CN111647095B - 一种白树多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
一种白树多糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及多糖提取技术领域的一种白树多糖及其制备方法和应用。一种白树多糖的制备方法，包括：白树嫩枝和/或叶用水提取，分离得到提取液；对所述提取液进行醇沉，分离得到沉淀物；用水复溶所述沉淀物，进行透析，透析的截留分子量为3500Da，收集截留的产物，即得白树粗多糖。
Description
技术领域
本发明涉及多糖提取技术领域，具体涉及一种白树多糖及其制备方法和应用。
背景技术
多糖是动植物体内重要的生物活性物质，由多个相同或者不同的单糖以糖苷键相连接而成。植物多糖结构复杂，其常与蛋白质、脂质等结合形成多糖复合物，生物活性也因其糖基的组成、排列顺序、连接方式等不同而有区别，这也给多糖的提取和纯化带来了困难。
白树为大戟科白树属植物，自古以来未被收载于任何中草药典籍之中，是一种新的药用植物。目前有关该植物的化学成分及生物活性研究报告较少，仅限于对白树中所含的黄酮类、生物碱类、萜类、氨基酸类等小分子化学成分，对其所含的高分子类物质诸如多糖、寡糖、糖蛋白、蛋白质及其功能尚无任何报道，有关白树多糖类成分的提取和纯化方法以及其生物活性尚属完全空白状态。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，本发明提供一种白树多糖及其制备方法和应用。
一种白树多糖的制备方法，包括如下步骤：
白树嫩枝和/或叶用水提取，分离得到提取液；对所述提取液进行醇沉，分离得到沉淀物；用水复溶所述沉淀物，以截留分子量为3500Da进行透析，收集截留的产物，即得白树粗多糖，记为BSCP。
所述的制备方法，所述白树嫩枝和/或叶进行干燥处理；所述干燥后的白树嫩枝和/或叶与水的质量比为(1-5):(5-8)；
所述水提取重复2-5次；
所述醇沉时，加入无水乙醇至体系中乙醇体积百分比为70％-90％。
所述的制备方法，对所述提取液进行醇沉之前，还包括，浓缩所述提取液，得到干膏，所述干膏复溶于水后进行醇沉；
用水复溶所述沉淀物之前，还包括，用无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇分别重复洗涤所得沉淀物，减压蒸干后用水复溶。
所述的制备方法，还包括，将所述白树粗多糖BSCP溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液进行阴离子交换柱纯化，依次用去离子水和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，获得的洗脱组分分别为白树中性多糖和白树酸性多糖，分别记为BSN和BSA。
所述的制备方法，所述白树粗多糖BSCP与去离子水的质量比为15：0.1-1；
所述去离子水和0.5mol/L NaCl溶液的流速均为1mL/min；
所述阴离子交换柱为DEAE-650M阴离子交换柱。
所述的制备方法，将所述白树中性多糖BSN溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经琼脂糖凝胶柱纯化，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集951-1107ml洗脱组分，记为BSN1；
将所述洗脱组分BSN1溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经葡聚糖凝胶柱纯化，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集344-376ml洗脱组分，记为BSNP。
所述的制备方法，所述白树中性多糖BSN与去离子水的质量比为500：0.05-0.1；
所述洗脱组分BSN1与去离子水的质量比为200：0.05-0.1；
所述0.1mol/L NaCl溶液的流速为1mL/min；
所述琼脂糖凝胶柱为Sepharose 6B柱；
所述葡聚糖凝胶柱为Sephacryl S-300凝胶色谱柱。
所述的制备方法，将所述白树酸性多糖BSA溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经阴离子交换柱纯化，分别用水和1mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集1340-1740mL洗脱组分，记为BSA1；
将所述洗脱组分BSA1溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经琼脂糖凝胶柱纯化，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集899-925ml洗脱组分BSAP1和925-1003ml洗脱组分BSAP2。
所述的制备方法，所述白树酸性多糖BSA与去离子水的质量比为5：0.01-0.1；
所述洗脱组分BSA1与去离子水的质量比为500：0.05-0.1
所述水和1mol/L NaCl溶液的流速为1mL/min，
所述0.1mol/L NaCl溶液的流速为1mL/min；
所述阴离子交换柱为DEAE-650M阴离子交换柱；
所述琼脂糖凝胶柱为Sepharose 6B柱。
本发明提供了一种所述制备方法得到的白树多糖。
本发明提供了一种白树粗多糖BSCP，所述白树粗多糖BSCP含有的单糖的mol％为：鼠李糖10.16％、阿拉伯糖16.35％、木糖1.57％、甘露糖6.12％、葡萄糖47.15％、半乳糖18.27％；
所述白树多糖的相对分子质量为11.8×104～141；
糖苷键组成和连接方式如下表1：
表1、白树多糖BSCP甲基化分析结果
一种白树多糖BSNP，所述白树多糖BSNP的含有的单糖的mol％为：鼠李糖2.7％、阿拉伯糖58.55％、木糖2.48％、甘露糖9.48％、葡糖糖9.08％、半乳糖17.691％；
所述白树多糖的相对分子质量为5.92×103；
糖苷键组成和连接方式如下表2：
表2、白树多糖BSNP甲基化分析结果
所述白树多糖、白树粗多糖BSCP或白树多糖BSNP在制备促进胰岛素分泌或降糖的药物、保健品或食品中的应用。
一种促进胰岛素分泌或降糖的药物，以所述白树多糖、白树粗多糖BSCP和/或白树多糖BSNP为活性成分。
所述的药物，还包括加入药学上可接受的赋形剂或辅料制成临床上可接受的剂型。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明首次采用水提醇沉、透析袋分子量截留从白树嫩枝和叶中提取出白树多糖类组分，其单糖组成为：鼠李糖10.16％、阿拉伯糖16.35％、木糖1.57％、甘露糖6.12％、葡糖糖47.15％、半乳糖18.27％，其相对分子质量为11.8×104～141，糖苷键组成和连接方式如表1。
2、本发明进一步通过阴离子交换柱、多级凝胶柱分离的方法进行白树多糖组分的分离纯化，获得白树中性多糖和白树酸性多糖。本发明获得的白树中性多糖的单糖组成为鼠李糖2.7％、阿拉伯糖58.55％、木糖2.48％、甘露糖9.48％、葡糖糖9.08％、半乳糖17.691％，其相对分子质量为5.92×103，糖苷键组成和连接方式如表2。
3、本发明提取分离的白树多糖如白树粗多糖BSCP和白树多糖BSNP能够刺激胰岛素分泌的分泌活性，在制备促进胰岛素分泌或降糖的药物/保健品中的应用方面具有广阔前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中BSCP经DEAE-650M阴离子交换柱的洗脱曲线；
图2为本发明实施例3中BSA经DEAE-650M阴离子交换柱的洗脱曲线；
图3为本发明实施例3中BSA1经琼脂糖凝胶Sepharose 6B柱的洗脱曲线；
图4为本发明实施例4中BSN经琼脂糖凝胶Sepharose 6B柱的洗脱曲线；
图5为本发明实施例4中BSN1经Sephacryl S-300凝胶色谱柱的洗脱曲线；
图6为本发明BSCP高效液相凝胶渗透色谱图；
图7为本发明BSNP高效液相凝胶渗透色谱图；
图8为本发明BSCP的FT-IR图；
图9为本发明BSNP的FT-IR图；
图10为本发明BSCP紫外全波长扫描图；
图11为本发明BSNP紫外全波长扫描图；
图12为本发明BSCP和BSNP的GC-MS图；
图13为本发明BSCP与BSNP在小鼠胰岛β细胞株Min6中对基础及高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能的影响结果；图中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与基础或高糖条件下的BS-P组比较；##P<0.01，高浓度葡萄糖与基础葡萄糖条件下对照组的促胰岛素分泌差异。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
本发明中，所用到的普鲁兰系列标准品、CH3COONH4、苯酚、浓硫酸、间羟基联苯、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、氨水、醋酸酐、1-甲基咪唑、无水硫酸钠、氯仿、碘甲烷、D2O、耐高温具塞玻璃反应管、HPGPC、FT-IR、GC-MS、DMEM培养基、葡萄糖刺激液、KRB刺激液等仪器试剂均采用市场公共渠道购买获得。小鼠Insulin ELISA检测试剂盒购自ALPCO，BCA蛋白含量检测试剂盒购自普利莱基因有限公司。
实施例1
本实施例提供一种白树多糖的制备方法，包括如下步骤：
取干燥白树嫩枝及叶1.5吨，加入3.5吨水反复提取3次(每次3.5吨水，提取3次)，合并提取液浓缩成水提干膏，所得干膏428kg，得率28.5％。
取上述干膏1000g，复溶于1000ml超纯水之中，室温搅拌下加入无水乙醇8000ml，继续搅拌10min之后静置48h，3500r/min离心10min，弃去上清液，所得沉淀经适量无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇分别重复洗涤后，60℃减压蒸干，得白树水提醇沉部位，并整体复溶于1800ml超纯水中，取其中100ml经截留分子量为3500Da的透析袋透析24小时，收集袋内部分，冷冻干燥得白树粗多糖(15g)，白树粗多糖记为BSCP。
实施例2
本实施例提供一种白树多糖的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1中BSCP 1.5g，用0.01-0.1倍(在本实施例中选择0.1倍)质量的去离子水充分溶解后，离心除去不溶于水的杂质，收集沉淀保存。另将上清液上样至已装填平衡完全的DEAE-650M阴离子交换柱，依次用H2O和0.5mol/L NaCl溶液以1mL/min流速洗脱，用自动部分收集器收集。以洗脱液中总糖的吸光度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制多糖的洗脱曲线。洗脱液中总糖的吸光度依照实验例1中苯酚硫酸法测定。BSCP的洗脱曲线如图1所示。
由图1可知，BSCP经过H2O和0.5mol/L NaCl溶液洗脱共得到两个洗脱峰，即分离得到2个组分，分别记为白树中性多糖(BSN)和白树酸性多糖(BSA)。按照洗脱曲线合并洗脱液、浓缩、透析、冷冻干燥，获得BSN和BSA。
实施例3
本实施例提供一种白树多糖的制备方法，包括如下步骤：
取实施例2中BSA 5g，加入0.01-0.1倍(在本实施例中选择0.1倍)质量的去离子水，室温下充分溶解，3000r/min，15min离心2次，取上清液，上样至已装填平衡完全的DEAE-650M阴离子交换柱，先用H2O以1mL/min流速洗脱，然后用1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速进行洗脱，用自动部分收集器收集。以洗脱液中总糖的吸光度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制多糖的洗脱曲线。洗脱液中总糖的吸光度依照实验例1中苯酚硫酸法测定。BSA的洗脱曲线如图2所示。按照洗脱曲线合并收集电荷量较为均一的组分，记为BSA1。在本实施例中合并收集1340-1740mL的洗脱液、浓缩、透析、冷冻干燥，获得BSA1。
取500mg BSA1，加入0.05-0.1倍(在本实施例中选择0.1倍)质量的去离子水，3000r/min，15min离心2次，取上清液，上样至已装填平衡完全的琼脂糖凝胶Sepharose6B柱，用0.1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速进行洗脱，收集洗脱液。以洗脱液中总糖的吸光度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制多糖的洗脱曲线。洗脱液中总糖的吸光度依照实验例1中苯酚硫酸法测定。BSA1的洗脱曲线如图3所示。由图3可知，BSA1经过0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到两个峰，BSA1是一种杂多糖，分子量分布范围广且不均一。按照洗脱曲线合并收集899-925ml和925-1003ml的洗脱液，分别记为BSAP-1和BSAP-2，浓缩、透析、冷冻干燥，获得BSAP1和BSAP2，计算得率为0.42％和0.38％。
实施例4
取实施例2中500mg BSN，加入0.05-0.1倍(在本实施例中选择0.1倍)质量的去离子水，3000r/min，15min离心2次，取上清液，上样至已装填平衡完全的琼脂糖凝胶Sepharose 6B柱，用0.1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速洗脱，收集洗脱液。以洗脱液中总糖的吸光度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制多糖的洗脱曲线。洗脱液中总糖的吸光度依照实验例1中苯酚硫酸法测定。BSN的洗脱曲线如图4所示。由图4可知，BSN经过0.1mol/LNaCl溶液洗脱，得到一个峰，分子量组成单一，但是糖峰很宽且不对称，说明分子量分布范围较大且不均一。按照洗脱曲线合并收集951-1107ml的洗脱液，记为BSN-1，浓缩、透析、冷冻干燥，获得BSN1。
取200mg BSN1，加入0.05～0.1倍去离子水(在本实施例中选择加入0.1倍去离子水)，取上清液，上样至已装填平衡完全的Sephacryl S-300凝胶色谱柱，用0.1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速洗脱，收集洗脱液。以洗脱液中总糖的吸光度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制多糖的洗脱曲线。洗脱液中总糖的吸光度依照实验例1中苯酚硫酸法测定。BSN1的洗脱曲线如图5所示。由图5可知，BSN1经过0.1mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱峰单一且较宽，表明分子量分布均匀但分子量分布范围较广。按照洗脱曲线合并收集344-376ml的组分，记为BSNP，浓缩、透析、冷冻干燥，获得BSNP，质量是112mg，得率为0.56％。
实验例1
(1)均一性分析及分子量测定
取普鲁兰系列标准品(分子量分别为642、337、194、107、47.1、21.1、9.6、6.1kD)5mg,用1mL超纯水充分溶解后，分别配置成5mg·mL-1普鲁兰系列标准溶液，过0.22μm滤膜，备用。分别取10μL标准溶液，进样至高效凝胶色谱仪，用0.02MCH3COONH4洗脱，流速为0.6mL·min-1，柱温40℃。以保留时间A为纵坐标，分子量C为横坐标绘制标准曲线，为A＝-1.449C+19.868，R2＝0.9968。取白树多糖样品5mg，用1mL超纯水充分溶解后，配置成5mg·mL-1样品溶液，过0.22μm滤膜，进样至高效凝胶色谱仪(HPGPC)，用0.02M CH3COONH4洗脱，流速为0.6mL·min-1，柱温40℃。得到白树多糖样品的保留时间。
白树粗多糖BSCP的高效凝胶渗透色谱图如图6所示，显示有三个主要的峰。经普鲁兰系列标准曲线计算，相对分子量从左到右依次为：2339Da，1074Da，349Da。白树粗多糖的相对分子量分布范围在11.8×104～141Da之间。
中性多糖BSNP的高效凝胶渗透色谱图如图7所示，可以看出峰型单一、尖锐且对称，表明BSNP多糖为分子量分布均一的纯化多糖，相对分子量为：5.92×103Da。
(2)总糖含量测定
总糖含量利用苯酚硫酸法进行测定。以α-D-半乳糖做标准品，配制1mg·mL-1半乳糖标准品溶液，依次稀释成200μg·mL-1，100μg·mL-1，50μg·mL-1，25μg·mL-1，12μg·mL-1系列浓度溶液，分别取0.2ml半乳糖标准品系列浓度，加入0.2mL质量分数5％的苯酚溶液，快速加入l.0mL浓硫酸，充分震荡后，静置20min，在490nm处测定吸光度。以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，所得标准曲线为A＝0.0077C+0.0473，R2＝0.9996。取干燥的样品，配制成100μg·mL-1样品溶液，稀释至50μg·mL-1,按照上述方法显色后测定吸光度，代入标准曲线，计算样品总糖含量。
白树粗多糖BSCP、中性多糖BSNP按照上述方法测定吸光度，代入标准曲线，计算得到，白树粗多糖BSCP中总糖含量为23.73wt％，中性多糖BSNP中总糖含量为76.53wt％。
(3)糖醛酸含量测定
糖醛酸含量利用间羟基联苯法进行测定。以α-D-半乳糖醛酸做标准品，配制1mg·mL-1半乳糖醛酸标准品溶液，依次稀释成100μg·mL-1，20μg·mL-1，10μg·mL-1，5μg·mL-1，2.5μg·mL-1，1.25μg·mL-1系列浓度溶液，分别吸取200μL半乳糖醛酸标准品系列浓度，加入l.2mL 0.0125M的硫酸-四硼酸钠溶液，冰浴至冷却，l00℃水浴加热5min，冰浴冷却后，加入20μl体积分数为0.15％的间羟基联苯溶液，空白组加入20μl质量浓度0.5％的NaOH溶液充分震荡后，静置5min，在520nm处测定吸光度。以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，所得标准曲线为A＝0.0709C-0.0847，R2＝0.9855。取干燥的样品，配制成100μg·mL-1样品溶液，稀释至50μg·mL-1，按照上述方法显色后测定吸光度，代入标准曲线，计算样品糖醛酸含量。
白树粗多糖BSCP、中性多糖BSNP按照上述方法测定吸光度，代入标准曲线，计算得到，白树粗多糖BSCP中糖醛酸含量为9.881wt％，中性多糖BSNP中糖醛酸含量为0wt％。
(4)FT-IR(傅里叶变换红外光谱仪)分析
取干燥的多糖样品2mg，加入200mg KBr，在玛瑙研钵中研磨混合后压片，用红外光谱仪在4000-400cm-1区域内进行红外扫描。
白树粗多糖BSCP、中性多糖BSNP的FT-IR图分别如图8和图9所示。约3370cm-1处的较大吸收峰为糖残基的O-H的伸缩震动，约2929cm-1处的吸收峰为糖环上的C-H伸缩振动，1640.62-1074.3cm-1处的较强的吸收峰表示单糖中存在吡喃环，614.15-831.6cm-1处的吸收峰表示存在α型的糖单元，这些均为多糖的特征吸收峰。
(5)蛋白质测定
取白树粗多糖BSCP、中性多糖BSNP样品1mg充分溶于1ml纯水，取适量至微量石英比色皿中，进行紫外全波长扫描，结果如图10和图11所示。
BSCP在260-280nm存在蛋白特征吸收峰，表明白树粗多糖BSCP中含有蛋白。BSNP在260-280nm的蛋白吸收峰不明显，表明中性多糖BSNP中含有少量的蛋白质。
(6)单糖组成分析
采用三氟乙酸对白树多糖进行水解、还原、乙酰化，进而进行气相色谱分析。具体方法如下：
分别称取L-鼠李糖(Rha)、L-岩藻糖(Fuc)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)和D-木糖(Xyl)标准品1mg,配制成2mg·mL-1混合单糖标准品溶液，取本发明提取方法提取的多糖样品1mg，加入0.5mL去离子水溶解，所得样品溶液备用。取三支耐高温具塞玻璃反应管，第一管中加入7种单糖混合标准溶液0.5ml。第二管中加入0.5mL的样品溶液。每管中加入0.5mL 4mol/L的TFA(三氟乙酸)溶液，120℃水解2h静置至室温后，用N2吹干溶剂，用甲醇洗涤3遍。加入0.5mL的1mol/L氨水溶液后，分别加入30mg硼氢化钠粉末，拧紧反应管，室温放置过夜。加入10％体积分数的醋酸-甲醇溶液，用旋转蒸发仪旋干溶剂，重复操作3次。再加入无水甲醇复溶，旋干溶剂，重复操作4次。加入1mL醋酸酐和0.1mL 1-甲基咪唑，室温下进行15min乙酰化反应。将溶液转移至反应管，加入1mL去离子水终止反应，冰浴。加1mL氯仿萃取2次，收集氯仿层，合并后转移至干净的反应管，再加1mL纯水洗涤5次，水层弃去。加入适量的无水硫酸钠去除溶液中的水，静置30min后，将溶液过自制无水硫酸钠小柱后，收集，N2吹至0.5mL，备用。
GC—MS(气相色谱-质谱联用仪)进样条件：载气为He2，分流比50:1，检测器：280℃，柱温由160℃，每分钟2℃升高至190℃，再由每分钟5℃升高至280℃，保持5min。
白树粗多糖BSCP、中性多糖BSNP按照上述方法进行处理。混合单糖标准品(Standards)、BSCP和BSNP的GC—MS结果如图12所示。
根据对应标准品的保留时间，确定样品中的单糖组成。由图12可知，BSCP和BSNP由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal组成。根据每种单糖的峰面积比计算出样品中每种单糖占总单糖的百分比(mol％)，结果如表3所示。可以看出BSCP主要由葡萄糖组成，BSNP主要由阿拉伯糖组成。
表3 BSCP和BSNP的单糖组成
(7)糖苷键的组成分析
对白树多糖依次甲基化、水解、还原、乙酰化得到可挥发性的乙酰化衍生物，进而进行GC-MS分析。具体方法如下：
取干燥的多糖样品2mg于2mL反应瓶中，置于干燥器中过夜。加入1mL DMSO，搅拌至样品完全溶解。将50mg NaOH用研钵中研成细粉，加入反应瓶中，搅拌2h。每隔15min加入150μL碘甲烷，一共加入3次，室温下搅拌45min，至溶液澄清透明。加入1mL纯水终止反应，冰浴，转移至玻璃反应管，N2吹干碘甲烷后，用等量氯仿萃取2次，合并氯仿层，再用纯水洗涤5次，水层弃去。氯仿层用N2吹干溶剂，加入0.5ml的2mol/L TFA溶液，120℃水解2h，静置至室温后，用N2吹干溶剂，用甲醇洗涤3遍。加入0.5mL的1mol/L氨水溶液后，分别加入30mg硼氘化钠粉末，拧紧反应管，室温放置过夜。加入10％体积分数的醋酸-甲醇溶液，用旋转蒸发仪旋干溶剂，重复操作3次。再加入无水甲醇复溶，旋干溶剂，重复操作4次。加入1mL醋酸酐和0.lmL甲基咪唑，室温下进行30min乙酰化反应。将溶液转移至反应管，加入1mL纯水终止反应，冰浴。加入1mL氯仿萃取2次，收集氯仿层，合并后转移至干净的反应管，再加入2mL纯水洗涤5次，水层弃去。加入适量的无水硫酸钠去除溶液中的水，静置30min后，将溶液过自制无水硫酸钠小柱后，收集，N2吹至0.5mL，备用。
GC-MS进样条件：载气为He2，分流比100:1，检测器：280℃，柱温由120℃，每分钟4℃升高至280℃，保持5min。
BSCP、BSNP经过甲基化、水解、还原、乙酰化处理得到单糖的乙酰化衍生物，进行GC-MS分析，通过MS归属各样品的总离子流图(TIC)中的信号峰，再通过峰面积计算每种糖残基的摩尔比。结果如表4所示。
BSCP主要由1-Glcp(26.2％)、1,4-Glcp(20.4％)组成。葡萄糖残基同时还存在少量1,6-Glcp(6.8％)。从HPGPC结果可以看出BSCP存在大量的寡聚糖，有可能在甲基化过程中解聚成单糖，所以存在大量的1-Glcp是合理的。阿拉伯糖残基主要是由1-Araf(5.7％)、1,5-Araf(6.7％)和1,3-Araf(1.8％)组成，同时还发现1,5-Araf的O-3位或1,3-Araf的O-5位存在少量分支比例为1.3％。鼠李糖残基主要是由大量的1-Rhap(8.5％)和少量的1,2-Rhap(1.8％)组成，同时还发现1,2-Rhap的O-4位存在分支比例为1.4％。半乳糖残基主要是由1-Galp(6.7％)、1,2-Galp(1.6％)、1,3-Galp(1.3％)、1,4-Galp(3.4％)、1,6-Galp(2.4％)组成，同时还发现1,3-Galp的O-4位或1,4-Galp的O-3位上和1,3-Galp的O-6位或1,6-Galp的O-3位上存在分支，比例分别为0.8％和1.1％。木糖残基主要是由1,3,4-Xylp(2.0％)组成。
BSNP主要由1-Araf(18.77％)、1,3-Araf(7.81％)和1,5-Araf(13.76％)组成，同时还发现在1,3-Araf的O-5或和1,5-Araf的O-3位存在分支比例为6.15％。鼠李糖残基主要是由大量的1-Rhap(6.18％)和少量的1,2-Rhap(2.53％)组成，同时还发现1,2-Rhap的O-4位存在分支比例为4.21％。葡萄糖残基由1-Glcp(3.75％)、1,4-Glcp(9.77％)和1,6-Glcp(1.23％)组成。半乳糖残基主要是由1-Galp(4.00％)、1,2-Galp(1.66％)、1,3-Galp(2.97％)、1,4-Galp(5.23％)、1,6-Galp(2.55％)组成，同时还发现1,3-Galp的O-4位或1,4-Galp的O-3位上和1,3-Galp的O-6位或1,6-Galp的O-3位上存在分支，比例分别为0.28％和7.40％。木糖残基主要是由1,3,4-Xylp(1.74％)组成。
表4 BSCP和BSNP甲基化分析结果
实验例2
取白树粗多糖BSCP和白树多糖BSNP分别用水溶解，使其浓度为10mg/ml，作为保存液备用，使用时用水稀释。
葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)：在细胞水平，采用小鼠胰岛β细胞株Min6，采用96孔板铺板(4个复孔/Condition)，培养2天后，分别在基础葡萄糖(2.8mM)和高葡萄糖浓度(16.8mM)下刺激其胰岛素分泌，检测上述BSCP(100μg/ml，图中标示为BS-P)和BSNP(100μg/ml)分别作用1小时后培养基中胰岛素的水平，以反映受试物调节胰岛素分泌的作用。同时以水作为对照组(Vehicle)。
结果如图13所示，BSCP(图中为BS-P)和BSNP均可显著刺激Min6细胞基础葡萄糖和高葡萄糖刺激的胰岛素分泌。该结果提示，白树多糖组分具有刺激胰岛素分泌功能的作用；另外，在相同受试浓度下，BSNP刺激对Min6细胞基础和高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌效果均显著优于BSCP，该结果提示，进一步纯化的白树多糖组分中包含粗提物中的促胰岛素分泌成分，且具有更优的刺激胰岛素分泌作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (14)
1.一种白树多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
白树嫩枝和/或叶用水提取，分离得到提取液；对所述提取液进行醇沉，分离得到沉淀物；用水复溶所述沉淀物，进行透析，透析的截留分子量为3500Da，收集截留的产物，即得白树粗多糖，记为BSCP；
将所述白树粗多糖BSCP溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液进行阴离子交换柱纯化，依次用去离子水和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，获得的洗脱组分分别为白树中性多糖和白树酸性多糖，分别记为BSN和BSA；
将所述白树中性多糖BSN溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经琼脂糖凝胶柱纯化，用0.l mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集 951-1107 ml洗脱组分，记为BSN1；
将所述洗脱组分BSN1溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经葡聚糖凝胶柱纯化，用0.l mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集344-376ml洗脱组分，记为BSNP。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述白树嫩枝和/或叶进行干燥处理；所述干燥后的白树嫩枝和/或叶与水的质量比为（1-5）:（5-8）；
所述水提取重复2-5次；
所述醇沉时，加入无水乙醇至体系中乙醇体积百分比为70%-90%。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，对所述提取液进行醇沉之前，还包括，浓缩所述提取液，得到干膏，所述干膏复溶于水后进行醇沉；
用水复溶所述沉淀物之前，还包括，用无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇分别重复洗涤所得沉淀物，减压蒸干后用水复溶。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述白树粗多糖BSCP与去离子水的质量比为15：0.1-1；
所述去离子水和0.5 mol/L NaCl溶液的流速均为1 mL/min；
所述阴离子交换柱为DEAE-650M阴离子交换柱。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述白树中性多糖BSN与去离子水的质量比为500：0.05-0.1；
所述洗脱组分BSN1与去离子水的质量比为200：0.05-0.1；
所述0.l mol/L NaCl溶液的流速为1 mL/min；
所述琼脂糖凝胶柱为Sepharose 6B柱；
所述葡聚糖凝胶柱为Sephacryl S-300凝胶色谱柱。
6.权利要求1-5任一项所述制备方法得到的白树多糖。
7.一种白树粗多糖BSCP在制备保健品、食品或促进胰岛素分泌或降糖的药物中的应用，其特征在于，所述白树粗多糖制备方法包括如下步骤:白树嫩枝和/或叶用水提取，分离得到提取液；对所述提取液进行醇沉，分离得到沉淀物；用水复溶所述沉淀物，进行透析，透析的截留分子量为3500Da，收集截留的产物，即得白树粗多糖，记为BSCP；所述白树粗多糖BSCP含有的单糖的mol %为：鼠李糖10.16%、阿拉伯糖16.35%、木糖1.57%、甘露糖6.12%、葡萄糖47.51%、半乳糖18.27%；
所述白树粗多糖BSCP的相对分子质量为11.8×104~141；
糖苷键组成和连接方式如下表1：
表1、白树多糖BSCP甲基化分析结果
8.一种白树多糖BSNP，其特征在于，所述白树多糖BSNP的含有的单糖的mol %为：鼠李糖2.7%、阿拉伯糖58.55%、木糖2.48%、甘露糖9.48%、葡糖糖9.08%、半乳糖17.691%；
所述白树多糖的相对分子质量为5.92×103；
糖苷键组成和连接方式如下表2：
表2、白树多糖BSNP甲基化分析结果
9.权利要求6所述白树多糖或权利要求8所述的白树多糖BSNP在制备保健品、食品或促进胰岛素分泌或降糖的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述白树多糖的制备方法，包括如下步骤：
白树嫩枝和/或叶用水提取，分离得到提取液；对所述提取液进行醇沉，分离得到沉淀物；用水复溶所述沉淀物，进行透析，透析的截留分子量为3500Da，收集截留的产物，即得白树粗多糖，记为BSCP；
将所述白树粗多糖BSCP溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液进行阴离子交换柱纯化，依次用去离子水和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，获得的洗脱组分分别为白树中性多糖和白树酸性多糖，分别记为BSN和BSA；
将所述白树中性多糖BSN溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经琼脂糖凝胶柱纯化，用0.l mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集 951-1107 ml洗脱组分，记为BSN1；
将所述洗脱组分BSN1溶解于去离子水中，离心收集上清液，所述上清液经葡聚糖凝胶柱纯化，用0.l mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集344-376ml洗脱组分，记为BSNP。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述白树嫩枝和/或叶进行干燥处理；所述干燥后的白树嫩枝和/或叶与水的质量比为（1-5）:（5-8）；
所述水提取重复2-5次；
所述醇沉时，加入无水乙醇至体系中乙醇体积百分比为70%-90%。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，对所述提取液进行醇沉之前，还包括，浓缩所述提取液，得到干膏，所述干膏复溶于水后进行醇沉；
用水复溶所述沉淀物之前，还包括，用无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇分别重复洗涤所得沉淀物，减压蒸干后用水复溶。
13.一种促进胰岛素分泌或降糖的药物，其特征在于，权利要求6所述白树多糖、权利要求7、10-12任一项中的白树粗多糖BSCP和/或权利要求8、10-12任一项中所述的白树多糖BSNP为活性成分。
14.根据权利要求13所述的药物，其特征在于，还包括加入药学上可接受的赋形剂或辅料制成临床上可接受的剂型。
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