CN105542024B - 红藻龙须菜多糖及其制备、抗肿瘤活性检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自红藻类植物龙须菜的海洋中药龙须菜多糖，还首次揭示了其作为抗肿瘤药物，尤其是顺铂的增效剂的增效作用，可作为抗肿瘤药物的增效剂。还公开了该龙须菜多糖在制备治疗肿瘤的药物、保健品或食品中的应用，其主要通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖达到抗肿瘤作用。对胃腺癌、肺癌和子宫颈癌都有抗肿瘤作用。本发明还公开了龙须菜多糖的制备方法，及其抗肿瘤作用的检测方法。本发明为龙须菜作为海洋药物资源的进一步利用提供了新的途径，本发明的龙须菜多糖在制备抗肿瘤药物、防癌保健品或食品中的用途，也为治疗或预防肿瘤的药物开发提供了新的选择。

Description

红藻龙须菜多糖及其制备、抗肿瘤活性检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种大型海藻来源的多糖、其制备方法、抗肿瘤活性的检测方法及应用，具体涉及一种红藻龙须菜多糖的提取和纯化、其制备方法、其抗肿瘤活性的检测方法及其在抗肿瘤药物制备或作为增效剂的用途。

背景技术

随着人口老龄化加剧、生态环境遭受破坏、不健康生活方式及食品安全问题等凸现，肿瘤发病率和死亡率持续上升，给人们生活、健康及社会带来严重危害。常见的肿瘤药物及放疗、化疗等治疗方法效果好但副作用较大。中医单独或辅助西药治疗肿瘤在提高机体免疫力、延长生存期、降低复发转移率及减轻副作用等方面有着积极的意义。从研制创新药物角度出发，海洋药物的研究是开发以传统中药为来源的新型天然活性药物的热点及重要方向之一。《中草药大辞典》载药5767味，其中海洋药物144种(128味)；《中国海洋药物辞典》收录海洋药物1600条，其中海洋藻类药物125条。美国国立肿瘤研究所每年筛选30,000个新的抗肿瘤化合物，约5％来自海洋生物。目前国内外关于海藻抗肿瘤药物的报道日益增多，我国海域辽阔，海藻资源丰富，利用藻类生产抗肿瘤物质很有潜力。如果能将资源丰富的海藻开发为抗肿瘤药物，必将降低新药研制和开发的成本。

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属大型海藻，主要分布于我国山东、辽宁、江苏、福建、海南等沿海地区，具有适应范围广、生长快、含胶量高、适应环境能力强和营养价值高等优点。明代李时珍在《本草纲目》中指出：龙须菜可以治瘿结热气，利小便。因此，龙须菜对人体有着极为重要的保健功效，且营养价值高，是“下八珍”的一珍。龙须菜性味甘、寒，主要入肝经，具有助消化、解积腻、清肠胃和止血降压、软坚化痰、清热利水、温经止痛的功效。龙须菜富含活性多糖、藻红蛋白及膳食纤维和营养元素等，具有免疫调节活性、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗病毒、抗菌、抗炎镇痛等多种生物学活性和药用保健功效，而且具有毒性小、药源丰富的特点。

鉴于龙须菜是一种容易获得且生长快的海洋藻类资源，为了充分利用这种藻类资源，本领域技术人员致力于进一步开拓其生物活性物质的用途。

发明内容

为了进一步开拓龙须菜的生物活性物质的用途，本发明的一个方面提供了一种多糖，其来自红藻类植物龙须菜，为981品种。

本发明的另一方面，提供了一种龙须菜多糖在制备治疗肿瘤药物的增效剂中的应用。

进一步地，治疗肿瘤药物的增效剂是指上述龙须菜多糖与抗肿瘤药物顺铂联用，能提高顺铂的抗肿瘤作用。

进一步地，上述药物包括龙须菜多糖和药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。

本发明的又一方面，提供一种龙须菜多糖在制备治疗肿瘤的药物、保健品或食品中的应用。

进一步地，上述肿瘤为胃腺癌、肺癌或子宫颈癌。

本发明的再一方面提供一种制备上述龙须菜多糖的方法，包括以下步骤：

1)用水溶解龙须菜干粉，并用NaOH调节溶液pH至9-11，离心获得第一上清液和第一沉淀；

2)在步骤1)中离心得到的第一沉淀中加入水溶解，并用NaOH调节溶液pH至9-11，并再次离心，获得第二上清液；

3)合并第一上清液和第二上清液，并加入三氯乙酸进行沉淀，离心获得第三上清液；

4)在第三上清液中加入无水乙醇进行沉淀，离心获得第二沉淀；

5)用丙酮洗涤第二沉淀，并冷冻干燥，获得粗提龙须菜多糖；

6)将步骤5)中的粗提龙须菜多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，真空干燥后获得纯化的龙须菜多糖。优选地，离子交换柱为DEAE Sephadex A-25离子交换柱；用蒸馏水、0.3mol/L NaCl和1.2mol/L NaCl溶液进行分步洗脱；分步洗脱后获得3种级分，将最显著的级分作为纯化的龙须菜多糖进行后续实验。

优选地，步骤1)和步骤2)中，用NaOH调节溶液pH至10。

进一步地，步骤3)中加入的三氯乙酸的质量浓度为2％-5％。优选三氯乙酸的质量浓度为3％。

本发明的又一方面提供一种检测上述龙须菜多糖抗肿瘤活性的方法，包括：

1)将肿瘤细胞接种到新鲜培养基中，培养至对数生长期，并制成细胞悬液，接种至多孔板中；

2)待细胞贴壁后，将培养基替换为含有不同浓度的龙须菜多糖的培养基，并继续培养24小时、48小时或72小时；

3)将步骤2)中的培养基替换为含有CCK-8的培养基，继续培养后检测吸光度值；

4)计算所述龙须菜多糖作用不同时间段对肿瘤细胞的增殖活力的影响，确定IC₅₀值。

进一步地，上述CCK-8的终浓度为8％-12％，检测波长450nm的吸光度值。优选的，CCK-8的终浓度为10％。

进一步地，上述肿瘤细胞为胃腺癌细胞MKN45、肺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞。

本发明采用的龙须菜富含活性多糖，其龙须菜多糖作为海洋药物资源，具有良好抗肿瘤效果，主要能够通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖来发挥其抗肿瘤的作用，同时没有明显的毒副作用。尤其是对人胃癌、肺癌、子宫颈癌和白血病等肿瘤均有良好的抑制作用，其中又以对肺癌的抗肿瘤作用最明显，且这种抑制作用在一定浓度范围内具有时间-浓度依赖性。另外，将龙须菜多糖与用于治疗多种实体瘤的一线用药顺铂联合使用，能够增强对顺铂的抗肿瘤作用，尤其是对肺癌的抗肿瘤作用的增效作用显著。

龙须菜多糖抑制肿瘤细胞的生长和增殖这种双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复，适于联合用药，具有广阔的应用前景。龙须菜多糖作为一种新型的抗肿瘤多糖，有望成为预防和治疗恶性肿瘤的辅助药物，值得进一步研究和开发成药用多糖或保健品多糖或者相关食品，以提高龙须菜的经济利用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖的提取、纯化的结果图。

图2是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对胃腺癌MKN45细胞生长和增殖的抑制作用图。

图3是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对肺癌细胞A549细胞生长和增殖的抑制作用图。

图4是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对子宫颈癌Hela细胞生长和增殖的抑制作用。

具体实施方式

本发明中使用的各种试剂，除了有特别标注，均可以直接购买获得。

本发明的龙须菜多糖是从一类红藻类植物龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)中提取并初步纯化得到的多糖。龙须菜为981品种，采自浙江温州。

实施例1龙须菜多糖的提取及纯化

提取：龙须菜于2014年10月采自浙江温州，经反复清洗、去除泥沙等杂物，阴干粉碎，保鲜袋冷藏保存。称取100g龙须菜干粉，加入700mL ddH₂O，用NaOH中和调节pH至10。在80℃的水浴中保温4小时，期间进行间歇性地搅拌。将上述溶液于8000rpm/min离心15min，取上清液。为减少多糖损失，在沉淀中再加入5mL ddH2O，并用NaOH调节pH至10，在80℃水浴中保温4小时，期间进行间歇性地搅拌，然后将溶液于8000rpm/min离心15min，再次取上清液。将第一次和第二次离心获得的上清液合并以提高多糖提取率，用草酸调节pH至7，在多糖水提液中滴加3％与多糖水提取液等体积的三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)，混匀，于25℃静置1h，将TCA沉淀后的溶液于8000rpm/min离心15min后除去胶状沉淀，得到无蛋白质的多糖。用丙酮洗涤沉淀2次，冷冻干燥得到白色粉末状粗提龙须菜多糖。

纯化：将上述方法提取的粉末状粗提多糖复溶于水，取3ml样品过DEAE SephadexA-25离子交换柱，用蒸馏水和3mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速0.5ml/min，每管5ml收集100管，用蒽酮—硫酸法测定每管多糖浓度。在此基础上，再用蒸馏水、0.3mol/L NaCl和1.2mol/L NaCl溶液分步洗脱，流速0.5ml/min，每管5ml收集，将含糖量较高的洗脱液减压浓缩后，透析去盐，真空干燥得到各多糖组分。结果显示：利用DEAE-Sephadex A-25离子交换柱进行分步洗脱，可以得到3个明显的吸收峰(图1)，表明本发明的这个实施例中提取及纯化获得的龙须菜多糖至少含有3种级分。收集这3种级分，依次命名为P-1、P-2和P-3，3种级分占上样量的比率分别3.56％、69.37％、18.29％。将上述真空干燥后获得的最显著的级分P-2加入ddH₂O配成1mg/mL母液，过滤除菌，分装，4℃保存备用，以此进行抗肿瘤活性检测。

实施例2龙须菜多糖对胃腺癌细胞MKN45生长和增殖的抑制作用

胃腺癌细胞MKN45为贴壁细胞，细胞复苏后以5×10⁶/L的接种密度种于新鲜的1640培养液(含有89％的RPMI1640培养基，10％的胎牛血清FBS，1％的1U/mL的青-链霉素)中培养，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。每2天换液、传代1次。取对数生长期的胃腺癌细胞MKN45，以0.25％胰酶消化、计数，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成1×10⁴/mL细胞悬液，接种于3块96孔培养板内，每孔200μL，使每孔细胞密度为2×10³个，每组设4个平行复孔，并设不含细胞的空白组，培养24h，待细胞贴壁后，每孔加入含不同浓度龙须菜多糖(0、5、10、20、30、40、50、60、80、100μg/mL)的200μL培养基换液，其中0μg/mL龙须菜多糖组为对照组。分别连续培养24、48、72h后，加入含10％CCK-8的培养基200μL换液，继续培养2.5h，采用自动酶标读数仪检测波长450nm的各孔吸光值A，并计算龙须菜多糖作用不同时间段对MKN45细胞的增殖活力的影响，确定IC₅₀浓度。

计算公式：细胞生长和增殖活力(％)＝[A₄₅₀(加药)－A₄₅₀(空白)]/[A₄₅₀(对照)－A₄₅₀(空白)]×100％

结果：从图2可知，当龙须菜多糖作用24h时，随着作用浓度的增加，抑制生长和增值效果也有所增加，但在80μg/mL以内，作用不明显(P>0.05)。而当作用48h，浓度为50、60、80和100μg/mL时，胃腺癌细胞生长和增殖能力分别是69.957％、59.163％、50.672％和51.258％(P<0.01)。作用72h时，以50、60、80和100μg/mL浓度差异性最为显著(P<0.01)。龙须菜多糖作用48和72h时，半数抑制浓度(IC₅₀)分别为80和95μg/mL。

可见，各实验组与对照组抑制增殖效果相比，龙须菜多糖对胃腺癌MKN45细胞的生长和增殖能力有抑制作用，且随着浓度的增大，作用时间越长，细胞增殖活力越小，抑制作用增大越明显。龙须菜多糖对胃腺癌细胞生长和增殖抑制的作用效果呈现出明显的浓度-时间依赖性。

实施例3龙须菜多糖对肺癌细胞A549生长和增殖的抑制作用

肺癌细胞培养方法、龙须菜多糖给药方法、细胞增殖能力检测方法、细胞活力计算公式及数据分析方法同实施例2。结果如下：

从图3可知，当龙须菜多糖作用于肺癌A549细胞24h时，随着作用浓度的增加，抑制生长和增值效果也有所增加，但在40μg/mL以内，作用不明显(P>0.05)。而当作用48h，浓度为50、60、80和100μg/mL时，肺癌细胞生长和增殖能力分别是49.813％、47.677％、50.042％和48.949％(P<0.01)。作用72h时，以40、50、60、80和100μg/mL浓度差异性最为显著(P<0.01)。龙须菜多糖作用48和72h时，半数抑制浓度(IC₅₀)分别为50和45μg/mL。

可见，各实验组与对照组抑制增殖效果相比，龙须菜多糖对肺癌A549细胞的生长和增殖能力有显著的抑制作用，且随着浓度的增大，作用时间越长，细胞增殖活力越小，抑制作用增大越明显。龙须菜多糖对肺癌细胞生长和增殖抑制的作用效果呈现出明显的浓度-时间依赖性，且作用效果比胃腺癌更显著。

实施例4龙须菜多糖对子宫颈癌Hela细胞生长和增殖的抑制作用

子宫颈癌细胞培养方法、龙须菜多糖给药方法、细胞增殖能力检测方法、细胞活力计算公式及数据分析方法同实施例2。结果如下：

从图4可知，当龙须菜多糖作用子宫颈癌Hela细胞24h时，随着作用浓度的增加，抑制生长和增值效果也有所增加，但作用不明显。而当作用48h，浓度为50、60、80和100μg/mL时，子宫颈癌细胞生长和增殖能力分别是52.163％、50.712％、54.499％和48.426％(P<0.01)。作用72h时，以60、80和100μg/mL浓度差异性最为显著(P<0.01)。龙须菜多糖作用48和72h时，半数抑制浓度(IC₅₀)分别为60和80μg/mL。

可见，各实验组与对照组抑制增殖效果相比，龙须菜多糖对子宫颈癌Hela细胞的生长和增殖能力抑制作用，且随着浓度的增大，作用时间越长，细胞增殖活力越小，抑制作用增大越明显。龙须菜多糖对子宫颈癌细胞生长和增殖抑制的作用效果呈现出较明显的浓度-时间依赖性。

实施例5龙须菜多糖对顺铂抗肿瘤增效作用的药效学研究

实施例2-4中，单独使用龙须菜多糖作用于胃癌MKN45、肺癌A549和宫颈癌Hela细胞均表现出一定的抗肿瘤作用。本实施例将龙须菜多糖与用于治疗多种实体瘤的一线用药顺铂(齐鲁制药，规格：20mg，国药准字H37021358)联合使用，作用于MKN45、A549和Hela细胞。龙须菜多糖给药方法同实施例2，作用浓度参照实施例2-4中的IC₅₀值浓度选择50和80μg/mL，作用48小时。肿瘤细胞培养方法、细胞增殖能力检测方法、细胞活力计算公式及数据分析方法同实施例2。结果如表1所示：

表1 肿瘤细胞生长抑制率(％) (n＝6)

注：与顺铂组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05

上述结果表明，单独使用化疗药顺铂时，2μg/mL顺铂对三种肿瘤细胞生长和增殖均有一定的抑制作用而将顺铂与龙须菜多糖联合使用时，其抑瘤效果明显增强且大于单独使用顺铂的抑瘤效果(P<0.01或P<0.05)，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著(P<0.01)。随着龙须菜多糖用量增加，增效作用增强，呈现剂量依赖性。这说明龙须菜多糖增加了顺铂的抑瘤效果，对顺铂起到了一种增效剂的作用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种龙须菜多糖在制备治疗肿瘤药物的增效剂中的应用，所述治疗肿瘤药物的增效剂是指所述龙须菜多糖与抗肿瘤药物顺铂联用，能提高顺铂的抗肿瘤作用，所述肿瘤为胃腺癌、子宫颈癌。

2.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述龙须菜多糖和药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。

3.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述龙须菜多糖的制备方法包括以下步骤：

1)用水溶解龙须菜干粉，并用NaOH调节溶液pH至9-11，离心获得第一上清液和第一沉淀；

2)在步骤1)中离心得到的所述第一沉淀中加入水溶解，并用NaOH调节溶液pH至9-11，并再次离心，获得第二上清液；

3)合并所述第一上清液和所述第二上清液，并加入三氯乙酸进行沉淀，离心获得第三上清液；

4)在所述第三上清液中加入无水乙醇进行沉淀，离心获得第二沉淀；

5)用丙酮洗涤所述第二沉淀，并冷冻干燥，获得粗提龙须菜多糖；

6)将步骤5)中的粗提龙须菜多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，真空干燥后获得纯化的龙须菜多糖。

4.一种如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中加入的所述三氯乙酸的质量浓度为2％-5％。

5.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述龙须菜多糖抗肿瘤活性的检测方法包括以下步骤：

1)将肿瘤细胞接种到新鲜培养基中，培养至对数生长期，并制成细胞悬液，接种至多孔板中；

2)待细胞贴壁后，将培养基替换为含有不同浓度的龙须菜多糖的培养基，并继续培养24小时、48小时或72小时；

3)将步骤2)中的培养基替换为含有CCK-8的培养基，继续培养后检测吸光度值；

4)计算所述龙须菜多糖作用不同时间段对肿瘤细胞的增殖活力的影响，确定IC₅₀值。

6.一种如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述CCK-8的终浓度为8％-12％，检测波长450nm的吸光度值。