CN106478830A - 一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法及应用，可有效解决厚朴花低聚糖及多糖的制备及厚朴花低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用问题，制备的厚朴花多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用问题。

Description

一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法及应用。
背景技术
厚朴花为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥花蕾。具有芳香化湿，理气宽中的功效，临床用于脾胃湿阻气滞，胸脘痞闷胀满，纳谷不香。现对其有效成分的研究主要集中在厚朴酚、和厚朴酚、挥发油等成分，对其中低聚糖及多糖的研究尚未见报道，尤其是如何解决一体化制备厚朴花低聚糖及多糖也没有见公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，可有效解决厚朴花低聚糖及多糖的制备及厚朴花多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和厚朴花低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂或化妆品中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量8～21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35～90min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚朴花药材重量8～20倍量的80％乙醇(v/v)，超声提取2次，每次30～60min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.08～1.16得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1～5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.4％～1.1％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入15～27倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5～5.7，45～58℃搅拌酶解6～9h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.3～1.9倍，5000r/m离心15min,取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％～80％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22～50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10～1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.10～1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4～1/3，混匀，加氢氧化钠调节pH至7.5～9.1，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5～10min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.10～1.15的浸膏，过SephadexG-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
实现以厚朴花为原料制备厚朴花低聚糖及多糖并有效用于制备增强免疫力和抗氧化的药物和保健品，实现厚朴花糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用，厚朴花低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂或化妆品中的应用。
本发明制备方法简单，易操作，原料丰富，产品应用面广，以厚朴花为原料同时制备厚朴花低聚糖及多糖，开发了厚朴花药材的应用范围，厚朴花多糖可用于制备增强免疫力的药物和保健品，厚朴花低聚糖可用于制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂或化妆品，具有很好的经济效益和社会效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：
实施例1
本发明制备的厚朴花低聚糖及多糖，在具体实施中，可经以下步骤制成：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量8倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的8倍量，每次提取时间30min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.08得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.4％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入15倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5，45℃搅拌酶解6h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.3倍，5000r/m离心15min，取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.10)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花低聚糖中糖含量为83.1％；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4，混匀，加氢氧化钠调节pH至7.5，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.10的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花多糖中糖含量为87.6％。
实施例2
本发明制备的厚朴花低聚糖及多糖，在具体实施中，还可经以下步骤制成：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取90min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚朴花药材重量20倍量的80％乙醇(v/v)，超声提取2次，每次60min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.16得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为1.1％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入27倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至5.7，58℃搅拌酶解9h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.9倍，5000r/m离心15min，取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为80％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花低聚糖中糖含量为82.2％；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/3，混匀，加氢氧化钠调节pH至9.1，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热10min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.15的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花多糖中糖含量为89.8％。
实施例3
本发明制备的厚朴花低聚糖及多糖，在具体实施中，亦可经以下步骤制成：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量14倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取68min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚朴花药材重量14倍量的80％乙醇(v/v)，超声提取2次，每次45min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.12得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照4.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.8％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至5.1，52℃搅拌酶解7.5h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.6倍，5000r/m离心15min，取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为77％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，41℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.15的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.15)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花低聚糖中糖含量为84.7％；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的7/24，混匀，加氢氧化钠调节pH至8.3，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热7.5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.12的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花多糖中糖含量为88.3％。
实施例4
本发明制备的厚朴花低聚糖及多糖，在具体实施中，又可经以下步骤制成：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材5kg，加入石油醚(60～90℃)40kg，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加80％乙醇(v/v)的量为70kg，每次超声30min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.12得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.8％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5，58℃搅拌酶解7.5h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂8kg，5000r/m离心15min，取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花低聚糖中糖含量为86.4％；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4，混匀，加氢氧化钠调节pH至8.3，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.15的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末，蒽酮-硫酸法测定厚朴花多糖中糖含量为90.1％。
上述制备的2种活性成分经蒽酮-硫酸法(常规测定方法，是公知技术)测定，其糖含量均不低于80％。经HPGPC法(公知技术)测定，厚朴花低聚糖的分子量均在350～2000之间，厚朴花多糖的分子量均大于3000。
上述仅是给出几个实例，在研制中，发明人经反复多次实验，均取得了相同或相似的结果，方法科学有效，具有较高实际应用价值，并对厚朴花低聚糖及多糖进行反复的试验均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
厚朴花多糖的免疫活性实验
一.试验材料
1.试验动物：18.5～23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供。
2.实验试药：本发明方法制备的厚朴花多糖(蒽酮-硫酸法测定厚朴花多糖中糖含量为90.1％)，香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)，瑞士染液，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，氯化钠，氯化钙，酒石酸钾钠，氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红，葡萄糖。
二.试验方法
1.厚朴花多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的厚朴花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(10mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于第7天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药后2h，注射5％鸡红细胞4h后，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部；然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，瑞氏染液染色，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表1腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表1可以看出，与空白对照组比，中剂量组、大剂量组及香菇多糖组均能极显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P＜0.01)，其中尤以大剂量厚朴花多糖组作用为最强；小剂量多糖组能显著提高吞噬百分率及吞噬指数(P＜0.05)。2.厚朴花多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的厚朴花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-TU1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
3.厚朴花多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的厚朴花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(10mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-TU1810型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表2溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与空白组比P＜0.01，**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表2可以看出，与空白对照组比，大、小剂量组溶血空斑均显著升高(P＜0.05)，中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均极显著提高(P＜0.01)。其中尤以中剂量厚朴花多糖组作用为最优。
4.厚朴花多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)，模型组建立完成后，分别灌服厚朴花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与模型组比P＜0.01
从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大、中、小剂量多糖组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)。
5.厚朴花多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服厚朴花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-TU1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表4。
6.厚朴花多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服厚朴花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-TU1810型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况，结果见表4。
表4溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与模型组比P＜0.01
从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P＜0.01)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，各个剂量厚朴花多糖组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg剂量厚朴花多糖组为最佳。
厚朴花低聚糖抗氧化活性实验
一、实验材料
(1)实验动物选用40只普通级昆明种小鼠，鼠龄2个月，体重(20±2)g，雌雄各半。由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证号：SCXK(豫)2005-0012)。
(2)实验试药丙二醛(MDA)测定试剂盒，生化试剂，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)测试盒，南京建成生物工程研究所；本发明制备的厚朴花低聚糖(蒽酮-硫酸法测定厚朴花低聚糖中糖含量为86.4％)。
二、实验方法
(1)动物的喂养与取样取体重(20±2)g的昆明种小鼠40只,适应性饲养1周后,随机分成4组,每组10只。分别为空白组、厚朴花低聚糖低剂量组(100mg/kg)、厚朴花低聚糖中剂量组(200mg/kg)、厚朴花低聚糖高剂量组(400mg/kg)，连续15天口服给药(空白对照组给等量纯净水)，每天小鼠给药体积为0.2mL/10g。末次给药后24h，处死动物，分别取小鼠血清及制备10％肝组织匀浆，待测。
制备10％小鼠肝组织匀浆：取肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，称0.5g，放入5mL～10mL的小烧杯内，取总量(总量为4.5mL)2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入匀浆管中，用剩余1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中，进行匀浆，使组织匀浆化,将匀浆液离心(3000r/min，10min)，取适量上清液进行以下测定。
血清制备：摘眼球取出血样，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹签沿试管四周轻轻剥离血块使血清尽快自行析出，然后2500r/min离心10min，用吸管吸出上层血清备用。
(2)检测方法
蛋白质含量测定：采用考马斯亮兰法。蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+基团结合，致使溶液变蓝，通过测定吸收度可计算出样品中蛋白质的含量。具体操作详见试剂盒说明书。SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)，即U/mL；组织中SOD活力以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐，即U/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
GSH-Px测定：采用二硫对硝基苯甲酸法测定，具体操作详见试剂和说明书，血清单位为U/mL，组织单位为U/mgprot。
MDA测定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，过氧化脂质降解产物中MDA可与TBA缩合，形成的红色产物在523nm处有最大吸收峰，因底物为TBA，所以此法称TBA法。血清单位为nmol/mL，组织单位为nmol/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
表5厚朴花低聚糖对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响
*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组比P＜0.01
从表5可以看出，与空白组比较，大剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性提高极显著(P＜0.01)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)；中剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性显著增高(P＜0.05)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)；小剂量组肝组织中SOD活性显著提高(P＜0.05)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)，但GSH-Px活性与空白组差异不显著(P＞0.05)。
表6厚朴花低聚糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
**表示与空白组比P＜0.01
从表6可见，与空白组相比，大、中剂量组的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性极显著提高(P＜0.01)，小剂量组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差异无显著性(P＞0.05)。
由上述资料可以看出，本发明提取的厚朴花多糖具有很好的增强机体免疫力的作用，完全具备开发为免疫增强药物、保健品和保健类食品的潜力及实际推广价值；厚朴花低聚具有较好的抗氧化作用，可作为抗氧化的药物、保健品、食品添加剂开发，由于其抗氧化活性，也可加入美白化妆品中应用。开发研究厚朴花低聚糖及多糖不仅拓宽中药厚朴花应用的新前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，具有实际的应用价值和巨大经济及社会效益，是中药上创新。

Claims (7)

1.一种厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量8～21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35～90min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的8～20倍量，每次提取时间30～60min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.08～1.16得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1～5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.4％～1.1％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入15～27倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5～5.7，45～58℃搅拌酶解6～9h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.3～1.9倍，5000r/m离心15min,取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％～80％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22～50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10～1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.10～1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4～1/3，混匀，加氢氧化钠调节pH至7.5～9.1，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5～10min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.10～1.15的浸膏，过SephadexG-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
2.根据权利要求1所述的厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量8倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的8倍量，每次提取时间30min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.08得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.4％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入15倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5，45℃搅拌酶解6h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.3倍，5000r/m离心15min，取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.10)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4，混匀，加氢氧化钠调节pH至7.5，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.10的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
3.根据权利要求1所述的厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取90min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的20倍量，每次提取时间60min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.16得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为1.1％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入27倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至5.7，58℃搅拌酶解9h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.9倍，5000r/m离心15min,取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为80％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/3，混匀，加氢氧化钠调节pH至9.1，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热10min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.15的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
4.根据权利要求1所述的厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量14倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取68min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的14倍量，每次提取时间45min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.12得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照4.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.8％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至5.1，52℃搅拌酶解7.5h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.6倍，5000r/m离心15min,取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为77％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，41℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.15的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.15)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的7/24，混匀，加氢氧化钠调节pH至8.3，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热7.5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.12的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
5.根据权利要求1所述的厚朴花低聚糖及多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)厚朴花粗低聚糖提取液的制备
称取厚朴花药材，加入药材重量8倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，过滤，药渣挥尽石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超声提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量为厚朴花药材重量的14倍量，每次提取时间30min，过滤，药渣备用，合并滤液，45℃减压浓缩至比重为1.12得厚朴花粗低聚糖提取液，备用；
(2)厚朴花粗多糖的制备
取纤维素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸馏水溶解制成质量浓度为0.8％的混合酶溶液；取步骤(1)中提取厚朴花低聚糖后的厚朴花药渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用盐酸调pH至4.5，58℃搅拌酶解7.5h，99℃加热15min灭酶，酶解液放至室温，得厚朴花粗多糖溶液；厚朴花粗多糖溶液减压回收溶剂至厚朴花药材重量的1.6倍，5000r/m离心15min,取上清液即得厚朴花粗多糖浓缩液，浓缩液在搅拌下加入95％的乙醇(v/v)，使浓缩液中含醇量为75％(v/v)，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得厚朴花粗多糖；
(3)厚朴花低聚糖及多糖的纯化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂溶液的配制A组分溶液：称取A组分1份，加入A组分99倍重量的蒸馏水，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液；B组分溶液：称取B组分1份，加入B组分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成质量浓度为1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液；取步骤(1)所制备的厚朴花粗低聚糖提取液，加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂B组分溶液，混匀，80℃水浴加热40min，每间隔5min搅拌1次，每次搅拌时间为3min，40min后加入厚朴花低聚糖提取液质量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂A组分溶液，边加边搅拌，1h后搅拌1次，搅拌时间10min，继续80℃水浴加热1.5h，6000r/min离心10min，倾出上清液，减压浓缩成比重为1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量达75％(v/v)，静置8h，6000r/min离心15min，倾出上清液，弃去沉淀，上清液减压浓缩成浸膏(比重1.20)，冷冻干燥即得厚朴花低聚糖粉末；
取步骤(1)所制备的厚朴花粗多糖，加厚朴花粗多糖10倍重量的蒸馏水80℃水浴加热使溶解，冷却至室温，加入30％过氧化氢(v/v)，加入30％过氧化氢(v/v)的体积为厚朴花粗多糖溶液体积的1/4，混匀，加氢氧化钠调节pH至8.3，70℃水浴下不断搅拌30min，100℃加热5min，抽滤，滤液减压浓缩至比重为1.15的浸膏，过Sephadex G-200凝胶树脂柱，收集多糖部分洗脱液，冷冻干燥即得厚朴花多糖粉末。
6.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的厚朴花多糖在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用。
7.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的厚朴花低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂或化妆品中的应用。
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