CN104031169A - 一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，可有效解决苦杏仁多糖及低聚糖的制备及杏仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和苦杏仁低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用的问题，制备的苦杏仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用，制备的苦杏仁低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用，本发明制备方法简单，易操作，方法简单，原料丰富，产品应用面广，以苦杏仁为原料同时制备苦杏仁多糖及低聚糖，开发了苦杏仁药材的应用范围，开拓了苦杏仁多糖及低聚糖的应用价值，具有很好的社会效益和经济效益，是中药上的巨大创新。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法及应用。
背景技术
苦杏仁，别名：杏仁，为蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.、东北杏Prunus mandshurica(Maxim.)Koehne或杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子。具有降气止咳平喘、润肠通便、抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用。临床主要用于咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘。现在对其有效成分的研究主要涉及苦杏仁苷、蛋白、酶、黄酮、脂肪油等成分，对其中多糖的研究较少，对苦杏仁低聚糖的研究尚未见报道，并且如何解决一体化制备苦杏仁多糖及低聚糖也未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，可有效解决苦杏仁多糖及低聚糖的制备及杏仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和苦杏仁低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用的问题。
本发明解决的技术方案是，一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量5-10倍的石油醚，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量6-15倍的体积浓度为78％-82％的乙醇，浸泡30min，50℃-65℃回流提取0.5h-3h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃-50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量6-10倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量6-10倍的水浸泡5-10min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的5-8倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1-4:1的重量比混合，用pH5.0-7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.5％-1.2％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.5-0.8混合，35℃-60℃水浴5-10h，得酶解液，将酶解液灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.2-2.0倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为75％-80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖；实现以苦杏仁为原料制备苦杏仁多糖及低聚糖，并有效用于制备增强免疫力的药物和保健品，实现苦杏仁多糖及低聚糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用，苦杏仁低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用。
所述的大孔吸附树脂为D-101型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂，阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
本发明制备方法简单，易操作，方法简单，原料丰富，产品应用面广，以苦杏仁为原料同时制备苦杏仁多糖及低聚糖，开发了苦杏仁药材的应用范围，苦杏仁多糖可用于制备增强免疫力的药物和保健品，苦杏仁低聚糖可用于制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品，开拓了苦杏仁多糖及低聚糖的应用价值，具有很好的社会效益和经济效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：
实施例1
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量5倍的石油醚，置于闪式提取器中提取1min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量6倍的体积浓度为78％的乙醇，浸泡30min，50℃回流提取0.5h，过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量6倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量6倍的水浸泡5min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的5倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1的重量比混合，用pH5.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.5％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.5混合，35℃水浴5h，得酶解液，将酶解液90℃℃下灭酶10min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，将苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.2倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为75％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
实施例2
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量7倍的石油醚，置于闪式提取器中提取2.7min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量8.5倍的体积浓度为79％的乙醇，浸泡30min，55℃回流提取2h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液45℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过D-101型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量8倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量8倍的水浸泡7.5min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的6.5倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照3.5:1的重量比混合，用pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.7％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.6混合，50℃水浴8h，得酶解液，将酶解液95℃下灭酶20min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.5倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为77％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，35℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
实施例3
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量10倍的石油醚，置于闪式提取器中提取3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量15倍的体积浓度为82％的乙醇，浸泡30min，65℃回流提取3h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量10倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取3min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量10倍的水浸泡10min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的8倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照4:1的重量比混合，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为1.2％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.8混合，60℃水浴10h，得酶解液，将酶解液100℃下灭酶30min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的2.0倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
实施例4
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁10kg，加石油醚80kg，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加100kg的体积浓度为81％的乙醇，浸泡30min，56℃回流提取1.3h，过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加水80kg，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2.8min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加水60kg浸泡8min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至58kg，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1的重量比混合，用pH5.0-7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为1％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.8混合，60℃水浴10h，得酶解液，将酶解液100℃下灭酶20min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至20kg，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
上述制备的2种活性成分经苯酚-硫酸法(常规测定方法，是公知技术)测定，其糖含量均不低于80％。经HPGPC法(公知技术)测定，苦杏仁低聚糖的分子量均在300-2000之间。
上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次实验，均取得了相同或相近似的结果，方法科学有效，原料丰富，产品应用面广，具有实际的应用价值，并对苦杏仁多糖及低聚糖进行反复的试验均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
苦杏仁多糖的免疫活性实验
一.试验材料
1.试验动物：18.5～23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供。
2.实验试药：本发明方法制备的苦杏仁多糖(含量为84.33％)，瑞士染液，香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，氯化钙，氯化钠，酒石酸钾钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红。
二.试验方法
1.苦杏仁多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的苦杏仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于7天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药后2h，注射5％鸡红细胞4h后，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部；然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干；显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表1腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表1可以看出，与空白对照组比，大剂量组可提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，可提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P＜0.05)；小、中剂量组及香菇多糖组均能显著提高吞噬百分率及吞噬指数(P＜0.01)，其中尤以中剂量苦杏仁多糖组作用为最强。
2.苦杏仁多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的苦杏仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
3.苦杏仁多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的苦杏仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组两个小鼠脾脏为一例；匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表2溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表2可以看出，与空白对照组比，大、小剂量组溶血空斑均升高(P＜0.05)，中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均显著提高(P＜0.01)。其中尤以中剂量苦杏仁多糖组作用为最优。
4.苦杏仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)，模型组建立完成后，分别灌服苦杏仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与模型组比P＜0.01
从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大、中、小剂量多糖组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)。
5.苦杏仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服苦杏仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表4。
6.苦杏仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服苦杏仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组中两个小鼠脾脏为一例，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况，结果见表4。
表4溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与模型组比P＜0.01
从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P＜0.01)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，各个剂量苦杏仁多糖组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg剂量苦杏仁多糖组为最佳。
苦杏仁低聚糖抗氧化活性实验
一、实验材料
(1)实验动物
选用40只普通级昆明种小鼠，鼠龄2个月，体重(20±2)g，雌雄各半。由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证号：SCXK(豫)2005-0012)。
(2)实验试药
丙二醛(MDA)测定试剂盒，生化试剂，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)测试盒，南京建成生物工程研究所；本发明制备的苦杏仁低聚糖含量为87.96％。
二、实验方法
(1)动物的喂养与取样
取体重(20±2)g的昆明种小鼠40只,适应性饲养1周后,随机分成4组,每组10只。分别为空白组、苦杏仁低聚糖低剂量组(100mg/kg)、苦杏仁低聚糖中剂量组(200mg/kg)、苦杏仁低聚糖高剂量组(400mg/kg)，连续15天口服给药(空白对照组给等量纯净水)，每天小鼠给药体积为0.2mL/10g。末次给药后24h，处死动物，分别取小鼠血清及制备10％肝组织匀浆，待测。
制备10％小鼠肝组织匀浆：取肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，称0.5g，放入5mL-10mL的小烧杯内，取总量(总量为4.5mL)2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入匀浆管中，用剩余1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中，进行匀浆，使组织匀浆化,将匀浆液离心(3000r/min，10min)，取适量上清液进行以下测定。
血清制备：摘眼球取出血样，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹签沿试管四周轻轻剥离血块使血清尽快自行析出，然后2500r/min离心10min，用吸管吸出上层血清备用。
(2)检测方法
蛋白质含量测定：采用考马斯亮兰法。蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+基团结合，致使溶液变蓝，通过测定吸收度可计算出样品中蛋白质的含量。具体操作详见试剂盒说明书。
SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)，即U/mL；组织中SOD活力以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐，即U/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
GSH-Px测定：采用二硫对硝基苯甲酸法测定，具体操作详见试剂和说明书，血清单位为U/mL，组织单位为U/mgprot。
MDA测定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，过氧化脂质降解产物中MDA可与TBA缩合，形成的红色产物在523nm处有最大吸收峰，因底物为TBA，所以此法称TBA法。血清单位为nmol/mL，组织单位为nmol/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
表5苦杏仁低聚糖对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响
*表示与空白组相比P<0.05**表示与空白组比P<0.01
从表5可以看出，与空白组比较，大剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性提高极显著(P<0.01)，MDA水平降低极显著(P<0.01)；中剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性显著增高(P<0.05)，MDA水平降低极显著(P<0.01)；小剂量组肝组织中SOD活性显著提高(P<0.05)，MDA水平降低极显著(P<0.01)，但GSH-Px活性与空白组差异不显著(P>0.05)。
表6苦杏仁低聚糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
**表示与空白组比P<0.01
从表6可见，与空白组相比，大、中剂量组的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性极显著提高(P<0.01)，小剂量组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差异无显著性(P>0.05)。
从上述资料可以看出，本发明提取的苦杏仁多糖具有很好的增强机体免疫力的作用，完全具备开发为保健类食品和免疫增强药的潜力及实际推广价值；苦杏仁低聚具有较好的抗氧化作用，可作为保健类食品和抗氧化药品开发，由于其抗氧化活性，也可加入美白化妆品中应用。开发研究苦杏仁多糖及低聚糖不仅拓宽中药苦杏仁应用的新前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，具有实际的应用价值和巨大经济及社会效益，是中药上创新。
Claims (7)
1.一种苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量5-10倍的石油醚，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量6-15倍的体积浓度为78％-82％的乙醇，浸泡30min，50℃-65℃回流提取0.5h-3h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃-50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量6-10倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量6-10倍的水浸泡5-10min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的5-8倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1-4:1的重量比混合，用pH5.0-7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.5％-1.2％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.5-0.8混合，35℃-60℃水浴5-10h，得酶解液，将酶解液灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.2-2.0倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为75％-80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖；所述的大孔吸附树脂为D-101型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂，阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
2.根据权利要求1所述的苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量5倍的石油醚，置于闪式提取器中提取1min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量6倍的体积浓度为78％的乙醇，浸泡30min，50℃回流提取0.5h，过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量6倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量6倍的水浸泡5min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的5倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1的重量比混合，用pH5.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.5％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.5混合，35℃水浴5h，得酶解液，将酶解液90℃℃下灭酶10min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，将苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.2倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为75％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
3.根据权利要求1所述的苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量7倍的石油醚，置于闪式提取器中提取2.7min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量8.5倍的体积浓度为79％的乙醇，浸泡30min，55℃回流提取2h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液45℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过D-101型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量8倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量8倍的水浸泡7.5min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的6.5倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照3.5:1的重量比混合，用pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为0.7％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.6混合，50℃水浴8h，得酶解液，将酶解液95℃下灭酶20min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的1.5倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为77％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，35℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
4.根据权利要求1所述的苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁，加苦杏仁重量10倍的石油醚，置于闪式提取器中提取3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加苦杏仁重量15倍的体积浓度为82％的乙醇，浸泡30min，65℃回流提取3h,过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱、强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加苦杏仁药渣B重量10倍的水，浸泡30min，置于闪式提取器中提取3min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加入苦杏仁药渣C重量10倍的水浸泡10min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至苦杏仁重量的8倍，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照4:1的重量比混合，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为1.2％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.8混合，60℃水浴10h，得酶解液，将酶解液100℃下灭酶30min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至苦杏仁重量的2.0倍，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
5.根据权利要求1所述的苦杏仁多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的苦杏仁10kg，加石油醚80kg，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，得苦杏仁药渣A，将苦杏仁药渣A挥发去石油醚，晾干，加100kg的体积浓度为81％的乙醇，浸泡30min，56℃回流提取1.3h，过滤，得提取液和苦杏仁药渣B，苦杏仁药渣B备用，提取液40℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为苦杏仁低聚糖部位浸膏，将苦杏仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得苦杏仁低聚糖；
(2)在步骤(1)中的苦杏仁药渣B中加水80kg，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2.8min，过滤，得第一次滤液和苦杏仁药渣C；在苦杏仁药渣C中加水60kg浸泡8min，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，真空浓缩至58kg，离心，得上清液，即为苦杏仁粗多糖液；取木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，按照2:1的重量比混合，用pH5.0-7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液溶解，制成浓度为1％的混合蛋白酶溶液；将苦杏仁粗多糖液和混合蛋白酶溶液按体积比1：0.8混合，60℃水浴10h，得酶解液，将酶解液100℃下灭酶20min后放至室温，sevage法脱蛋白，得苦杏仁多糖溶液，苦杏仁多糖溶液减压回收溶剂至20kg，4000r/m离心15min,取上清液即得苦杏仁多糖浓缩液，将苦杏仁多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为80％，静置12h，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，即得苦杏仁多糖。
6.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的苦杏仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用。
7.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的苦杏仁低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用。
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