CN111296712A - 一种沙棘叶水提取物固体饮料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种沙棘叶水提取物的提取方法与用途，采用闪式提取法水为溶剂，其中转速为4900～5100r/min、提取时间10～20s、温度80～90℃、料液比35:1～40:1mL/g。结果得到沙棘叶多糖提取率为(10.12±0.14)％，并且测得多糖的含量为(16.85±0.22)％，糖醛酸的含量约为(4.37±0.06)％，蛋白质的含量约为(5.54±0.08)％。并且从中分离并得到6个多糖，提取过程简单，能耗低，且采用本方法得到的多糖具有增强抗氧化、抗凝血活性的作用。提取出的沙棘叶水提取物可与全乳脂粉和增稠剂用于制备出固体功能饮料。

Description

一种沙棘叶水提取物固体饮料及其制备方法
技术领域
本发明属于固体饮料技术领域，更具体的涉及一种沙棘叶水提取物固体饮料及其制备方法。
背景技术
沙棘(HippophaerhamnosidesL.)属于胡颓子科沙棘属植物，又叫做沙枣或者酸柳。在我国的华北、西北、西藏、云南等很多地区均有分布,我国是沙棘资源最丰富的国家，其覆盖面积占世界沙棘总面积的95％以上，居全球首位，主要分布于华北、西北、西南、东北等地。其成熟干燥的果实—沙棘(Hippophaerhamnoides)为蒙古族、藏族习用药材，是国家认可的药食两用资源，1977年开始被纳入《中国药典》,之后在历年《中国药典》中均有收录。沙棘的很多功效与沙棘中的多种生物活性物质和营养物质有关，如：多糖类、黄酮类、蛋白质、维生素和植物甾醇等。沙棘果实是被国家认可的药食两用的资源，被载入中华人民共和国的药典。近年来相关研究文献发现，沙棘叶也含有丰富的营养成分和生理活性物质。沙棘叶产量颇大，是一种廉价且目前开发应用较少的废弃物，富含多酚类、多糖类化合物，但与沙棘的果实和种子相比，关于沙棘叶药理作用的研究很少。
闪式提取法是近年来一种新型提取方法，以其时间短，效率高而备受关注。赵宏(沙棘多糖的闪式提取工艺条件的优化[J].辽宁中医杂志,2015(2):364-366.)运用闪式提取法通过正交试验设计考察了电压、料液比和提取时间对沙棘多糖提取率的影响。结果发现，当电压为225V，提取时间110s，固液比为1:30g/mL时，对沙棘多糖的提取效果最好，提取率是9.43mg/g。
包怡红等人(沙棘叶多糖的提取工艺及抗氧化作用的研究[J].食品工业科技,2010,31(01):286-290.)做了四项沙棘叶体外抗氧化实验，得出沙棘叶的抗氧化能力均随其浓度的增加而增加，与同浓度的Vc溶液相比具有明显的总抗氧化能力和清除·OH的能力，其中对O2-的清除作用比同浓度的Vc溶液还高18.92％。李芳亮等人(响应面优化蒽酮-硫酸法测定水溶性沙棘叶多糖含量[J].光谱实验室,2012,29(01):185-190.)在对沙棘叶水溶性多糖分级组分抗氧化活性的研究中得出：WPFH60、WPFH70、WPFH80和BHT(日常使用的抗氧化剂)在一定浓度范围内均具有一定的还原力，对O2-和·OH有明显的清除作用，其中WPFH70对O2-和·OH的清除率接近于BHT，明显高于WPFH60和WPFH80。
宋苗苗(榴莲皮多糖结构表征及抗凝血活性研究[D].河南：河南大学,2019:1-58)对榴莲皮多糖体外抗凝血活性进行研究，发现榴莲皮多糖可极显著延长APTT、PT的作用时间(P<0.0001)，可显著延长TT的作用时间(P<0.01)，通过抑制内源性和外源性凝血途径，抑制血小板的聚集及降低全血粘度和血浆粘度，因而榴莲皮多糖有相当的抗凝血活性。
包怡红(沙棘叶多糖的超声波辅助提取及抑菌作用研究[J].食品与发酵工业,2010,36(05):161-166.)等采用琼脂平板扩散法研究了沙棘叶多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的抑制效果，结果发现沙棘叶多糖对这四种菌均有很强的抑制作用，表明沙棘叶多糖具有强的广谱抑菌作用。刘海青等(沙棘叶水溶性多糖的生物活性研究[J].海南大学学报(自然科学版),2006,24(2):162-165)的研究也表明沙棘叶多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和四叠杆菌都具有明显的抑菌作用。
高歌(生姜固体饮料的加工工艺研究[D].山东:山东农业大学,2013:1-40)对生姜固体饮料进行了研究制备，发现生姜固体饮料加工工艺简单，以真空浓缩的工艺最大限度的保护了有效成分，同时以固体饮料的形式，充分发挥了固体饮料方便快捷，高效卫生，携带方便的优点。
发明内容
本专利采用闪式提取法对沙棘叶多糖进行提取，相比于传统的提取法缩短了提取时间，降低成本，并且保护了生物活性物质的特性，提高了抗氧化、抑菌的活性，并发现了抗凝血活性；并将沙棘叶水提取物制成固体饮料，实现农产品深加工，提高其附加值。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种沙棘叶水提取物的提取方法，包括以下步骤：以水为提取剂采用闪式提取器进行提取，提取后将提取液脱溶得沙棘叶水提取物；具体闪式提取器的提取工艺参数为：转速为4900～5100r/min，提取时间10～20s，提取温度80～90℃，液料比35:1～40:1mL/g；所述脱溶可在减压或常压下加热脱溶，或在减压或常压下冻干脱溶。
优选的，所述提取方法的沙棘叶多糖提取率为(10.12±0.14)％；所述沙棘叶水提取物中多糖的含量为(16.85±0.22)％，糖醛酸的含量约为(4.37±0.06)％，蛋白质的含量约为(5.54±0.08)％。
优选的，所述提取方法中还包括纯化和或分离步骤；所述纯化步骤是指采用棉状DEAE纤维素纯化，所述分离步骤是指对沙棘叶水提取物经过DEAE纯化后，采用DEAE-52纤维素分离进行分离；
所述沙棘叶水提取物经过棉状DEAE纤维素纯化后其多糖含量为(42.06±0.55)％、蛋白质含量为(4.31±0.06)％、糖醛酸含量为(9.25±0.13)％；所述纯化后的沙棘叶水提取物中含有不同比例的Man、GluN、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glu、Gal、Xyl、Arab和Fuc单糖组成，所述纯化后的沙棘叶水提取物中分子量范围为176862～626895Da；
所述采用棉状DEAE纤维素纯化是指：取棉状DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡24h以上，直至絮状纤维均匀渗透在水中，把液体抽滤干净；然后将蒸馏水处理后的DEAE用等同上述蒸馏水体积的0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡2～3h后，把液体抽滤干净；再用蒸馏水将DEAE洗至中性，再用同样体积的0.5mol/L盐酸浸泡2～3h，蒸馏水将DEAE洗至中性，即得脱蛋白和脱色素的棉状DEAE纤维素；准确称取500mg提取的沙棘叶水提取物，溶解于30mL蒸馏水中并放置在干净的烧杯中；用干燥洁净的滴管将溶解好的水提取物溶液分别缓慢均匀地滴加至DEAE层析柱中，用0.6mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为1mL/min，利用苯酚-硫酸法对多糖含量测量，直至用苯酚-硫酸法溶液无明显黄色为止；将洗脱下来的的多糖溶液全部收集，用旋转蒸发仪蒸发出多余的水分即得纯化后的沙棘叶水提取物。
所述采用DEAE-52纤维素分离进行分离是指：将DEAE-52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/L的HCL溶液中浸泡1～2h,再用蒸馏水洗至pH值中性或pH＝4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中1～2h，再用蒸馏水将其洗至中性，然后装柱；将纯化后的沙棘叶水提取物上柱溶液加到已平衡好的DEAE-52柱内，分别用馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/LNaCl溶液各125mL相继洗脱，流速控制在1.0～1.5mL/min，分瓶收集，每5～6min收集一瓶，分瓶收集，用苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线。
优选的，所述沙棘叶水提取物具有抗氧化、抗菌和抗凝血功能；沙棘叶水提取物清除DPPH·能力的IC50是(0.0103±0.0010)mg/mL，清除ABTS·能力的IC50是(0.0032±0.00029)mg/mL，清除·OH的IC50是(0.6629±0.073)mg/mL；沙棘叶水提取物对大肠杆菌和短小芽孢杆菌均有抑制作用，且用棉状DEAE纤维素纯化后的抑菌圈均比纯化前多0.05cm；沙棘叶水提物浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的APPT的凝血时间分别为40.9±2.04s和30.4±1.52s，PT为25.8±1.29s和19.8±0.99s，TT为31.6±1.58s和16.5±0.82s，FIB的含量为2.42±0.17(g/L)和2.65±0.23(g/L)。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种含沙棘叶水提取物固体饮料，包含沙棘叶水提取物、乳脂粉和增稠剂；
优选的，按重量份数计算，所述沙棘叶水提取物1.8份、全乳脂粉3.0份、增稠剂0.2份；所述增稠剂为魔芋胶；
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种沙棘叶水提取物的制备方法，包括如下步骤：
取沙棘叶水提取物、全脂乳粉、魔芋胶和水混合均匀制成软材，过16目筛网质粒；将湿颗粒置于烘箱内的不锈钢网盘中干燥，用14目筛网整粒；所得颗粒置于三维混合器内，混合25min：将混合的颗粒，用颗粒分装机，分装于复合膜袋中(5g±0.2g/袋)，封装。
优选的，所述干燥是70～80℃条件下干燥至水分含量低于5％。
本发明首次采用闪式提取器进行提取法提取沙棘叶水提取物，其中主要成分之一为多糖，分别测定粗提物中多糖、蛋白质、糖醛酸的含量，进行多糖的单糖组成、分子量、抗氧化、抑菌活性和抗凝血的测定，并且制备了沙棘叶水提取物固体饮料。
与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
本发明采用闪式提取法提取沙棘叶多糖，提取率达到(10.12±0.14)％，并且从中分离并得到6个多糖，提取过程简单，能耗低，且采用本方法得到的多糖具有增强抗氧化、抗凝血活性的作用，具有重要的实际意义。
附图说明
图1是葡萄糖标准曲线图；
图2是蛋白质标准曲线图；
图3是糖醛酸标准曲线图；
图4是沙棘叶洗脱曲线图；
图5是清除DPPH自由基能力测定；
图6是清除ABTS自由基能力测定；
图7是羟基自由基清除能力测定。
具体实施方式
主要原料来源：沙棘叶：采于吉林市龙潭区。DEAE纤维素和DEAE-52纤维素均来自于上海源叶生物有限公司。其余均为市售常规实验试剂。
实施例1闪式法提取沙棘叶水提取物
将干燥的沙棘叶放入闪式提取器中，通过预实验在其中确定了4个主要因素：转速、提取时间、提取温度、液料比。
提取时间15s，提取温度90℃，液料比35:1ml/g的基础上，转速分别为3000、4000、5000、6000、7000r/min，进行提取沙棘叶多糖单因素试验并测定，5000r/min提取率最优，为8.13％。
转速5000r/min，提取温度90℃，液料比70:1ml/g的基础上，提取时间分别为5、10、15、20、25s，完成提取沙棘叶多糖的单因素试验，15S提取率最优，为9.16％。
转速为5000r/min，提取时间为15s，液料比70:1ml/g的基础上，提取温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，进行提取沙棘叶多糖单因素试验，90℃下提取率最优，为9.08％。
转速为5000r/min，提取时间为15s，提取温度为90℃，液料比分别为30:1、40:1、60:1、70:1、80:1mL/g，完成提取沙棘叶多糖的单因素试验，40:1提取率最优，为9.98％。
最终得出沙棘叶的最优工艺，其中转速为4900～5100r/min，提取时间10～20s，提取温度80～90℃，液料比35:1～40:1mL/g，多糖的提取率为(10.12±0.14)％。
实施例2沙棘叶多糖有效成分含量的测定
采用实施例1中最优工艺对沙棘叶多糖进行提取，提取液进行蒸干，然后对沙棘叶水提取物中多糖、蛋白质、糖醛酸分别进行含量测定：
(1)沙棘叶水提取物中多糖的含量测定
精密称取葡糖糖标准品0.1g，于105℃烘箱干燥至恒重(差值不超过0.03g)，准确称取100mg，溶解并定容至1000mL容量瓶中，吸取1mL于10mL容量瓶中，并定容至刻度，即得葡萄糖对照品(0.1mg/mL)。取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mL分别置于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后，采用苯酚-硫酸法测定：将葡萄糖标准品配置成一定浓度梯度的溶液，准确地移取葡萄糖溶液0.5mL的同时迅速加入1mL浓度为5％苯酚试剂，浓硫酸3.5mL，40℃水浴加热30min，空白对照为蒸馏水，在紫外分光光度计最大吸收波长为490nm处测定溶液的吸光度，横坐标为浓度，纵坐标为溶液吸光度，制作标准曲线。测定其含量，如图1所示。将粗多糖配成一定浓度的溶液用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光度A，带入曲线，计算即得多糖百分含量。
采用苯酚-硫酸法测量总多糖含量，取多糖样品0.5mL，分别加入5％苯酚1mL，并迅速加入浓硫酸3.5mL，震荡均匀，40℃水浴30min，在490nm波长下测量其吸光度A，带入标准曲线算出其多糖含量。纯化前沙棘叶水提取物中多糖含量为(16.85±0.22)％，纯化后多糖含量为(42.06±0.55)％，纯化后是指按实施例3所述方法进行纯化。
(2)沙棘叶水提取物中蛋白质含量的测定
分别吸取20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL牛血清蛋白溶液，加考马斯亮蓝G-250显色5min后测得吸光度值，由此绘制标准曲线为y＝7.23x-0.0022，R2＝0.9998，在20-100μg/mL之间呈良好的线性关系，如图2所示。
采用考马斯亮蓝法测量蛋白质含量，取多糖样品1mL，加入考马斯亮蓝溶液5mL，静置5min，在595nm波长下测量吸光度，带入标准曲线求蛋白质含量。纯化前沙棘叶粗提物中蛋白质含量为(5.54±0.08)％，纯化后含量为(4.31±0.06)％，纯化后是指按实施例3所述方法进行纯化。
(3)沙棘叶水提取物中糖醛酸含量的测定
精密称取干燥至恒重的半乳糖醛酸标准品8mg，置于100mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀即得。精密移去对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于试管中，用蒸馏水定容至0.5mL，采用间羟基联苯法测量糖醛酸含量，绘制标准曲线线性方程为y＝8.8625x-0.0432，R2＝0.9996在10-100μg/mL之间成良好的线性关系，如图3所示。
用间羟基联苯法在528nm处测吸光度，将测得的吸光度带入曲线得糖醛酸含量。测得沙棘叶水提取物中糖醛酸含量为(4.37±0.06)％，纯化后糖醛酸含量为(9.25±0.13)％，纯化后是指按实施例3所述方法进行纯化。
实施例三、沙棘叶水提取物的纯化及分离
一、纯化
称取一定量的棉状DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡24h以上，直至絮状纤维均匀渗透在水中，把液体抽滤干净，然后将蒸馏水处理后的DEAE用等同上述蒸馏水体积的0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡2～3h后，把液体抽滤干净，再用蒸馏水将DEAE洗至中性，再用同样体积的0.5mol/L盐酸浸泡2～3h，用大量蒸馏水将DEAE洗至中性，即得脱蛋白和脱色素的棉状DEAE纤维素。
准确称取500mg上述提取的沙棘叶水提取物，溶解于30mL蒸馏水中并放置在干净的烧杯中。用干燥洁净的滴管将溶解好的水提取物溶液分别缓慢均匀地滴加至DEAE层析柱中，用0.6mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为1mL/min，利用苯酚-硫酸法对多糖含量测量，直至用苯酚-硫酸法溶液无明显黄色为止。将洗脱下来的多糖溶液全部收集，用旋转蒸发仪蒸发出多余的水分，收集备用。
二、分离
将DEAE-52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/L的HCl溶液中浸泡1～2h,再用蒸馏水洗至pH值中性或pH＝4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中1～2h，再用蒸馏水将其洗至中性，然后装柱。
将纯化后的沙棘叶多糖溶液上柱溶液加到己平衡好的DEAE-52柱内，分别用馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/LNaCl溶液各125mL相继洗脱，流速控制在1.0～1.5mL/min，分瓶收集，每5～6min收集一瓶。分瓶收集，用苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线。洗脱曲线如说明书附图4。从洗脱曲线可以看出有6个存在，分别命名为HRLP-1、HRLP-2、HRLP-3、HRLP-4、HRLP-5和HRLP-6。将6个组分的沙棘叶多糖收集、浓缩、透析、冷冻干燥，得6种沙棘叶多糖粉末，备用。
实施例四沙棘叶多糖单糖组成及分子量的测定
1、单糖组成的测定
分别准确称取实施例3纯化分离后的6种沙棘叶多糖粉末，置于反应釜中，加入3mL2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液，封口放入110℃烘箱中水解5h，取上清液蒸干，用甲醇重复洗涤3次，蒸干水解产物。
取上述水解产物，加水溶解定容至10mL，准确移取0.2mL于玻璃离心管中，分别加入0.2mL、0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)的甲醇溶液和0.2mL0.3mol/L的氢氧化钠溶液于70℃水浴加热60min，冷却后加入0.2mL0.3mol/L的盐酸溶液中和，再加入1mL氯仿萃取，离心除去上清液，重复3次，用水稀释定容至5mL备用。
分离HPLC条件：分离柱：ODS2C18柱(250×4.6mm2，5mm)，流动相：乙腈-0.05mol/mL磷酸盐缓冲pH＝6.8(18:82)，流速：0.8mL/min，柱温：30℃，紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为20μL。甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖作为标准品。如图表1得单糖及其摩尔比。
表1沙棘叶6个单体多糖组成及摩尔比
Figure BDA0002416386960000131
2、沙棘叶多糖分子量的测定
配制2mg/mL的纯化分离后的6个沙棘叶多糖溶液，用0.45μm滤膜过滤，备用。数据处理采用N2000GPC色谱工作站进行记录。分别用T-40、T-70、T-100、T-400等不同分子量大小的葡聚糖作为标准品建立校正曲线。
HPLC条件：分离柱：KS-804葡聚糖凝胶柱(8.0300mm2)，流动相：超纯水，流速：0.8mL/min，柱温：50℃，检测器温度：35℃，示差折光检测器。
表2各单糖分子量
组分 峰面积 数均Mn(Da) 重均Mw(Da)
HRLP-1 204 230567 338659
HRLP-2 220 204481 401305
HRLP-3 345 325647 599849
HRLP-4 531 129762 393904
HRLP-5 29 155520 626895
HRLP-6 384 49074 176862
纯化后沙棘叶多糖分子量范围为176862～626895Da。
实施例五沙棘叶水提取物的生物活性
(A)抗氧化活性
(1)清除DPPH·的能力
准确称取0.0039gDPPH，用无水乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液备用。基本步骤为：取质量浓度分别为0.006，0.008，0.01，0.012，0.018mg/mL的沙棘叶多糖粗提物(即未进行DEAE纯化前的产品)水溶液2mL，加入等体积的浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，混匀后在室温条件下避光反应30min，在517nm处下测定吸光度Ai；并以2mL无水乙醇和2mL作为空白调零。空白对照组为2mL样品液加上2mL无水乙醇，其在517nm处的吸光值为Aj，设置空白对照组目的是为了去除多糖样品本身的吸光值。模型对照组为2mLDPPH溶液加上2mL无水乙醇，其在517nm处的吸光值为A0。平行测定3次取平均值。根据如下公式(2-1)计算样品对DPPH自由基清除率：
清除率(％)＝{1-(Ai-Aj)/A0}×100％式(2-1)
式中，Ai为样液2ml，DPPH2ml；Aj为2ml样液，2ml无水乙醇；A0为2mlDPPH,2ml无水乙醇。
粗提物的IC50是0.0103mg/mL，Vc的IC50是0.0029mg/mL。如图5所示，随着浓度的增加，沙棘叶清除DPPH自由基能力越强，质量浓度约为0.005mg/mL到0.01mg/mL之间时清除率随浓度的增加最快，浓度为0.018mg/ml时清除DPPH自由基能力达到91.76％。浓度在0和0.005mg/mL之间时，Vc随浓度的增加清除DPPH自由基能力趋势强于沙棘叶。相比之下，Vc浓度在0.005mg/ml到0.01mg/ml之间趋于平缓。总体清除DPPH能力Vc高于沙棘叶。
(2)清除ABTS·的能力
分别配置7mmoL/LABTS溶液和140mmoL/L过硫酸钾溶液，取ABTS溶液7mL，88μL过硫酸钾溶液混合并在室温避光条件下静置过夜(12-16h)，形成ABTS自由基储备液，然后取ABTS自由基储备液1mL，加水稀释至100mL容量瓶中并定容至刻度，即得稀释100倍的ABTS工作液，使在30℃,734nm波长处吸光度为0.7+0.02。
精密移取质量浓度分别为0.004，0.006，0.01，0.014，0.1mg/mL的沙棘叶多糖粗提物水溶液各2.0mL于试管中，分别加入稀释后的ABTS溶液2.0mL，分别震荡10s，静置6min后，于734nm处测定吸光度A。同时移取蒸馏水2.0mL于试管中，按上述的方法处理，测得Ao。重复测定3次，计算清除率。
清除率(％)＝(Ao—A样品)/Ao×100％
粗提物的IC50是0.0032mg/mL，Vc的IC50是0.0031mg/mL。ABTS法是评价抗氧化活性较为快速，方便，灵敏，可行的一种方法，DPPH是一种很稳定的自由基。如图6所示，沙棘叶浓度在0.003mg/mL到0.005mg/mL之间时，随着浓度的增加，清除ABTS自由基能力随浓度增加的速率最快；而Vc随浓度增着清除ABTS能力的增加趋势不如沙棘叶多糖明显。浓度在0.002mg/ml到0.004mg/ml之间时，Vc清除ABTS自由基能力强于沙棘叶；浓度在0.004mg/ml到0.0055mg/ml之间时，沙棘叶对ABTS的清除能力高于Vc。
(3)清除·OH能力的测定
准确称量取邻二氮菲0.0068g并溶解，装入50ml容量瓶并用蒸馏水定容至刻度得0.17mmol/L邻二氮菲溶液；取磷酸二氢钾0.69g溶解，取0.1mol/L氢氧化钠39.5ml，二者混合至100ml容量瓶并用蒸馏水定容至刻度得PBS(pH＝7.40)溶液；精密称取硫酸亚铁0.0209g，用蒸馏水定容至100ml容量瓶中得0.75mmol/L硫酸亚铁溶液；取30％过氧化氢0.2mL，加水定容至50mL得0.12％过氧化氢溶液；取0.75mmol/L邻二氮菲1mL于试管中，依次加入PBS溶液(pH7.40)2mL，蒸馏水1mL，充分混匀后，加入0.75mmol/L硫酸亚铁溶液1mL，混匀，加质量分数为0.12％的H2O21mL，于37℃水浴60min，在511nm处测定其吸光度Ap值；用蒸馏水代替H2O2，测定其吸光度Ab值；取质量分别浓度为0.4，0.5，0.7，0.9，1.0mg/mL的沙棘叶粗提物水溶液代替蒸馏水1mL，测定其吸光度As值。计算样品对羟自由基的清除率。
清除率(％)＝(As－Ap)/(Ab－Ap)×100
粗提物的IC50是0.6629mg/mL，Vc的IC50是5.3007mg/mL。如图7所示，沙棘叶的清除羟基自由基能力明显强于Vc，沙棘叶对清除羟基自由基的所需最低浓度远远低于Vc的浓度。沙棘叶浓度在0.4mg/mL到1mg/mL之间时，随着浓度的增加，清除羟基自由基能力随浓度增加而升高的趋势明显，且在质量浓度为1mg/mL时，沙棘叶清除羟基自由基能力就已达到99.66％，而Vc质量浓度在4g/mL时其清除羟基自由基能力才到达30.27％，在浓度为4mg/mL到8mg/mL之间清除羟基自由基能力随浓增加而度升高的趋势相对平缓。
(B)抗凝血活性
以肝素(2μg/ml)和0.90％NaCl为参照，采用APTT、PT、TT和FIB的试剂盒检测方法测定沙棘叶水提取物的抗凝血活性。
血浆预处理：0.109mol/L柠檬酸钠与新鲜健康人血浆，按1：9(体积比)混合，3000r/min离心20min，取上层清液，装入密封的塑料管中，冷冻保存。
APTT试剂盒法，将沙棘叶水提取物溶解于95％的乙醇溶液中，分别配成浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的溶液。取配置好的沙棘叶水提取物20μl添加到80μl血浆中，在37℃凝血仪中孵育1min，再加入APTT检测试剂100μl，在37℃条件下再孵育1min，最后加入25mmol/LCaCl2溶液100μl，之后记录其凝血时间。
PT试剂盒法，将沙棘叶水提取物溶解于95％的乙醇溶液中，分别配成浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的溶液。取配置好的沙棘叶水提取物20μl添加到80μl血浆中，在37℃凝血仪中孵育30s，再加入PT检测试剂200μl，在37℃条件下再孵育30s，之后记录其凝血时间。
TT试剂盒法，将沙棘叶水提取物溶解于95％的乙醇溶液中，分别配成浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的溶液。取配置好的沙棘叶水提取物20μl添加到80μl血浆中，在37℃凝血仪中孵育30s，添加预热的TT试剂0.1ml，之后记录其凝血时间。
FIB试剂盒法，按试剂说明书制定标准曲线。FIB的标准曲线为：lgT＝-0.821lgC+3.3413然后将沙棘叶水提取物溶解于95％的乙醇溶液中，分别配成浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的溶液。取配置好的沙棘叶水提取物20μl添加到80μl血浆中，加入稀释好的咪唑(20mmol/L)0.9ml，37℃孵育30s，取上述稀释后的血浆0.1ml加入0.05ml复试后的凝血酶，记录凝固时间，根据待测血浆凝固时间。凝血时间记录在CL-2000BV血凝仪中。结果见表3
表3沙棘叶抗凝血结果
组别 APTT(s) PT(s) TT(s) FIB(g/L)
12.5mg/ml 40.9±2.04 25.8±1.29 31.6±1.58 2.42±0.17
2.5mg/ml 30.4±1.52 19.8±0.99 16.5±0.82 2.65±0.23
生理盐水 26.48±1.22 14.09±0.70 16.56±0.83 3.06±0.25
肝素2μg/ml 55.62±2.78 38.79±1.94 33.06±1.65 1.94±0.07
与生理盐水相比，沙棘叶提取物可显著延长APTT、PT和TT的作用时间，并且及其显著地降低FIB的含量，综合以上数据分析可以得出，沙棘叶提取物表现出一定的抗凝血作用。
(5)抑菌活性
分别精密称取沙棘叶水提取物和用棉状DEAE纤维素纯化后的混合多糖各6mg，加1mL蒸馏水使其溶解，配制成质量浓度为6mg/mL的多糖溶液，分别做抑菌实验。沙棘叶水提取物对生活中六种常见菌的抑菌效果，结果表4所示：
表4抑菌效果及其强度对比
Figure BDA0002416386960000211
注：“+”代表有菌生长，“-”代表无菌生长。
如表4所示，沙棘叶多糖对大肠杆菌和短小芽孢杆菌有抑制作用，纯化后的沙棘叶多糖抑菌强度有所提高，纯化前的沙棘叶多糖对大肠杆菌的抑制作用大于短小芽孢杆菌，纯化后的沙棘叶多糖对短小芽孢杆菌的抑制作用大于大肠杆菌。
实施例六沙棘叶水提取物固体饮料的制备
取实施例1中最优工艺下所得沙棘叶水提取物冻干后(真空度小于20Pa和冷肼温度-63℃的条件下干燥，得沙棘叶水提取物冻干粉)过100目筛，之后取1.8份水提取物，3.0份全职乳粉和0.2份魔芋胶混合均匀，加至混合机中，搅拌30min，混合均匀，制成软材，过16目筛出质粒：将湿颗粒置于烘箱内的不锈钢网盘中，于75℃干燥至水分小于3％，用14目筛网整粒；所得颗粒置于三维混合器内，混合25min：将混合的颗粒，用颗粒分装机，分装于复合膜袋中(5g±0.2g/袋)，真空封装。得一种具有沙棘叶固体饮料产品；所述干燥是在75℃的条件下干燥至水分含量低于3％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：按照重量份数计算包括，沙棘叶水提取物1-3份、全乳脂粉2-6份和增稠剂0.1-0.5份；
所述沙棘叶水提取物是采用闪式提取法提取所得；以水为提取剂采用闪式提取器对沙棘叶进行闪式提取，提取后将提取液脱溶得沙棘叶水提取物。
2.根据权利要求1所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述闪式提取法的工艺参数为：转速为4900～5100r/min，提取时间10～20s，提取温度80～90℃，液料比35:1～40:1mL/g；所述脱溶可在减压或常压下加热干燥脱溶，或在减压或常压下冻干脱溶。
3.根据权利要求2所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述沙棘叶水提取物具有抗氧化、抗菌和抗凝血功能；沙棘叶水提取物清除DPPH·能力的IC50是(0.0103±0.0010)mg/mL，清除ABTS·能力的IC50是(0.0032±0.00029)mg/mL，清除·OH的IC50是(0.6629±0.073)mg/mL；沙棘叶水提取物对大肠杆菌和短小芽孢杆菌均有抑制作用，且用棉状DEAE纯化后的抑菌圈均比纯化前多0.05cm；沙棘叶水提物浓度为12.5mg/ml和2.5mg/ml的APPT的凝血时间分别为40.9±2.04s和30.4±1.52s，PT为25.8±1.29s和19.8±0.99s，TT为31.6±1.58s和16.5±0.82s，FIB的含量为2.42±0.17(g/L)和2.65±0.23(g/L)。
4.根据权利要求2所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述闪式提取法提取的沙棘叶多糖提取率为(10.12±0.14)％；所述沙棘叶水提取物中多糖的含量为(16.85±0.22)％，糖醛酸的含量为(4.37±0.06)％，蛋白质的含量为(5.54±0.08)％。
5.根据权利要求2所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述闪式提取法中还包括纯化和/或分离步骤；所述纯化步骤是指采用棉状DEAE纤维素对沙棘叶水提取物纯化，所述分离步骤是指对沙棘叶水提取物经过DEAE纤维素纯化后，采用DEAE-52纤维素分离进行分离。
6.根据权利要求5所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述沙棘叶水提取物经过棉状DEAE纯化后其多糖含量为(42.06±0.55)％、蛋白质含量为(4.31±0.06)％、糖醛酸含量为(9.25±0.13)％；所述纯化后的沙棘叶水提取物中含有不同比例的Man、GluN、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glu、Gal、Xyl、Arab和Fuc单糖组成，所述纯化后的沙棘叶水提取物中分子量范围为176862～626895Da。
7.根据权利要求5所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述采用棉状DEAE纯化是指：取棉状DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡24h以上，直至絮状纤维均匀渗透在水中，把液体抽滤干净；然后将蒸馏水处理后的DEAE用等同上述蒸馏水体积的0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡2～3h后，把液体抽滤干净；再用蒸馏水将DEAE洗至中性，再用同样体积的0.5mol/L盐酸浸泡2～3h，蒸馏水将DEAE洗至中性，即得脱蛋白和脱色素的棉状DEAE；准确称取500mg提取的沙棘叶水提取物，溶解于30mL蒸馏水中并放置在干净的烧杯中；用干燥洁净的滴管将溶解好的水提取物溶液分别缓慢均匀地滴加至DEAE层析柱中，用0.6mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为1mL/min，利用苯酚-硫酸法对多糖含量测量，直至用苯酚-硫酸法溶液无明显黄色为止；将洗脱下来的的多糖溶液全部收集，用旋转蒸发仪蒸发出多余的水分即得纯化后的沙棘叶水提取物。
8.根据权利要求5所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料，其特征在于：所述采用DEAE-52纤维素分离进行分离是指：将DEAE-52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/L的HCL溶液中浸泡1～2h,再用蒸馏水洗至pH值中性或pH＝4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中1～2h，再用蒸馏水将其洗至中性，然后装柱；将纯化后的沙棘叶水提取物上柱溶液加到已平衡好的DEAE-52柱内，分别用馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/LNaCl溶液各125mL相继洗脱，流速控制在1.0～1.5mL/min，分瓶收集，每5～6min收集一瓶，分瓶收集，用苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线。
9.一种权利要求1所述的含有沙棘叶水提取物的功能性固体饮料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
取沙棘叶水提取物、全脂乳粉、魔芋胶和水混合均匀制成软材，过16目筛网质粒；
将湿颗粒置于烘箱内的不锈钢网盘中干燥，用14目筛网整粒；所得颗粒置于三维混合器内，混合25min：将混合的颗粒，用颗粒分装机，分装于复合膜袋中(5g±0.2g/袋)，封装。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述干燥是70～80℃条件下干燥至水分重量含量低于5％。
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