CN117986391A - 一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP‑A及其制备方法，该抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP‑A是一种由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖按照摩尔比0.395:0.162:0.170:0.109组成的均一多糖，分子量约为48.6kDa，其主链结构主要由半乳糖醛酸和鼠李糖组成，包含糖苷键→3)‑β‑L‑Rhap‑(1、→3,4)‑β‑L‑Rhap‑(1、→4)‑α‑D‑GalAp‑(1→、→3,4)‑α‑D‑GalAp‑(1→，支链主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，支链通过→3,4)‑β‑L‑Rhap‑(1→的O‑4键连接在主链上。该桑叶多糖MBP‑A体外能够清除多种自由基，抵抗肝细胞氧化损伤，体内对药物导致的小鼠肝脏氧化损伤有显著的缓解作用，并且可以调控小鼠的肠道微生物，提高具有抗炎、抗肝损伤活性的有益菌Akkermansia的相对丰度。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术的技术领域，特别是一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A及其制备方法的技术领域。
【背景技术】
肝脏是人和动物体内主要的解毒器官，对于药物、酒精、毒物、毒素的代谢和分解具有至关重要的作用，因此肝脏也是有害物质攻击的主要靶器官。氧化应激被认为是急慢性肝脏疾病的病理基础，参与肝损伤的发生和发展，可导致肝脏炎症反应、线粒体功能障碍甚至肝坏死。桑叶是中国传统的中药材，桑叶具有“疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功能”。研究表明，桑叶中的生物碱、多酚、黄酮、多糖等都对不同原因导致的肝损伤有缓解作用，其中生物碱、多酚、黄酮等均是小分子化合物，结构简单，其提取分离纯化技术较为成熟，开发利用已有较多报道。多糖是聚合度大于10的复杂大分子，分子量可高达数万以上，而结构和分子量的不同又导致其活性差异，因此特定结构和功能的均一多糖分离制备对于桑叶多糖的开发利用具有重要意义，但目前提取桑叶中特定结构的活性多糖用于治疗肝损伤的研究还非常缺乏。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种抗肝氧化损伤的桑叶多糖MBP-A及其制备方法，所制备的桑叶多糖MBP-A纯度均一，结构明确，对肝氧化损伤有显著的缓解作用，可用于护肝活性产品的开发。
为实现上述目的，本发明提出了一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A，其单糖组成为由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖＝0.395：0.162：0.170：0.109，分子量为48.6kDa，分子结构如下：
其中，支链R通过→3、4)-α-L-Rha-(1→的O-4键与主链连接，其结构如下：
为实现上述目的，本发明还提出了一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，包括如下步骤：
a)将桑叶干燥后粉碎过筛，加入到水中，超声处理后，转至高压釜内经中温高压处理，离心过滤上清液，得到桑叶水提物。
b)将步骤a)中的桑叶水提物减压浓缩，加入乙醇，收集沉淀；
c)将步骤b)中的沉淀用热水溶解，冷却后用Sevag法脱除蛋白质，用过氧化氢氧化脱色，再次用乙醇沉淀后，收集沉淀物，得桑叶粗多糖；
d)将步骤c)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，用截留分子量为10kDa和50kDa的超滤膜过滤，获得分子量介于10kDa-50kDa的截留组分。
e)将步骤d)中的截留组分依次通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、透析膜除盐、BRT105-104-102串联凝胶柱纯化、再次透析膜除盐后，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
作为优选，所述步骤a)中，桑叶的干燥方式为烘箱温度50～60℃，过筛目数50～80目，加入水的质量体积比1：20～1：50，超声时间30～60min，高压釜中提取温度90～105℃，压力1～5Mpa，提取时间30～60min。
作为优选，所述步骤b)中将桑叶水提物浓缩至干物质含量为20～50g/L，添加乙醇至体积分数为70～75％，在静置12～24h后离心或抽滤收集沉淀物。
作为优选，所述步骤c)中沉淀用热水溶解，水量以能够完全溶解沉淀的最小体积为宜，冷却后按照体积比为4：1～6：1将桑叶粗多糖水溶液与Sevage溶液混合，所述Sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，多糖和Sevage混合物在封闭容器中剧烈振荡5～10min后离心，分离上层多糖溶液。分离的多糖溶液再次按照上述步骤加入Sevage去除蛋白，重复操作6次，最后一次分离上清液后，在上清液中添加15～25％的过氧化氢，在50～65℃下水浴2～3h，放冷后，缓慢加入乙醇至体积分数为70～75％，静置12～24h后离心，收集沉淀，并用70～75％冲洗几次，得到去蛋白脱色后的桑叶粗多糖。
作为优选，所述步骤d)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，采用MilliporeLabscale TFF系统先用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤，留取分子量大于10kDa的部分，然后再将分子量大于10kDa的部分过50kDa的超滤膜，留取分子量小于50kDa的部分，获得分子量介于10kDa～50kDa的截留组分。
作为优选，所述步骤e)中截留组分以5～10mL/min流速上DEAE-Sepharose FastFlow离子交换层析柱，用纯水以5～15mL/min流速冲洗DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱3倍柱床体积。随后，以5～15mL/min流速分别用0.2M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，各洗脱液的洗脱体积均为3倍柱床体积。用苯酚硫酸法进行追踪检测洗脱液中的多糖含量，绘制绘制散点图，根据散点图峰形，收集0.2M NaCl洗脱液中的主要对称峰，减压浓缩，3500Da透析袋透析除盐，旋蒸浓缩后，用全自动凝胶纯化系统(BRT-GS)进行纯化，结合示差检测器(RI-502SHODEX)收集主要对称峰。将收集液用3500Da透析袋再次透析除盐，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
本发明的有益效果：本发明通过超声预处理、中温高压蒸煮、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、过氧化氢法脱色后从桑叶中获得粗多糖，再用超滤膜过滤截留分子量介于10kDa-50kDa的多糖组分，然后经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、透析膜除盐、BRT105-104-102串联凝胶柱纯化、再次透析膜除盐后，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。该桑叶多糖MBP-A是一种由鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：甘露糖：阿拉伯糖：木糖以摩尔比为0.328：0.345：0.154：0.138：0.021：0.014组成的多糖，分子量约为48.6kDa，纯度均一，其主链结构主要由半乳糖醛酸和鼠李糖组成，包含糖苷键→3)-β-L-Rhap-(1、→3,4)-β-L-Rhap-(1、→4)-α-D-GalAp-(1→、→3,4)-α-D-GalAp-(1→，支链主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，支链通过→3,4)-β-L-Rhap-(1→的O-4键连接在主链上。该桑叶多糖MBP-A体外能够清除多种自由基，抵抗肝细胞氧化损伤，体内对药物导致的小鼠肝脏氧化损伤有显著的缓解作用，并且可以调控小鼠的肠道微生物，提高具有抗炎、抗肝损伤活性的有益菌Akkermansia的相对丰度。本发明所制备的桑叶多糖MBP-A可用于护肝产品开发，对于桑叶中活性成分的挖掘和利用，具有积极的社会效益和经济效益。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A纯度的HPLC色谱图；
图2a是表示多糖MBP-A的1H NMR谱特征；
图2b是表示多糖MBP-A的13C NMR谱特征；
图2c是表示多糖MBP-A的HH-COSY谱特征；
图2d是表示多糖MBP-A的HSQC谱特征；
图3是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A分子结构图；
图4a是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A对DPPH自由基的体外清除作用图；
图4b是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A对羟基自由基的体外清除作用图；
图4c是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A对过氧化氢的体外清除作用图；
图4d是桑叶多糖MBP-A对过氧化氢诱导的LO2肝细胞形态影响图；
图4e是桑叶多糖MBP-A对过氧化氢诱导的LO2肝细胞存活率影响图；
图5a是MBP-A对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝氧化损伤小鼠肝脏炎症细胞浸润的抑制作用的HE染色图；
图5b是MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的血清中谷丙转氨酶(ALT)的恢复作用图；
图5c是MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的血清中谷草转氨酶(AST)的恢复作用图；
图5d是MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的血清中过氧化氢的恢复作用图；
图5e是MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的恢复作用图；
图6是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的肠道菌群标志性物质的影响图；
图7是抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A对APAP诱导肝氧化损伤小鼠的肠道中抗炎活性有益菌Akkermansia菌属的相对丰度恢复作用图。
【具体实施方式】
实施例一、制备抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A：
原料准备：
a)将成熟桑叶在60℃烘箱中烘干后，过80目筛，按照料液比1：50加入超纯水，超声60min，转至高压釜中，在温度105℃，压力5Mpa环境下提取60min。
b)将冷却后的上述桑叶水提物浓缩至干物质含量为50g/L，添加乙醇至体积分数为75％，在静置24h后抽滤收集沉淀物。
c)将步骤b)中沉淀用热水溶解，冷却后按照体积比为6：1将桑叶粗多糖水溶液与Sevage溶液混合，所述Sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，多糖和Sevage混合物剧烈振荡10min后离心，分离上层多糖溶液。分离的多糖溶液再次按照上述步骤加入Sevage去除蛋白，重复操作6次，最后一次分离上清液后，在上清液中添加20％的过氧化氢，在65℃下水浴2h，放冷后，缓慢加入乙醇至体积分数为75％，静置24h后离心，收集沉淀，并用75％冲洗3次，得到去蛋白脱色后的桑叶粗多糖。
d)所述步骤出c)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，采用Millipore LabscaleTFF系统先用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤，留取分子量大于10kDa的部分，然后再将分子量大于10kDa的部分过50kDa的超滤膜，留取分子量小于50kDa的部分，获得分子量介于10kDa～50kDa的截留组分。
e)所述步骤d)中截留组分以10mL/min流速上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用纯水以10mL/min流速冲洗DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱3倍柱床体积。随后，以10mL/min流速分别用0.2M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，各洗脱液的洗脱体积均为3倍柱床体积。用苯酚硫酸法进行追踪检测洗脱液中的多糖含量，绘制绘制散点图，根据散点图峰形，收集0.2MNaCl洗脱液中的主要对称峰，减压浓缩，3500Da透析袋透析除盐，旋蒸浓缩后，用全自动凝胶纯化系统(BRT-GS)进行纯化，结合示差检测器(RI-502SHODEX)收集主要对称峰。将收集液用3500Da透析袋再次透析除盐，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A成品的形状为白色粉末，贮存方法为避光、干燥、常温(25℃以下)保存。
实施例二、桑叶多糖MBP-A纯度及分子量：
将实施例一所制备的桑叶多糖MBP-A，用BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)，0.05M NaCl溶液为流动相，示差检测器RI-10A在线检测其纯度和分子量，如图1所示，结果呈现单一对称峰，证明桑叶多糖MBP-A为均一多糖。绘制标准曲线并计算后，其重均分子量Mw为48.6KDa。
实施例三、桑叶多糖MBP-A核磁共振结构特征：
将实施例一所制备的桑叶多糖MBP-A，用核磁共振进行结构表征。称取桑叶多糖MBP-A样品50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5ml的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5ml的重水中，在室温25℃下置于以600MHz的核磁共振仪测定一维图谱1H NMR谱、13C NMR谱和二维图谱HH-COSY谱、HSQC谱。如图2所示，(a)表示多糖MBP-A的1H NMR谱特征，(b)表示多糖MBP-A的13C NMR谱特征，(c)表示多糖MBP-A的HH-COSY谱特征，(d)表示多糖MBP-A的HSQC谱特征，这些图谱中的信息共同构成了桑叶多糖MBP-A的结构特征。汇总这些特征信息后，可以得出桑叶多糖MBP-A的结构为图3所示，其主链结构主要由半乳糖醛酸和鼠李糖组成，包含糖苷键→3)-β-L-Rhap-(1、
→3,4)-β-L-Rhap-(1、→4)-α-D-GalAp-(1→、→3,4)-α-D-GalAp-(1→，支链主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，支链通过→3,4)-β-L-Rhap-(1→的O-4键连接在主链上。
实施例四、桑叶多糖MBP-A体外抗氧化试验：
将实施例一所制备的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A进行清除自由基试验和抗肝细胞氧化损伤实验。
实验方法：(1)DPPH自由基清除实验：用无水乙醇配制0.25mg/mL的DPPH自由基溶液。将桑叶MBP-A用无水乙醇稀释成0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL共5个梯度浓度，向96孔酶标板的微孔中分别加入180μL被测液和60μL自由基溶液，37℃孵育30min后，测定516nm处OD值。以无水乙醇代替自由基溶液作为本底对照，以无水乙醇代替被测液作为空白对照。根据下面公式计算自由基清除率：
式中，As：桑叶多糖MBP-A+DPPH乙醇溶液；Ao：桑叶多糖MBP-A+无水乙醇；Ab：无水乙醇+DPPH乙醇溶液。计算抑制率后进行多元非线性拟合利用回归方程，求出桑叶多糖MBP-A对DPPH自由基的半抑制浓度IC50。
(2)羟基自由基清除实验：1mL不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL)的桑叶多糖MBP-A样品加300μL 6mmol/L FeSO4，再加300μL 6mmol/L水杨酸混匀，然后加入300μL0.1％ H2O2(v/v)混匀，37℃下恒温反应30min，在510nm处测吸光度值(平行测定三次)，根据下面公式计算清除率：
式中，As：桑叶多糖MBP-A+FeSO4+水杨酸+H2O2；Ao：桑叶多糖MBP-A+FeSO4+水杨酸+去离子水；Ab：去离子水+FeSO4+水杨酸+H2O2。计算抑制率后进行多元非线性拟合利用回归方程，求出桑叶MBP-A对羟基自由基的半抑制浓度IC50。
(3)过氧化氢清除实验：0.1mL不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL)的桑叶多糖MBP-A样品加0.1mL的163mmol/L H2O2在37℃下恒温反应30min，用过氧化氢测定试剂盒按照说明书依次加入相应试剂后，在405nm处测吸光度值(平行测定三次)，根据下面公式计算清除率：
式中，As：桑叶多糖MBP-A+H2O2；Ao：桑叶多糖MBP-A+去离子水；Ab：去离子水+H2O2。计算抑制率后进行多元非线性拟合利用回归方程，求出桑叶MBP-A对过氧化氢的半抑制浓度IC50。
(4)抗肝细胞氧化损伤实验：将人肝细胞株LO2以1×105个/ml的密度接种于96孔板中，每孔100μl，培养液为含有10％胎牛血清的DMEM培养基，培养过夜。将细胞分为4个处理，分别为对照组(Control)、过氧化氢组(H2O2)、过氧化氢+桑叶多糖MBP-A的低剂量组(H2O2+MBP-A 25)、过氧化氢+桑叶多糖MBP-A高剂量组(H2O2+MBP-A 50)，每个处理3个重复孔。除对照组外，均加入终浓度为0.6mM的H2O2，在此基础上，过氧化氢+桑叶多糖MBP-A的低剂量组和高剂量组分别加入终浓度为25μg/mL或50μg/mL的桑叶多糖MBP-A，对照组加入等体积的无菌超纯水。细胞在5％ CO2、37℃培养箱中培养48h。培养结束后用MTT法测定细胞的活力，计算细胞存活率。用SPSS16软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，应用t检验评价试验结果，P<0.01表示有极显著差异，结果图中用**表示。
从图4a、b、c可以看出，本发明制备的桑叶多糖MBP-A对DPPH自由基、羟基自由基、过氧化氢都具有清除作用，其半数抑制率IC50分别为0.1672、0.8659、1.471mg/mL。图4d和e显示，本发明制备的桑叶多糖MBP-A对过氧化氢诱导的人正常肝细胞LO2氧化损伤有保护作用，过氧化氢导致肝细胞形态皱缩，桑叶多糖MBP-A在25μg/mL和50μg/mL的低浓度下均具有能够维持肝细胞基本形态，大大提高细胞的存活率。这些结果表明，桑叶多糖MBP-A体外能够直接清除自由基、缓解肝细胞的氧化损伤。
实施例五、桑叶多糖MBP-A体内抗肝氧化损伤试验：
将实施例一所制备的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A进行动物体内的抗肝氧化损伤实验。
实验动物及饲养条件：24只体重20±2g的SPF级雌性ICR小鼠(中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证：SCXK(沪)2022-0004])，在清洁级环境饲养，饲喂全价营养颗粒饲料，饮用自来水，自由饮食，每笼饲养8只小鼠。
试验设计及测定指标：小鼠随机分为3组，分别为Control组、APAP组、APAP+MBP-A组，每组8只饲养于一笼中。APAP组每日灌胃对乙酰氨基酚300mg/kg体重，APAP+MBP-A组每日灌胃300mg/kg体重对乙酰氨基酚和250mg/kg桑叶多糖MBP-A，Control组每日灌胃等体积的超纯水。试验周期10周，实验结束后将小鼠麻醉，取血，解剖取肝脏做HE染色，观察肝脏病例损伤。血液分离血清后测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、过氧化氢、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。取盲肠内容物，用16S rDNA测序方法检测肠道中菌群结构的变化。
数据分析：用SPSS16软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，应用t检验评价试验结果，P<0.05和P<0.01分别表示两组之间差异显著和极显著，结果图中分别用*和**表示。
从图5可以看出，APAP诱导小鼠肝脏产生了损伤，导致炎症细胞浸润(图5a)，血清中反应肝脏损伤的ALT和AST两个转氨酶水平显著升高(图5b、c)，过氧化氢和炎症因子TNF-α的水平均显著上升(图5d、e)。本工艺制备的桑叶多糖MBP-A显著改善了APAP诱导的肝脏氧化损伤，降低了肝脏组织中炎症浸润程度(图5a)，显著降低了血液中ALT、AST、过氧化氢、TNF-α的水平(图5b、c、d、e)，表明桑叶多糖MBP-A具有体内抗肝脏氧化损伤的功效。
图6显示了Control组、APAP组、和APAP+MBP-A组中的标志性微生物，分析发现Verrucomicrobiota门的Akkermansia属细菌在Control组和APAP+MBP-A具有较高的相对丰度，而在APAP组的相对丰度显著降低(图7)。现有研究已经证明Akkermansia是具有抗炎作用的菌属，其在APAP诱导的肝脏氧化损伤中的保护作用已被证实(Xia J,Lv L,Liu B,etal.Akkermansia muciniphila Ameliorates Acetaminophen-Induced Liver Injury byRegulating Gut Microbial Composition and Metabolism.Microbiol Spectr.2022,10(1):e0159621.)，本工艺制备的桑叶多糖MBP-A能够提高Akkermansia菌属的丰度，是其发挥抗肝损伤功效的重要特征之一。
以上实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A，其特征在于：所述抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A为由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖按照摩尔比0.395:0.162:0.170:0.109组成的支链多糖，分子量为48.6kDa，分子结构如下：
其中，支链R通过→3,4)-α-L-Rha-(1→的O-4键与主链连接，其结构如下：
2.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a)将桑叶干燥后粉碎过筛，加入到水中，超声处理后，转至高压釜内经中温高压处理，离心过滤上清液，得到桑叶水提物；
b)将步骤a)中的桑叶水提物减压浓缩，加入乙醇，收集沉淀；
c)将步骤b)中的沉淀用热水溶解，冷却后用Sevag法脱除蛋白质，用过氧化氢氧化脱色，再次用乙醇沉淀后，收集沉淀物，得桑叶粗多糖；
d)将步骤c)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，用截留分子量为10kDa和50kDa的超滤膜过滤，获得分子量介于10kDa-50kDa的截留组分；
e)将步骤d)中的截留组分依次通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、透析膜除盐、BRT105-104-102串联凝胶柱纯化、再次透析膜除盐后，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
3.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，桑叶的干燥方式为烘箱温度50～60℃，过筛目数50～80目，加入水的质量体积比1：20～1：50，超声时间30～60min，高压釜中提取温度90～105℃，压力1～5Mpa，提取时间30～60min。
4.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤b)中水提具体为，将桑叶水提物浓缩至干物质含量为20～50g/L，添加乙醇至体积分数为70～75％，在静置12～24h后离心或抽滤收集沉淀物。
5.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中沉淀用热水溶解，水量以能够完全溶解沉淀的最小体积为宜，冷却后按照体积比为4：1～6：1将桑叶粗多糖水溶液与Sevage溶液混合，所述Sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，多糖和Sevage混合物在封闭容器中剧烈振荡5～10min后离心，分离上层多糖溶液。分离的多糖溶液再次按照上述步骤加入Sevage去除蛋白，重复操作6次，最后一次分离上清液后，在上清液中添加15～25％的过氧化氢，在50～65℃下水浴2～3h，放冷后，缓慢加入乙醇至体积分数为70～75％，静置12～24h后离心，收集沉淀，并用70～75％冲洗几次，得到去蛋白脱色后的桑叶粗多糖。
6.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤d)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，采用MilliporeLabscale TFF系统先用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤，留取分子量大于10kDa的部分，然后再将分子量大于10kDa的部分过50kDa的超滤膜，留取分子量小于50kDa的部分，获得分子量介于10kDa～50kDa的截留组分。
7.如权利要求2至6中任一项所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤e)中截留组分以5～10mL/min流速上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用纯水以5～15mL/min流速冲洗DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱3倍柱床体积。随后，以5～15mL/min流速分别用0.2M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl洗脱DEAE-SepharoseFast Flow离子交换层析柱，各洗脱液的洗脱体积均为3倍柱床体积。用苯酚硫酸法进行追踪检测洗脱液中的多糖含量，绘制绘制散点图，根据散点图峰形，收集0.2M NaCl洗脱液中的主要对称峰，减压浓缩，3500Da透析袋透析除盐，旋蒸浓缩后，用全自动凝胶纯化系统(BRT-GS)进行纯化，结合示差检测器(RI-502SHODEX)收集主要对称峰。将收集液用3500Da透析袋再次透析除盐，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
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