CN109674811A - 藿香多糖组合物及其应用和提取方法 - Google Patents
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Abstract
本方案公开了药物化学领域的一种藿香多糖组合物，包括一种中性藿香多糖级分和两种酸性藿香多糖级分，中性藿香多糖级分含有羟基(3417cm‑1、1636cm‑1)和C‑H(1413cm‑1)官能团，糖苷键型为α‑吡喃型(1042cm‑1)；第一酸性藿香多糖级分含有羟基(3413cm‑1)、羧基(1618cm‑1、1098cm‑1)和C‑H(2928cm‑1、1425cm‑1)官能团，以及特征峰为1078cm‑1的β‑半乳聚糖主链；第二藿香酸性多糖级分含有羟基(3411cm‑1)、羧基(1613cm‑1、1095cm‑1)和C‑H(2930cm‑1、1423cm‑1)官能团，以及特征峰为1079cm‑1的β‑半乳聚糖主链。本方案的藿香多糖组合物可应用于制备抗炎药物，增加了临床用药的选择面。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种藿香多糖组合物及其应用和提取方法。
背景技术
藿香(Agastache rugosa)又名合香、苍告、山茴香等，属唇形目，唇形科多年生草本植物等，广泛地分布于全国各地，多入药。藿香全草均能入药，有抗炎、镇痛、和中止呕、发表解暑等功效。研究表明，藿香的药物活性成分主要是多糖、挥发油类和黄酮类等物质。
由于多糖具有诸多的生物学活性，受到了越来越多的关注，如，免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和抗辐射血等。近年来，发现藿香多糖具有较强的药理学活性，如，乌兰格日乐等通过优化藿香多糖的提取工艺，发现藿香多糖对氧自由基有很强的清除作用，活性大小与浓度呈正相关；田光辉等通过正交实验明确了藿香多糖提取的最佳条件，且亦发现藿香多糖具有抗氧化活性，对Fenton反应产生的·OH具有明显地清除作用。
多糖是由一种或多种单糖通过共价键连接的多聚生物大分子，这些单糖包括半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、半乳糖(galactose,Gal)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)、葡萄糖(glucose,Glc)、木糖(xylose,Xyl)、芹菜糖(apiose,Api)和甘露糖(mannose,Man)等十余种。植物多糖中不同结构域和结构单元的主链中糖残基的种类、含量、连接方式以及取代基的修饰都有一定变化，导致了多糖在结构上的多样性。多糖的生物活性和应用取决于其结构的变化，包括糖残基的种类和含量、酯化度等。
但是迄今为止，尚未见到关于从藿香中分离纯化得到藿香多糖的成分及这些成分在药学领域方面运用的研究和报道。
发明内容
本发明意在提供一种藿香多糖组合物及其应用。
本方案中的藿香多糖组合物，包括中性藿香多糖级分和酸性藿香多糖级分，所述中性藿香多糖级分由摩尔含量为62.3％的葡萄糖、23.1％的半乳糖、9.5％的阿拉伯糖和5.1％的甘露糖构成，且所述中性藿香多糖级分包含的糖类均含有特征峰为3417cm-1和1636cm-1的羟基和特征峰为1413cm-1的C-H官能团，糖苷键型为α-吡喃型，α-吡喃型的特征峰为1042cm-1；
所述酸性藿香多糖级分包括第一酸性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分，所述第一酸性藿香多糖级分由摩尔含量为46.5％的半乳糖醛酸、25.4％的半乳糖、9.2％的阿拉伯糖、7.0％的甘露糖、6.1％的葡萄糖、4.8％的葡萄糖醛酸和1.0％的鼠李糖构成，且所述第一酸性藿香多糖级包含的糖类均含有特征峰为3413cm-1的羟基、特征峰为1618cm-1和1098cm-1的羧基、特征峰为2928cm-1和1425cm-1的C-H官能团，以及特征峰为1078cm-1的β-半乳聚糖主链；
所述第二藿香酸性多糖级分由摩尔含量为47.6％的半乳糖醛酸、19.9％的葡萄糖醛酸、14.0％的半乳糖、7.3％的甘露糖、4.3％的阿拉伯糖、4.3％的葡萄糖和2.5％的鼠李糖构成，且所述第二藿香酸性多糖级分包含的糖类均含有特征峰为3411cm-1的羟基、特征峰为1613cm-1和1095cm-1的羧基、特征峰为2930cm-1和1423cm-1的C-H官能团，以及特征峰为1079cm-1的β-半乳聚糖主链。
本发明藿香多糖组合物应用于制备抗炎药物。
本发明中的中性藿香多糖级分、第一酸性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分的抗炎活性采用10ng/mL脂多糖(LPS)作用于小鼠腹腔巨噬细胞16小时后对一氧化氮(NO)的释放率进行评价。结果显示，在给药剂量50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的条件下，中性藿香多糖级分作用后，NO的释放率依次为23.1％、12.1％和5.3％；第一酸性藿香多糖级分作用后，NO的释放率依次为137.2％、145.1％和141.7％；第二酸性藿香多糖级分作用后，NO的释放率依次为134.9％、109.8％和65.8％。中性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分的活性呈现一定的浓度依赖性，其中中性藿香多糖级分的活性最强。
本发明藿香多糖组合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将藿香根加蒸馏水经沸水煮提，煮提液经过滤收集滤液，并于55～65℃的条件下将滤液浓缩至原滤液体积的1/10～1/15后，得到藿香水提的浓缩液；
步骤二、向藿香水提的浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，混匀后于3～5℃静置过夜，经离心后留取沉淀备用；
步骤三、将步骤二所得沉淀依次用75％乙醇、90％乙醇和无水乙醇洗涤，沉淀经洗涤后在真空干燥得到藿香粗多糖；
步骤四、准备DEAE-纤维素分别用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L HCl处理为Cl-型后装入层析柱中，将藿香粗多糖上样于DEAE-纤维素柱层析后，依次分别用2倍柱体积的蒸馏水、0.25mol/L NaCl和0.5mol/L NaCl进行洗脱，并收集洗脱液，将洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，分别对应得到三个洗脱组分；
步骤五步骤四中的三个洗脱组分分别经Sepharose CL-6B分子筛柱层析进行纯化，三个洗脱组分分别用0.15mol NaCl水溶液进行洗脱，将所述洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，分别对应得到所述中性藿香多糖子级分、第一酸性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分。
本方案提取方法的步骤四中，DEAE-纤维素分别用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L HCl处理为Cl-型是指：DEAE-纤维素属于一种阴离子交换层析的一种，用HCl处理后即为氯离子型，可以和其它阴离子进行交换。
本发明采用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析联合Sepharose CL-6B分子筛柱层析，对藿香粗多糖成功进行了系统地分离纯化，得到了一种中性藿香多糖级分和二种酸性藿香多糖级分，操作步骤简便，效率高，适用于工业上规模化生产。
附图说明
图1为藿香粗多糖经DEAE-纤维素分离纯化洗脱图；
图2为中性藿香多糖子级分经Sepharose CL-6B分离纯化洗脱图；
图3为第一酸性藿香多糖级分经Sepharose CL-6B分离纯化洗脱图；
图4为第二酸性藿香多糖级分经Sepharose CL-6B分离纯化洗脱图；
图5为藿香多糖各级分的单糖组成检测图谱；
图6为中性藿香多糖子级分的红外检测图谱；
图7为第一酸性藿香多糖级分的红外检测图谱；
图8为第二酸性藿香多糖级分的红外检测图谱；
图9为藿香多糖各级分的抗炎活性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
图中ARP为藿香多糖组合物；ARP-1a为中性藿香多糖子级分；ARP-2a为第一酸性藿香多糖级分；ARP-3a为第二酸性藿香多糖级分；Vo为外水体积；Vt为总体积。(外水体积和总体积指的是分子筛的特定体积，前者指的是色谱柱内指基质颗粒之间液体体积的总和，后者指的是胶颗粒之间空隙的总体积。)
提取本发明藿香多糖组分的方法是：
步骤一、将藿香根加蒸馏水经沸水煮提，煮提液经过滤收集滤液，并于55～65℃(优选60℃)的条件下将滤液浓缩至原滤液体积的1/10～1/15后，得到藿香水提的浓缩液；
步骤二、向藿香水提的浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，混匀后于3～5℃(优选4℃)静置过夜，经离心后留取沉淀备用；
步骤三、将步骤二所得沉淀依次用75％乙醇、90％乙醇和无水乙醇洗涤，沉淀经洗涤后在真空干燥得到藿香粗多糖；
步骤四、准备DEAE-纤维素分别用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L HCl处理为Cl-型后装入层析柱中，将藿香粗多糖上样于DEAE-纤维素柱层析后，依次分别用2倍柱体积的蒸馏水、0.25mol/L NaCl和0.5mol/L NaCl进行洗脱，并按照图1中洗脱曲线收集相应的洗脱液，分别将相应的洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，得到中性藿香多糖子级分ARP-1、第一酸性藿香多糖级分ARP-2和第二酸性藿香多糖级分ARP-3；
步骤五、步骤四中的三个洗脱组分分别经Sepharose CL-6B分子筛柱层析进行纯化，三个洗脱组分分别用一倍柱体积的0.15mol NaCl水溶液进行洗脱；洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，分别对应得到中性藿香多糖子级分ARP-1a、第一酸性藿香多糖级分ARP-2a和第二酸性藿香多糖级分ARP-3a。
步骤五的洗脱过程中，每个藿香多糖级分对应准备若干试管，每流出1.8mL洗脱液便收集一管，每个级分收集的洗脱液采用苯酚硫酸法检测，分别测得每支试管中的总糖吸光度，还采用硼酸间羟基联苯法检测，分别测得每支试管中的酸性糖吸光度。结果如图2～4所示，图中看出中性藿香多糖子级分ARP-1a、第一酸性藿香多糖级分ARP-2a和第二酸性藿香多糖级分ARP-3a均呈现出较好的均一性。
本发明藿香多糖组合物中：中性藿香多糖级分ARP-1a的单糖组成如图5所示，按摩尔含量计，由62.3％葡萄糖(Glc)、23.1％半乳糖(Gal)、9.5％阿拉伯糖(Ara)和5.1％甘露糖(Man)构成。
中性藿香多糖级分ARP-1a的红外光谱如图6所示，结果表明，ARP-1a主要含有羟基(3417cm-1、1636cm-1)和C-H(1413cm-1)官能团，糖苷键型以α-吡喃型(1042cm-1)为主。另外，图中无糖醛酸的特征峰，这与ARP-1a的单糖组成结果相吻合。
第一酸性藿香多糖级分ARP-2a的单糖组成如图5所示，按摩尔含量计，由46.5％半乳糖醛酸(GalA)、25.4％半乳糖(Gal)、9.2％阿拉伯糖(Ara)、7.0％甘露糖(Man)、6.1％葡萄糖(Glc)、4.8％葡萄糖醛酸(GlcA)和1.0％鼠李糖(Rha)构成。
第一酸性藿香多糖级分ARP-2a的红外光谱如图7所示，结果表明，ARP-2a主要含有羟基(3413cm-1)、羧基(1618cm-1、1098cm-1)和C-H(2928cm-1、1425cm-1)官能团，以及β-半乳聚糖主链的特征峰为1078cm-1。
第二藿香酸性多糖级分ARP-3a的单糖组成如图5所示，按摩尔含量计，由47.6％半乳糖醛酸(GalA)、19.9％葡萄糖醛酸(GlcA)、14.0％半乳糖(Gal)、7.3％甘露糖(Man)、4.3％阿拉伯糖(Ara)、4.3％葡萄糖(Glc)和2.5％鼠李糖(Rha)构成。
第二藿香酸性多糖级分ARP-3a的红外光谱如图8所示，结果表明，主要含有羟基(3411cm-1)、羧基(1613cm-1、1095cm-1)和C-H(2930cm-1、1423cm-1)官能团，以及β-半乳聚糖主链的特征峰为1079cm-1。
藿香多糖组合物及其各级分(ARP-1a、ARP-2a和ARP-3a)的抗炎活性的结果如图9所示，在给药剂量50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的条件下，ARP-1a作用后，NO释放率的平均值依次为23.1％、12.1％和5.3％；ARP-2a作用后，NO释放率的平均值依次为137.2％、145.1％和141.7％；ARP-3a作用后，NO释放率的平均值依次为134.9％、109.8％和65.8％。ARP-1a和ARP-3a的活性呈现一定的浓度依赖性，随着多糖浓度的升高，NO释放的百分率就越低。另外，在藿香多糖各子级分中，ARP-1a的活性最强。
Claims (3)
1.藿香多糖组合物，其特征在于：包括中性藿香多糖级分和酸性藿香多糖级分，所述中性藿香多糖级分由摩尔含量为62.3％的葡萄糖、23.1％的半乳糖、9.5％的阿拉伯糖和5.1％的甘露糖构成，且所述中性藿香多糖级分包含的糖类均含有特征峰为3417cm-1和1636cm-1的羟基和特征峰为1413cm-1的C-H官能团，糖苷键型为α-吡喃型，α-吡喃型的特征峰为1042cm-1；
所述酸性藿香多糖级分包括第一酸性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分，所述第一酸性藿香多糖级分由摩尔含量为46.5％的半乳糖醛酸、25.4％的半乳糖、9.2％的阿拉伯糖、7.0％的甘露糖、6.1％的葡萄糖、4.8％的葡萄糖醛酸和1.0％的鼠李糖构成，且所述第一酸性藿香多糖级包含的糖类均含有特征峰为3413cm-1的羟基、特征峰为1618cm-1和1098cm-1的羧基、特征峰为2928cm-1和1425cm-1的C-H官能团，以及特征峰为1078cm-1的β-半乳聚糖主链；
所述第二藿香酸性多糖级分由摩尔含量为47.6％的半乳糖醛酸、19.9％的葡萄糖醛酸、14.0％的半乳糖、7.3％的甘露糖、4.3％的阿拉伯糖、4.3％的葡萄糖和2.5％的鼠李糖构成，且所述第二藿香酸性多糖级分包含的糖类均含有特征峰为3411cm-1的羟基、特征峰为1613cm-1和1095cm-1的羧基、特征峰为2930cm-1和1423cm-1的C-H官能团，以及特征峰为1079cm-1的β-半乳聚糖主链。
2.根据权利要求1所述的藿香多糖组合物应用于制备抗炎药物。
3.根据权利要求1所述的藿香多糖组合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将藿香根加蒸馏水经沸水煮提，煮提液经过滤收集滤液，并于55～65℃的条件下将滤液浓缩至原滤液体积的1/10～1/15后，得到藿香水提的浓缩液；
步骤二、向藿香水提的浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，混匀后于3～5℃静置过夜，经离心后留取沉淀备用；
步骤三、将步骤二所得沉淀依次用75％乙醇、90％乙醇和无水乙醇洗涤，沉淀经洗涤后在真空干燥得到藿香粗多糖；
步骤四、准备DEAE-纤维素分别用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L HCl处理为Cl-型后装入层析柱中，将藿香粗多糖上样于DEAE-纤维素柱层析后，依次分别用2倍柱体积的蒸馏水、0.25mol/L NaCl和0.5mol/L NaCl进行洗脱，并收集洗脱液，将洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，分别对应得到三个洗脱组分；
步骤五、步骤四中的三个洗脱组分分别经Sepharose CL-6B分子筛柱层析进行纯化，三个洗脱组分分别用0.15mol NaCl水溶液进行洗脱，将所述洗脱液依次经浓缩、透析、真空冷冻干燥后，分别对应得到所述中性藿香多糖子级分、第一酸性藿香多糖级分和第二酸性藿香多糖级分。
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