CN108409878A - 厚朴多糖及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种厚朴多糖的制备方法及其降血糖、降血脂活性。属于医药领域，国际专利号分类为C08B 38/60。一种厚朴多糖粗品和厚朴多糖精品，它是由植物厚朴皮粉碎后过筛，经热水提取，乙醇沉淀，4℃过夜，离心去上清，沉淀用乙醇洗涤三次，干燥后得厚朴水提物。厚朴水提物溶解于水，加入阴离子大孔树脂去色素和蛋白质。脱色液浓缩后，乙醇沉淀，离心去上清，沉淀用乙醇洗涤3次，干燥后得厚朴多糖粗品。厚朴多糖粗品经离子交换层析和凝胶过滤层析纯化后得厚朴多糖精品。它们具有降血脂、降血糖、抗炎活性和免疫调节作用。

Description

厚朴多糖及其制备和用途

技术领域

本发明涉及一种厚朴多糖的制备方法及其降糖、降脂、消炎和抗氧化活性，用于治疗与高血糖、高血脂、炎症相关的疾病或作为免疫调节剂，属于医药领域，国际专利分号分类为C08B37/60。

背景技术

中药厚朴为木兰科植物厚朴(Magnolia offcinalis Rend et Wils)的干皮、根皮或枝皮，性温、味苦辛、无毒，入脾、胃、大肠经，能温中下气，燥湿消痰。厚朴在我国有两千多年药用历史，用于治疗消化系统、呼吸系统等多个系统及器官的疾病，2015版《中国药典》记载的厚朴为主要原料药的中成药达20余种。我国很多方剂如厚朴三物汤、大承气汤、四七汤和桅子厚朴汤中都含有生药厚朴。

厚朴含有多种化学成分，包括酚类、生物碱类、挥发油类、黄酮类、多糖等成分，其中厚朴酚与和厚朴酚是主要活性成分，目前国内外对厚朴的药理研究主要其中在厚朴酚、和厚朴酚的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用。近年来，虽然中药大分子的研究最来最受到关注，但对厚朴多糖的研究仅限于提取方法的优化及体外抗氧化活性，对其结构和药理作用的研究还是空白。本发明通过解决厚朴多糖制备的技术性难题，获得均一厚朴多糖，并进一步研究了厚朴多糖的降脂、降糖、抗炎和免疫调节活性，证明厚朴多糖可以应用于高血脂、高血糖、炎症以及免疫相关疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种从厚朴水提取物中获得厚朴多糖粗品的方法以及从厚朴多糖粗品中分离纯化得到厚朴多糖纯品的方法。

本发明所述的厚朴多糖为含D-葡萄吡喃环的多糖，具体由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖以摩尔比0.003：0.002：0.019：0.967：0.008组成，所述的厚朴多糖的分子量大于20000Da。

所述的获得厚朴多糖粗品的方法，将厚朴皮干燥品粉碎过筛后加入去离子水，加热，离心取上清，将上清液浓缩，加入乙醇沉淀，真空干燥后得到本发明所述的厚朴水提取物。将厚朴水提取物溶解于去离子水中，加入大孔树脂去色素和蛋白质，将脱色液过滤，加入乙醇沉淀，将沉淀真空干燥后得到本发明的厚朴多糖粗品(MOP)，其多糖含量占总固体重量的60％以上。

所述的获得厚朴多糖精品的方法，将厚朴多糖粗品(MOP)溶解于去离子水，用离子交换层析进行纯化，洗脱液为去离子水，用硫酸-蒽酮比色法跟踪检测，收集主峰，再采用凝胶过滤层析，洗脱液为去离子水，用硫酸-蒽酮比色法跟踪检测，收集主峰，真空干燥，即得到本发明所述的厚朴多糖精品(MOP-1)，其多糖含量占总固体的95％以上。

所述方法中，加热提取是在水浴中加热，水浴温度在60-95℃。

所述方法中，加热提取时间为1-6小时。

所述方法中，提取所用的液固比为5-30(mL/g)。

所述方法中，大孔树脂为阴离子交换树脂。

所述方法中，大孔树脂脱色时间为0.5-4小时。

所述方法中，离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素(DEAE-52)，或二乙胺基乙基萄聚糖凝胶(DEAE Sephadex A-25或DEAE Sephadex A-50)，或二乙胺基乙基琼脂糖凝胶(DEAESepharose)。

所述方法中，凝胶过滤层析所用填料为Sephcryl S-200。

本发明目的之二是提供一种结构明确、质量可控的厚朴多糖在制备降脂、降糖、抗炎和免疫调节药物中的应用。

所述的本发明的多糖在制备降脂、降糖、抗炎和免疫调节药物中的应用，将上述方法制备得到的厚朴多糖精品(MOP-1)应用于小鼠脂肪耐量实验、小鼠葡萄糖耐量实验、二甲苯致耳肿胀实验，均具有一定的治疗作用，因此可应用于制备降脂、降糖、抗炎和免疫调节药物。

所述方法中，制得的厚朴多糖粗品(MOP)多糖含量在60％以上。

所述方法中，制得的厚朴多糖精品(MOP-1)多糖含量在95％以上，分子量为20000Da左右。

本发明将所述制备得到的厚朴多糖可以用作制备与高血糖、高血脂、炎症相关的疾病或作为免疫调节剂。

附图说明

图1为厚朴多糖精品(MOP-1)紫外-可见光扫描光谱。

图2为厚朴多糖精品(MOP-1)红外光谱。

图3为厚朴多糖精品(MOP-1)降低小鼠血脂的作用。

图4为厚朴多糖精品(MOP-1)急性降小鼠血糖的作用。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的化学试剂、层析柱等，如无特殊说明均按常规实验条件下进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

实施例1：

厚朴多糖粗品的制备方法

取厚朴皮干粉100g，按液固比15：1(mL/g)加入90℃热水，90℃浸提3h，冷却至室温后3 500rpm离心15min，取上清液，残渣重复提取一次。合并两次的浸提液，浓缩至总体积的1/10，向浓缩液中缓缓加入无水乙醇，至乙醇终浓度为80％，4℃冰箱静置过夜，3500rpm离心15min，弃上清得到厚朴水提物。将水提物溶解于去离子水中，加入大孔树脂去色素和蛋白质，将脱色液过滤，加入乙醇沉淀，将沉淀真空干燥后得到本发明的厚朴多糖粗品(代号：MOP)。

实施例2：

均一厚朴多糖的制备

取厚朴多糖粗品(MOP)500mg，去离子水充分溶解，上样至已平衡好的DEAESephadex A-25离子交换层析柱中，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，用去离子水以1.5mL/min的流速洗脱，3min/管分部收集，采用硫酸-蒽酮法检测各管洗脱液中多糖含量，以收集管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线合并相同组分。离子交换柱分离所得厚朴多糖水洗组分上Sephacryl S-200分子筛层析，去离子水洗脱。柱规格为(1.0×100cm)，分部收集，硫酸-蒽酮法跟踪检测，合并相同组分。冷冻干燥，得到厚朴多糖精品(代号：MOP-1)。

在图1中，通过对(MOP-1)进行紫外－可见光(200-700nm)全波长扫描，证明厚朴多糖精品纯度较高，基本无蛋白质、核酸和其它杂质。

在图2中：MOP-1在3600～3200cm^-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动。在3000～2800cm^-1的一组峰是糖类C-H伸缩振动，1400～1200cm^-1的一些峰是C-H的变角振动，这两组峰是糖类化合物的特征吸收。1665～1635cm^-1间的吸收是糖水化物的吸收峰，1250～950cm^-1的一组峰是吡喃环的醚键(C-O-C)和羟基的吸收峰，在848cm^-1的吸收是由α-端基碳差向异构体的C-H变振动引起的，表明MOP-1的端基碳为α-构型，MOP-1在760cm^-1处的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起。

实施例3：

理化性质测定

1.多糖含量测定

采用硫酸-蒽酮法，在620nm处，分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计厚朴多糖粗品(MOP)多糖含量为60％，厚朴多糖精品(MOP-1)多糖含量为95％。

2.紫外光谱分析

样品以蒸馏水溶解，置于200～400nm紫外全波长扫描。如图1所示，MOP-1在260、280nm处无吸收，说明其不含蛋白质和核酸。

3.红外光谱分析

样品2mg加入适量的溴化钾，研磨、压片，制作溴化钾片。400-4000^-1区间扫描。如图2所示，MOP-1在848cm^-1的吸收是由α-端基碳差向异构体的C-H变振动引起的，表明MOP-1的端锘碳为α-构型，MOP-1在760cm^-1处的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起。4.单糖组成分析

称取MOP-1干粉2mg，加入1mL 2mol/L三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干，再加入2mL甲醇，蒸干，按此方法反复处理2次。用2mL双蒸水将已水解的残基溶解，向其中加入60mg硼氢化钠还原8h，然后加入冰乙酸中和过量的硼氢化钠，浓缩，加入甲醇3mL以除去水分和反应副产物硼酸，反复处理3次，浓缩，110℃烘干以充分除去水分。向以上干燥样品中加入1mL乙酸酐乙酰化，100℃反应1h后冷却，向其中加入3mL甲苯，旋转蒸发仪蒸干，反复操作4～5次，以除去多余的乙酸酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解，加入少量蒸馏水充分振荡，除去水相，重复操作4次后用无水硫酸钠干燥氯仿层，完全除去残留水相，最后定容至10mL用于GC-MS分析。结果见表1：厚朴多糖精品(MOP-1)由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五种单糖组成。摩尔比为0.003:0.002:0.019:0.967:0.008。

表1厚朴多糖MOP-1单糖组成气相色谱分析

5.分子量测定

以Shodex SUGAR KS-805(8.0mm×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器。色谱条件为：流动相为蒸馏水，流速为1.0mL/min；样品浓度为1.5mg/mL，进样量20μL。依次以相对分子质量为2 700、5 250、9 750、13 050、36 800Da的五种右旋糖酐标准品绘制保留时间与各分子量参数关系标准曲线，再测样品的保留时间，根据标准曲线求得样品的分子量。结果表明：MOP-1的分子量为20 802Da。

实施例4：

1.口服厚朴多糖精品(MOP-1)降低小鼠血脂的作用

取正常昆明小鼠50只，随机分为空白组、模型组、阳性对照辛伐他汀组、厚朴多糖精品低、高剂量组。空白组和模型组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃辛伐他汀3mg/kg，低、高剂量组分别灌胃MOP-1 50mg/kg、100mg/kg。每天按时等体积灌胃给药，连续用药7d。末次给药后除空白组外其余4组小鼠均按10mL/kg灌胃橄榄油。分别在0h到4h每间隔1h眼静脉取血，测定血清三酰甘油(Triglycerides，TG)浓度，绘出血脂变化曲线，计算AUC。如图4所示，MOP-1能降低小鼠的血脂。在图3中：厚朴多糖精品(MOP-1)在50mg/kg、100mg/kg剂量下均能降低健康小鼠口服脂肪耐量试验(Oral Fat Tolerance Test，OFTT)中的三酰甘油浓度，说明厚朴多糖具有降血脂作用。

2.口服厚朴多糖精品(MOP-1)急性降小鼠血糖作用

将昆明小鼠50只，随机分为空白组、模型组、阳性对照盐酸二甲双胍组、厚朴多糖精品(MOP-1)低、高剂量组，每组10只。空白组和模型组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍200mg/kg，低、高剂量组分别灌胃MOP-1 50mg/kg、100mg/kg。连续灌胃7d，末次给药后，动物禁食12h，不禁水，除空白组外按2g/kg腹腔注射葡萄糖生理盐水溶液，空白组注射等体积的生理盐水。分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0h眼静脉取血，葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定血清中葡萄糖浓度。以取血时间为横坐标，血糖浓度为纵坐标绘制血糖变化曲线，积分得到血糖曲线下面积(Area under the curve，AUC)。如图4所示，MOP-1能显著降低腹腔注射葡萄糖耐量试验中小鼠的血糖曲线下面积，说明MOP-1能加速小鼠体内的葡萄糖代谢，具有降血糖作用。

3.口服厚朴多糖精品(MOP-1)对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

取正常昆明小鼠50只，随机分为空白组、模型组、阳性对照吲哚美辛组、厚朴多糖精品低、高剂量组。空白组和模型组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃吲哚美辛2mg/kg，低、高剂量组分别灌胃MOP-1 50mg/kg、100mg/kg。每天按时等体积灌胃给药，连续用药7d。末次给药后30min给小鼠右耳廓均匀凃20μL二甲苯致炎，1h后断颈处死，剪下双耳，用直径为6mm的不锈钢冲子在耳朵相同部位冲下大小一致的耳片，称重，以左右耳之差表示耳肿胀程度，计算各组小鼠的耳肿胀率。

解剖小鼠并剥离脾脏，滤纸片吸去残留血液，称重，计算脾脏的脏器指数。

结果见表2：厚朴多糖精品(MOP-1)能显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀的肿胀率和增加脾脏指数，说明MOP-1有抗炎和增强免疫作用。

表2对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(n＝10,x±SD)

Claims (9)

1.厚朴多糖为含D-葡萄吡喃环的多糖，具体由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖以摩尔比0.003：0.002：0.019：0.967：0.008组成，所述的厚朴多糖的分子量大约20 000 Da。

2.权利要求1所述的厚朴多糖为厚朴水提醇沉物。

3.权利要求1或2所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取厚朴皮干燥品粉碎后，按液固比质量比15-30：1加入70-90℃热水，水浴浸提3 h，冷却至室温离心，取上清液，浓缩后加入无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清得到厚朴水提物沉淀，干燥得厚朴水提取；

步骤二：取干燥后的厚朴水提物溶于水中，加入D301G大孔树脂，室温下振荡、离心，取上清液浓缩，加无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清，沉淀烘干，得厚朴多糖粗品；

步骤三：将厚朴多糖粗品溶解于水，上阴离子交换柱，去离子水洗脱，分部收集，采用硫酸-蒽酮法检测各管洗脱液中多糖含量，收集主峰，浓缩后乙醇沉淀，2-8℃放置，离心去上清，真空干燥；

步骤四：将干燥后的样品溶于去离子水，上Sephacryl S-200凝胶过滤层析柱，去离子水洗脱，分部收集，硫酸-蒽酮法检测，收集主峰，浓缩后冷冻干燥制得厚朴多糖精品。

4.权利要求3所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中无水乙醇的体积为步骤（1）所述的固液体积的1-6倍。

5.权利要求3所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中无水乙醇的体积为步骤（2）的浓缩液体积的1-6倍。

6.权利要求3所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，步骤（3）中无水乙醇的体积为步骤（3）的浓缩液提交的3-5倍。

7.权利要求3所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）中所述的离心转速为3000-4000rpm。

8.权利要求3所述的厚朴多糖的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的阴离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素DEAE-52，或二乙胺基乙基萄聚糖凝胶，具体为DEAE SephadexA-25或DEAE Sephadex A-50，或二乙胺基乙基琼脂糖凝胶DEAE Sepharose。

9.权利要求3-8任一项所述制备得到的厚朴多糖可以用于制备降血脂、降血糖、抗炎药物的免疫调节剂的原料药。