CN115028753B

CN115028753B - 具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离纯化方法及应用

Info

Publication number: CN115028753B
Application number: CN202210912645.7A
Authority: CN
Inventors: 凌娜; 汲晨锋; 徐贵国; 高铭泽
Original assignee: Harbin University of Commerce
Current assignee: Harbin University of Commerce
Priority date: 2022-07-30
Filing date: 2022-07-30
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-07-30
Also published as: CN115028753A

Abstract

具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离纯化方法及应用，它涉及多糖及其分离纯化方法和应用，它是要解决现有沙棘多糖提取方法存在成分易被破坏、耗时长、过程繁琐、提取率低的技术问题。本发明的沙棘均一多糖为HSP‑0、HSP‑1、HSP‑2或HRP‑3；它们由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、鼠李糖构成。它们是先利用闪式提取，再脱蛋白、脱色后用DEAE‑52纤维柱梯度洗脱，再用Sephadex G‑200色谱柱分离纯化后得到的。它们对人胃癌SGC‑7901和肺腺癌A549细胞具有显著的抑制作用，特别是沙棘酸性多糖HRP‑3的活性和得率最高，可用于人胃癌和肺腺癌的治疗领域。

Description

具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及多糖及其分离纯化方法，具体涉及具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖分离纯化方法，属于多糖的提取分离和应用领域。

背景技术

沙棘( Hippophae rhamnoides) ，属胡颓子科落叶灌木或小乔木，树身具刺，果橙色，一般生长在干燥、寒冷的贫瘠山区，别名醋柳、黑刺、酸刺、其察日嘎纳(蒙名) 、达普(藏名) 、吉汗(维吾尔名) 。我国沙棘分布面积较大且种类繁多、资源丰富，常见于东北、西北等地，沙棘种植覆盖面占世界总生产面积的90%以上，我国已成为沙棘产品最重要的出口国之一。沙棘是一种药食同源植物，富含黄酮、沙棘油、多糖、维生素、脂肪酸、微量元素等多种活性物质，广泛分布于沙棘果实、叶及果皮中，具有极高的食用、药用及研究价值。目前，对沙棘多糖均一化组分的纯化、结构鉴定及抗肿瘤、免疫调节等活性研究，国内外研究尚不够深入和全面，仅处于初级阶段，特别是抗肿瘤活性及机制方面的研究报道目前尚属空白。因此，通过对沙棘多糖进一步分离纯化，得到多糖均一化组分，并对其抗肿瘤活性及作用机制进行深入探讨，旨在为进一步开发沙棘产品和药物研究提供强有利的依据。

目前，沙棘多糖多采用热水提取法（10.24%）、微波辅助法（1.90%）、超声波法（8.81%）、酶法（6.59%）和酶法-超声波协同萃取法（8.15%）等。但由于沙棘多糖分子量较大、结构复杂，现有沙棘多糖提取方法存在操作时间长、过程繁琐、提取率低、多糖易降解、难以满足工业化规模生产等缺点。此外，不同提取分离方法常导致沙棘多糖单糖组分不同，从而导致多糖生物活性存在较大差别，也限制了多糖类药物的应用。因此，沙棘多糖的提取分离、纯化方法有待于进一步改进和提高。

闪式提取法是近年来发展起来的一种新型植物多糖提取方法，具有操作简便、提取时间短、提取率高、有效保护多糖结构等优点。赵宏等在2015年《辽宁中医杂志》第2期第364-366页上的文章《沙棘多糖的闪式提取工艺条件的优化》采用闪式提取法通过正交试验设计考察了电压、料液比和提取时间对沙棘多糖提取率的影响。发现当电压为225V，提取时间110s，固液比为1:30g/mL时，对沙棘多糖的提取效果最好，但提取率仅达到0.943%。周鸿立等在2019年申报专利《一种具有抗氧化功能的沙棘多糖闪式制备工艺》中运用响应面优化沙棘多糖闪式提取工艺，并确定最佳提取条件为转速5000r/min，时间为15s，温度85℃，料液比38:1ml/g，提取率为15.47%。然而，这两种方法具有一定的局限性，一是多糖提取率较低，不能将沙棘中的有效成分充分提取出来，对于沙棘产品的工业化生产造成一定的浪费，产品的生产率降低、产值下降、利润降低，也限制了多糖类产品的研发；另一方面，沙棘提取过程中温度和电压过高，可能导致多糖的分解、氧化等现象的发生，多糖高级结构被破坏，从而影响多糖的生物学活性，限制了多糖类药物的应用。

发明内容

本发明是要解决现有沙棘多糖提取方法存在成分易被破坏、耗时长、过程繁琐、提取率低的技术问题，以及填补沙棘多糖在抗肿瘤活性研究及其应用方面的空白，而提供具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离纯化方法及应用。

本发明的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖为HSP-0、HSP-1、HSP-2或HRP-3；

其中HSP-0是由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）与鼠李糖（Rha）按摩尔比为12.25：3.77：2.89：1.45：1：0.34构成的多糖；

HSP-1是由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）与半乳糖（Gal）按摩尔比为28.77：3.23：1.25：1：1.62构成的多糖；

HSP-2是由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、半乳糖（Gal）与鼠李糖（Rha）按摩尔比为2.55：0.45：1：0.77：0.32构成的多糖；

HRP-3是由阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、葡萄糖醛酸（GlcA）与半乳糖（Gal）按摩尔比为1.05：3.56：2.47：1：1.87：0.74构成的多糖。

更进一步地，沙棘均一多糖HRP-3的分子结构式为：

，其中n=10~20。

上述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，按以下步骤进行：

一、将沙棘干果去除表面杂质，粉碎、过筛，获得沙棘粗粉；石油醚回流提取，此过程需重复2次，每次时间为1h~1.5h；除去沙棘果中含有的脂溶性物质，抽滤，得到沙棘果渣；

二、按1mg沙棘果渣中加入20~40mL蒸馏水的比例，将沙棘果渣与蒸馏水混合，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为120~190V，提取时间80~130s，提取温度70~90℃，提取两次，合并提取液；

三、将提取液过滤、浓缩；然后再向浓缩液中加入无水乙醇，无水乙醇与浓缩液的体积比为4∶1，在温度为4℃条件下醇沉、离心、浓缩、干燥，获得沙棘粗多糖；

四、采用Sevag法对沙棘粗多糖进行脱蛋白处理，获得脱蛋白的沙棘多糖；

五、溶解脱蛋白的沙棘多糖，调pH值至8.0，加入H₂O₂溶液，脱色1.5～2h，获得脱色的沙棘多糖；

六、将脱色后的沙棘多糖置于透析袋中流水透析24h～48h，再用蒸馏水透析24h～48h；最后加入质量百分浓度为95%的乙醇，室温醇沉，离心、浓缩、真空干燥，得到沙棘精多糖；

七、配制5mg/mL沙棘精多糖溶液，离心、0.45μm滤膜过滤，然后加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，分别采用浓度为0、0.1、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速为0.8mL/min，每管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对洗脱液进行跟踪检测，绘制洗脱曲线，分别收集洗脱峰液体；再用蒸馏水透析24h~48h，冷冻干燥，获得四种沙棘多糖组分；

八、将每一种沙棘多糖组分溶解于蒸馏水中配制5mg/mL，离心、过滤，然后加入到预平衡好的Sephadex G-200色谱柱中，采用0.005 mol/L、pH值为 6.2的磷酸盐缓冲液进行洗脱，从而使大小不同的多糖分子得到分离纯化，控制流速为0.8mL/min，每管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对层析液进行跟踪检测，分别收集单一洗脱峰液体，再用蒸馏水透析24h～48h，冷冻干燥，获得沙棘均一多糖HSP-0、HSP-1、HSP-2和HRP-3。

更进一步地，步骤二中所述的闪式提取，按1mg沙棘果渣中加入30mL蒸馏水的比例将沙棘果渣与蒸馏水混合，提取电压为180V，提取时间为120s，提取温度为75℃。

更进一步地，步骤三中所述的在温度为4℃条件下醇沉的时间为10h~12h。

更进一步地，步骤四中所述的Sevag法脱蛋白处理的具体操作为：将沙棘粗多糖配制成饱和水溶液，然后向沙棘粗多糖水溶液中加入Sevag试剂并振荡10min~20min，然后在转速为5000rpm的条件下离心10min，弃去固相物（即变性蛋白），重复2~3次，取上清液浓缩干燥，得脱蛋白的沙棘多糖；其中所述的 Sevag试剂是用CHCl₃与CH₃(CH₂)₃OH按体积比为（3~5）：1混合而成的。

更进一步地，步骤五中所述的H₂O₂溶液的质量百分浓度为6%~7%，脱色温度为48℃～50℃；

更进一步地，步骤六中所述的醇沉，是加入3~5倍体积的95%乙醇，在室温下，醇沉20h～24h。

更进一步地，步骤六中所述的离心，是在转速为5000rpm的条件下离心10min。

更进一步地，步骤七中，用浓度为0的NaCl溶液（即蒸馏水）洗脱时，一些不带电或带电能力较弱的组分在洗脱过程中不易被DEAE-52纤维素吸附，最先被洗脱出来是中性多糖，洗脱峰液体主要成分为HRP-0；用不同浓度的NaCl溶液洗脱时，由于溶液中Cl^-的吸附性强，可被DEAE-52纤维素吸附的带有负电荷的部分洗脱下来是酸性多糖。用浓度为0.1 mol/L的NaCl溶液洗脱时，洗脱峰液体中主要成分为HRP-1；用浓度为0.3 mol/L的NaCl溶液洗脱时，洗脱峰液体中主要成分为HRP-2；用浓度为0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱时，洗脱峰液体中主要成分为HRP-3。

上述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的应用，是将具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖作为治疗胃癌和肺腺癌的药物的应用。

本发明对现有的沙棘多糖提取方法进行了改进，利用闪式提取方法能最大限度保留植物有效成分，显著缩短提取时间、明显提高沙棘多糖的提取效率。本发明的沙棘均一多糖的闪式提取工艺，当电压为180V，温度为75℃，提取时间120s，料液比为1:30时，提取两次，提取率达到23.57%，沙棘均一多糖含量为58.43mg/g，比现有技术中报道的热水回流（13.42%）、超声和酶解联用（13.94%）、闪式提取（15.47%）等方法的提取率均显著提高。同时通过降低生产成本，为沙棘多糖产品带来更高的附加值。

本发明的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖HSP-0、HSP-1、HSP-2或HRP-3，四种沙棘均一多糖通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤活性，对人胃癌SGC-7901和肺腺癌A549细胞具有显著的抑制作用，特别是沙棘酸性多糖HRP-3的活性和得率最高。多糖HRP-3主要由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成的α-D-1, 4-葡聚糖。多糖HRP-3可显著上调胃癌SGC-7901细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bad、Caspase-3、caspase-9的表达，下调Bcl-2和细胞周期蛋白Cdk2、CyclinA的表达。HRP-3可显著上调肺腺癌A549细胞中Bax、Caspase-3的表达，下调Bcl-2、CyclinA和Cdk2蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。多糖HRP-3对SGC-7901和A549细胞的抑制率最高分别达到85.56%和65.82%，作用72 h后的半数抑制浓度IC₅₀分别为0.33mg/mL和0.44mg/mL。沙棘多糖可作为新型的抗肿瘤药物，用于临床上胃癌和肺腺癌的治疗。

附图说明

图1为实施例1获得的沙棘多糖在DEAE-52柱层析的洗脱曲线；

图2为实施例1获得的沙棘均一多糖HSP-3的紫外光谱图；

图3为实施例1获得的沙棘均一多糖HSP-3的红外光谱图；

图4为实施例1获得的沙棘均一多糖HSP-3的扫描电镜图；

图5为实施例1获得的沙棘均一多糖HSP-3的¹H-NMR谱图；

图6为实施例1获得的沙棘均一多糖HSP-3的¹³C-NMR谱图；

图7为实施例1获得的HSP-3对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用图；

图8为实施例1获得的HSP-3对人肺腺癌A549细胞增殖抑制作用图；

图9为实施例1获得的HSP-3对人胃癌SGC-7901细胞中相关蛋白表达的影响图；

图10为实施例1获得的HSP-3对人肺腺癌A549细胞中相关蛋白表达的影响图。

具体实施方式

用下面的实施例验证本发明的有益效果。

实施例1：本实施例的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，按以下步骤进行：

一、将沙棘干果去除表面杂质，粉碎、过筛，获得沙棘粗粉；石油醚回流提取，此过程需重复2次，每次时间为1h，除去沙棘果中含有的脂溶性物质，抽滤得到沙棘果渣；

二、将100mg沙棘果渣与3000mL蒸馏水进行混合，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为180V，提取时间为120s，提取温度为75℃，提取次数2次，合并得到的提取液；本步骤中提取率达到23.57%，与其他方法相比有大幅度提升。

三、将提取液用0.45μm滤膜过滤，采用旋转蒸发仪将滤液进行浓缩，获得200mL浓缩液；然后再向浓缩液中加入1000mL无水乙醇，在温度为4℃条件下醇沉10h，然后再在5000rpm的条件下离心10min，再浓缩、干燥，获得沙棘粗多糖；

四、采用Sevag法对沙棘粗多糖进行脱蛋白处理，具体操作是：将沙棘粗多糖配制成100mL饱和水溶液，然后向沙棘粗多糖水溶液加入25mL的Sevag试剂振荡15min，然后在转速为5000rpm的条件下离心10min，弃去固相物（即变性蛋白），重复3次，取上清液浓缩，置于温度为40℃的烘箱中干燥，得到固体粉状脱蛋白的沙棘多糖；其中所述的 Sevag试剂是用氯仿（CHCl₃）与正丁醇（CH₃(CH₂)₃OH）按体积比为4：1混合而成的；

五、5g脱蛋白的沙棘多糖溶于100mL蒸馏水配制50mg/mL的多糖溶液，调pH值至8.0，加入质量百分浓度为6%的H₂O₂溶液，在温度为50℃条件下脱色2h，获得脱色的沙棘多糖；

六、将脱色后的沙棘多糖置于透析袋中流水透析36h，再用蒸馏水透析36h；以除去其中的无机离子、低聚糖等杂质；最后加入4倍体积的质量百分浓度为95%的乙醇，室温醇沉24h，再在转速为5000rpm的条件下离心10min，再浓缩、真空干燥，得到沙棘精多糖；

七、将脱色后的沙棘多糖加入到蒸馏水中完全溶解，在5000rpm条件下离心10min后，用0.45μm滤膜过滤，然后将滤液加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，分别采用浓度为0、0.1、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速为0.8mL/min，每管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对洗脱液进行跟踪检测，绘制洗脱曲线，分别收集蒸馏水、0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L NaCl溶液洗脱的主要洗脱峰液体；再用蒸馏水透析36h，冷冻干燥，获得四种沙棘多糖组分；本步骤中采用的DEAE-纤维素柱层析可吸附杂质、纯化多糖，适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于交换柱上，中性多糖不吸附，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱从而达到分离目的。本步骤中经DEAE-52柱层析后的洗脱曲线如图1所示，获得四种沙棘多糖，一种中性多糖，3种酸性多糖。

八、依次将每一种将沙棘多糖组分10mg溶解于2mL蒸馏水中，8000rpm条件下离心8min后用0.45µm滤膜过滤，然后将滤液加入到预平衡好的Sephadex G-200色谱柱中，采用0.005 mol/L、pH值为 6.2的磷酸盐缓冲液进行洗脱，从而使大小不同的多糖分子得到分离纯化，控制流速为0.8mL/min，每管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对层析液进行跟踪检测，分别收集单一洗脱峰液体，再用蒸馏水透析36h，冷冻干燥，获得纯化后的沙棘均一多糖HSP-0、HSP-1、HSP-2和HRP-3。本步骤中所得的四种沙棘均一多糖，分别为一种中性多糖HRP-0（294.32mg），三种酸性多糖HRP-1（177.44mg）、HRP-2（199.95mg）和HRP-3（498.25mg），四种均一多糖的得率分别为：9.81%、5.91%、6.67%、16.61%，其中HRP-3的得率最高。

经本实施例1提取的沙棘多糖含量为58.43mg/g，提取率为23.57%。

对本实施例1中获得四种均一多糖进行结构鉴定：

1. 分子量测定：制备5.0mg/mL样品溶液，5000rpm离心10min，0.22µm滤膜过滤收集样品。采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定各均一多糖组分的分子量，流动相为0.1mol/L NaCl溶液，流速为1mL/min，柱温为40℃，进样量为20µL，采用Astra软件计算多糖的分子量，结果如表1所示。

表1四种诺沙棘均一多糖的分子量如下：

样品	分子量
		HSP-0	1.03×10<sup>5 </sup>Da
HSP-1	1.55×10<sup>5 </sup>Da
		HSP-2	1.87×10<sup>5 </sup>Da
HSP-3	1.39×10<sup>5 </sup>Da

2. 单糖组成：分别取四种沙棘均一多糖10mg，90℃下溶解于2mL的3.0 mol/L三氟乙酸中酸水解6h，然后进行气相色谱分析，流动相为0.2 mol/L NaOH溶液，流速为0.5 mL/min，柱温为30℃。经本实施例获得的四种沙棘均一多糖的单糖组成及摩尔比如表2所示：

表2 实施例1获得的四种沙棘均一多糖的单糖组成及摩尔比

单糖	单糖组成	摩尔比
			HSP-0	Ara：Gal：Glc：Man：Xyl：Rha	12.25：3.77：2.89：1.45：1：0.34
HSP-1	Glc：Man：Ara：Xyl：Gal	28.77：3.23：1.25：1：1.62
			HSP-2	Glc：Man：Xyl：Gal ：Rha	2.55：0.45：1：0.77：0.32
HSP-3	Ara：Glc：Man：Xyl：GlcA：Gal	1.05：3.56：2.47：1：1.87：0.74

3. 紫外光谱分析：配制0.1mg/mL沙棘均一多糖HSP-3的水溶液，用紫外分光光度计对多糖溶液进行扫描，扫描180~600nm的波长范围。沙棘均一多糖HSP-3的紫外光谱图如图2所示。由图可知，沙棘均一多糖HSP-3在206nm处具有多糖特征吸收峰，证明HSP-3是一种多糖类物质；在260nm和280nm两个波长处均无吸收峰，说明沙棘均一多糖HSP-3中不含有游离的核酸和蛋白质。

4. 红外光谱分析：取5.0 mg沙棘均一多糖HSP-3样品与KBr粉末混合压片，在400~4000cm^-1范围内进行红外光谱扫描。沙棘均一多糖HSP-3的红外光谱图如图3所示。由图可知，沙棘均一多糖HSP-3在3422.3 cm^-1处有羟基O-H的伸缩振动峰，2977.4 cm^-1附近的吸收峰为C-H伸缩振动峰，1628.4 cm^-1处有羰基C-O伸缩振动峰，表明HSP-3是一种多糖水合物，1395.8 cm^-1附近的吸收峰与C-H的弯曲振动有关，1053.8 cm^-1处的吸收峰表明HSP-3中存在吡喃糖，881.7 cm^-1的吸收峰为β-糖苷的特征峰，红外光谱表明HSP-3是一种β构型吡喃糖。

5. 扫描电镜分析：将沙棘均一多糖HSP-3粉末均匀附着于样品台上，采用扫描电镜观察多糖表面形态。沙棘均一多糖HSP-3的扫描电镜图如图4所示；由图可知，沙棘均一多糖HSP-3呈片状结构，表面不规整，常沿边缘折叠，结构紧密，说明分子间作用力较强。

6. 核磁共振光谱分析：将2mg沙棘均一多糖HSP-3溶于D2O中，采用核磁共振波谱仪上机检测，¹H-NMR和¹³C-NMR光谱分析多糖的结构特征。沙棘均一多糖HSP-3的¹H-NMR谱图如图5所示，由图可知，在¹H-NMR谱中，端基区出现3个糖基信号，化学位移分别为δ5.32、4.70、4.49ppm，后两个化学位移均小于5ppm，表明糖残基可能为β-型吡喃糖。沙棘均一多糖HSP-3的¹³C-NMR谱图如图6所示。由图可知，在¹³C-NMR谱中有多个信号峰，分别为C1~C6信号，结合红外光谱分析，推测HSP-3可能为β-D-1, 4-葡聚糖。

从结构表征可知，沙棘均一多糖HSP-3的分子结构为：

，其中n=10~20。

由化学结构图可知，HSP-3主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸等组成的β-D-1, 4-葡聚糖。

对本实施例1中获得四种均一沙棘多糖进行抗肿瘤活性测试：

1. 生长抑制作用：采用MTT法检测沙棘四种均一多糖对人胃癌SGC-7901细胞和肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。具体操作步骤为：分别取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901和肺腺癌A549细胞进行传代，制备单细胞悬液，血球计数板计数，调整细胞密度为5×10⁴个/mL。在96孔板中每孔加入100μL单细胞悬液，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24h。每孔分别加入不同浓度的四种沙棘均一多糖溶液，每个给药组设置6个复孔，对照组加入等体积的细胞培养液，继续培养72h。弃去培养液，每孔加入100μL的0.5mg/mL MTT溶液，继续培养4h，弃上清，每孔再加入150μL DMSO溶液，振荡10min，用酶标仪在495nm波长下测定其光密度值(OD)。用以下公式计算沙棘均一多糖对胃癌HepG2细胞和肺腺癌A549细胞的生长抑制率，使用SPSS软件计算半数抑制率（IC₅₀）。

抑制率（%）＝(对照组OD值－给药组OD值)/对照组OD值×100％

2. 蛋白表达：采用Western blot检测沙棘均一多糖对胃癌SGC-7901和肺腺癌A549细胞中与细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达的影响，主要检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK2、CyclinA等蛋白的表达。详细操作步骤如下：

（1）细胞处理及蛋白样品制备：将处于对数生长期的SGC-7901和A549细胞调成浓度为5×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔培养板。培养24h后，加入不同浓度(0.2、0.4、0.8mg/mL)的HRP-3处理72h。弃去培养基，用冰的PBS洗涤2次，收集细胞转移至离心管中，每管加入细胞裂解液180 μL，冰上裂解1h，4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清液，使用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。将样品与Loading buffer等体积混合后，煮沸5min使蛋白变性，变性后的蛋白分装，保存于-20℃。

（2）SDS-PAGE电泳：首先制备分离胶和浓缩胶，取10μL变性后的蛋白样品上样进行SDS-PAGE电泳，初始电压设置为80 V，当跑过浓缩胶后（约30min），将电压调至130V，继续电泳至溴酚蓝跑至凝胶底部（约90min）。

（3）转膜：PVDF膜预先用100%甲醇处理15s，用转膜缓冲液浸泡平衡 PVDF膜、滤纸、海绵15min，安装转模装置，加入适量转移缓冲液，设置电压 110V，75min，转膜结束后将PVDF膜取出。

（4）封闭：用TBST缓冲液将PVDF膜洗涤1次，加入含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温封闭2h，弃去封闭液，再次用TBST缓冲液将PVDF膜洗涤3次（每次置于摇床晃动洗涤15min）。

（5）一抗孵育：加入一抗IgG（用封闭液按1：800的比例稀释），使PVDF膜完全被覆盖，室温水平摇床晃动1h。

（6）二抗孵育：弃去一抗，用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次（每次置于摇床晃动洗涤15min），加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按 1∶2000的比例稀释），4˚C平稳摇动过夜。

（7）蛋白检测：弃去二抗，用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次（每次置于摇床晃动洗涤15min），采用ECL化学发光试剂盒进行显色，凝胶扫描分析系统进行拍照分析。

沙棘多糖对人胃癌SGC-7901的增殖抑制作用图如图7所示，由图可知，四种沙棘均一多糖HRP-0、HRP-1、HRP-2和HRP-3对人胃癌SGC-7901细胞具有显著的生长抑制作用，且具有剂量依赖性，这四种多糖对SGC-7901细胞作用72h的IC₅₀值分别为：1.57mg/mL、0.56mg/mL、0.82mg/mL、0.33mg/mL。

沙棘多糖对人肺腺癌A549的增殖抑制作用图如图8所示，由图可知，四种沙棘均一多糖HRP-0、HRP-1、HRP-2和HRP-3对人肺腺癌A549细胞具有显著的生长抑制作用，且具有剂量依赖性，这四种多糖对A549细胞作用72h的IC₅₀值分别为：1.54mg/mL、0.76mg/mL、0.94mg/mL、0.44mg/mL。

由图7和图8的结果表明沙棘均一多糖对胃癌SGC-7901细胞和肺腺癌A549细胞具有显著的增殖抑制作用，其中HRP-3的抑制效果最好；此外，沙棘均一多糖对胃癌SGC-7901的抑制作用优于肺腺癌A549细胞。

用Western Blot法检测HRP-3对人胃癌SGC-7901细胞中相关蛋白的表达情况如图9所示，结果显示：HRP-3可显著上调胃癌SGC-7901细胞中与凋亡相关蛋白Bax、Bad、Caspase-3、caspase-9的表达，下调Bcl-2和细胞周期蛋白Cdk2、CyclinA的表达。

用Western Blot法检测HRP-3对人肺腺癌A549细胞中相关蛋白的表达情况如图10所示，结果显示：HRP-3可显著上调肺腺癌A549细胞中Bax、Caspase-3的表达，下调Bcl-2、CyclinA和Cdk2蛋白的表达，且具有剂量依赖性（P<0.05或P<0.01）。

图9和图10的结果表明沙棘多糖主要通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥对人胃癌SGC-7901和肺腺癌A549细胞的抗肿瘤活性，沙棘均一多糖为新型抗肿瘤药物的研发提供了新的理论依据和研究材料，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

二、按1mg沙棘果渣中加入20~40mL蒸馏水的比例，将沙棘果渣与蒸馏水混合，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为120~190V，提取时间80~130s，提取温度70~90℃，得到提取液；

七、配制5mg/mL沙棘精多糖溶液，离心、0.45μm滤膜过滤，然后加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，分别采用浓度为0、0.1、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速为0.8mL/min，单管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对洗脱液进行跟踪检测，绘制洗脱曲线，收集0.5mol/L的NaCl溶液的洗脱峰液体；再用蒸馏水透析24h~48h，冷冻干燥；

八、将沙棘多糖组分溶解于蒸馏水中配制5mg/mL，离心、过滤，然后加入到预平衡好的Sephadex G-200色谱柱中，采用0.005 mol/L、pH值为 6.2的磷酸盐缓冲液进行洗脱，从而使大小不同的多糖分子得到分离纯化，控制流速为0.8mL/min，单管2mL；采用苯酚-硫酸法在490nm处对层析液进行跟踪检测，收集单一洗脱峰液体，再用蒸馏水透析24h～48h，冷冻干燥，获得沙棘均一多糖HRP-3。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于步骤二中所述的闪式提取，按1mg沙棘果渣中加入30mL蒸馏水的比例将沙棘果渣与蒸馏水混合，提取电压为180V，提取时间为120s，提取温度为75℃。

3.根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于步骤三中所述的醇沉的时间为10h~12h。

4.根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤四中所述的Sevag法脱蛋白处理的具体操作为：将沙棘粗多糖配制成饱和水溶液，然后向沙棘粗多糖水溶液中加入Sevag试剂并振荡10min~20min，然后在转速为5000rpm的条件下离心10min，弃去固相物，重复2~3次，取上清液浓缩干燥，得脱蛋白的沙棘多糖；其中所述的 Sevag试剂是用CHCl₃与CH₃(CH₂)₃OH按体积比为（3~5）：1混合而成的。

5.根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤五中所述的H₂O₂溶液的质量百分浓度为6%~7%，脱色温度为48℃～50℃。

6.根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤六中所述的醇沉，是加入3~5倍体积的95%乙醇，在室温下，醇沉20h～24h。

7.一种具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖，其特征在于具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖由权利要求1至6中任一项所述的分离纯化方法制备所得的沙棘均一多糖HRP-3。

8.根据权利要求7所述的沙棘均一多糖，其特征在于沙棘均一多糖HRP-3是由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸与半乳糖按摩尔比为1.05：3.56：2.47：1：1.87：0.74构成的多糖。

9.如权利要求7或8所述的沙棘均一多糖的应用，其特征在于该应用是将具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖在制备胃癌和肺腺癌的药物中的应用。