CN102626418B

CN102626418B - 一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用

Info

Publication number: CN102626418B
Application number: CN 201210079821
Authority: CN
Inventors: 杨云; 李晓坤; 雷雪; 于雷; 卫冰; 张华锋; 郝鹏飞
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102626418A

Abstract

本发明涉及一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，可有效解决制备增强人体免疫功能的药物及保健品的问题，其解决的技术方案是，鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，该鹿衔草多糖是取鹿衔草药材粉末，加水，搅拌均匀，水浴提取，过滤，合并滤液，浓缩得多糖浓缩液，多糖浓缩液搅拌下加入乙醇至含醇为80%～90%，密封，静置过夜，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥，得鹿衔草多糖，本发明提取工艺简单、方便，提取的鹿衔草多糖可用于增强机体免疫功能的药物及保健食品的开发，开辟了鹿衔草药材的新的应用前景，具有巨大的经济及社会效益。

Description

一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用。

背景技术

近年来，随着天然药物化学、药理学的飞速发展，已有大量实验证明，从天然产物中分离出来的多糖对抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、愈溃疡、提高人体免疫力等方面都有非常显著的效果。并且，许多天然产物中的多糖具有较强的生物活性，为其有效成分。

鹿衔草始载于《滇南本草》，具有祛风湿，强筋骨，止血等功效，临床用于治疗风湿痹痛，腰膝无力，月经过多，久咳劳嗽等症。现代研究表明，鹿衔草中含有黄酮、鞣质、多酚类等化学成分，并对其药理作用有了较深入的研究，但对其多糖类成分的提取分离及其药理活性的研究却未见报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，可有效解决制备增强人体免疫功能的药物及保健品的问题。

本发明解决的技术方案是，鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，该鹿衔草多糖是取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1:5—30加水，搅拌均匀，60～100℃水浴提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2～4倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%～90%，密封，4℃静置过夜8-12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥，得鹿衔草多糖；所述的鹿衔草药材粉末是鹿衔草经粉碎过24目筛的粉末；所述的与鹿衔草药材粉末混合的水为自来水、或纯净水、或蒸馏水、或去离子水。

本发明提取工艺简单、方便，提取的鹿衔草多糖可用于增强机体免疫功能的药物及保健食品的开发，开辟了鹿衔草药材的新的应用前景，具有巨大的经济及社会效益。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，该鹿衔草多糖是由以下实施例和技术资料给出：

实施例1

取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：10加水，搅拌均匀，90℃水浴提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%，密封，4℃冷藏静置过夜12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖。计算多糖获得率，经苯酚-硫酸法（常规测定方法，是公知技术）测定含糖含量，结果表明所提取的鹿衔草多糖得率为8.92%，含糖量为17.88%。

实施例2

取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：5加水，搅拌均匀，60℃水浴提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为90%，密封，4℃冷藏静置过夜8小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤2次，真空干燥，得鹿衔草多糖，多糖得率为4.02%，含糖量为16.91%。

实施例3

取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：30加水，搅拌均匀，100℃水浴提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的4倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%，密封，4℃冷藏静置过夜12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤2次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖，多糖得率为14.88%，含糖量为24.54%。

实施例4

取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：20加水，搅拌均匀，75℃水浴提取3次，每次2.5h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的3倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为85%，密封，4℃冷藏静置过夜10小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖，多糖得率为6.35%，含糖量为20.76%。

本发明所述从鹿衔草中提取鹿衔草多糖的方法经反复多次实验（12次），均取得了相同或者相近似的结果，表明该方法结论可靠，利于工业化生产，其所制备的鹿衔草多糖具有很好的增强人体免疫力的功能，并为动物试验充分证明，具体试验资料情况如下：

一.试验材料

1. 试验动物：18～22g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由河北省实验动物中心提供。

2. 实验试药：鹿衔草多糖制剂，瑞士染液，香菇多糖制剂（湖北广仁药业有限公司），环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），枸橼酸钠，氯化钙，氯化钠，酒石酸钾钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红。

二、试验方法

2.1 鹿衔草多糖制剂对正常小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响

取体重18～22 g小鼠50只，雌雄各半，随机均匀分为5组，每组10只。分别灌服小、中、大剂量的鹿衔草多糖制剂水溶液（10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g），阳性对照组灌服香菇多糖混悬液（5mg/ml；0.2ml/10g），空白对照组灌服等体积的生理盐水（0.2ml/10g）。每天给药1次，连续给药7 天，于第7天给药后2 h，各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5 mL，给鸡红细胞4 h后，脱颈椎处死小鼠。腹腔注射汉氏液2.5 mL，轻柔小鼠腹部，酒精消毒后在腹部上剪一小孔，用长颈吸管吸取腹腔液约2 mL置于试管中，混匀，然后吸取少许腹腔液于载玻片上，液滴大小约为1.5×2 cm²，将载玻片放在铺有湿纱布的搪瓷盘中，置于37 ℃培养箱中孵育30 min，后用生理盐水冲去附着的细胞，瑞士染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率(%)=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数）×100%

吞噬指数=巨噬细胞吞噬鸡红细胞的总数/巨噬细胞总数

表1 鹿衔草多糖制剂对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（x±s）

组别	动物数（只）	剂量（g/kg）	吞噬百分率（%）	吞噬指数
					空白对照组	10	-	44.9+6.1	0.55+0.06
香菇多糖组	10	0.1	76.7+3.9**	1.29+0.14**
					鹿衔草多糖小剂量组	10	0.1	71.0+4.9**	1.02+0.05**
鹿衔草多糖中剂量组	10	0.2	65.9+9.9**	0.86+0.12**
					鹿衔草多糖大剂量组	10	0.4	53.4+3.5*	0.71+0.07**

**表示与空白组比P<0.01, *表示与空白组比P<0.05

从上表可以看出，与空白对照组比，香菇多糖组与本发明鹿衔草多糖0.1 g/kg、0.2 g/kg剂量组均可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，具有极显著性意义（P<0.01）；鹿衔草多糖0.4 g/kg剂量组可明显提高正常小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，具有显著性意义（P<0.05）；香菇多糖组与鹿衔草多糖各剂量组均可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数，具有极显著性意义（P<0.01）。

2.2鹿衔草多糖制剂对正常小鼠血清中溶血素及溶血空斑形成的影响

小鼠规格、分组、给药剂量均同2.1，于给药第1天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2 mL/只，进行免疫。于第7天给药后2 h，小鼠眼眶取血，3500 rpm/min离心10 min，分离血清。用生理盐水1:100稀释，取1 mL稀释液与5%鸡红细胞混悬液0.5 mL、10%补体液0.5 mL，混匀；另设不加血清的空白管作对照。置37 ℃水浴中保温30 min，然后将试管移入冰水中终止反应。吸取各管上清液于紫外分光光度计540 nm处比色，测定溶血素形成细胞情况。

将眼眶取血后的小鼠，脱颈椎处死，解剖取出脾脏，将两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×10⁶个/mL。取脾细胞混悬液1.0mL与0.2%鸡红细胞混悬液0.5mL、1:10的豚鼠血清0.5mL混匀，另设不加脾细胞混悬液的空白管作对照，置37 ℃水浴中保温1h，离心，取上清液于紫外分光光度计413nm处比色，测定溶血空斑形成细胞情况，结果如下：

表2 鹿衔草多糖制剂对正常小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响（x±s）

组别	动物数（只）	剂量（g/kg）	溶血素形成（OD）	溶血空斑形成（OD）
					空白对照组	10	-	0.169+0.005	0.241+0.013
香菇多糖组	10	0.1	0.215+0.003**	0.266+0.013*
					鹿衔草多糖小剂量组	10	0.1	0.211+0.003**	0.271+0.020**
鹿衔草多糖中剂量组	10	0.2	0.212+0.005**	0.276+0.008**
					鹿衔草多糖大剂量组	10	0.4	0.168+0.006	0.261+0.023

**表示与空白组比P<0.01, *表示与空白组比P<0.05

从该表可看出，与空白对照组比，香菇多糖组、鹿衔草0.1 g/kg、0.2 g/kg剂量组均可显著促进正常小鼠溶血素和溶血空斑的形成，而鹿衔草多糖高剂量0.4 g/kg组对于小鼠溶血素及溶血空斑的形成与空白组差异无统计学意义，提示，鹿衔草多糖高剂量组对小鼠溶血素及溶血空斑的形成无明显作用。

2.3 鹿衔草多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

取体重18～22 g小鼠60只，雌雄各半，随机均匀分为6组：分别灌服鹿衔草小、中、高剂量组多糖水溶液（5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g），香菇多糖混悬液（5mg/ml，0.2ml/10g）及空白组灌服同体积的生理盐水（0.2ml/10g）。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫低下小鼠模型，每只小鼠均腹腔注射浓度为8 mg/mL的环磷酰胺溶液，连续3 d，7~10 d后小鼠免疫功能全部降低。于造模第1天，鹿衔草多糖高、中、低 3个剂量组分别灌服各自对应剂量的鹿衔草多糖溶液0.2mL/10g；香菇多糖组灌服0.1 g/kg香菇多糖混悬液0.2 mL/10g；模型组、空白对照组灌服等体积的生理盐水。于第7天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5 mL/只，于给鸡红细胞2h后给药，脱颈椎处死小鼠。按2.2项下方法区腹腔液、孵育、染色、镜检并计算吞噬百分率和吞噬指数，结果如下：

表3 鹿衔草多糖制剂对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（x±s）

组别	动物数（只）	剂量（g/kg）	吞噬百分率（%）	吞噬指数
					空白对照组	10	-	60.0+2.67**	0.65+0.03**
模型组	10	-	35.1+9.00	0.38+0.08
					香菇多糖片组	10	0.1	57.6+7.34**	0.95+0.08**
鹿衔草多糖小剂量组	10	0.1	58.8+4.10**	0.99+0.04**
					鹿衔草多糖中剂量组	10	0.2	44.6+10.29**	0.73+0.10**
鹿衔草多糖大剂量组	10	0.4	38.2+5.41	0.54+0.23**

**表示与模型组比P<0.01, *表示与模型组比P<0.05

从表中3可以看出，与空白对照组比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率与吞噬指数显著降低（P<0.01），提示，免疫抑制模型造模成功。与模型组比，鹿衔草多糖0.1 g/kg、0.2 g/kg剂量组、香菇多糖组均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，具有极显著性意义（P<0.01），而鹿衔草多糖高剂量组0.4g/kg组对小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率与模型组无明显差异，但吞噬指数有显著差异（P<0.05）。

2.4 鹿衔草多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响

小鼠规格、分组、给药剂量均同2.3，于给药第1天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.4 mL/只，进行免疫。于第7天给药后2 h，小鼠眼眶取血，按2.2项下的方法测定溶血素形成细胞情况。将小鼠脱颈椎处死，解剖取出脾脏，将两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×10⁶个/mL。按2.2项下的方法测定溶血空斑形成细胞情况，结果如下：

表4 鹿衔草多糖对免疫低下小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响（x±s）

组别	动物数（只）	剂量（g/kg）	溶血素形成（OD）	溶血空斑形成（OD）
					空白对照组	10	-	0.280+0.003**	0.429+0.004**
模型组	10	-	0.219+0.004	0.400+0.013
					香菇多糖组	10	0.1	0.253+0.003**	0.420+0.004**
鹿衔草多糖小剂量组	10	0.1	0.257+0.002**	0.416+0.008*
					鹿衔草多糖中剂量组	10	0.2	0.245+0.003**	0.417+0.008*
鹿衔草多糖大剂量组	10	0.4	0.232+0.002**	0.414+0.017*

从表中可以看出，香菇多糖组能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，具有极显著性意义（P<0.01），鹿衔草多糖各剂量组可明显提高免疫低下小鼠溶血素的形成，具有极显著性意义（P<0.01），而对免疫低下小鼠溶血空斑形成，具有显著性意义（P<0.05）。

本发明提取工艺简单、方便、快速，提取的鹿衔草经实验验证，按照本发明中的提取方法提取的鹿衔草多糖，具有很好的增强免疫的作用，完全具备开发为保健类食品和免疫增强药的潜力及实际推广价值，鹿衔草多糖可用于由营养不全、生活无序、过度疲劳、肿瘤病人放化疗等多种原因导致的免疫力低下的症状，开发研究鹿衔草多糖不仅可拓宽中药鹿衔草应用的新前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，具有巨大的经济及社会效益。

Claims

1.一种鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，该鹿衔草多糖是：取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1:5—30加水，搅拌均匀，60～100℃水浴提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2～4倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%～90%，密封，4℃静置过夜8-12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥，得鹿衔草多糖；所述的鹿衔草药材粉末是鹿衔草经粉碎过24目筛的粉末；所述的与鹿衔草药材粉末混合的水为自来水、或纯净水、或蒸馏水、或去离子水。

2.根据权利要求1所述的鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，其特征在于，所述的鹿衔草多糖是：取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：10加水，搅拌均匀，90℃水浴提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%，密封，4℃冷藏静置过夜12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖。

3.根据权利要求1所述的鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，其特征在于，所述的鹿衔草多糖是：取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：5加水，搅拌均匀，60℃水浴提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的2倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为90%，密封，4℃冷藏静置过夜8小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤2次，真空干燥，得鹿衔草多糖。

4.根据权利要求1所述的鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，其特征在于，所述的鹿衔草多糖是：取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：30加水，搅拌均匀，100℃水浴提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的4倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为80%，密封，4℃冷藏静置过夜12小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤2次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖。

5.根据权利要求1所述的鹿衔草多糖在制备增强免疫力药物和保健食品中的应用，其特征在于，所述的鹿衔草多糖是：取鹿衔草药材粉末，按料液重量比1：20加水，搅拌均匀，75℃水浴提取3次，每次2.5h，过滤，合并滤液，浓缩至体积为鹿衔草重量的3倍，得多糖浓缩液，在多糖浓缩液中搅拌下缓慢加入体积浓度为95%以上的乙醇溶液并充分搅拌，直至含醇量达到体积浓度为85%，密封，4℃冷藏静置过夜10小时，离心得多糖沉淀，再依次用无水乙醇洗涤2次、丙酮洗涤1次、无水乙醚洗涤1次，真空干燥，得鹿衔草多糖。