CN109796538A - 提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 - Google Patents
提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109796538A CN109796538A CN201910034544.2A CN201910034544A CN109796538A CN 109796538 A CN109796538 A CN 109796538A CN 201910034544 A CN201910034544 A CN 201910034544A CN 109796538 A CN109796538 A CN 109796538A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- porphyra yezoensis
- dpspy
- degradation
- obtains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提出了一种提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，包括以下步骤：粗多糖溶液中加入过氧化氢和抗坏血酸，用水稀释后获得混合液；将所得混合液在40～60℃保温搅拌反应1～3h，获得反应液；将所得的反应液浓缩至原体积的15％～20％，得浓缩液；向浓缩液中加入无水乙醇，于0～5℃静置过夜，之后离心，获得沉淀；将所得沉淀加入去离子水进行复溶后进行透析，获得透析液Ⅰ；将所得的透析液Ⅰ浓缩后进行冷冻干燥，得到条斑紫菜降解多糖。本发明得到的条斑紫菜降解多糖与条斑紫菜粗多糖相比，体外抗氧化活性、胆酸结合活性和免疫活性均显著提高。本发明还提出一种如上述方法制备所得到的降解条斑紫菜多糖作为功能性食品基料的应用。
Description
技术领域
本发明属于化学化工技术领域，涉及一种通过过氧化氢和抗坏血酸结合的方法对条斑紫菜多糖进行降解从而增强其生物活性的方法。
背景技术
条斑紫菜是在日本、韩国和中国等东亚和东南亚国家广泛种植和消费的一种可食用经济型褐藻。可食用的板状干燥条斑紫菜被称为“海苔”，传统上被用于日本料理，如寿司。海苔已知含有一些生物功能成分，如条斑紫菜多糖、牛磺酸、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素和类细胞外膜孔道蛋白、类氨基酸以及矿物质、维生素等。据文献报道，条斑紫菜多糖具有提高哺乳动物免疫力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此将条斑紫菜开发成功能食品有很好的前景。
条斑紫菜水提多糖主要为水溶性的硫酸多糖，分子量大，生物活性相对较低。因此需要对其做进一步改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种提高条斑紫菜多糖生物活性的方法；
为解决上述技术问题，本发明提出一种提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，包括以下步骤：
S1、向条斑紫菜粗多糖溶液中加入过氧化氢和抗坏血酸，用水稀释后获得混合液；
所述过氧化氢和抗坏血酸的摩尔比＝1：0.8～1.2；
所述混合液中条斑紫菜粗多糖浓度为2～6mg/mL，过氧化氢(及抗坏血酸)的浓度为2～6mmol/L；
将所得混合液在40～60℃保温搅拌反应1～3h，获得反应液；
S2、将步骤S1所得的反应液浓缩至原体积的15％～20％，得浓缩液；
向浓缩液中加入无水乙醇，于0～5℃静置过夜(12h)，之后离心(8000rpm,20min)，获得沉淀；
所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:3.5～4.5；
将所得沉淀加入去离子水进行复溶后进行透析，获得透析液Ⅰ(即，透析袋中保留的溶液)；
所述去离子水与浓缩液的体积比为1:0.8～1.2；
将所得的透析液Ⅰ浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥(-40～-60℃冷冻干燥24小时)，得到条斑紫菜降解多糖(DPSPY)。
作为本发明提高条斑紫菜多糖生物活性的方法的改进：
所述混合液中：
条斑紫菜粗多糖浓度的浓度为5mg/mL，过氧化氢的浓度为4.1mmol/L、抗坏血酸的浓度为4.1mmol/L；
将所得混合液在52.4℃条件下搅拌反应2.1h，获得反应液；
作为本发明提高条斑紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：
所述步骤S2中：
将步骤1)所得的反应液浓缩至原体积的1/6，得浓缩液；
向浓缩液中加入无水乙醇，于4℃静置过夜(12h)，之后离心(8000rpm,20min)，获得沉淀；
所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4；
取沉淀用去离子水进行复溶后用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h，获得透析液Ⅰ；
所述去离子水与浓缩液的体积比为1:1；
将所得的透析液Ⅰ浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥(-50～-60℃冷冻干燥24小时)，得到条斑紫菜降解多糖(DPSPY)；
作为本发明提高条斑紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：
将步骤S2所得条斑紫菜降解多糖(DPSPY)进行分离纯化，其方法为：
①、粗分：
按照450mg:4.8～5.2ml的比例，将步骤S2所得条斑紫菜降解多糖(DPSPY)溶于去离子水中，离心取上清液Ⅰ；
将上清液Ⅰ均匀的加入到层析柱填料上表面，经DEAE Cellulose-52层析柱，依次用去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液分别进行洗脱(当检测到洗脱剂对应的洗脱液中不含有多糖时，则换下一种洗脱剂进行洗脱；可采用硫酸-苯酚法隔管检测其在490nm处的紫外吸收值)，流速为1mL/min(每10min收集1管)；
分别收集去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液这4种洗脱剂各自对应的洗脱液，旋蒸浓缩(60℃下旋转蒸发浓缩至为原体积的10％)、透析脱盐(用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h)、将所得透析液Ⅱ(透析袋中保留的溶液)冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)，得到条斑紫菜降解多糖的四种初步纯化多糖组分；
注：采用DEAE Cellulose-52进行洗脱，柱子规格为60cm×Φ2.6cm，有效长度为50cm；
②、纯化：
分别将步骤①所得四种初步纯化多糖组分进行以下操作：
按照250mg:4.8～5.2ml的比例，将步骤①所得初步多糖组分分别溶于去离子水中，离心(6000r/min的转速下离心10分钟)取上清液Ⅱ；
将上清液Ⅱ通过0.45μm过滤后，加样于Sephadex G-100凝胶色谱柱中，用去离子水作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.25mL/min，每管20min，获得洗脱液(当检测到洗脱液中无多糖时，则停止洗脱；可采用硫酸-苯酚法隔管检测其在490nm处的紫外吸收值)；
将所得洗脱液经旋蒸浓缩(60℃下旋转蒸发浓缩至原体积的10％)、冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)，后获得对应纯化多糖组分(即，DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M)；
注：采用Sephadex G-100凝胶色谱柱，层析柱规格为60cm×Φ1.6cm，柱子的有效体积为50cm×Φ1.6cm；
作为本发明提高条斑紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：
所述条斑紫菜多糖生物活性包括抗氧化活性、胆酸结合活性及免疫调节活性；
利用上述任一方法制备所得到的条斑紫菜降解多糖、纯化多糖组分作为功能性食品基料的应用。
备注说明：本发明条斑紫菜粗多糖按照文献报道的方法制备(Jie Xu,Li-Li Xu,Qin-Wei Zhou,Shu-Xian Hao,Tao Zhou,Hu-Jun Xie.Enhanced in vitro antioxidantactivity of polysaccharides from Enteromorpha Prolifera by enzymaticdegradation.Journal of Food Biochemistry.2016，40(3),275-283.)。
针对现有技术，本发明的技术优势是：
1.与未降解的条斑紫菜粗多糖(PSPY)相比，本发明所得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)的体外抗氧化活性、体外免疫活性和体外胆汁酸结合能力显著提高。
2.本发明对条斑紫菜降解多糖(DPSPY)进行分离纯化后得到的四个分离纯化组分，其中DPSPY-0.5M组分具有相对较高的体外抗氧化和体外免疫活性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是实验1中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M进行还原能力的测试结果。
图2是实验2中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M的DPPH自由基清除能力的测试结果。
图3是实验3中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M的超氧阴离子自由基清除能力的测试结果。
图4是实验4中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M的羟基自由基清除能力的测试结果。
图5是实验5中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)的胆酸结合能力的测试结果。
图6是实验6中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响(图6上表示培养24h后的测试结果，图6下表示培养48h后的测试结果)。
图7是实验7中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M对RAW264.7细胞吞噬活性的影响(图7上表示培养24h后的测试结果，图7下表示培养48h后的测试结果)。
图8是实验8中条斑紫菜粗多糖(PSPY)、由本发明实施例1-1得到的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)和实施例2-1得到的四个分离纯化组分DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M及DPSPY-0.5M对RAW264.7细胞分泌NO的影响(图8上表示培养24h后的测试结果，图8下表示培养48h后的测试结果)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1-1：
S1、将条斑紫菜粗多糖(PSPY)溶于蒸馏水配成浓度为10mg/mL的条斑紫菜粗多糖溶液；
向条斑紫菜粗多糖溶液中加入过氧化氢和抗坏血酸，用蒸馏水稀释后获得混合液。
过氧化氢和抗坏血酸的摩尔比＝1：1。
所得混合液中过氧化氢和抗坏血酸的终浓度均为4.1mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL。
将所得混合液在52.4℃保温搅拌反应2.1h，从而实现对条斑紫菜粗多糖进行降解，获得反应液；
S2、将步骤S1所得的反应液于60℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/6，得浓缩液；
向浓缩液中加入浓度为无水乙醇，于4℃静置过夜(12h)，之后离心(8000rpm,20min)，获得沉淀。
浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4。
取沉淀用去离子水进行复溶，用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h，获得透析液Ⅰ(即，透析袋中保留的溶液)；
浓缩液与去离子水的体积比为1:1。
将所得的透析液Ⅰ60℃下旋转蒸发浓缩至原体积的25％，于-60℃冷冻干燥24小时，得到条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-1)，其浓度为4mg/mL时，DPSPY1-1对DPPH自由基的清除率为51.0％。
DPSPY1-1的组成及分子量见表1。
表1、降解多糖DPSPY1-1和粗多糖的组成和分子量比较
注:Gal,Glc,Man,Xyl和Rha分别代表半乳糖、葡糖糖、甘露糖、木糖和鼠李糖。
实施例1-2、调节实施例1-1中过氧化氢和抗坏血酸的用量，并相应调节去离子水的用量，使过氧化氢和抗坏血酸终浓度均为6mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL；将所得混合液在50℃保温搅拌反应1.5h，获得反应液。其余均等同于实施例1-1，获得条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-2)，其浓度为4mg/mL时，DPSPY1-2对DPPH自由基的清除率为39.4％。
实施例1-3、调节实施例1-1中过氧化氢和抗坏血酸的用量，并相应调节去离子水的用量，使过氧化氢和抗坏血酸终浓度均为2mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL，将所得混合液在50℃保温搅拌反应2.5h，获得反应液。其余均等同于实施例1-1，获得条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-3)，其浓度为4mg/mL时，DPSPY1-3对DPPH自由基的清除率为44.6％。
实施例1-4、调节实施例1-1中过氧化氢和抗坏血酸的用量，并相应调节去离子水的用量，使过氧化氢和抗坏血酸终浓度均为4mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL，将所得混合液在60℃保温搅拌反应2.5h，获得反应液。其余均等同于实施例1-1，获得条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-4)，其浓度为4mg/mL时，DPSPY1-4对DPPH自由基的清除率为47.1％。
实施例1-5、调节实施例1-1中过氧化氢和抗坏血酸的用量，并相应调节去离子水的用量，使过氧化氢和抗坏血酸终浓度均为4mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL，将所得混合液在40℃保温搅拌反应1.5h，获得反应液。其余均等同于实施例1-1，得到条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-5)，其浓度为4mg/mL时，DPSPY1-2对DPPH自由基的清除率为37.7％。
对比例1、调节实施例1-1中过氧化氢和抗坏血酸的用量，并相应调节去离子水的用量，使过氧化氢和抗坏血酸终浓度均为20mmol/L，条斑紫菜粗多糖终浓度为5mg/mL，将所得混合液在40℃保温搅拌反应1.5h，获得反应液。其余均等同于实施例1-1，其浓度为4mg/mL时，所得条斑紫菜降解多糖DPSPY-1D对DPPH自由基的清除率为33.8％。
对比例2、将实施例1-1中“在52.4℃保温搅拌反应2.1h”更改为“在25℃保温搅拌反应1h”，其余均等同于实施例1-1，其浓度为4mg/mL时，所得条斑紫菜降解多糖DPSPY-2D对DPPH自由基的清除率为28.6％。
实施例2-1、
准确称取实施例1-1制备获得的条斑紫菜降解多糖(DPSPY1-1)450mg，溶于5mL的去离子水中，6000r/min的转速下离心10分钟取上清液Ⅰ，将上清液Ⅰ均匀的加入到层析柱填料上表面，经DEAE Cellulose-52层析柱(柱子规格为60cm×Φ2.6cm，有效长度为50cm)，依次用去离子水、以及浓度为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液这5种洗脱剂进行洗脱，控制流速1mL/min每管10min，用自动收集器收集；以硫酸-苯酚法隔管检测所得各组洗脱液在490nm处的紫外吸收值，并绘制洗脱曲线。
注：通过硫酸-苯酚法检测洗脱液在490nm处的紫外吸收值从而判定洗脱液中是否含有多糖，当检测到洗脱剂对应的洗脱液中不含有多糖时，则换下一种洗脱剂进行洗脱；
由于0.7mol/LNaCl的洗脱液中糖含量较少，不予进一步研究。
分别按照洗脱剂类型合并用去离子水、以及浓度为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂洗脱得到的四种含糖洗脱液(洗脱液体积分别为180、760、950、400mL)，经60℃下旋转蒸发浓缩至为原体积的10％、透析脱盐(用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h)、将所得透析液Ⅱ(透析袋中保留的溶液)冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)，得到条斑紫菜降解多糖的四个初步纯化多糖组分。
四个初步纯化多糖组分再分别经SephadexG-100凝胶柱层析纯化(层析柱规格为60cm×Φ1.6cm，有效长度为50cm)，用去离子水进行洗脱，纯化后得到DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M四个纯化多糖组分；
对每个初步纯化多糖组分具体进行如下步骤：
取初步纯化多糖组分250mg溶于5mL去离子水中，离心(6000r/min的转速下离心10分钟)取上清液Ⅱ并过0.45μm的滤膜，加样于葡聚糖凝胶色谱柱里(即，SephadexG-100凝胶柱)，以去离子水作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.25mL/min，每管20min。用硫酸-苯酚法逐管检测所得洗脱液在490nm处紫外吸收值，绘制Sephadex G-100色谱柱洗脱曲线(用于确认收集的管数与样品的纯度，当检测到所得洗脱液不含有多糖时，停止洗脱)；
洗脱液经60℃下旋转蒸发浓缩至原体积的10％、冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)后得到对应纯化多糖组分，即，DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M四个纯化多糖组分。它们的组成及分子量见表2。
表2、四个纯化多糖组分的组成和分子量
Note:Gal,Glc,Man,Xyl和Rha分别代表半乳糖、葡糖糖、甘露糖、木糖和鼠李糖。
实验1、
采用文献(Yen G,Chen H.Antioxidant activity of various tea extracts inrelation to their antimutagenicity[J].Journal ofAgricultural and FoodChemistry,1995,43:27-32.)报道的方法，将实施例2-1得到的条斑紫菜降解多糖的四个分离纯化组分进行还原能力的测试，并与降解多糖(DPSPY)和条斑紫菜粗多糖(PSPY)进行比较。由图1可见，对条斑紫菜降解多糖(DPSPY)进行降解后所得分离纯化组分(DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M、DPSPY-0.5M)还原力得到显著提高。
实验2、
采用文献(Espin J C,Soler-Rivas C,Wichers H J,etal.Anthocyanin-basednatural colorants:a new source of antiradical activity for foodstuff[J].Journal Agricultural Food Chemistry,2000,48(5):1588-1592.)报道方法，将实施例2-1得到的条斑紫菜降解多糖的四个分离纯化组分进行DPPH自由基清除能力的测试，并与降解多糖和条斑紫菜粗多糖进行比较。由图2可见，与条斑紫菜粗多糖相比，条斑紫菜降解多糖对DPPH自由基清除能力得到显著提高。条斑紫菜粗多糖(PSPY)和条斑紫菜降解多糖(DPSPY)的IC50分别为15.067mg/mL和3.71mg/mL。但DPSPY的清除DPPH自由基的活性仍小于维生素C(IC50为0.005mg/mL)。
实验3、
采用文献(徐艳，曲婷婷.甘草消除氧自由基的体外研究[J].食品研究与开发,2006,27(8)：63-65.Prasad N K,Yang B,Zhao M M,et al.Effects ofhigh-pressuretreatment on the extraction yield,phenolic content and antioxidant activityof litchi(Litchi chinensisSonn.)fruit pericarp.International Journal ofFoodScience and Technology,2009,44:960-966.)报道方法，将实施例2-1得到的条斑紫菜降解多糖的四个分离纯化组分进行超氧阴离子自由基清除能力的测试，并与降解多糖和条斑紫菜粗多糖进行比较。由图3可见，对条斑紫菜粗多糖(PSPY)进行降解后获得的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)超氧阴离子自由基清除能力得到显著提高。但DPSPY的超氧阴离子自由基的活性仍小于维生素C。PSPY和DPSPY清除超氧阴离子自由基的IC50分别为12.44mg/mL和8.39mg/mL。
实验4、
采用文献(Chen H W,ChenAH,Shao Y,etal.Studies on the antioxidantcapacity ofzinc rich exopolysaccharide of cordyceps militaris[J].Food andFermentation Industries,2009,35(6):54-57.Deng C,Hu Z,Fu H T,Hu M H,etal.Chemical analysis and antioxidant activity in vitro of aβ-D-glucanisolated from Dictyophora indusiata.International Journal of BiologicalMacromolecules,2012,51:70-75.)报道方法，将实施例2-1得到的条斑紫菜降解多糖的分离纯化组分进行羟基自由基清除能力的测试，并与降解多糖和未降解多糖进行比较。由图4可见，对条斑紫菜粗多糖(PSPY)进行降解后获得的条斑紫菜降解多糖(DPSPY)的羟基自由基清除能力得到显著提高。但DPSPY的超氧阴离子自由基的活性仍小于维生素C。PSPY和DPSPY羟基自由基清除能力的IC50分别为19.25mg/mL和10.86mg/mL。
实施例1-2～实施例1-5制备所得的“条斑紫菜降解多糖(DPSPY)、对比例1-1～对比例1-2所得的条斑紫菜降解多糖，按照上述实验1～实验4所述方法进行检测，所得结果与实施例-1的对比，如下表所示；
表3.实施例1-1～1-5以及对比例1和2得到的降解多糖的抗氧化活性比较
实验5、
采用文献(何平伟.三种不同谷物可溶性(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖结构与束缚胆汁酸特性的对比研究[D].华南理工大学，2016.)报道方法，以消胆胺为阳性对照，纤维素为阴性对照，分别对多糖结合胆酸钠、鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠的能力进行测定。将实施例1-1得到的降解多糖DPSPY进行胆汁酸结合能力的测定，并与粗多糖PSPY进行比较。由图5可见，降解后的多糖DPSPY对这五种胆酸的结合能力都显著高于未降解的多糖PSPY，表明降解后多糖具有更强的降血脂活性。
实验6、
MTT法检测RAW264.7巨噬细胞增殖：
取处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，将该细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔50μL；
实验组：分别加入50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的多糖溶液(PSPY、DPSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M)各50μL，使样品最终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL。
空白对照组：加入50μL的DMEM高糖培养基；、阳性对照组：加入50μL浓度为10μg/mL、15μg/mL、30μg/mL的脂多糖(LPS)，使终浓度为5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL。
每组设置6个复孔，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
细胞分别培养24h和48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，轻轻混匀后，在37℃、5％CO2细胞培养箱中继续孵育4h，吸弃孔内培养液(将96平板轻轻倒扣并用吸水纸吸干)，每孔加入100μL Formazan Solubilization Solution(试剂盒中组分C)，轻轻震荡使甲臜全部溶解，在酶标免疫检测仪570nm测定OD值。独立批次细胞重复3次。
由图6可见，无论作用24h(图6上)还是48h(图6下)，DPSPY的作用效果均高于PSPY，进一步说明H2O2-Vc法降解条斑紫菜粗多糖能提高条斑紫菜多糖促进RAW264.7细胞的增殖的活性。在作用24h后各级纯化组分均比PSPY和DPSPY的作用效果强，其中在500μg/mL浓度时DPSPY-0.3M的作用效果最强，其增值指数达到251.4％。
巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要组成部分，增殖是免疫细胞分化成多种功能表型发挥免疫作用的重要基础。本研究表明，条斑紫菜多糖和其降解多糖及分离纯化各级组分均能促进RAW264.7细胞的增殖，从而提高免疫力。
实验7、
中性红法测定RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力：
取处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，调整细胞浓度为4×105个/mL,每孔50μL接种于96孔细胞培养板中；
实验组：分别加入50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的多糖溶液(PSPY、DPSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M)50μL，使样品最终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL；
空白对照组：加入50μL的培养基(DMEM高糖培养基)；
注：DMEM高糖培养基为现有常用培养基，故无需对其具体配方进行介绍，相关领域的技术人员也能轻易获得该培养基。
阳性对照组：加入50μL浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的LPS，使终浓度为5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL。
每组设置6个复孔，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
细胞分别培养24h和48h后，吸弃孔内培养液(将96平板轻轻倒扣并用吸水纸吸干)，每孔加入0.075％的无菌中性红PBS溶液100μL，继续培养4h，吸弃孔内培养液(将96平板轻轻倒扣并用吸水纸吸干)，每孔加入200μLPBS洗3遍吸干。每孔加入细胞裂解液150μL(冰醋酸﹕无水乙醇＝1﹕1，体积比),37℃放置1h，振荡均匀后于570nm处测OD值。
巨噬细胞吞噬中性红能力的强弱可以间接的反应其免疫活性的高低。所得结果如图7所述，由图7可得知：无论样品作用时间是24h(图7上)还是48h(图7下)，与空白对照组相比，样品处理组的吸光度值均有不同程度的提高，说明在PSPY、DPSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M、DPSPY-0.5M的诱导下，巨噬细胞吞噬中性红的能力得到不同程度的提高，但是剂量依赖性不明显。就单个样品处理组而言，吞噬能力随给药浓度和给药时间的增加而增加，在浓度为500μg/mL时诱导细胞吞噬能力最强。给药24h时DPSPY-0.1M和DPSPY-0.5M两组诱导巨噬细胞吞噬作用较强(图7上)；而给药48h时各组对巨噬细胞诱导吞噬能力作用差别不大(图7上)。
实验8、
Griess法检测多糖样品对RAW264.7细胞分泌NO的影响：
取处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，调整细胞浓度为4×105个/mL,每孔50μL接种于96孔细胞培养板中；
实验组：分别加入50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的多糖溶液(PSPY、DPSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M)50μL，使样品最终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL；
空白对照组：加入50μL的DMEM高糖培养基；
阳性对照组：加入50μL浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的LPS，使终浓度为5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL。
每组设置6个复孔，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
细胞分别培养24h和48h后，将细胞培养上清液转移至另一96孔细胞培养板中，各孔加入磺胺溶液和萘乙二胺溶液的混合溶液(体积比1﹕1)100μL，避光反应10min后，于570nm处测定OD值
由图8可知，无论作用24h还是48h，与空白对照组相比PSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M和DPSPY-0.3M四种样品对巨噬细胞分泌NO基本没有作用，而DPSPY和DPSPY-0.5M两种样品随剂量的增加能明显的促进RAW264.7细胞分泌NO，剂量依赖性显著(P＜0.05)。说明H2O2-Vc法条斑紫菜降解多糖能明显的提高其对RAW264.7细胞分泌NO活性。同时也证明了DPSPY-0.5M是DPSPY中相对于提高对RAW264.7细胞分泌NO活性的有效成分。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，其特征是包括以下步骤：
S1、向条斑紫菜粗多糖溶液中加入过氧化氢和抗坏血酸，用水稀释后获得混合液；
所述过氧化氢和抗坏血酸的摩尔比＝1：0.8～1.2；
所述混合液中条斑紫菜粗多糖浓度为2～6mg/mL，过氧化氢的浓度为2～6mmol/L；
将所得混合液在40～60℃保温搅拌反应1～3h，获得反应液；
S2、将步骤S1所得的反应液浓缩至原体积的15％～20％，得浓缩液；
向浓缩液中加入无水乙醇，于0～5℃静置过夜，之后离心，获得沉淀；
所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:3.5～4.5；
将所得沉淀加入去离子水进行复溶后进行透析，获得透析液Ⅰ；
所述去离子水与浓缩液的体积比为1:0.8～1.2；
将所得的透析液Ⅰ浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥，得到条斑紫菜降解多糖。
2.根据权利要求1所述提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：
所述混合液中：
条斑紫菜粗多糖浓度的浓度为5mg/mL，过氧化氢的浓度为4.1mmol/L、抗坏血酸的浓度为4.1mmol/L；
将所得混合液在52.4℃条件下搅拌反应2.1h，获得反应液。
3.根据权利要求2所述提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：
所述步骤S2中：
将步骤1)所得的反应液浓缩至原体积的1/6，得浓缩液；
向浓缩液中加入无水乙醇，于4℃静置过夜，之后离心，获得沉淀；
所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4；
取沉淀用去离子水进行复溶后用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h，获得透析液Ⅰ；
所述去离子水与浓缩液的体积比为1:1；
将所得的透析液Ⅰ浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥，得到条斑紫菜降解多糖。
4.根据权利要求1～3任一所述提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：
将步骤S2所得条斑紫菜降解多糖进行分离纯化，其方法为：
①、粗分：
按照450mg:4.8～5.2ml的比例，将步骤S2所得条斑紫菜降解多糖(DPSPY)溶于去离子水中，离心取上清液Ⅰ；
将上清液Ⅰ均匀的加入到层析柱填料上表面，经DEAE Cellulose-52层析柱，依次用去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液分别进行洗脱，流速为1mL/min；
分别收集去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液这4种洗脱剂各自对应的洗脱液，旋蒸浓缩、透析脱盐、将所得透析液Ⅱ冷冻干燥，得到条斑紫菜降解多糖的四种初步纯化多糖组分；
②、纯化：
分别将步骤①所得四种初步纯化多糖组分进行以下操作：
按照250mg:4.8～5.2ml的比例，将步骤①所得初步多糖组分分别溶于去离子水中，离心取上清液Ⅱ；
将上清液Ⅱ通过0.45μm过滤后，加样于Sephadex G-100凝胶色谱柱中，用去离子水作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.25mL/min，每管20min，获得洗脱液；
将所得洗脱液经旋蒸浓缩、冷冻干燥，后获得对应纯化多糖组分。
5.根据权利要求4所述提高条斑紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：
所述条斑紫菜多糖生物活性包括抗氧化活性、胆酸结合活性及免疫调节活性。
6.如权利要求1～5任一方法制备所得到的条斑紫菜降解多糖、纯化多糖组分作为功能性食品基料的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910034544.2A CN109796538B (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910034544.2A CN109796538B (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109796538A true CN109796538A (zh) | 2019-05-24 |
| CN109796538B CN109796538B (zh) | 2021-06-29 |
Family
ID=66558916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910034544.2A Active CN109796538B (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109796538B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114316080A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-04-12 | 浙江工商大学 | 提高灰树花粗多糖提取率及生物活性的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102319256A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-01-18 | 中国科学院海洋研究所 | 紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用 |
| CN103168784A (zh) * | 2011-12-23 | 2013-06-26 | 中国科学院海洋研究所 | 紫菜寡糖在紫菜病害防治中的应用 |
| CN105542022A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-05-04 | 浙江工商大学 | 提高浒苔多糖生物活性的方法 |
-
2019
- 2019-01-15 CN CN201910034544.2A patent/CN109796538B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102319256A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-01-18 | 中国科学院海洋研究所 | 紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用 |
| CN103168784A (zh) * | 2011-12-23 | 2013-06-26 | 中国科学院海洋研究所 | 紫菜寡糖在紫菜病害防治中的应用 |
| CN105542022A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-05-04 | 浙江工商大学 | 提高浒苔多糖生物活性的方法 |
Non-Patent Citations (15)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114316080A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-04-12 | 浙江工商大学 | 提高灰树花粗多糖提取率及生物活性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109796538B (zh) | 2021-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shu et al. | Extraction, purification and properties of water-soluble polysaccharides from mushroom Lepista nuda | |
| Wang et al. | Structural characterization of a novel polysaccharide from Pleurotus citrinopileatus and its antitumor activity on H22 tumor-bearing mice | |
| Meng et al. | Structural characterization and immunomodulating activities of polysaccharides from a newly collected wild Morchella sextelata | |
| Nie et al. | A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities | |
| CN113274490A (zh) | 一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用 | |
| CN109160954B (zh) | 一种香瓜茄酸性多糖及其提纯方法和用途 | |
| CN109796538A (zh) | 提高条斑紫菜多糖生物活性的方法 | |
| CN117414319A (zh) | 一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜及制备方法 | |
| CN111138558A (zh) | 一种天然免疫增强多糖pcp及其制备方法和用途 | |
| CN115028753B (zh) | 具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离纯化方法及应用 | |
| Song et al. | Isolation, structural characterization and immunomodulatory activity on RAW264. 7 cells of a novel exopolysaccharide of Dictyophora rubrovalvata | |
| CN108424469A (zh) | 一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途 | |
| CN110317844B (zh) | 一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途 | |
| CN114807270A (zh) | 一种利用黑根霉发酵制备的牛蒡根多糖及其生产工艺和应用 | |
| CN116731217B (zh) | 一种藤茶酸性多糖AGP-2a及其制备方法和在制备抗炎化妆品中的用途 | |
| CN109400745B (zh) | 一种低分子量条斑紫菜多糖的制备及其在抗人宫颈癌细胞肿瘤中的应用 | |
| CN113817076A (zh) | 一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖sgp2-1及其制备方法和应用 | |
| Pan et al. | Ultrasonic-assisted extraction of a low molecular weight polysaccharide from Nostoc commune Vaucher and its structural characterization and immunomodulatory activity | |
| CN116655820B (zh) | 一种藤茶酸性多糖AGP-3a及其提取分离方法和在制备抗炎化妆品中的用途 | |
| CN112409502A (zh) | 一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的人参多糖的分离和表征方法 | |
| CN116158535B (zh) | 一种桑叶蛋白-桑葚花青素复合乳液及其制备方法 | |
| CN116120475B (zh) | 一种云莓均一多糖rcp-90-1及其分离纯化方法和作为抗肿瘤药物的应用 | |
| CN114409824B (zh) | 毛霉胞外多糖及其制备方法和应用 | |
| CN111675771B (zh) | 一种北沙参多糖及其制备方法和应用 | |
| CN109678981A (zh) | 一种红花多糖的制备方法、产品及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |