CN110845638B - 一种苍术寡糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苍术寡糖的分离纯化方法,属于天然药物化学技术领域,首先以1:10~1:25的料液比将苍术粉末加入到40~100v%的乙醇水溶液中,加热进行回流提取,经去脂、脱色处理后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末,再利用分子排阻色谱以及亲水作用色谱对粗寡糖进行分离纯化,同时利用高效液相跟踪检测,获得不同聚合度的苍术寡糖纯品。本发明方法可以有效提高寡糖的分离纯化效果,提高了寡糖的得率和纯度。本发明所制得的苍术寡糖,免疫活性显著,可以用来制备促免疫活性药物。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域,具体涉及一种苍术寡糖的分离纯化方法。
背景技术
苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb)DC或北苍术Atractylodeschinensis Koidz的干燥根茎。现代药理学研究证明,苍术有独特的化学成分和显著的药理活性,具有抗溃疡、抗心率失常、降血压、利尿、保肝、抗炎、抗菌等作用。目前对苍术活性成分研究较多的是挥发性油,但是在临床医学中,苍术多以水煎剂的形式广泛应用且疗效较好,说明苍术水溶性成分具有良好的药理活性和应用价值。
苍术水溶性成分多为果寡糖,果寡糖也称低聚果糖,是由β-D-果糖残基通过β-2,1糖苷键连接而成的直链低聚糖,能够调节肠道微生物菌群、促进脂类代谢、调节免疫功能、降低血糖等作用。苍术中的果寡糖具有良好的生物活性且毒性较低,然而其分离纯化较困难。首先,寡糖类成分无紫外吸收,常见的紫外检测器不能对其进行检测,因此在纯化过程中难以对寡糖类成分进行跟踪检测。另外,不同聚合度的寡糖溶解性质差异较大,在分离纯化过程中可能会有少量样品析出,而且寡糖类成分的极性较大,一般的分离材料很难得到纯品,因此,无法获得高纯度的寡糖。
发明内容
为解决以上问题,本发明提供了一种苍术寡糖的分离纯化方法,该方法分离纯化效果好,寡糖得率高、纯度高。
本发明还提供了苍术寡糖在制备促免疫活性药物中的应用。
本发明通过以下技术方案实现:
一种苍术寡糖的分离纯化方法,包括如下步骤:
(1)提取:以1:10~1:25的料液比将苍术粉末加入到40~100v%的乙醇水溶液中,加热进行回流提取,提取温度为70~85℃,提取时间为1~3h,得到苍术寡糖粗提液;
(2)脱色:采用D101大孔树脂柱对苍术寡糖粗提液进行脱色,用去离子水冲洗2~6个柱体积,收集洗脱液并旋转蒸发,然后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末;
(3)DP3~DP8的分离纯化:采用分子排阻色谱法对苍术粗寡糖粉末进行分离纯化,分子排阻色谱法中,上样量55~70mg,采用的是AKTA蛋白纯化系统,填料为Bio-Gel P-2,用超纯水作流动相进行等度洗脱,流速为0.2~0.4mL/min,收样体积为2~4mL/管,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP3~DP8的寡糖纯品以及特定聚合度寡糖组分段;
(4)DP8~DP18的分离纯化:采用亲水作用色谱对步骤(3)得到的特定聚合度寡糖组分段进行分离纯化,继续采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP8~DP18的寡糖纯品。
进一步,步骤(1)中,料液比优选为1:20,料液比增大时,寡糖提取率随之增大,当料液比为1:20时,提取率达到最大,再增大,提取率反而降低。
进一步,步骤(1)中,乙醇水溶液浓度为60v%,该浓度下寡糖提取率较佳,并且更有利于后期的分离纯化。
进一步,步骤(1)中,提取温度为85℃。
进一步,步骤(3)中,所述流速为0.3mL/min,收样体积3mL/管,上样量60mg,此条件下,寡糖样品的纯度及回收率均较佳。
进一步,步骤(4)中,亲水作用色谱的条件:XAmide色谱柱(10×250mm id,5μm),示差折光检测器,进样量0.6mL,在室温条件下以66%~71%(v/v)的乙腈水溶液作流动相进行等度洗脱,流速为3~4mL/min,得到DP8~DP18的寡糖纯品。
本发明的有益效果:本发明以乙醇水溶液对苍术粉末进行回流提取,经去脂、脱色处理后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末,再利用优化的分子排阻色谱以及亲水作用色谱条件对苍术粗寡糖进行分离纯化,同时利用高效液相跟踪检测,最后得到不同聚合度的苍术寡糖纯品,本发明方法可以有效提高寡糖的分离纯化效果,提高了寡糖的得率和纯度。本发明所制得的苍术寡糖,免疫活性显著,可以用来制备促免疫活性药物。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的苍术粗寡糖的液相色谱图;
图2为本发明实施例1中得到的特定聚合度寡糖组分段的液相色谱图;
图3为本发明实验例1中得到的寡糖纯品DP3~DP18的液相色谱图;
图4为本发明实施例1中获得的特定聚合度寡糖组分段的免疫活性测试结果;
图5为本发明实施例1获得的寡糖纯品DP3~DP18的免疫活性测试结果。
具体实施方式
以下结合最佳实施例对本发明作进一步说明。该实例仅用于说明本发明,而对本发明没有限制。下述实施例中,所用的高效液相色谱仪为Thermo U3000系列(Thermo),蒸发光散射检测器为ELSD6000(天津埃文森科技有限公司),蛋白纯化系统为AKTA prime plus(GE Healthcare Bio-Sciences),制备液相系统为NP700(江苏汉邦科技有限公司),RefractoMax 520示差折光检测器(美国ERC公司)。
实施例1
一种苍术寡糖的分离纯化方法,包括如下步骤:
(1)提取:将1±0.01g苍术粉末加入到20mL 60v%的乙醇水溶液中,加热进行回流提取,提取温度为85℃,提取时间为2.5h,得到苍术寡糖粗提液;
(2)脱色:采用D101大孔树脂柱对苍术寡糖粗提液进行脱色,用去离子水冲洗3个柱体积,收集洗脱液并在60℃下旋转蒸发,然后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末,得率为18.65%;
取0.02±0.0001g苍术粗寡糖粉末,以纯水溶解,采用高效液相色谱进行检测,高效液相色谱条件为:流动相:A相乙腈;B相超纯水,流速:1mL/min,柱温:30℃,进样量:5μL。流动相程序:0-6min,75%-68%A;6-21min,68%-50%A;21-26min,50%-75%A;26-30min,75%A。检测器:蒸发光散射检测器。苍术粗寡糖的液相色谱图如图1所示。由图1可以看出,苍术中含有不同聚合度的寡糖,这些寡糖的色谱峰均能得到很好的分离,其中包括DP3~DP19,同时也可以看出,苍术中存在大量的单糖以及二糖,其中单糖含量最高。
(3)DP3~DP8的分离纯化:采用分子排阻色谱法对苍术粗寡糖粉末进行分离纯化,分子排阻色谱法中,上样量60mg,采用的是AKTA蛋白纯化系统,填料为Bio-Gel P-2,用超纯水作流动相进行等度洗脱,流速为0.3mL/min,收样体积为3mL/管,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP3~DP8的寡糖纯品以及特定聚合度寡糖组分段;
高效液相色谱条件:流动相:A相乙腈;B相超纯水,流速:1mL/min,柱温:30℃,进样量:5μL。流动相程序:0-6min,75%-68%A;6-21min,68%-50%A;21-26min,50%-75%A;26-30min,75%A。检测器:蒸发光散射检测器。
DP3~DP8纯度及回收率测定见表1:
表1 DP3~DP8的纯度及回收率
特定聚合度寡糖组分段的液相色谱图如图2所示,可以看出,分离收集到的不同组分段,每个峰的峰形都很好而且也都分离开了,说明得到的寡糖段纯度较好。
(4)DP8~DP18的分离纯化:采用亲水作用色谱对步骤(3)得到的特定聚合度寡糖组分段进行分离纯化,亲水作用色谱的条件:XAmide色谱柱(10×250mm id,5μm),示差折光检测器,进样量0.6mL,以66%~71%(v/v)的乙腈水溶液作流动相进行等度洗脱,流速为3mL/min,继续采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP8~DP18的寡糖纯品。
实施例2
一种苍术寡糖的分离纯化方法,包括如下步骤:
(1)提取:将1±0.01g苍术粉末加入到25mL 80v%的乙醇水溶液中,加热进行回流提取,提取温度为80℃,提取时间为2.5h,得到苍术寡糖粗提液;
(2)脱色:采用D101大孔树脂柱对苍术寡糖粗提液进行脱色,用去离子水冲洗3个柱体积,收集洗脱液并在60℃下旋转蒸发,然后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末,得率为17.54%;
(3)DP3~DP8的分离纯化:采用分子排阻色谱法对苍术粗寡糖粉末进行分离纯化,分子排阻色谱法中,上样量60mg,采用的是AKTA蛋白纯化系统,填料为Bio-Gel P-2,用超纯水作流动相进行等度洗脱,流速为0.3mL/min,收样体积为3mL/管,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP3~DP8的寡糖纯品以及特定聚合度寡糖组分段;
高效液相色谱条件:流动相:A相乙腈;B相超纯水,流速:1mL/min,柱温:30℃,进样量:5μL。流动相程序:0-6min,75%-68%A;6-21min,68%-50%A;21-26min,50%-75%A;26-30min,75%A。检测器:蒸发光散射检测器。
(4)DP8~DP18的分离纯化:采用亲水作用色谱对步骤(3)得到的特定聚合度寡糖组分段进行分离纯化(亲水作用色谱的条件:XAmide色谱柱(10×250mm id,5μm),示差折光检测器,进样量0.6mL,以66%~71%(v/v)的乙腈水溶液作流动相进行等度洗脱,流速为3mL/min),继续采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度及测定,得到DP8~DP18的寡糖纯品。
实验测试:
1.将实施例1获得的寡糖纯品DP3~DP18,分别称取0.001±0.0001g,加入1mL60%乙醇水溶液,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度检测。具体条件如下:
(1)蒸发光散射检测器;流动相:A乙腈、B超纯水;流速:1mL/min,柱温30℃,进样量5μL。
(2)流动相洗脱程序为:
表2流动相洗脱程序
寡糖纯品DP3~DP18的液相色谱图如图3所示,可以看出,DP3~DP18均得到很好的分离,根据峰面积计算可知:寡糖样品的纯度都较高,其中DP3、DP16、DP17和DP18的纯度略低,分别为89.78%,89.97%,88.49%,88.99%;DP9的纯度最高,为99.19%,其余寡糖样品的纯度均在95%左右。DP3~DP18的纯度检测具体结果:DP3为89.78%,DP4为98.33%,DP5为97.48%,DP6为97.56%,DP7为98.18%,DP8为98.90%,DP9为99.19%,DP10为98.32%,DP11为98.61%,DP12为94.63%,DP13为95.74%,DP14为98.74%,DP15为91.94%,DP16为89.97%,DP17为88.49%,DP18为88.99%。
2.通过细胞吞噬实验对实施例1获得的特定聚合度寡糖组分段进行免疫活性测试,具体方法如下:
(1)测试方法:
将小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞接种在24孔板中过夜,密度为2×105个/孔,等细胞贴壁之后再进行实验。往实验组中加入2mg/mL的不同聚合度寡糖段溶液(DP1-3;DP4-9;DP6-9;DP8-11;DP10-15;DP11-17),往阴性对照组中加入DMEM基础培养基;往阳性对照组中加入1μg/mL LPS溶液。37℃,5%CO2条件下培养18h,移去上清液,往孔中加入0.1mg/mLFITC-葡聚糖溶液,避光,在37℃,5%CO2环境下培养1h。小心除去上清液,用预冷的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗细胞4次,最后通过流式细胞仪进行分析,以平均荧光强度表示细胞吞噬活性强弱。
(2)实验结果:
特定聚合度寡糖组分段的免疫活性测试结果如图4所示,粗寡糖刺激的巨噬细胞,其吞噬功能明显低于纯化寡糖段刺激的细胞,约为纯化寡糖段的55.20%,这表明纯化寡糖的免疫调节活性高于粗寡糖,因而分离纯化工作具有十分重要的意义。此外,DP1-3、DP4-9以及DP6-9刺激的巨噬细胞,其吞噬作用显著增强,并且明显高于阳性(LPS)对照,约为阳性对照的131.80%。随着聚合度的增大,DP8-11、DP10-15和DP11-17的刺激作用下降,与阳性对照相当,约为空白对照组的2.33倍。
3.将实施例1获得的寡糖纯品DP3~DP18通过细胞吞噬实验进行免疫活性测试。
(1)测试方法:
将小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞接种在24孔板中过夜,密度为2×105个/孔,等细胞贴壁之后再进行实验。往实验组中加入2mg/mL的寡糖纯品溶液(DP3~DP18),往阴性对照组中加入DMEM基础培养基;往阳性对照组中加入1μg/mL LPS溶液。37℃,5%CO2条件下培养18h,移去上清液,往孔中加入0.1mg/mL FITC-葡聚糖溶液,避光,在37℃,5%CO2环境下培养1h。小心除去上清液,用预冷的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗细胞4次,最后通过流式细胞仪进行分析,以平均荧光强度表示细胞吞噬活性强弱。
(2)实验结果:
如图5所示,纯化苍术寡糖能显著刺激细胞,增强巨噬细胞的吞噬功能。DP4的刺激作用最为显著,约是空白对照组的3.78倍,是阳性(LPS)对照组的103%。
Claims (5)
1.一种苍术寡糖的分离纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取:以1:10~1:25的料液比将苍术粉末加入到40~100%的乙醇水溶液中,加热进行回流提取,提取温度为70~85℃,提取时间为1~3 h,得到苍术寡糖粗提液;
(2)脱色:采用D101大孔树脂柱对苍术寡糖粗提液进行脱色,用去离子水冲洗2~6个柱体积,收集洗脱液并旋转蒸发,然后冷冻干燥,得到苍术粗寡糖粉末;
(3)DP3~DP8的分离纯化:采用分子排阻色谱法对苍术粗寡糖粉末进行分离纯化,分子排阻色谱法中,上样量55~70 mg,采用的是AKTA蛋白纯化系统,填料为Bio-Gel P-2,用超纯水作流动相进行等度洗脱,流速为0.2~0.4 mL/min,收样体积为2~4 mL/管,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度测定,得到DP3、DP4、DP5、DP6、DP7、DP8的寡糖纯品以及特定聚合度寡糖组分段DP1-3、DP3-9、DP4-9、DP6-9、DP8-11、DP10-15和DP11-17;
(4)DP8~DP17的分离纯化:采用亲水作用色谱对步骤(3)得到的特定聚合度寡糖组分段进行分离纯化,并继续采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行纯度测定,得到DP8、DP9、DP10、DP11、DP12、DP13、DP14、DP15、DP16、DP17的寡糖纯品;
步骤(4)中,亲水作用色谱的条件:XAmide色谱柱,尺寸为:10 × 250 mm id, 5 μm,示差折光检测器,上样量0.6 mL,以66%~71%v/v的乙腈水溶液作流动相进行等度洗脱,流速为3~4 mL/min。
2.如权利要求1所述苍术寡糖的分离纯化方法,其特征在于,步骤(1)中,料液比为1:20。
3.如权利要求1所述苍术寡糖的分离纯化方法,其特征在于,步骤(1)中,乙醇水溶液浓度为60%。
4.如权利要求1所述苍术寡糖的分离纯化方法,其特征在于,步骤(1)中,提取温度为85℃。
5.如权利要求1所述苍术寡糖的分离纯化方法,其特征在于,步骤(3)中,所述流速为0.3 mL/min,收样体积3 mL/管,上样量60 mg。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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