CN109400731A - 一种冷水溶性黄芪多糖及其制备方法及其体外抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冷水溶性黄芪多糖及其制备方法及其体外抗肿瘤应用，冷水溶性黄芪多糖为α‑吡喃型葡聚糖，其组成为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，各组分摩尔比为0.28:0.62:0.96:1.00:12.10:1.70，分子量为1.61×10⁶Da。该多糖是以黄芪为原料，在4℃条件下用水提取得到。本发明冷水溶性黄芪多糖对MGC803人胃癌细胞展现了较强的抑制活性，其抑制率相比于热水提黄芪多糖高出一倍以上，且当其浓度为400μg/mL时，相当于50μg/mL的化疗药物5‑Fu的作用效果。

Description

一种冷水溶性黄芪多糖及其制备方法及其体外抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及黄芪多糖，尤其是一种冷水溶性黄芪多糖制备方法及其体外抗肿瘤应用。

背景技术

在中国，黄芪是一种非常珍贵的药材，富含多种生物活性物质，如多糖、黄酮等。传统的多糖提取方法是热水或弱碱性提取，乙醇沉淀。如专利CN105777921A公开了一种黄芪多糖提取工艺，原料黄芪经挑、洗、润、切等预处理后，投入到8-12倍量的蒸馏水中，温度升高至45-50℃，调节pH 5.5-7.0，加入纤维素酶和木瓜蛋白酶的混合酶制剂水解2-3h；随后，加入氢氧化钙溶液，调节溶液pH值为9.0-10.0，升温至75℃，维持60-100min后，自然冷却至50℃，过滤除渣，得滤液I，备用；收集上述残渣，投入6-8倍量的蒸馏水中，温度升高至50-60℃，调节pH在5.5-7.0，加入酶制剂水解2-3h，随后加入氢氧化钙溶液，调节溶液 pH值至9.0-10.0，升温维持在75℃，保持40-60min后，自然冷却至50℃，过滤除渣，得滤液II-1；再次收集残渣，重复上述操作，得到滤液II-2；合并滤液I、II-1和II-2。将合并后的滤液置于真空浓缩机中，减压浓缩至原液体积的70％；向浓缩液中缓慢加入95％乙醇至乙醇终浓度为70％，静置沉降8-12h，机械过滤，获得的沉析物即为黄芪多糖，再用95％乙醇洗涤1-2次；将洗涤后的黄芪多糖沉析物进行冷冻干燥，粉碎后，过100目筛，即得黄芪多糖提取物，其工艺条件温和，所得黄芪多糖提取物纯度高、生物活性好，作为一种药品的原料药，可用于增强机体免疫功能、杀菌抗病毒、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗溃疡和调节血压等。

关于黄芪多糖提取技术的现代研究主要集中在增加黄芪多糖的得率上，且通常与化疗药物顺铂等联用以达到抗肿瘤的功效。

然而，相比于这些现代提取技术，很少有人研究4℃条件提取对黄芪多糖结构和活性的保护作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种冷水溶性黄芪多糖的制备方法，该制备方法提取条件温和，有效保护了多糖结构不被破坏，进而维持多糖较强的抗肿瘤活性，为以后天然活性成分在药品和食品行业的应用提供了良好的基础。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种冷水溶性黄芪多糖，为α-吡喃型葡聚糖，其组成为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，各组分摩尔比为0.28:0.62:0.96:1.00:12.10:1.70，分子量为1.61×10⁶Da。

该多糖的制备方法为：

(1)以蒙古黄芪为原料，向洗净、晾干的黄芪原料500g中加入5L蒸馏水，于4℃条件下浸泡6h，抽滤后得浸提液；对抽滤后的残渣采用相同条件再提取一次，合并两次得到的浸提液，并利用冻融法进行浓缩，50％乙醇沉淀过夜，3500r/min离心15min，沉淀加蒸馏水复溶，采用冻融除蛋白最终获得黄芪粗多糖。

(2)对(1)中获得的粗多糖采用低温条件过G-200葡聚糖凝胶柱，最终分离得到了一种新型的冷水溶性黄芪多糖，其分子量为1.61×10⁶Da。

本发明同时保护该冷水溶性黄芪多糖在抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为人胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人甲状腺癌细胞、人肝癌细胞、人食管癌细胞、人白血病细胞。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明冷水溶性黄芪多糖对MGC803细胞展现了较强的抑制活性，其抑制率相比于热水提黄芪多糖高出一倍以上，且当其浓度为400μg/mL时，相当于50μg/mL的化疗药物5-Fu的作用效果。

2、本发明针对现有的水提醇沉技术成本高、所得多糖生物活性低等不足，采用4℃条件对黄芪多糖进行提取、分离及纯化，得到一种新型、高抗肿瘤活性的冷水溶性黄芪多糖，有效防止高温引起的多糖变性和降解，从而保证其较高的体外抗肿瘤活性。

附图说明

图1为本发明冷水溶性黄芪多糖的Sephade G-200纯化洗脱曲线；

图2为本发明冷水溶性黄芪多糖的紫外全波长扫描图；

图3为本发明冷水溶性黄芪多糖的高效液相色谱图；

图4(a)为单糖标准品的气相色谱图(图中：1—鼠李糖、2—阿拉伯糖、3—木糖、4—甘露糖、5—葡萄糖、6—半乳糖)；

图4(b)为冷水溶性黄芪多糖的气相色谱图；

图5为冷水溶性黄芪多糖的红外光谱图；

图6(a)为冷水溶性黄芪多糖的核磁共振¹H谱图；

图6(b)为冷水溶性黄芪多糖的核磁共振¹³C谱图；

图7为冷水溶性黄芪多糖的的最大吸收波长变化趋势图；

图8为冷水溶性黄芪多糖的的扫描电镜图；

图9为冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的生长抑制作用；

图10为冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的形态学变化的影响(A)；MGC-803细胞经冷水溶性黄芪多糖处理后的扫描电镜图(B:×2000,C:×5000)；

图11为冷水溶性黄芪多糖作用于MGC-803细胞的Hoechst33258染色结果；

图12为冷水溶性黄芪多糖(0–800μg/mL)作用于MGC-803细胞36h后的Annexin V-FITC/PI双染结果；

图13冷水溶性黄芪多糖(0–800μg/mL)作用于MGC-803细胞36h后的细胞周期分布。MGC-803细胞的DNA含量直方图(A)；G0/G1、S及G2/M期细胞分布百分比(B)；

图14冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的ROS水平变化的影响；

图15冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的线粒体膜电位变化的影响。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例

本发明以蒙古黄芪为原料，首先，将清洗干净的黄芪根干燥至恒重，将黄芪干燥根粉碎并过80目筛，得到均匀的黄芪粉末。准确称取上述制备的黄芪粉末500g，按照料液比(1： 10，w/v)加入去离子水，并置于4℃条件下浸泡6h，抽滤后得浸提液；对抽滤后的残渣采用相同条件再提取一次，合并两次获得的黄芪浸提液，采用冷冻浓缩法对浸提液浓缩，得到黄芪浓缩液；向浓缩液中加入等体积的无水乙醇，于4℃冰箱放置过夜，以使多糖充分沉淀。沉淀多糖通过3500rpm离心5min获得后，加水复溶，并采用Sevag法(氯仿-正丁醇)进行脱蛋白处理。将脱除蛋白的多糖水溶液置于蒸馏水中透析3天，以去除盐及小分子物质，最终采用冻干干燥法获得黄芪粗多糖，其提取得率为1.86％，多糖含量为54.15％。

将上述所得黄芪粗多糖(20mg/mL,2mL)采用低温条件过Sephadex G-100层析柱，以超纯水为洗脱溶液，根据苯酚硫酸法合并同一色谱峰的各管收集液，冷冻干燥后得到一种新型的抗肿瘤冷水溶性黄芪多糖，其洗脱曲线如图1所示。经苯酚硫酸法测定该冷水溶性黄芪多糖的多糖含量为89.39％。如图2所示，紫外全波长扫描光谱图结果显示，该冷水溶性黄芪多糖在280nm和260nm处未发现明显的吸收峰，表明该多糖不存在或存在少量的蛋白质、多肽和核酸。

本文采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定该冷水溶性黄芪多糖的分子量分布情况(图 3)。根据葡萄聚糖标准品的分子量(Mw)及相对应的保留时间(Rt)建立标准曲线，其回归方程为y＝-0.4233x+8.7693,R2＝0.9910(y＝lg Mw,x＝Rt)。如图3所示，其高效液相色谱图展示了对称的单一峰，表明该多糖为分子量分布均一的纯多糖。将出峰时间6.054min带入上述回归方程，计算得其重均分子量为1.61×10⁶Da。

该冷水溶性黄芪多糖的单糖组成成分通过气相色谱分析被测定并定性。图4(a)为单糖标准品的气相色谱图，其出峰顺序从左至右依次为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。图4(b)为冷水溶性黄芪多糖的气相色谱图，对比图4(a)，结果显示冷水溶性黄芪多糖的单糖组成为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为0.28:0.62:0.96:1.00:12.10:1.70。其中，葡萄糖为其最主要成分。图中：1—鼠李糖、 2—阿拉伯糖、3—木糖、4—甘露糖、5—葡萄糖、6—半乳糖

生物大分子物质的单体的不对称性和大分子整体的空间不对称性决定其比旋光度大小，且比旋光度是多糖在溶液中表现出的特有的物理常数，与多糖的结构密切相关。依据实验方法，测定冷水溶性黄芪多糖的比旋光度为+140°，表明该多糖中α-糖苷键的存在。

本发明采用KBr压片法，对冷水溶性黄芪多糖的官能团进行了红外光谱分析，实验结果如图5所示。结果显示，该多糖具有相似的特征性官能团。其中，在大约3420cm^-1，2920cm^-1和1420cm^-1处分别代表O–H的伸缩振动吸收峰、C–H的伸缩振动以及C–H的变角振动，为多糖的红外特征吸收峰。在大约1630cm^-1处均有一强吸收峰，是C＝O的伸缩振动，表示多糖中均含有醛基-CHO。在大约845cm^-1处的特征吸收峰，可推断出多糖中α-型糖苷键的存在。此外，在1200–1000cm^-1范围内的三处吸收峰，证明在多糖的葡萄糖残基中含有α-吡喃型糖苷键。结果表明，该冷水溶性黄芪多糖为α-吡喃型葡聚糖。

本发明冷水溶性黄芪多糖的¹H and¹³C NMR图谱如图6所示。其中，¹H NMR主要用于解决多糖中的糖苷键构型问题。从图6(a)中可以看出，该冷水溶性黄芪多糖的质子信号在δ4.9–δ5.5ppm内有6个主要的异头氢，说明含有六种不同类型的糖，与气相分析中的单糖组成结果分析结果一致，且葡萄糖的异头氢有主要位移，其异头氢质子共振大于4.95ppm表明其糖环构型为α型，与红外光谱分析结果一致。质子信号δ值在约4.79ppm处是HOD的化学位移。δ值在3.1–4.2ppm范围内，为H2–H6的质子信号，是典型的多糖信号峰。

如图6(b)，在¹³C NMR图谱中，低场160～180ppm处未见有信号峰出现，表明该多糖不含糖醛酸或糖蛋白。在97ppm和104ppm之间出现三个异头碳，表明它们的糖残基呈α异头构型，与¹H NMR及红外光谱分析结果一致。在大约97.70ppm处的异头碳信号峰证实了多糖中α型葡萄糖残基的存在。然而，在¹³C NMR图谱中，其他几种类型的糖残基的异头碳原子未被成功检测到，可能是由于其他糖残基含量较少且在¹³C NMR中灵敏度低导致的。此外，在65ppm和74ppm之间的强的化学位移是α-D-葡萄糖的C2–C6信号。

刚果红实验结果表明，在不同NaOH浓度下，冷水溶性黄芪多糖与刚果红反应后，其最大吸收波长变化趋势图如图7所示。与刚果红最大吸收波长变化相比，刚果红+该冷水溶性黄芪多糖的最大吸收波长在NaOH浓度为0.1M时发生了明显的红移，当NaOH浓度超过0.1M时，其最大吸收波长逐渐下降，表明该多糖在弱碱溶液中均存在三股螺旋构型。

扫描电子显微镜(SEM)被用于观察冷水溶性黄芪多糖的表面结构特性，其放大200倍后的显微结构图如图8所示。从图中可以看出，该冷水溶性黄芪多糖样品表面呈现明显的片状结构，且带有少量的杆状结构。

为了阐述冷水溶性黄芪多糖对人胃癌MGC-803细胞的生长抑制作用，我们将MGC-803 细胞接种至滚瓶中培养贴壁，待细胞生长至对数生长期，分别向各滚瓶中加不同浓度的多糖溶液(50、100、200、400、800和1000μg/mL)继续培养24、36和48h。培养结束，收集细胞，利用MTT法测定细胞存活率。从图9中可以看出，多糖处理对MGC-803细胞表现出了显著地增长抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。冷水溶性黄芪多糖作用于MGC-803细胞 24、36和48h的半致死抑制率分别为647.15μg/mL、272.1μg/mL和163.93μg/mL。当冷水溶性黄芪多糖作用于MGC-803细胞24、36和48h时，其生长抑制率分别从7.89％增长至 56.03％、19.33％增长至73.23％及21.41％增长至80.15％。此外，当冷水溶性黄芪多糖作用浓度达到800μg/mL时，对MGC-803细胞的生长抑制作用相当于50μg/mL的5-Fu的作用效果。

MGC-803细胞在用不同浓度的冷水溶性黄芪多糖处理之后，其形态学特性如图10所示。与未加药处理组贴壁良好、形态呈正常上皮样的细胞相比，MGC-803细胞在被冷水溶性黄芪多糖处理之后表现出了显著地凋亡形态学变化，包括细胞皱缩、变圆，排列疏松，贴壁能力逐渐丧失。如图10(B)和(C)所示，MGC-803细胞的扫描电镜图表明，未经冷水溶性黄芪多糖处理的MGC-803细胞具有完整的细胞膜和大量的微绒毛，且呈现出良好的贴壁形态；经冷水溶性黄芪多糖处理后，MGC-803细胞的微绒毛逐渐丧失，膜出泡，大小皱缩。这些现象表明，冷水溶性黄芪多糖作用后的MGC-803细胞也许正在经历凋亡。

为进一步证实冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的凋亡诱导作用，将不同浓度加药处理的细胞用特异性核酸染料Hoechst33258染色。该结果表明，MGC-803细胞经药物处理后，表现出了典型的凋亡学特性，例如核固缩、染色质浓缩、DNA碎片及形成凋亡小体(图11)。然而，未经药物处理的细胞表现出了形态规则、染色均匀的细胞核。上述现象表明，冷水溶性黄芪多糖处理在诱导MGC-803细胞凋亡过程中能够引起核DNA碎片。

为了证实上述细胞形态学和核染色结果，AnnexinV-FITC/PI双染被进一步用于检测冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的凋亡诱导作用。如图12所示，当加药浓度从0μg/mL依次增加至200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL时，活细胞(Annexin V–阴性/PI–阴性)的比例从97.17％分别降低至81.31％、63.55％和54.23％。此外，当MGC-803细胞暴露于冷水溶性黄芪多糖后，早期凋亡细胞(Annexin V–阳性/PI–阴性)的比例从2.01％(0μg/mL)增加至了23.36％(800μg/mL)，而晚期凋亡细胞(Annexin V–阳性/PI–阳性)的比例从0.58％(0μg/mL) 增加至了20.60％(800μg/mL)，呈现出计量依赖性。这些数据表明，冷水溶性黄芪多糖对 MGC-803细胞的凋亡诱导作用可通过膜联蛋白外翻引起，进一步引起凋亡形态学的变化。

为评估冷水溶性黄芪多糖对MGC-803细胞的生长抑制作用是否由于细胞周期阻滞， MGC-803细胞用不同浓度的冷水溶性黄芪多糖处理36h后，细胞被收集并用PI染色，采用流式细胞术检测MGC-803的细胞周期分布。从DNA直方图(图13)可以看出，随着冷水溶性黄芪多糖作用浓度的不断增加，MGC-803细胞的S期明显积累，其比例从37.66％(0μg/mL)依次增加至41.66％(200μg/mL)、48.1％(400μg/mL)和60.88％(800μg/mL)；相对应的， G0/G1期的比例从52.63％(0μg/mL)依次降低至45.46％(200μg/mL)、40.58％(400μg/mL) 和36.99％(800μg/mL)。此外，随着冷水溶性黄芪多糖浓度的增加，G2/M期比例也出现不同程度的降低。由此可知，冷水溶性黄芪多糖能够使MGC-803细胞周期阻滞在S期，从而诱导细胞凋亡。

为进一步推测MGC-803细胞对冷水溶性黄芪多糖的凋亡反应是否部分由于ROS水平的额外增加，本文采用DCFH-DA作用荧光探针，并用流式细胞术检测MGC-803细胞的ROS水平的变化。实验结果如图14所示，经不同浓度的冷水溶性黄芪多糖处理36h后，MGC-803细胞的荧光强度显著地被加强，且呈剂量相关性。MGC-803细胞的活性氧水平从未经冷水溶性黄芪多糖处理的12.08％依次增加至23.20％(200μg/mL)、35.14％(400μg/mL)和52.42％(800μg/mL)。结果表明，冷水溶性黄芪多糖处理可显著地激发MGC-803细胞内ROS的产生。

为证实冷水溶性黄芪多糖诱导的线粒体凋亡通路，本文通过流式细胞术检测MGC-803 细胞线粒体膜电位的变化。如图15所示，MGC-803细胞经不同浓度的冷水溶性黄芪多糖处理后，其线粒体膜电位呈剂量相关性的降低。随着冷水溶性黄芪多糖剂量从0μg/mL依次增加至200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL，Rh123阳性细胞的比例从83.08％显著降低至68.98％、60.39％和43.73％。实验结果表明，冷水溶性黄芪多糖处理可诱导MGC-803细胞线粒体膜电位完整性的破坏。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种冷水溶性黄芪多糖，其特征在于：为α-吡喃型葡聚糖，其组成为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，各组分摩尔比为0.28:0.62:0.96:1.00:12.10:1.70，分子量为1.61×10⁶Da。

2.根据权利要求1所述的冷水溶性黄芪多糖的制备方法，其特征在于：以黄芪为原料，在4℃条件下用水提取黄芪多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，步骤如下：

(1)以蒙古黄芪为原料，向洗净、晾干的黄芪原料中加入蒸馏水，蒸馏水与黄芪的比例为1：10，w/v，于4℃条件下浸泡6～12h，抽滤后得浸提液；对抽滤后的残渣采用相同条件再提取一次，合并两次得到的浸提液，并利用冻融法进行浓缩，乙醇沉淀过夜，离心，沉淀加蒸馏水复溶，采用冻融除蛋白最终获得黄芪粗多糖；

(2)对步骤(1)中获得的粗多糖采用低温条件过G-200葡聚糖凝胶柱，最终分离得到了一种新型的冷水溶性黄芪多糖。

4.根据权利要求1～3任一权利要求所述的冷水溶性黄芪多糖在抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为人胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人甲状腺癌细胞、人肝癌细胞、人食管癌细胞、人白血病细胞。