CN111337529A - 一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，包括以下步骤：(1)向干燥的多糖样品加入氘代试剂，混匀直至完全溶解；(2)将制备的多糖核磁样品置于核磁共振仪中，获得核磁共振图谱。本发明能够快速有效的检测出羟丙基甘露聚糖独立的糖单元异头碳质子峰、羟丙基甲基质子峰，进而计算出羟丙基甘露聚糖的取代度，同时本发明能够显著降低多种多糖样品的粘度，使水峰偏移到不干扰其它峰的程度，并且氘代盐酸的浓度与水峰的化学位移值呈线性关系，因此可以通过调节氘代盐酸浓度来定位水峰位置。本发明可实现常温下进行核磁共振检测，克服了现有技术中需要通过升高测定温度并进行反复的重水置换来改变HOD峰对其它峰的影响的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于核磁测定的研究及应用领域，涉及一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法。
背景技术
多糖广泛存在于自然界中，且在科技发展、人们生活水平日益提高的今天，多糖广泛应用于我们的日常生活当中。自然界中存在的多糖多种多样，它们一般是由单糖单元以α-或β-糖苷键链接而成的大分子结构，如纤维素、壳聚糖、木聚糖、从属于甘露聚糖的葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等。纤维素是世界上最丰富的天然可再生有机物，广泛存在于各种生物质中，纤维素及其衍生物广泛应用于纺织、轻工、化工、国防、石油、医药、能源、生物技术和环境保护等领域，由于天然纤维素的聚集态结构特点及其分子间和分子内存在很多氢键和较高的结晶度，不溶于水和常用的有机、无机溶剂，耐化学腐蚀，缺乏热可塑性，强度较差，这对其成型、加工和应用都极为不利，致使其应用受到许多限制，为有效利用纤维素，纤维素的改性方法不断得到改进，改性的纤维素应用范围一定程度上也取决于其改性的程度，如取代度等；几丁质是自然界中极为丰富的多糖资源，其含量仅次于纤维素，壳聚糖是通过几丁质部分脱乙酰而获得的多糖，可用于许多行业，例如食品加工，化妆品，废物管理，水净化，伤口愈合，组织修复，药物和基因传递，该生物聚合物的大多数物理和化学性质在很大程度上取决于其脱乙酰度；木聚糖是木材中最常见的半纤维素，在一年生植物中，例如草，谷类和药草，在硬木(如桉木，枫木，桦木)占10-35wt％，软木中占10-15wt％(例如云杉，松木和雪松)，木聚糖的应用领域非常广泛，其潜力可以通过化学衍生化来增强，木聚糖及其衍生物已被用于生产生物乙醇，木糖醇和木糖寡糖，以及低透氧性的薄膜，复合材料，作为纸添加剂和絮凝助剂的水凝胶表面活性剂，抗微生物剂和涂料着色组分，其衍生物的取代度再一定程度上会影响其应用范围；甘露聚糖是富含甘露糖的半纤维素化合物，存在于软木以及某些植物(尤其是兰花)的根，块茎，鳞茎和种子中，广泛应用于水处理、造纸、食品、医药等领域，但其溶解速度慢，粘度难以控制等使其应用受到一定的限制。目前通过对甘露聚糖羧甲基化、酯化、离子化等可改善其性能，同样，不同改性的甘露聚糖的应用也取决于其取代度。取代度的测定需要一种精确测量该参数的技术，现有技术中核磁法是公认的测定取代度较好的方法之一，其用量少，易操作，可以准确测定取代度，且1H-NMR常作为标准方法用于校准其它方法。
核磁法也有一定的局限性，如一定测试温度下多糖核磁谱图的水峰(主要是HOD峰)与糖单元异头碳质子峰所处的位移相近，在一些多糖样品核磁谱图中，其水峰(主要是HOD峰)与糖单元异头碳质子峰无法很好的分离，同时像甘露聚糖等样品粘度较大，导致其在所需的核磁样品浓度范围内流动性较差，无法获得精确的核磁谱图；专利CN201810987193.2中提到可以通过升高测试温度60-70℃来降低待测样品溶液的粘度，从而提高质子峰信号采集的灵敏度，使待测质子峰避开HOD峰对其测定的影响，但同时较高的测试温度也会对核磁共振波谱仪的性能有更高的要求，这在一定程度上限制了取代度的测定等。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，用于解决现有技术中多糖核磁样品难以制备和测定的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，具体包括以下步骤：
(1)多糖核磁样品的制备
向干燥的多糖样品中分别加入氘代试剂(D2O、DCl)，混匀直至将其完全溶解；
(2)样品测试
将步骤(1)中制备的多糖核磁样品置于核磁共振仪中，获得多糖样品的核磁共振图谱。
进一步地，所述的步骤(1)中，甘露聚糖选自多糖样品选自半乳甘露聚糖、羟丙基半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、羟丙基葡甘露聚糖、木聚糖、羟丙基木聚糖、淀粉或高取代度的羟丙基纤维素。
进一步地，所述的步骤(1)中，多糖样品的干燥条件为：先80℃干燥1-2小时后，迅速升温至105℃再干燥1-2小时，干燥至恒重。
进一步地，所述的步骤(1)中多糖核磁样品制备所用氘代试剂DCl溶液的摩尔浓度为0.6mol/L～3.0mol/L。
进一步地，所述的步骤(1)中多糖核磁样品制备所用氘代试剂DCl溶液的摩尔浓度为1.8mol/L。
进一步地，所述的步骤(2)中核磁共振仪的参数设置如下：温度为室温、采集数据前的热平衡时间为10-20分钟。
进一步地，所述室温为25℃。
同时，本发明还提供一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法在测定羟丙基甘露聚糖取代度中的应用，在上述提供的不同技术方案的基础上，还包括对羟丙基甘露聚糖核磁图谱的数据处理和计算取代度的步骤：从步骤(2)中得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的峰面积积分与计算；波谱归属为4.53±0.02ppm的质子峰为葡萄糖异头碳质子峰HG，波谱归属为4.76±0.02ppm的质子峰为甘露糖异头碳的质子峰HM，其两峰的面积积分和为I1；波谱归属为1.16±0.02ppm的质子峰为羟丙基甘露聚糖羟丙基上甲基的质子峰，其积分为ICH3；则羟丙基甘露聚糖的取代度为：
此外，本发明还提供一种多糖样品核磁共振图谱中定位HOD峰位置的方法，包括上述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值呈线性关系，所述氘代溶剂选自D2O和DCl的混合溶液，多糖样品选自半乳甘露聚糖、羟丙基半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、羟丙基葡甘露聚糖、木聚糖、羟丙基木聚糖、淀粉、高取代度的羟丙基纤维素、羟丙基壳聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃-60℃。
进一步地，所述线性关系具体为：当所述多糖样品选自羟丙基甘露聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.5081x+4.8193，
进一步地，当所述多糖样品选自羟丙基甘露聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为60℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.5292x+4.4888，
进一步地，当所述多糖样品选自羟丙基壳聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.4714x+4.7729，
其中，上述线性方程中x均为氘代盐酸的摩尔浓度，单位为mol/L，y均为HOD峰的化学位移值。
如上所述，本发明所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，具有以下有益效果：
(1)能检测出独立的HG质子峰(4.53±0.02ppm)、HM质子峰(4.76±0.02ppm)和HCH3质子峰(1.16±0.02ppm)和HOD峰。
(2)通过说明书附图3看出，不同盐酸浓度能降低甘露聚糖的粘度。
(3)通过羟丙基甘露聚糖核磁谱图(说明书附图2)的结构解析看出加入DCl后，水峰(即HOD峰)逐渐的向低场移动，且测试条件在室温下的水峰偏移程度要大于60℃，在DCl浓度为1.8mol/L时，水峰已完全与糖单元异头碳质子峰分离。
(4)通过甘露聚糖核磁谱图(说明书附图4)的结构解析看出当DCl浓度为1.8mol/L时，甘露聚糖的核磁谱图能够清晰的获得，且水峰与糖单元异头碳质子峰完全分离。
(5)通过红外图谱(说明书附图1)和羟丙基甘露聚糖核磁氢谱(说明书附图2)的结构解析确认HCH3质子峰为发生羟丙基取代的取代质子峰，HCH3质子峰为C6-OH、C2-OH、C3-OH上发生羟丙基取代的O-取代质子峰。
(6)通过核磁谱图(说明书附图5和说明书附图6)的结构解析看出当DCl浓度为1.8mol/L时，羟丙基纤维素和木聚糖的核磁谱图能够清晰的获得，且水峰与糖单元异头碳质子峰完全分离。
(7)通过核磁谱图(说明书附图7)的结构解析看出当DCl浓度改变时，羟丙基壳聚糖的核磁谱图中水峰发生了明显偏移。
(8)通过说明书附图8-10，可以看出，氘代盐酸的浓度与水峰的化学位移值呈现良好的线性关系。
综上，本发明提供的技术方案能够很好的解决甘露聚糖等多糖样品粘度较大和在进行核磁测试中流动性较差的难题，进而获得了精确的核磁谱图；同时实现了在常温条件下，核磁谱图的水峰与糖单元异头碳质子峰很好的分离，有利于取代度的准确测定，同时发现了氘代盐酸浓度与水峰位置呈现线性关系，进而可以通过调整氘代盐酸的浓度，定位水峰的位置。
附图说明
图1显示为本发明甘露聚糖与羟丙基甘露聚糖红外谱图，其中a为甘露聚糖、b为羟丙基甘露聚糖。
图2显示为本发明不同浓度的DCl、不同检测温度下羟丙基甘露聚糖的核磁谱图示意图。
图3显示为本发明不同DCl浓度降低甘露聚糖粘度的示意图。
图4显示为本发明氘代盐酸对甘露聚糖核磁谱图的影响示意图。
图5显示为本发明氘代盐酸对羟丙基纤维素核磁谱图的影响示意图。
图6显示为本发明氘代盐酸对木聚糖核磁谱图的影响示意图。
图7显示为本发明氘代盐酸对羟丙基壳聚糖核磁谱图的影响示意图。
图8显示为本发明25℃时氘代盐酸的摩尔浓度与羟丙基甘露聚糖HOD峰的化学位移值线性关系图。
图9显示为本发明60℃时氘代盐酸的摩尔浓度与羟丙基甘露聚糖HOD峰的化学位移值线性关系图。
图10显示为本发明25℃时氘代盐酸的摩尔浓度与羟丙基壳聚糖HOD峰的化学位移值线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于此实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均在本发明的保护范围内。
本发明所用的不同摩尔浓度的氘代盐酸，可通过20％DCl的溶液以本领域常规手段配置获得。
实施例1
羟丙基甘露聚糖的制备和结构表征
试剂：甘露聚糖(KGM，
30℃)、NaOH、无水乙醇、环氧丙烷、丙酮。
仪器：Nicolet IS10傅里叶变换红外色谱仪Thermo公司
实验方法：
(1)样品制备
a.羟丙基甘露聚糖的制备
将甘露聚糖加入至20％NaOH、70％无水乙醇和环氧丙烷混合液中，40℃反应6.5h，后用丙酮沉淀、水溶解中和、透析、冻干得羟丙基甘露聚糖样品。
b.甘露聚糖和羟丙基甘露聚糖红外样品的制备
称取甘露聚糖、羟丙基甘露聚糖分别10mg，80℃干燥1-2小时，再升温至105℃，直至干燥至恒重。干燥结束后，置于干燥器中冷却备用；
(2)样品测试
取部分样品与溴化钾混合均匀压片，与Nicolet IS10傅里叶变换红外色谱仪(Thermo公司)检测，其中参数为1cm-1步进、扫描次数32次，扫描范围为4000-400cm-1。
(3)数据处理
利用红外的应用软件，从步骤(2)中得到甘露聚糖和羟丙基甘露聚糖的红外谱图如说明书附图1所示：甘露聚糖在1743cm-1处有吸收，而其衍生物羟丙基甘露聚糖在此波数下无吸收，1743cm-1可归属于乙酰基上C＝O的伸缩振动，由此可以看出，羟丙基过程中破坏了甘露聚糖上的乙酰基，从而一定程度上改变其凝胶特性。在1641cm-1、1064cm-1处的吸收峰强度变大，可以说明甘露聚糖上已经有了一定的羟丙基取代。
实施例2
DCl浓度和温度对羟丙基甘露聚糖HOD峰偏移的影响
试剂：羟丙基甘露聚糖样品(
30℃)
仪器：JNM-ECP600核磁共振波谱仪日本电子株式会社
实验方法：
(1)羟丙基甘露聚糖核磁样品的制备
称取羟丙基甘露聚糖10mg，在60℃过夜干燥，80℃干燥1-2小时，再升温至105℃，直至干燥至恒重。干燥结束后，打开烘箱立即封口，置于干燥器中冷却备用；将氘代试剂(0M、0.6M、1.8M、3.0M的DCl)与羟丙基甘露聚糖样品充分混匀，静置，直至完全溶解，用移液器加入到核磁管中，4小时后待测。
(2)样品测试
将装有样品的核磁管就位于核磁共振仪(JNM-ECP600核磁共振波谱仪日本电子株式会社)中，通过锁场、匀场、探头调谐、设置参数、数据的采集以及数据处理等步骤，获得质子核磁共振图谱。其中，参数设置方面，测试温度为25℃和60℃，热平衡时间为10分钟后进行数据采集，扫描次数为32次，将采集到的数据保存待用。
通过记录不同DCl浓度和温度条件下的水峰(即HOD峰)的化学位移值，研究DCl浓度和温度对羟丙基甘露聚糖HOD峰偏移的影响。
表1 不同DCl浓度和温度对羟丙基甘露聚糖HOD峰偏移影响
注：表中“—”表示受相邻的HOD峰影响，HM峰或HG峰被覆盖而观察不到。
从表1可以看出，在室温25℃下，不加入氘代盐酸(即DCl＝0mol/L)时，HOD峰4.84ppm与HM峰4.76±0.02ppm位置接近，因此在说明书附图2的e图中无法检测到HM吸收峰，同样的在60℃下，不加氘代盐酸(即DCl＝0mol/L)的HOD峰4.47ppm与HG峰4.53±0.02ppm位置相近，氘代盐酸浓度为0.60mol/L时，HOD峰的4.82ppm与HM峰4.76±0.02ppm位置接近，因此在这三个条件下都无法准确的检测到羟丙基甘露聚糖的糖单元异头碳质子峰。同时，可以从表1中发现在同一DCl浓度下，25℃下的HOD峰较60℃的HOD峰位置向低场偏移，当氘代盐酸浓度为0.60mol/L时，25℃下可以同时检测到HM峰和HG峰，而相同氘代盐酸浓度下，当检测温度为60℃时，无法检测到HM峰。
此外，从说明书附图2b(60℃)可以看出，羟丙基甘露聚糖的核磁谱图中HOD峰未与甘露糖异头碳的质子峰完全分离，导致其无法测得羟丙基甘露聚糖的取代度，而DCl浓度与说明书附图2b相同，但测试温度为室温的说明书附图f可以看出HOD峰与甘露糖异头碳的质子峰分离，可用于取代度的测定。因此可认为室温下较60℃下更便于测取代度。
(3)羟丙基甘露聚糖取代度的测定
利用核磁共振波谱仪的应用软件，从步骤(2)中得到羟丙基甘露聚糖的核磁共振谱图如说明书附图2所示：波谱归属为4.53±0.02ppm的质子峰为葡萄糖异头碳质子峰H1-G，波谱归属为4.76±0.02ppm的质子峰为甘露糖异头碳的质子峰H1-M，其两峰的面积积分和为I1；波谱归属为1.16±0.02ppm的质子峰为羟丙基甘露聚糖羟丙基上甲基的质子峰，其积分为ICH3；则羟丙基甘露聚糖的取代度为：
计算结果如表2。
表2 25℃下羟丙基甘露聚糖取代度的测定
从表2可以看出，仅使用重水(DCl浓度为0)作溶剂时，由于水峰(即HOD峰)的覆盖，无论是25℃还是60℃，均难以测得异头碳的质子峰，因此难以计算取代度。同理，60℃时，0.60mol/L的氘代盐酸溶液中，由于水峰的覆盖，也难以计算取代度。加入不同浓度的DCl溶液(羟丙基甘露聚糖核磁样品制备所用氘代试剂DCl的摩尔浓度为0.60mol/L～3.01mol/L时)，由于水峰左移，被水峰覆盖的异头碳的质子峰逐渐露出来，
25℃相对于60℃时，水峰向低场偏移的幅度更加明显。同时，25℃相对于60℃的核磁共振测试条件，成本上更加经济，时间上更加快速。因此，选择25℃时，氘代盐酸溶液浓度为0.6-3.0mol/L，可以快速准确的检测并通过计算得出羟丙基甘露聚糖的取代度。
由此可见，氘代盐酸溶液对于HOD峰的偏移具有重要作用，常温下就能实现核磁共振检测，具有显著的有益技术效果。
实施例3
DCl浓度对多糖粘度的影响
试剂：甘露聚糖(KGM，
30℃)，D2O，20％DCl.
实验方法：低粘度的甘露聚糖样品制备：配制浓度为0M、0.5M、1.8M DCl溶液与甘露聚糖样品混合，40℃加热，直至溶解，观察流动性。
实验结果：
如说明书附图3所示，加入DCl溶液后甘露聚糖的流动性得到了很大的提高。
采用上述类似的实验方法，发现加入DCl溶液后，半乳甘露聚糖、羟丙基半乳甘露聚糖、羟丙基葡甘露聚糖、木聚糖、羟丙基木聚糖，淀粉或高取代度的羟丙基纤维素，粘度均得到显著降低，流动性明显提高。
实施例4
DCl浓度对甘露聚糖HOD峰偏移的影响
试剂：甘露聚糖(KGM，
30℃)，D2O，20％DCl。
仪器：JNM-ECP600核磁共振波谱仪日本电子株式会社
实验方法：
(1)核磁样品制备
称取甘露聚糖10mg，在60℃过夜干燥，80℃干燥1-2小时，再升温至105℃，直至干燥至恒重。干燥结束后，打开烘箱立即封口，置于干燥器中冷却备用；将氘代试剂(0M DCl和1.8M DCl)与甘露聚糖充分混匀，静置，直至完全溶解，用移液器加入到核磁管中，4小时后待测；
(2)样品测试
将装有样品的核磁管就位于核磁共振仪(JNM-ECP600核磁共振波谱仪日本电子株式会社)中，通过锁场、匀场、探头调谐、设置参数、数据的采集以及数据处理等步骤，获得质子核磁共振图谱。其中，参数设置方面，测试温度为25℃，热平衡时间为10分钟后进行数据采集，扫描次数为32次，将采集到的数据保存待用。
利用核磁共振波谱仪的应用软件，从步骤(2)中得到甘露聚糖的核磁共振谱图如说明书附图4所示：波谱归属为4.53±0.02ppm的质子峰为葡萄糖异头碳质子峰HG，波谱归属为4.76±0.02ppm左右的质子峰为甘露糖异头碳的质子峰HM，水峰(即HOD峰)在DCl浓度为1.8mol/L时其与糖单元异头碳质子峰分离，说明DCl浓度能够使甘露聚糖HOD峰产生明显偏移。
实施例5
DCl浓度对其他多糖(羟丙基纤维素、木聚糖、羟丙基壳聚糖)HOD峰偏移的影响
试剂：羟丙基纤维素，木聚糖，羟丙基壳聚糖，D2O，20％DCl。
仪器：JNM-ECP600核磁共振波谱仪日本电子株式会社
实验方法：
(2)多糖核磁样品制备
分别称取羟丙基纤维素和木聚糖10mg，在60℃过夜干燥，80℃干燥1-2小时，再升温至105℃，直至干燥至恒重。干燥结束后，打开烘箱立即封口，置于干燥器中冷却备用；将氘代试剂(1.8M DCl)分别与羟丙基纤维素和木聚糖充分混匀，静置，直至完全溶解，用移液器加入到核磁管中，4小时后待测；
(2)样品测试
将装有样品的核磁管就位于核磁共振仪(JNM-ECP600核磁共振波谱仪，日本电子株式会社)中，通过锁场、匀场、探头调谐、设置参数、数据的采集以及数据处理等步骤，获得质子核磁共振图谱。其中，参数设置方面，测试温度为25℃，热平衡时间为10分钟后进行数据采集，扫描次数为32次，将采集到的数据保存待用。
利用核磁共振波谱仪的应用软件，从步骤(2)中得到羟丙基纤维素和木聚糖的核磁共振谱图分别与现有技术中已报道的羟丙基纤维素和木聚糖在氘代溶剂(0M的DCl)的核磁共振谱图进行对比，如说明书附图5和图6所示，可以发现水峰(即HOD峰)在DCl浓度为1.8mol/L时其与糖单元异头碳质子峰分离，说明DCl浓度能够使羟丙基纤维素和木聚糖等其他多糖的HOD峰产生明显偏移。
利用核磁共振波谱仪的应用软件，从步骤(2)中得到不同DCl浓度下的羟丙基壳聚糖的核磁共振谱图，如说明书附图7所示，可以发现水峰(即HOD峰)在DCl浓度为1.78mol/L时其与糖单元异头碳质子峰分离，说明DCl浓度能够使羟丙基壳聚糖的HOD峰产生明显偏移。氘代试剂的摩尔浓度与羟丙基甘露聚糖HOD峰的化学位移值之间的关系如下表3所示：
表3 25℃时，不同DCl浓度对羟丙基壳聚糖HOD峰偏移影响
| DCl浓度 | 0.026623 | 1.777219 | 2.941811 |
| 水峰位置 | 4.785 | 5.612 | 6.159 |
实施例6
氘代试剂的摩尔浓度与羟丙基甘露聚糖HOD峰的化学位移值线性关系研究
研究25℃和60℃下，不同氘代盐酸浓度下，羟丙基甘露聚糖核磁共振图谱中水峰的化学位移值，发现二者呈良好的线性关系。根据表4和表5作图，如附图8、附图9所示：
表4 25℃时，不同DCl浓度对羟丙基甘露聚糖HOD峰偏移影响
| DCl浓度 | 0 | 0.59 | 1.78 | 2.93 |
| 水峰位置 | 4.84 | 5.09 | 5.73 | 6.31 |
表5 60℃时，不同DCl浓度对羟丙基甘露聚糖HOD峰偏移影响
| DCl浓度 | 0 | 0.59 | 1.78 | 2.93 |
| 水峰位置 | 4.47 | 4.82 | 5.44 | 6.03 |
因此，可以通过调整不同浓度的氘代盐酸的浓度，来定位水峰的位置，该线性关系具有非常重要且实用意义。
实施例7
氘代试剂的摩尔浓度与羟丙基壳聚糖HOD峰的化学位移值线性关系研究
研究25℃下，不同氘代盐酸浓度下，羟丙基壳聚糖水峰的化学位移值，发现二者呈良好的线性关系。根据表6作图，如附图10所示：
表6 25℃时，不同DCl浓度对羟丙基壳聚糖HOD峰偏移影响
| DCl浓度 | 0.026623 | 1.777219 | 2.941811 |
| 水峰位置 | 4.785 | 5.612 | 6.159 |
因此，可以通过调整不同浓度的氘代盐酸的浓度，定位水峰的位置，该线性关系具有非常重要且实用意义。
综上所述，本发明提供了一种降低样品粘度、使水峰偏移的核磁样品制备方法，能够很好的解决甘露聚糖等样品粘度较大和在进行核磁测试中流动性较差的难题，进而获得了精确的核磁谱图；同时实现了常温条件下，核磁谱图的水峰与糖单元异头碳质子峰很好的分离，有利于取代度的准确测定。本发明的技术方案揭示了氘代盐酸的浓度与水峰的化学位移值呈线性关系，因此可以通过调节氘代盐酸浓度来定位水峰位置。本发明可实现常温下进行核磁共振检测，克服了现有技术中需要通过升高测定温度并进行反复的重水置换来改变HOD峰对其它峰的影响的缺陷。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
Claims (10)
1.一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)多糖核磁样品的制备
向干燥的多糖样品加入氘代试剂，混匀直至将其完全溶解，所述氘代试剂为D2O和DCl的混合溶液；
(2)样品测试
将步骤(1)中制备的多糖核磁样品置于核磁共振仪中，获得多糖样品的核磁共振图谱。
2.根据权利要求1所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，多糖样品选自半乳甘露聚糖、羟丙基半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、羟丙基葡甘露聚糖、木聚糖、羟丙基木聚糖、淀粉、高取代度的羟丙基纤维素、羟丙基壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，多糖样品的干燥条件为：先80℃干燥1-2小时后，迅速升温至105℃再干燥1-2小时，干燥至恒重。
4.根据权利要求1所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述的步骤(1)中多糖核磁样品制备所用氘代试剂DCl溶液的摩尔浓度为0.6mol/L～3.0mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述的步骤(1)中多糖核磁样品制备所用氘代试剂DCl溶液的摩尔浓度为1.8mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述的步骤(2)中核磁共振仪的参数设置如下：温度为室温、采集数据前的热平衡时间为10-20分钟。
7.根据权利要求6所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于：所述室温为25℃。
8.一种测定羟丙基甘露聚糖取代度的方法，包括权利要求1-7任一项所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于还包括对羟丙基甘露聚糖核磁图谱的数据处理和计算取代度的步骤：从步骤(2)中得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的峰面积积分与计算；波谱归属为4.53±0.02ppm的质子峰为葡萄糖异头碳质子峰HG，波谱归属为4.76±0.02ppm的质子峰为甘露糖异头碳的质子峰HM，其两峰的面积积分和为I1；波谱归属为1.16±0.02ppm的质子峰为羟丙基甘露聚糖羟丙基上甲基的质子峰，其积分为ICH3；则羟丙基甘露聚糖的取代度为：
9.一种多糖样品核磁共振图谱中定位HOD峰位置的方法，包括权利要求1-4任一项所述的一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法，其特征在于所述氘代溶剂选自D2O和DCl的混合溶液，氘代溶剂的浓度为摩尔浓度，所述多糖样品选自半乳甘露聚糖、羟丙基半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、羟丙基葡甘露聚糖、木聚糖、羟丙基木聚糖、淀粉、高取代度的羟丙基纤维素、羟丙基壳聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃-60℃，所述氘代溶剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值呈线性关系。
10.根据权利要求9所述的一种多糖样品核磁共振图谱中定位HOD峰位置的方法，其特征在于当所述多糖样品选自羟丙基甘露聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.5081x+4.8193；
当所述多糖样品选自羟丙基甘露聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为60℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.5292x+4.4888；
当所述多糖样品选自羟丙基壳聚糖，所述步骤(2)中核磁共振图谱采集温度设置为25℃时，所述氘代试剂的摩尔浓度与HOD峰的化学位移值之间的线性方程为y＝0.4714x+4.7729，
其中，上述线性方程中x均为氘代盐酸的摩尔浓度，单位为mol/L，y均为HOD峰的化学位移值。
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| CN111337529B (zh) | 2023-06-16 |
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