顺序洗涤，抽滤，取沉淀在65-80℃烘干，得到水溶性的沙棘多糖。该方法得到的多糖为水溶性多糖，加入乙醇会破坏其氢键，从而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。
本发明中制得的沙棘多糖包括由摩尔比为1:3.6:2.4:4.1:7.8的木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成的杂多糖，杂多糖的平均分子量为7.49×104Da。该沙棘多糖的物理性质为：多糖干品呈淡黄色晶体状，无味，溶于水，易溶于热水，难溶于高浓度的乙醇、苯、甲苯、氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂。完全溶解后的水溶液呈半透明状；碘-碘化钾反应呈阴性，说明无淀粉存在；硫酸苯酚反应呈阳性，表示有糖存在。
上述的，一种沙棘干膏，通过以下步骤制备：
S1. 将沙棘药材加水进行煎煮过滤，得到过滤药液；
S2. 将上述过滤药液进行搅拌浓缩，得到浸膏；
S3. 将上述浸膏进行煎煮浓缩，并根据上述浸膏的密度变化控制煎煮温度，得到干膏半成品；
S4. 将上述干膏半成品静置后取出，进行干燥，得到沙棘干膏；
在上述S3中，当浸膏的密度达到1.21g/ml时，向浸膏中搅拌加入上述的沙棘多糖。该方法制得的沙棘干膏能够极大程度方便储存，增加储存时间，提高原药材的利用率；方便运输，降低在运输过程中的损耗，也在保证药材质量的前提下增加运输距离与运输时长；能做到按处方精确用药，精准控制用药量，用药浓度等各种参数，以保证药品质量均一与稳定；能代替现有技术中的沙棘浸膏使用或与其他药物进行混合制药。
在一些实施方案中，如图4所示的沙棘浸膏的制备流程，包括上述S1和S2。其中：S1具体步骤为：将沙棘药材进行清洗切片等预处理后，向沙棘药材中加入6-8倍量的水中进行第一次煎煮，煎煮温度为180-200℃，煎煮时间90-110min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅰ和药液Ⅰ；
向药渣Ⅰ中加入1-3倍量的水，进行第二次煎煮，煎煮温度为180-200℃，煎煮时间80-100min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅱ和药液Ⅱ；
向药渣Ⅱ中加入等量的水，进行第三次煎煮，煎煮温度为180-200℃，煎煮时间20-40min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅲ与药液Ⅲ；将药渣Ⅲ废弃，将药液Ⅰ、药液Ⅱ和药液Ⅲ混合，得到过滤药液。
在一些实施方案中，在上述S2中，将上述过滤药液进行搅拌浓缩，检测上述过滤药液的密度，当上述过滤药液的密度不低于1.12g/ml时，浓缩完成。优选的，浓缩时间为40-60min，搅拌间隔时间为20min。
在一些实施方案中，如图5所示的沙棘干膏的制备流程，包括S3和S4。其中：上述S3中煎煮浓缩的初始温度为180-200℃；上述根据浸膏的密度变化控制上述煎煮温度，具体步骤为：
当煎煮15-25min、每20min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.14g/ml时，控制煎煮温度下降15-20℃；
当煎煮20-30min、每20min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.15g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃；
当煎煮45-55min、每20min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.17g/ml时，控制煎煮温度下降5-15℃；
当煎煮20-30min、每20min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.20g/ml时，控制煎煮温度下降5-15℃；
当煎煮15-25min、每10min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.21g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃；
当煎煮10-20min、每10min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.23g/ml时，控制煎煮温度下降5-10℃；
继续煎煮35-45min、每10min搅拌一次后，控制煎煮温度下降35-45℃；
继续煎煮115-125min、每5min搅拌一次，当浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成。
作为优选，煎煮浓缩步骤中，搅拌频率为每10-20min搅拌一次；浸膏的密度越高，搅拌频率越快，可根据密度适当调整搅拌频率，当浸膏的密度不低于1.23g/ml时，搅拌频率为每5-10min搅拌一次。采用煎煮浓缩后再干燥，能在不添加粉状药用辅料的情况下直接制成干膏，能直接压片、填充胶囊或制粒，有利于精准控制用药量，具有广阔的市场前景。
需要说明的是，上述浸膏的密度与温度控制，可根据具体实施场景进行调整，其他根据浸膏的密度变化下调煎煮温度的方式，均属于本申请的保护范围。
作为优选，所述沙棘多糖的添加量为S2所得浸膏重量的1-10%。沙棘多糖在沙棘干膏中的添加，能增加沙棘干膏中的多糖含量，增加干膏产品质量，提升活性成分功效，并使得干膏具有自防腐功能。
在另一些更优选的实施方案中，煎煮浓缩步骤开始前，向沙棘浸膏中添加有反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮，其添加量为煎煮浓缩步骤中初始沙棘浸膏重量的0.05-0.15%，其中反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮的重量比为1:1-3。两者加入可能协同促进了沙棘浸膏中有效成分的胶结，使得浸膏能更加快速地失水，有效降低了浸膏煎煮浓缩的时间，节约了能耗和生产成本；两者还具有掩蔽沙棘干膏涩味的作用，有效改善沙棘干膏的口感，适口性和感官体验得到提升。
在一些实施方案中，在上述S4中，干膏半成品的静置时间为15-25h，干燥方式为电热鼓风干燥或真空干燥或自然阴干。优选的，干燥方式为电热鼓风干燥或真空干燥。
优选的，真空干燥的操作条件为：干燥温度为60-80℃，干燥时间为5-9d，真空压强为0.05Mpa。
最优选的，采用电热鼓风干燥的方式，操作条件如下：干燥温度为60-80℃，干燥时间为5-9d。在三种干燥方式中，自然阴干耗时较长，在实际生产中较少应用；真空干燥中浸膏容易产生“爆沸”现象，导致中药流浸膏溅到真空干燥箱的内壁造成药物损失，因此最佳干燥为电热鼓风干燥。
本发明制得的沙棘干膏在制备药物中的用途，其中包括采用沙棘干膏代替沙棘浸膏制备藏药二十五味竺黄散。
本发明及实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。
应当理解，前面的描述应被认为是说明性或示例性的而非限制性的，本领域普通技术人员可以在所附权利要求的范围和精神内进行改变和修改。特别地，本发明覆盖了具有来自上文和下文上述的不同实施方案的特征的任何组合的其他实施方案，而本发明的范围并不限制于在以下具体实例中。
实施例1：
一种沙棘多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）取沙棘药材洗净，粉碎至过200目筛，然后添加5倍重量的石油醚进行搅拌脱脂，脱脂时间为8h，温度为55℃，然后抽滤回收石油醚，然后将滤渣用水冲洗3次，抽滤，收集滤渣备用；
（2）向脱脂后的滤渣中添加25倍量的蒸馏水，使用超声结合酶法提取多糖，具体的操作条件为：酶法用酶为木瓜蛋白酶和果胶酶、纤维素酶，加酶量为2.3%，温度为45℃，pH为6.0，超声功率为150W，超声辅助时间为20min，超声结束后再酶提20min，灭酶，然后过滤，滤渣重复提取2次，合并提取后过滤所得滤液为提取液，备用；上述木瓜蛋白酶和果胶酶、纤维素酶的重量比为1:0.75:1.25；
（3）将提取液旋转蒸发，浓缩至原重量的1/3，得到提取液浓缩液，然后向其中添加3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮，搅拌均匀后，再向其中添加体积占比为23%的Sevage试剂（V正丁醇:V三氯乙酸=1:4），在2500r/min条件下混合30min，然后于3000r/min条件下离心15min，收集上清液，得到脱蛋白的提取液，备用；上述3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的添加量分别为Sevage试剂重量的0.075%和0.125%；
（4）向所得脱蛋白的提取液中加入5倍体积的无水乙醇，置于4℃环境下冷藏12h后取出，于4000r/min条件下离心，取沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次顺序洗涤，抽滤，取沉淀在70℃烘干，得到水溶性的沙棘多糖。
（5）将上述沙棘多糖加300倍缓冲液溶解，分散形成胶体溶液，经DEAE-SepharoseFast Flow离子交换柱分离，得到组分EPS(见附图1)，富集主要多糖组分EPS，再进一步纯化。用葡聚糖凝胶G-100柱层析纯化EPS，得到附图2，显示EPS为杂多糖。
DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-SepharoseFast Flow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡。将多糖样品用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL缓冲液溶解分散后上样，上样量为5.00mL，用1mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1mL/min，蒽酮-硫酸法跟踪检测至无糖检出，收集多糖洗脱液，得到组分EPS，洗脱曲线见附图1，富集主要多糖组分EPS，再进一步纯化。
葡聚糖凝胶G-100柱层析条件为：将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL溶液平衡，将组分EPS配制成10mg/mL溶液上样，上样量为5.00mL，用0.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1mL/min，蒽酮-硫酸法跟踪检测至无糖检出，收集多糖洗脱液，洗脱曲线见附图2，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥，用于多糖水解定性分析。
（6）分子量的测定：以针头过滤器过滤EPS样品(5mg/mL，200μL)(孔径0.22μm)；将过滤后的EPS样品注入两个Ultrahydrogel TM线性串联柱(ID 7.8mm×300mm)中，用NaNO3溶液(0.1M)以0.9mL/min流速进行洗脱，得到响应值数据；将得到的数据用Empower(Waters，USA)收集和处理，分子量(Mw)直接根据每个洗脱体积的分子量和RI信号值的的定义Mw来计算Mw。
测定结果为：EPS的平均分子量为7.49×104Da；EPS的色谱图显示为单一对称的窄峰，表明EPS是均质材料；同时，在220、260、280nm处从UV检测器未检测到峰，表明EPS没有蛋白质或核酸。
（7）单糖组成的测定：将10mg收集得到的EPS用10mL三氟乙酸(TFA)(2M)在110℃水解12h；通过减压蒸发除去EPS中的TFA，甲醇冲洗3次，于40℃下真空烘干；以标准岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和果糖作为对比，通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)连同脉冲安培检测器(Thermo Scientific，USA)和CarboPac PA20柱(ID3mm×150mm)测定水解产物的单糖组成和单糖含量；
其中，HPAEC操作条件如下：流动相A：250mmol/L的NaOH；流动相B：水；流动相C：1mol/L的NaAc；流速：0.5mL/min；梯度洗脱条件如下：0-21.1min，98.2%A、1.8%B；21.1-30min，93.2%A、1.8%B、5%C；30-30.1min，78.2%A、1.8%B、20%C；30.1-50min，20%A、80%B。
结果如图3所示，将测定结果与标准品对比计算，结果发现：EPS由木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1:3.6:2.4:4.1:7.8，结果表明，EPS是杂多糖。
实施例2：
一种沙棘干膏，其中浸膏和干膏的制备流程如图4和5所示，在本实施例中的具体制备步骤如下：
（1）将15kg沙棘药材进行清洗切片等预处理后，加入105L的水到500L容量的夹层锅中，进行第一次煎煮，煎煮温度190℃，煎煮时间100min，每20min搅拌一次，煎煮后经100目筛过滤，得到药渣Ⅰ和药液Ⅰ；
（2）将药渣Ⅰ加水30L，进行第二次煎煮，煎煮温度190℃，煎煮时间90min，每20min搅拌一次，煎煮后经100目筛过滤，得到药渣Ⅱ和药液Ⅱ；
（3）将药渣Ⅱ加水15L，进行第三次煎煮，煎煮温度190℃，煎煮时间30min，每20min搅拌一次，煎煮后经100目筛过滤，得到药渣Ⅲ与药液Ⅲ，将药渣Ⅲ废弃；
（4）将药液Ⅰ、药液Ⅱ和药液Ⅲ混合，得到过滤药液；
（5）将过滤药液加到300L夹层锅中进行浓缩，浓缩温度190℃，每20min搅拌一次，测量过滤药液密度，当测得过滤药液密度达到1.12g/ml时，浓缩完成，得到浸膏；
（6）将浸膏加入300L夹层锅中进行煎煮浓缩，设定初始煎煮温度为190℃，每20min搅拌一次，随时检测浸膏的密度，根据浸膏的密度变化下调煎煮温度，其浸膏的密度随温度变化曲线图如图6所示：
具体的，当浸膏的密度达到1.14g/ml，控制煎煮温度为170℃，期间每20min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.15g/ml，调节煎煮温度为150℃，期间每20min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.17g/ml，调节煎煮温度为130℃，期间每20min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.20g/ml，调节煎煮温度为120℃，期间每20min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.21g/ml，调节煎煮温度为110℃，期间每10min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.23g/ml，调节煎煮温度为100℃，期间每10min搅拌一次；
继续煎煮，每5min搅拌一次，当浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成，得到干膏半成品；
（7）将干膏半成品静置20h后取出，进行电热鼓风干燥，干燥温度为70℃，干燥时间为7d，干燥完成后收膏，即得沙棘干膏。
实施例3：
一种沙棘干膏，其制备方法基本与实施例2一致，具体不同之处在于：步骤（6）中，当浸膏的密度达到1.21g/ml，调节煎煮温度为110℃，期间每10min搅拌一次，温度调节完成后，向浸膏中搅拌加入沙棘多糖，沙棘多糖的添加量为步骤（5）所得浸膏重量的5%；制得沙棘干膏。
实施例4：
一种沙棘干膏，其制备方法基本与实施例2一致，具体不同之处在于：步骤（6）中，煎煮浓缩步骤开始前，向沙棘浸膏中添加有反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮，其添加量为煎煮浓缩步骤中初始沙棘浸膏重量的0.1%，其中反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮的重量比为1:2.5；然后开始煎煮浓缩，当浸膏的密度达到1.21g/ml，调节煎煮温度为110℃，期间每10min搅拌一次，温度调节完成后，向浸膏中搅拌加入沙棘多糖，沙棘多糖的添加量为步骤（5）所得浸膏重量的5%。
对比例1：
一种沙棘多糖的制备方法，基本与实施例1一致，具体不同之处在于：步骤（3）中，向提取液浓缩液中添加有3-羟基己酸，未添加1,3-二羟基丙酮。
对比例2：
一种沙棘多糖的制备方法，基本与实施例1一致，具体不同之处在于：步骤（3）中，向提取液浓缩液中添加有1,3-二羟基丙酮，未添加3-羟基己酸。
对比例3：
一种沙棘多糖的制备方法，基本与实施例1一致，具体不同之处在于：步骤（3）中，未向提取液浓缩液中添加3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮。
对比例4：
一种沙棘干膏，其制备方法基本与实施例4一致，具体不同之处在于：步骤（6）中，煎煮浓缩步骤开始前，向初始沙棘浸膏中添加有反式-查耳酮，未添加3-羟基-2-丁酮。
对比例5：
一种沙棘干膏，其制备方法基本与实施例4一致，具体不同之处在于：步骤（6）中，煎煮浓缩步骤开始前，向初始沙棘浸膏中添加有3-羟基-2-丁酮，未添加反式-查耳酮。
试验例1：
沙棘多糖的提取分离中多糖损失率、得率和蛋白质去除率的测定
试验方法：取等量的实施例1和对比例1-3中脱蛋白步骤前后的沙棘多糖提取液为试验样品。分别测定脱蛋白前提取液和脱蛋白后提取液中的蛋白质含量和多糖含量，计算蛋白脱除率和多糖损失率，计算公式如下：蛋白质去除率%=（M1-M2）/M1×100%；多糖损失率%=（N1-N2）/N1×100%；式中，M1-脱蛋白前提取液中蛋白质含量，M2-脱蛋白后提取液中蛋白质含量，N1-脱蛋白前提取液中多糖含量，N2-脱蛋白后提取液中多糖含量；多糖含量的测定方法为苯酚-硫酸法，蛋白质含量的测定方法为Brodford法。沙棘多糖得率＝所制多糖干重/原料干重。结果如图7、表1所示。
图7为沙棘多糖的提取分离中多糖损失率和蛋白质去除率的测定结果示意图。
表1不同制备方法制得的沙棘多糖的得率测定结果
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3
得率mg/g 89.78 62.46 72.71 63.65
结果显示，实施例1的多糖损失率和蛋白质去除率分别为8.6%和86.2%，对比例1的多糖损失率和蛋白质去除率分别为18.5%和76.4%，对比例2的多糖损失率和蛋白质去除率分别为14.7%和68.5%，对比例3的多糖损失率和蛋白质去除率分别为18.3%和74.6%；可得，实施例1中3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮协同存在的制备方法能在脱蛋白步骤中降低多糖损失率，提高蛋白质去除率，进而提高多糖得率，明确地，能使多糖损失率降低至不超过10%，蛋白质去除率提升至不低于85%，提取得率从63.65mg/g提高至不低于89.50mg/g，有效提高了生产效率和原料利用率。
试验例2：
沙棘多糖的抗疲劳活性试验
试验方法：取等量的实施例1和对比例1-3中脱蛋白步骤前后的沙棘多糖提取液为试验样品，以生理盐水为空白组。挑选出的75只具有游泳能力的小鼠，并将小鼠随机分为5组，每组15只，将试验样品分别配制成200mg/kg的溶液，进行分组灌胃15d，期间正常采食和水。通过小鼠游泳时间及测定血清中LA(乳酸)、BUN(尿素)含量、肝脏中糖原含量，来评价沙棘多糖抗疲劳的效果。结果如图8、9、10所示。
图8为沙棘多糖对小鼠负重游泳时间的影响示意图，图9为沙棘多糖对疲劳小鼠血清中LA乳酸、BUN尿素含量的影响示意图，图10为沙棘多糖对疲劳小鼠肝脏中糖原含量的影响示意图。
结果显示：（1）食用实施例1的沙棘多糖的小鼠的负重游泳时间最长达到20.6min，空白组最短为10.5min，对比例1-3处于中间，表明沙棘多糖能在一定程度上缓解小鼠的疲劳状态，使得小鼠的负重游泳时间增加；（2）血清中LA乳酸、BUN尿素含量降低，则说明机体能有效缓解运动疲劳感，其中实施例1的LA、BUN含量均为最低，分别为14.26mmol/L和4.26mmol/L，空白组最高，分别为30.57mmol/L和10.15mmol/L，对比例1-3较空白组有不同程度降低，说明沙棘多糖能减低血清中LA乳酸、BUN尿素含量，具有抗疲劳作用；（3）增加肝糖原储备，有利于提高运动耐力，及时补充运动过程中主要的能源物质葡萄糖和糖原，从而使得运动疲劳感降低。实施例1的肝糖原含量最高，达到45.98mg/g，空白组最低为29.54mg/g，对比例1-3较空白组有不同程度提升，表明沙棘多糖能增加肝糖原储备，有效降低疲劳感；
综上所述，沙棘多糖能延长小鼠负重游泳时间，增加肝糖原含量，降低血清中LA及BUN含量，有利于提高机体的抗疲劳能力，对于预防和消除运动性疲劳有重要作用；且实施例1的制备方法制得的沙棘多糖，表现出比对比例更优的抗疲劳效果，可能是实施例1中3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮协同存在的制备方法能更多地激发多糖的生理活性，从而使得抗疲劳效果得到一定提升和增益。
试验例3：
沙棘干膏制备条件优化测试
试验方法：分别按照实施例2、3、4和对比例4、5的方法制备沙棘干膏，对步骤（6）根据浸膏的密度变化控制煎煮温度的步骤中，所用的煎煮时间进行精细测量，对比各制备方法中的时间，结果如下表2所示。
表2不同制备方法煎煮浓缩步骤的时间监测结果（单位：min）
Figure 363899DEST_PATH_IMAGE001
结果显示，实施例4在煎煮浓缩步骤中耗时最短，实施例2、3与对比例5差异不显著，对比例4较实施例2、3耗时短，但仍高于实施例4，可能是因为实施例4的制备方法中添加有反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮协同发挥作用，能促进沙棘浸膏中有效成分的胶结，使得浸膏能更加快速地失水，有效降低浸膏煎煮浓缩的时间，进而能够节约能耗和生产成本。
试验例4：
沙棘干膏的感官体验测试
试验方法：分别取等量的实施例2、3、4和对比例4、5制得的沙棘干膏为试验样品。随机选择年龄为20-40岁、男女各半的50人，随机分成感官评估小组5组，每组10人。对本发明中制得的沙棘干膏进行嗅觉和味觉上的感官评价，其中，评价标准为：嗅觉1-10分（1=有异味、5=无气味、10=具有浓郁果香），味觉1-10分（1=酸涩至带有苦味、5=酸甜味、10=清甜）；测定结果取平均值。其结果如下表3所示。
表3沙棘干膏的感官评价结果
实施例2 实施例3 实施例4 对比例4 对比例5
嗅觉 7.5 7.6 7.7 7.7 7.5
味觉 4.2 4.1 5.4 4.4 4.0
结果显示，实施例2、3、4和对比例4、5制得的沙棘干膏在嗅觉上的差异不显著，都属于具有较淡的、自然的果香味道；味觉差异较大，其中实施例4的味觉评价总体为酸中略带甜味，实施例2和3被评价为味酸略涩，对比例4和5和实施例2差异不显著；可能是因为实施例4的制备方法中添加有反式-查耳酮和3-羟基-2-丁酮协同发挥作用，能掩蔽沙棘干膏的涩味，有效改善沙棘干膏的口感，使得适口性和感官体验得到提升。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (1)

1.一种沙棘多糖提取液的制备方法，包括：
（1）取沙棘药材洗净，粉碎至过200目筛，然后添加5倍重量的石油醚进行搅拌脱脂，脱脂时间为8h，温度为55℃，然后抽滤回收石油醚，然后将滤渣用水冲洗3次，抽滤，收集滤渣备用；
（2）向脱脂后的滤渣中添加25倍量的蒸馏水，使用超声结合酶法提取多糖，具体的操作条件为：酶法用酶为木瓜蛋白酶和果胶酶、纤维素酶，加酶量为2.3%，温度为45℃，pH为6.0，超声功率为150W，超声辅助时间为20min，超声结束后再酶提20min，灭酶，然后过滤，滤渣重复提取2次，合并提取后过滤所得滤液为提取液，备用；
（3）将提取液旋转蒸发，浓缩至原重量的1/3，得到提取液浓缩液，然后向其中添加3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮，搅拌均匀后，再向其中添加体积占比为23%的正丁醇/三氯乙酸混合试剂，在2500r/min条件下混合30min，然后于3000r/min条件下离心15min，收集上清液，得到脱蛋白的多糖提取液，即为沙棘多糖提取液；
所述步骤（2）中，木瓜蛋白酶和果胶酶、纤维素酶的重量比为1:0.75:1.25；
所述步骤（3）所用正丁醇/三氯乙酸混合试剂中，正丁醇和三氯乙酸的体积比为1:4；
所述步骤（3）中，3-羟基己酸和1,3-二羟基丙酮的添加量分别为正丁醇/三氯乙酸混合试剂重量的0.075%和0.125%。
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