CN113956371A

CN113956371A - 一种沙棘果皮多糖铜的制备方法

Info

Publication number: CN113956371A
Application number: CN202111285312.8A
Authority: CN
Inventors: 王海宾; 高莉; 郭建峰; 史楠; 王芳; 赵英虎; 刘盼盼; 郜淑瑶
Original assignee: North University of China
Current assignee: North University of China
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本发明公开了一种沙棘果皮多糖铜的制备方法，包括：步骤一、将干燥好的沙棘果皮，加入磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液，加入木瓜蛋白酶，水浴后抽滤，得到提取液；步骤二、称取一定质量的沙棘果皮多糖，加入柠檬酸钠和水，置于55～65℃水浴锅中加热并不断搅拌；用氢氧化钠溶液调节pH值至碱性，缓缓滴加硫酸铜，出现不溶物时立即停止滴加硫酸铜，继续在水浴锅中加热搅拌0.8～1.2h后停止搅拌，收集离心液；向离心液中加入95％乙醇，使乙醇浓度达到80％，置于3～5℃环境12～18小时后，离心取沉淀，得到沙棘果皮多糖铜络合物。本发明从沙棘果皮中提取多糖，并且将所得多糖与硫酸铜成功络合制成沙棘果皮多糖铜复合物，为促进沙棘资源的开发利用提供理论依据。

Description

一种沙棘果皮多糖铜的制备方法

技术领域

本发明涉及一种沙棘果皮多糖铜的制备方法。

背景技术

多糖是由十个以上的单糖通过糖苷键结合组成的聚合糖高分子碳水化合物，在生物体内参与各项生理活动，对维持正常生命活动有着重要作用，其具有广泛的生理活性，如降血糖、抗氧化、降血脂、抗病毒等，成为继蛋白质和核酸研究之后的又一功能性食品研究热点。沙棘属落叶灌木或小乔木，沙棘果实、叶片和种子的提取物具有一定的生物活性。沙棘成分主要有黄酮类、维生素、沙棘油等，沙棘果皮多糖是其主要活性成分之一。铜是人体中含量位居第二的必需微量元素，其可帮助铁质传递蛋白，在血红素形成过程中扮演催化的重要角色；铜对于血液、中枢神经和免疫系统，头发、皮肤和骨骼组织等的发育和功能有重要影响；铜元素在人体很多重要的酶中也发挥重要作用，含铜的酶主要有酪氨酸酶、单胺氧化酶、超氧化酶、超氧化物歧化酶、血铜蓝蛋白等；铜对血红蛋白的形成起活化作用，促进铁的吸收和利用，在传递电子、弹性蛋白的合成、结缔组织的代谢、嘌呤代谢、磷脂及神经组织形成方面有重要意义，人体缺乏铜会引起贫血，毛发异常，骨和动脉异常以至脑障碍。

在生物体中，铜离子自己是没有生物活性的，只有与某些物质(如多糖、蛋白质)结合形成生物配位化合物后，才表现出不同的生理生化功能。很多缺铜的地区，因为铜的缺失，让小羔羊患上了摇背症，成年山羊的流产率也升高，大家常用硫酸铜这类铜盐对羊群进行补铜，但由于铜盐中铜含量高，易引起铜中毒；有研究表明，多糖铜复合物具有更好的稳定性、水溶性和吸收率；多糖结构中含有的羧基、氨基和羟基等基团可以与金属离子配位，形成金属配合物后可能使多糖的某些药理作用加强，或者使其具有了新的药理活性，且利用多糖与铜进行螯合来补充铜会更加安全可靠。

因此，本发明从沙棘果皮中提取多糖，并对其提取条件进行了优化，将其与硫酸铜络合制成沙棘果皮多糖铜复合物，对其稳定性和抗氧化活性进行了研究，为促进沙棘资源的开发利用提供了理论依据。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于将从沙棘果皮中提取的多糖，与硫酸铜络合制成沙棘果皮多糖铜复合物。

为实现以上目的，本发明提供一种沙棘果皮多糖铜的制备方法，采用如下技术方案：

一种沙棘果皮多糖铜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、使用酶法提取沙棘果皮多糖：将干燥好的沙棘果皮，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入木瓜蛋白酶，45～55℃水浴70～90min，抽滤，得到沙棘果皮多糖提取液，冻干得粉末；

步骤二、称取一定质量的沙棘果皮多糖粉末，加入柠檬酸钠和水，置于55～65℃水浴锅中加热并不断搅拌；用氢氧化钠溶液调节pH值至碱性，缓缓滴加硫酸铜，出现不溶物时立即停止滴加硫酸铜，继续在55～65℃水浴锅中加热搅拌0.8～1.2h，然后停止搅拌，趁热离心，弃去沉淀，收集离心液；向离心液中加入95％乙醇，使乙醇浓度达到80％，置于3～5℃环境12～18小时后，离心取沉淀，得到沙棘果皮多糖铜络合物。

优选的，所述步骤一中，木瓜蛋白酶添加量为2％，提取时间为80min，提取pH为4.4。

优选的，所述步骤一中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的pH为7.4。

优选的，所述步骤二中，沙棘果皮多糖与柠檬酸钠质量比为2:1。

优选的，所述步骤二中，氢氧化钠溶液浓度为2mol/L。

与现有技术相比，本发明从沙棘果皮中提取多糖，并对其提取条件进行了优化，并且将所得多糖与硫酸铜成功络合制成沙棘果皮多糖铜复合物，为促进沙棘资源的开发利用提供理论依据。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为酶用量对多糖提取量的影响；

图2为pH值对多糖提取量的影响；

图3为酶作用时间对多糖提取量的影响；

图4为沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜的扫描电镜图。A、B分别为沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜，A-1、B-1为放大200倍、A-2、B-2为放大5倍。

图5为沙棘果皮多糖/沙棘果皮多糖铜紫外扫描光谱；

图6为沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜红外扫描光谱；

图7为Cu²⁺释放量；

图8为沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜对DPPH自由基清除能力；

图9为沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜对ABTS自由基清除能力；

图10为蒽酮法测总糖的标准曲线；

图11为还原糖含量的标准曲线；

图12为铜标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

一种具有抗氧化作用的沙棘果皮多糖铜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、沙棘果皮粗多糖的提取

使用酶法提取沙棘果皮多糖：称取一定质量的干燥好的沙棘果皮，加入pH为7.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入木瓜蛋白酶，50℃水浴80min，抽滤，得到多糖提取液，冻干得粉末；

通过以下单因素实验，得到沙棘果皮粗多糖提取时的最佳酶用量、pH值和作用时间：

(一)酶用量

称取1g沙棘果皮，加入20倍的pH4.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，分别加入0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％木瓜蛋白酶，50℃水浴80min，抽滤，然后取滤液测总糖、还原糖含量，得出多糖含量，确定最适的木瓜蛋白酶用量。

由图1以看出，不同酶含量作用下，多糖含量分别为2.839mg/g、10.868mg/g、14.31mg/g、18.56mg/g与13.11mg/g。当酶添加量在0.5％-2％时，沙棘果皮多糖提取量呈增加趋势，其中酶用量为2％时多糖提取量最大，为6.8mg/g；而后多糖提取量减小。这是由于酶跟沙棘果皮反应，等两者反应到沙棘果皮中多糖析出完全后，加入再多的酶，因为没有了底物而无法进行。因此木瓜蛋白酶的最适添加量为2％。

(二)酶作用pH值

称取1g沙棘果皮，分别加入20倍的pH为3.4、4.4、5.4、6.4、7.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入2％木瓜蛋白酶，50℃水浴80min，抽滤，然后取滤液测总糖、还原糖含量，得出多糖含量，确定最适的木瓜蛋白酶作用pH值。

图2可以看出，不同pH条件下，提取液中的多糖含量分别为3.31mg/g、7.89mg/g、6.15mg/g、6.73mg/g、5.39mg/g。多糖提取量随着pH值的升高先增加而后减少，在pH值为4.4时达到最大为7.89mg/g，由此说明木瓜蛋白酶与底物作用的最适pH值为4.4，当pH值高于或低于4.4时活性均明显下降。因此，选择提取pH为4.4。

(三)酶作用时间

称取1g沙棘果皮，加入20倍的pH为5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入2％木瓜蛋白酶，分别在55℃水浴40min、60min、80min、100min，120min抽滤，然后取滤液测总糖、还原糖含量，得出多糖含量，确定最适的木瓜蛋白酶作用时间。

由图3可以看出，不同作用时间下提取液中的多糖含量分别为1.75mg/g、6.55mg/g、6.89mg/g、8.785mg/g、6.612mg/g。从80min以后提取量开始下降，是因为木瓜蛋白酶在80min内基本与沙棘果皮作用完毕，所以再加入更多的酶，没有底物与值反应，往后多糖提取量始减小。因此，选择作用时间为80min。

步骤二、沙棘果皮多糖铜的制备

称取沙棘果皮多糖粉末1g，柠檬酸钠0.5g，加水60mL，置于60℃水浴锅中加热并不断搅拌；用2mol/L氢氧化钠调节pH值至碱性，缓缓滴加硫酸铜；出现不溶物时立即停止滴加硫酸铜，继续在60℃水浴锅中加热搅拌1h；然后停止搅拌，趁热离心，弃去沉淀，收集离心液；向离心液中加入95％乙醇，使乙醇浓度达到80％，置于4℃冰箱中过夜，离心取沉淀，得到沙棘果皮多糖铜络合物。

进一步地，对所得沙棘果皮多糖铜进行表征及性能测定：

1.沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜的扫描电子显微镜(SEM)分析

使用扫描电子显微镜观察沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜的表观结构。使用仪器对平台进行喷金处理，在镜头下对二者进行观察并拍照，如图4所示。

由图4(A)可知，沙棘果皮多糖呈颗粒状，表面粗糙。图4(B)可知，沙棘果皮多糖铜表面光滑密致，边缘整齐。上述结果可能是由与沙棘果皮多糖多糖链上的羟基与铜络合，使多糖链被打开，内部结构发生变动，从而引起多糖铜表观形态上的变化，导致沙棘果皮多糖与沙棘果皮多糖铜的扫描电子显微镜图存在显著差异。

2.沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜的紫外可见光谱分析

分别配制0.04mg/mL沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜复合物的水溶液50ml，在可见光200-400nm处进行扫描。

如图5所示，沙棘果皮多糖在206nm与225nm处都有特征吸收峰，与铜络合以后，两特征峰都还存在，但是峰的宽度略微变大，吸收峰位置发生了极小的偏移，这是由于形成复合物之后影响了电子的跃迁，说明沙棘果皮多糖与铜成功络合。

3.沙棘果皮多糖、沙棘果皮多糖铜的红外光谱(FT-IR)分析

精密称取沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜各2mg及溴化钾200mg，放入精密鼓风干燥箱，以105℃烘干至恒重，取出分别使用研钵充分研磨混合后压片机压片。使用傅里叶变换近红外光谱仪测定沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜在400-4000cm^-1波长范围内的红外吸光度，得到红外光谱图。

如图6所示，在3189cm^-1内的强吸收峰对应分子间-OH伸缩振动，其中含有糖类物质；在1610cm^-1处的吸收峰对应C＝O；1420cm^-1处的吸收峰对应N—H弯曲振动和C—N伸缩振动；在1240cm-1处的特征吸收带对应O＝S＝O的伸缩振动；在1034cm-1处对应C-O-C的吸收峰，制备的多糖结构符合多糖的一般性质。沙棘果皮多糖铜的红外光谱图中主要吸收峰发生少量红移；说明沙棘果皮多糖与铜发生了络合反应。

4.沙棘果皮多糖铜稳定性测定

称取10mg的沙棘果皮多糖铜，0.32g胃蛋白酶跟0.2g氯化钠放入锥形瓶中，加入100mL水制成模拟胃液，将锥形瓶放在37℃的水浴振荡器中震荡2h，每30min取出5mL，放入5mL的模拟胃液。两小时后，将消化液的pH值调至6.8，并加入0.68g KH₂PO₄、0.093g NaCl和1g胰蛋白酶，配制成模拟肠液，在水浴振荡器中消化3h。在整个消化过程中，每隔30min取出5.0mL消化液，并加入同等体积的胃肠模拟液。取出的消化液经0.45μm微滤膜过滤后，用于测定释放的Cu²⁺含量。

如图7所示，随着时间的增加，铜离子的释放量逐渐增多，经胃肠道消化后铜的释放率可达50％以上。说明其有潜力开发为补铜剂。

5.沙棘果皮多糖铜抗氧化活性测定

(1)DPPH自由基清除能力测定

配置0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存备用。在试管中分别加入不同浓度的沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)2.0mL以及2.0mLDPPH乙醇溶液，摇匀、室温下避光反应30min，于517nm处进行吸光度测定，平行三次。2mL蒸馏水分别代替沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜溶液及2mL DPPH乙醇溶液(0.1mmol/L)反应作为空白对照，测定OD517值，以蒸馏水作对照调零。DPPH自由基清除率计算公式如下：

清除率/％＝[1-(A2-A1)/A3]×100％ (1)

式中：A1为蒸馏水替代DPPH测得的吸光度；A2为不同浓度沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜测得的吸光度；A3为蒸馏水替代沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜测得的吸光度。

如图8所示，随着多糖及多糖铜浓度的增加，DPPH自由基清除率整体呈现增加趋势，达90％以上。而沙棘果皮多糖铜复合物相对于沙棘果皮多糖而言，DPPH自由基的清除活性略低一点，但仍具有非常高的活性。

(2)ABTS自由基清除能力测定

配置0.7±0.02mol/L的ABTS工作液，在试管中分别加入不同浓度的沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)1mL以及3mL的ABTS工作液，摇匀，室温下避光反应6min，与734nm波长处测吸光度，平行三次。1mL蒸馏水分别代替沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜溶液作为空白参比，3mL80％乙醇溶液代替ABTS工作液做空白参比，测定OD734值。ABTS自由基清除率计算公式如下：

清除率/％＝[1-(As-Ar)/A0]×100％ (2)

式中：Ar为80％乙醇溶液替代ABTS测得的吸光度；As为不同浓度沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜测得的吸光度；A0为蒸馏水替代沙棘果皮多糖及沙棘果皮多糖铜测得的吸光度。

如图9所示，沙棘果皮多糖对ABTS自由基的清除能力越来越大，在浓度1mg/mL时，其清除率达到了95％左右；沙棘果皮多糖铜相比于沙棘果皮多糖对ABTS的清除率有所减低，在浓度1mg/mL时，沙棘果皮多糖铜的清除率达60％左右。总体而言，沙棘果皮多糖和沙棘果皮多糖铜复合物对ABTS自由基的清除活性都呈浓度依赖性，且都具有一定的抗氧化活性。

从图8与图9可以得出，铜与沙棘果皮多糖复合后，仍较好地保留了多糖的抗氧化活性。

本实施例中，多糖含量测定方法如下：

(一)总糖含量的测定

采用蒽酮分光光度法测定蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮和0.5g硫脲(阻氧化剂)置于烧杯中，缓慢加入50mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液。避光保存，现配现用。标准曲线的制作：称取0.2g葡萄糖于100mL容量瓶中定容，然后分别吸取1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，分别置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，可得20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L的葡萄糖系列浓度溶液。吸取系列标准糖液1mL、蒸馏水1mL，各加入5mL蒽酮试剂，混匀，盖上玻璃塞，在沸水浴中加热10min，取出后在流水中冷却，在620nm波长下，以试剂空白调零，测定A620，做标准曲线。

实验结果表明，在实验浓度范围内，吸光度与葡萄糖浓度之间存在线性关系，线性回归方程为y＝5.4416x+0.1489，相关系数R²＝0.9962，总糖含量的标准曲线，如图10所示。

测定：吸取多糖提取液1mL，加入5mL蒽酮试剂，混匀，于试管口盖上玻璃塞，在沸水浴中加热10min，取出在流水中冷却，在620nm波长下，以试剂空白调零，测定A620。与标准曲线对照，求出样品含糖总量。

(二)还原糖含量的测定

采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定：称取0.65g 3，5-二硝基水杨酸，溶于少量水中，移入100mL容量瓶中，加入2mol/L的NaOH溶液32.5mL，再加入4.5g丙三醇，摇匀，定容至100mL。

标准曲线的制作：称取葡萄糖100mg，用蒸馏水配成1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0～1mL的葡萄糖标准溶液于试管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加入3，5－二硝基水杨酸试剂1mL，在沸水浴中加热5min，取出用自来水冷却，再加入蒸馏水8mL，混匀，在波长540nm下测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

实验结果表明，在实验浓度范围内，吸光度与葡萄糖浓度之间存在线性关系，线性回归方程为y＝0.4186x+0.0114，相关系数R²＝0.9946还原糖含量的标准曲线，如图11所示。

测定步骤：吸取样液1mL，加入3，5-二硝基水杨酸1mL，在沸水浴中加热5min，取出用自来水冷却，再加入蒸馏水8mL，混匀，在波长540nm下测定吸光度。通过标准曲线，求出样品中还原糖的含量。

最后，根据公式：多糖含量＝总糖含量-还原糖含量，得到最终的多糖含量。

铜含量测定方法如下：

标准曲线：向1-6号50mL容量瓶中依次加入0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0mL的铜标准溶液，加入10mL的铜试剂标准溶液，滴加浓氨水调节PH值至9，用去离子水定容至刻度，在波长452nm处测定溶液的吸光度，绘制标准曲线，如图12所示。

溶液中铜含量测定：测定时将铜离子稀释合适浓度的范围，加入10mL的铜试剂标准溶液，滴加浓氨水至pH值为9，用纯水定容至刻度线，在波长452nm处测定样品溶液的吸光度值。

本实施例中，称取沙棘果皮多糖铜0.01g溶于去离子水中，加入10mL铜试剂，用浓氨水调节PH值至9，将溶液移入50mL容量瓶中，定容至刻度线。在波长452nm处测定样品溶液的吸光度值为0.4752。计算得出1g多糖铜中铜离子含量为0.01456g。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种沙棘果皮多糖铜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述沙棘果皮多糖铜的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，木瓜蛋白酶添加量为2％，提取时间为80min，提取pH为4.4。

3.根据权利要求1或2所述沙棘果皮多糖铜的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的pH为7.4。

4.根据权利要求1所述沙棘果皮多糖铜的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，沙棘果皮多糖与柠檬酸钠质量比为2:1。

5.根据权利要求1所述沙棘果皮多糖铜的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，氢氧化钠溶液浓度为2mol/L。