CN107213145A - 细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 - Google Patents

细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用。实验证明，细锥香茶菜乙素可抑制食管鳞癌细胞的增殖、抑制食管鳞癌细胞的克隆形成、影响食管鳞癌细胞周期进程、诱导食管鳞癌细胞周期阻滞、抑制食管鳞癌细胞的DNA修复、诱导食管鳞癌细胞凋亡、上调cleaved‑caspase‑9的表达量、上调cleaved‑caspase‑3的表达量、上调cleaved‑PARP的表达量、抑制Akt信号通路、抑制NF‑κB信号通路和抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长，具有重要的应用价值。

Description

细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及细锥香茶菜乙素的一种新用途，更具体涉及细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用。
背景技术
食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是恶性程度非常高的癌症，在亚洲有着很高的发病率，五年生存率只有15％-25％。虽然近年来癌症诊疗技术有了长足进步，但ESCC预后仍然很差。化疗是晚期ESCC患者的主要治疗方法，但大多数患者对治疗不敏感。因此，迫切需要开发高效低毒的新药。
唇形科(Labiatae)香茶菜属(Isodon)植物是我国民间广泛使用的中草药，该属植物以全草或根入药，具有清热利湿、活血散瘀、解毒消肿等功效，富含结构多样的活性二萜类化合物。溪黄草(Isodon serra(Maxim.)Hara)属唇形科(Labiatae)香茶菜属(Isodon)，又名熊胆草、血风草，俗称土黄连，主产于长江以南的广东、江浙等省区，常成丛生于山坡、溪旁，海拔120-1250米。根或全草入药，具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀的功效，用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎、跌打瘀痛等病症。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制食管鳞癌细胞增殖。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了细锥香茶菜乙素在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。
细锥香茶菜乙素的应用也属于本发明的保护范围。细锥香茶菜乙素的应用可为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。。
上述应用中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE30细胞。
上述应用中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE450细胞。
上述应用中，所述A3)或A4)中，所述细胞周期为G2/M期。
上述应用中，所述产品可为药物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，含有细锥香茶菜乙素；所述产品的功能可为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。
上述产品中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE30细胞。
上述产品中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE450细胞。
上述产品中，所述A3)或A4)中，所述细胞周期为G2/M期。
所述产品可为药物。
上述任一所述cleaved-caspase-9的Gene ID为842。
上述任一所述cleaved-caspase-3的Gene ID为836。
上述任一所述cleaved-PARP的Gene ID为142。
上述任一所述细锥香茶菜乙素可为式(Ⅰ)的化合物。
上述任一所述细锥香茶菜乙素可为溪黄草提取物。
上述任一所述细锥香茶菜乙素可为溪黄草酮提物。所述酮具体可为丙酮。
所述溪黄草酮提物的制备方法可包括如下步骤：以溪黄草的地上部分为原料，依次进行丙酮浸泡、乙酸乙酯萃取、硅胶色谱柱分析、薄层色谱法检测、MCI脱色、甲醇洗脱和重结晶。
所述“丙酮浸泡”具体可为采用丙酮水溶液进行浸泡。所述丙酮水溶液具体可为70％(v/v)丙酮水溶液。所述“丙酮浸泡”中，丙酮水溶液与原料的配比可为6Kg：20L。所述“丙酮浸泡”的时间具体可为3d。为了增加产率，可多次重复浸泡后再混合。
所述制备方法中，具体可将所述“丙酮浸泡”得到的浸泡液减压蒸馏(目的为回收丙酮)，然后将得到的提取液用乙酸乙酯进行萃取。
所述“乙酸乙酯萃取”中，所述提取液和乙酸乙酯的体积配比可为1:3。
所述“硅胶色谱柱分析”中，具体可使用填充有80-100目孔径硅胶的硅胶色谱柱分析。
所述“薄层色谱法检测”具体可为用薄层色谱法检测，合并相同部分，得到7个馏分，然后将馏分二依次进行MCI脱色、甲醇洗脱和重结晶。
所述“甲醇洗脱”具体可为采用甲醇水溶液进行洗脱。所述甲醇水溶液具体可为90％(v/v)甲醇水溶液。
所述“重结晶”具体可为甲醇溶解重结晶。
获得细锥香茶菜乙素的步骤具体可如下：
(1)将溪黄草的地上部分进行粉碎(筛网目数：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。
(2)完成步骤(1)后，取原料，加入70％(v/v)丙酮水溶液进行浸泡，浸泡分别进行三次，每次浸泡时间为3d，分别得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。
(3)完成步骤(2)后，分别将浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3减压蒸馏(目的为回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。
(4)完成步骤(3)后，分别向提取液1、提取液2和提取液3中按体积比为1：3加入乙酸乙酯，进行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。
(5)完成步骤(4)后，使用填充有80-100目孔径硅胶的硅胶色谱柱分析乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。
(6)完成步骤(5)后，先用薄层色谱法检测，合并相同部分，得到7个馏分；然后将馏分二依次进行MCI脱色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脱和甲醇溶解重结晶，得到的固体物质即为细锥香茶菜乙素。
实验证明，细锥香茶菜乙素可抑制食管鳞癌细胞的增殖、抑制食管鳞癌细胞的克隆形成、影响食管鳞癌细胞周期进程、诱导食管鳞癌细胞周期阻滞、抑制食管鳞癌细胞的DNA修复、诱导食管鳞癌细胞凋亡、上调cleaved-caspase-9的表达量、上调cleaved-caspase-3的表达量、上调cleaved-PARP的表达量、抑制Akt信号通路、抑制NF-κB信号通路和抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为细锥香茶菜乙素的1H-NMR谱。
图2为细锥香茶菜乙素的13C-NMR谱。
图3为细锥香茶菜乙素的HR-ESIMS谱。
图4为实施例2的实验结果。
图5为实施例3的实验结果。
图6为实施例4步骤一的实验结果。
图7为实施例4步骤二的实验结果。
图8为实施例5的实验结果。
图9为实施例6步骤2的实验结果。
图10为实施例6步骤3的实验结果。
图11为实施例6步骤4的实验结果。
图12为实施例6步骤5和6的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
KYSE30细胞和KYSE450细胞均由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供。经过STR鉴定，KYSE30细胞和KYSE450细胞均符合日本细胞库(JCRB)提供的STR位点谱。
结晶紫为碧云天公司的产品，产品目录号为C0121。细胞周期检测试剂盒为江苏凯基生物技术股份有限公司的产品，产品目录号为KGA512。CCK8为同仁化学研究所的产品，产品目录号为CK04。细胞凋亡检测试剂盒(商品名称为：Annexin V，FITC ApoptosisDetection Kit)为同仁化学研究所的产品，产品目录号为556547。无胸腺裸鼠为华阜康公司的产品，产品目录号为No.11401300035372。DNA Damage Antibody Sampler Kit、Cdc25CAntibody Sampler Kit、Cdc2Antibody、Phospho-Cdc2Antibody、Cyclin B1Antibody、GAPDH Antibody、Apoptosis Antibody Sampler Kit、Caspase 8Antibody、Bax Antibody、Bcl-2Antibody、Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit和NF-κB PathwayAntibody Sampler Kit均为Cell Signaling Technology公司的产品，产品目录号分别为#9947、#9555、#9112、#4539、#4138、#5174、#9915、#9746、#2772、#2870、#9916和#9936。
使用DMSO配制浓度分别为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、6mM、8mM和10mM的细锥香茶菜乙素母液，用1640完全培养液将上述浓度的细锥香茶菜乙素母液分别稀释1000倍，得到DMSO含量均为0.1％(v/v)、细锥香茶菜乙素浓度为0.5μM的细锥香茶菜乙素溶液1、浓度为1μM的细锥香茶菜乙素溶液2、浓度为1.5μM的细锥香茶菜乙素溶液3、浓度为2μM的细锥香茶菜乙素溶液4、浓度为2.5μM的细锥香茶菜乙素溶液5、浓度为3μM的细锥香茶菜乙素溶液6、浓度为4μM的细锥香茶菜乙素溶液7、浓度为6μM的细锥香茶菜乙素溶液8、浓度为8μM的细锥香茶菜乙素溶液9和浓度为10μM的细锥香茶菜乙素溶液10。
实施例1、制备细锥香茶菜乙素(Rabdocoestin B)
细锥香茶菜乙素的结构式如式(Ⅰ)所示，制备细锥香茶菜乙素的步骤如下：
1、将6Kg市售的溪黄草的地上部分进行粉碎(筛网目数：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。
2、完成步骤1后，取原料，加入20L 70％(v/v)丙酮水溶液进行浸泡，浸泡分别进行三次，每次浸泡时间为3d，分别得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。
3、完成步骤2后，分别将浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3减压蒸馏(目的为回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。
4、完成步骤3后，分别向提取液1、提取液2和提取液3中按体积比为1：3加入乙酸乙酯，进行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。
5、完成步骤4后，使用填充有80-100目孔径硅胶的硅胶色谱柱分离乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。流动相由氯仿(A)和丙酮(B)组成，流速为1000mL/min，使用以下梯度洗脱条件：在0～1h内，流动相为纯氯仿洗脱；在1h～3h内，用由氯仿和丙酮按照9:1的体积比混合得到的流动相进行洗脱；在3h～10h内，用由氯仿和丙酮按照8:2的体积比混合得到的流动相进行洗脱；在10h～15h内，用由氯仿和丙酮按照7:3的体积比混合得到的流动相进行洗脱；在15h～18h内，用由氯仿和丙酮按照6:4的体积比混合得到的流动相进行洗脱；在18h～19h内，用由氯仿和丙酮按照5:5的体积比混合得到的流动相进行洗脱；在19h～20h内，流动相为纯丙酮洗脱。进行线性梯度洗脱检测波长为254nm。
6、完成步骤5后，先用薄层色谱法检测，合并相同部分，得到7个馏分；然后将馏分二依次进行MCI脱色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脱和甲醇溶解重结晶，得到固体物质。
将该固体物质分别进行1H-NMR谱、13C-NMR谱和HR-ESIMS谱检测，实验结果依次见图1、图2和图3。
该固体物质的的核磁数据如下：
白色无定形粉末；
C22H30O6；
positive HRESIMS[M+Na]+m/z 413.1934(calcd for C22H30O6Na，413.1935)；
1H NMR(C5D5N，600MHz)：δH 6.29and 5.43(each 1H，br s，H2-17)，5.31(1H，br s，H-14α)，4.78(1H，dd，11.4，5.2，H-1β)，4.57and 4.48(each 1H，d，10.1，H2-20)，2.02(3H，s，OAc)，1.08and 0.70(each 3H，s，Me-18，19)；
13C NMR(C5D5N，600MHz)，δC 73.7(d,C-1)，25.9(t，C-2)，38.4(t，C-3)，34.2(s，C-4)，49.1(d，C-5)，31.39(t，C-6)，98.6(s，C-7)，59.7(s，C-8)，53.0(d，C-9)，39.9(s，C-10)，18.9(t，C-11)，33.0(t，C-12)，43.6(d，C-13)，76.5(d，C-14)，204.4(s，C-15)，154.0(s，C-16)，117.4(t，C-17)，31.8(q，C-18)，21.8(q，C-19)，64.2(t，C-20)，170.5(s，AcO-1)，21.8(q，AcO-1)
上述结果表明，通过上述步骤制备的固体物质为细锥香茶菜乙素。获得的细锥香茶菜乙素为8.0g，得率约为0.133％。
实施例2、细锥香茶菜乙素对食管鳞癌细胞的细胞毒性
一、细锥香茶菜乙素抑制食管鳞癌细胞的增殖
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的改良型RPMI-1640培养液培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到浓度为2×104个/mL的细胞悬浮液。
2、取96孔细胞培养板，每孔加入100μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约2000个细胞)，细胞贴壁后换液为100μL细锥香茶菜乙素溶液(细锥香茶菜乙素溶液1、细锥香茶菜乙素溶液2、细锥香茶菜乙素溶液3、细锥香茶菜乙素溶液4、细锥香茶菜乙素溶液5、细锥香茶菜乙素溶液6、细锥香茶菜乙素溶液7、细锥香茶菜乙素溶液8或细锥香茶菜乙素溶液9)，5％CO2、37℃培养12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μL含10％(10μL/1mL)CCK8的1640完全培养液，采用酶标仪检测在450nm处的吸光值。
在96孔细胞培养板中设置阴性对照孔，每个阴性对照孔加入100μL步骤1所得细胞悬液，即每孔约2000细胞。阴性对照组待细胞贴壁后换液为100μL含0.1％DMSO(v/v)的1640完全培养液(与细锥香茶菜乙素溶液同一时间点换液)，5％CO2、37℃培养12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μL含10％(10μL/1mL)CCK8的1640完全培养液，采用酶标仪检测阴性对照孔在450nm处的吸光值。
以细锥香茶菜乙素在孔中的浓度为横坐标，相对活性为纵坐标，比较细锥香茶菜乙素处理后待测细胞的增殖程度。相对活性根据下述公式计算：
相对活性(％)＝(细锥香茶菜乙素溶液处理组在450nm处的吸光值-无细胞空白对照组在450nm处的吸光值)/(阴性对照组在450nm处的吸光值-无细胞空白对照组在450nm处的吸光值)×100％。
实验结果表明，细锥香茶菜乙素可显著抑制KYSE30细胞和KYSE450细胞的增殖，IC50分别为1.56μM和1.94μM(图4中A，左图为KYSE30细胞，右图为KYSE450细胞)；细锥香茶菜乙素对KYSE30细胞和KYSE450细胞的生长抑制呈剂量和时间依赖性(图4中B为KYSE30细胞，左图为线性图，右图为柱状图；图4中C为KYSE450细胞，左图为线性图，右图为柱状图)。
二、细锥香茶菜乙素抑制食管鳞癌细胞的克隆形成
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的改良型RPMI-1640培养液培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到浓度为1×104个/mL的细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL 1640完全培养液和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约500个细胞)，5％CO2、37℃培养12h。
3、完成步骤2后，取所述6孔板，弃液相，加入2mL细锥香茶菜乙素溶液(细锥香茶菜乙素溶液1或细锥香茶菜乙素溶液2)，5％CO2、37℃培养24h。
4、完成步骤3后，取所述6孔板，弃液相，加入2mL 1640完全培养液，5％CO2、37℃培养7d。
5、完成步骤4后，将采用结晶紫染色，观察集落数目及大小。
按照上述步骤，将步骤3中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图4中D(左图为生长状态，右图为集落数目统计结果，control为对照)。结果表明，与对照相比，细锥香茶菜乙素温育24h后，KYSE30细胞和KYSE450细胞形成的集落数目明显减少，面积也较小；细锥香茶菜乙素的浓度越高，KYSE30细胞和KYSE450细胞形成的集落数目越少。
上述结果表明，细锥香茶菜乙素对食管鳞癌细胞(如KYSE30细胞、KYSE450细胞)具有显着的细胞毒性。
实施例3、细锥香茶菜乙素抑制食管鳞癌细胞的DNA修复
一、细锥香茶菜乙素影响食管鳞癌细胞周期进程
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的改良型RPMI-1640培养液培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到浓度为5×104个/mL的细胞悬浮液。取培养皿(规格为6cm)，加入4mL细胞悬浮液(即每培养皿铺有2×105个细胞)，5％CO2、37℃培养12h。
2、完成步骤1后，取所述培养皿，弃液相，加入4mL无血清培养液1640，5％CO2、37℃培养12h(饥饿培养，目的为使细胞同步化)。
3、取完成步骤2的细胞，弃液相，加入4mL细锥香茶菜乙素溶液(细锥香茶菜乙素溶液6或细锥香茶菜乙素溶液8)，5％CO2、37℃培养24h。
4、完成步骤3后，离心，收集沉淀。
5、取步骤4收集的沉淀，加入70％(v/v)乙醇水溶液，置于4℃固定12h；然后采用细胞周期检测试剂盒染色，最后用流式细胞仪检测G2/M期细胞、S期细胞、G0/G1期细胞的百分比。
按照上述步骤，将步骤3中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图5中A(control为对照)。结果表明，与对照相比，细锥香茶菜乙素处理的G2/M期食管鳞癌细胞(如KYSE30细胞、KYSE450细胞)的百分比显著增加，且细锥香茶菜乙素浓度越高，则百分比越高。因此，细锥香茶菜乙素可影响食管鳞癌细胞周期进程，诱导食管鳞癌细胞细胞周期阻滞。
二、细锥香茶菜乙素抑制食管鳞癌细胞的DNA修复
1、同步骤一中1。
2、取完成步骤1的细胞，弃液相，加入4mL细锥香茶菜乙素溶液(细锥香茶菜乙素溶液4、细锥香茶菜乙素溶液7、细锥香茶菜乙素溶液8、细锥香茶菜乙素溶液9或细锥香茶菜乙素溶液10)，5％CO2、37℃培养24h。
3、完成步骤2后，提取细胞总蛋白并检测蛋白浓度。
4、完成步骤3后，将细胞总蛋白进行Western blot(采用DNA Damage AntibodySampler Kit检测γH2AX、p-Chk2、p-Chk1、p-ATM、p-ATR和p-BRCA1，采用Cdc25C AntibodySampler Kit检测Cdc25C和p-Cdc25C，采用Cdc2Antibody检测Cdc2，采用Phospho-Cdc2Antibody检测p-Cdc2，采用Cyclin B1Antibody检测Cyclin B1，采用GAPDH Antibody检测GAPDH)。
按照上述步骤，将步骤2中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图5中B(control为对照)：随着细锥香茶菜乙素浓度的增加，磷酸化组蛋白γH2AX也显着增加，γH2AX在DNA双链断裂造成的损伤反应中起重要作用，是一种DNA损伤标志物，γH2AX的升高表明细锥香茶菜乙素作用后造成了细胞DNA的损伤；G2/M期检验点蛋白p-Chk2的表达量随细锥香茶菜乙素浓度增加而增加，p-Chk1先升高而后降低；细胞周期蛋白Cdc25C和p-Cdc25C的表达随着Chk1/2激活的增加而减少；Cdc2的总量、p-Cdc2以及Cyclin B1的表达量，均随细锥香茶菜乙素的浓度增加而递降。结果表明细锥香茶菜乙素造成的DNA损伤激活了Chk1/2，而活化的Chk1/2抑制了Cdc25C的功能；由于Cdc2是Cdc25C的作用靶点，Cdc25C的失活抑制了Cdc2功能，从而防止不成熟有丝分裂的发生。此外，CyclinB1的表达同样受到细锥香茶菜乙素抑制，加强了G2/M期停滞作用。因此，细锥香茶菜乙素导致食管鳞癌细胞DNA损伤，诱导了G2/M期阻滞，并且抑制食管鳞癌细胞DNA修复。
实施例4、细锥香茶菜乙素诱导食管鳞癌细胞凋亡
一、细锥香茶菜乙素诱导食管鳞癌细胞凋亡
1、同实施例3步骤一中1。
2、取完成步骤1的细胞，弃液相，加入4mL细锥香茶菜乙素溶液(细锥香茶菜乙素溶液7或细锥香茶菜乙素溶液9)，5％CO2、37℃培养24h或48h。
3、完成步骤2后，离心，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取沉淀，先用pH7.4、10mM的PBS缓冲液清洗两遍，然后用细胞凋亡检测试剂盒染色，最后用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
按照上述步骤，将步骤2中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图6(control和DMSO均为对照)。结果表明，与对照相比，细锥香茶菜乙素处理的食管鳞癌细胞(如KYSE30细胞、KYSE450细胞)发生凋亡的比例显著增加，且细锥香茶菜乙素浓度越高，则发生凋亡的比例越高。因此，细锥香茶菜乙素可诱导食管鳞癌细胞凋亡。
二、检测凋亡相关蛋白的变化
已有研究表明，cleaved-caspase-9(Gene ID：842；以下简称c-Cas9)、cleaved-caspase-3(Gene ID：836；以下简称c-Cas3)、cleaved-caspase-8(Gene ID：841；以下简称c-Cas8)、cleaved-PARP(Gene ID：142；以下简称PARP)和Bax(Gene ID：581)均为促进细胞凋亡蛋白；Bcl-2(Gene ID：596)为抑制细胞凋亡蛋白。
1、同实施例3步骤二中1。
2、同实施例3步骤二中2。
3、同实施例3步骤二中3。
4、完成步骤3后，将细胞总蛋白进行Western blot(采用Apoptosis AntibodySampler Kit检测PARP、c-Cas9和c-Cas3，采用Caspase 8Antibody检测c-Cas8，采用BaxAntibody检测Bax，采用Bcl-2Antibody检测Bcl-2，采用GAPDH Antibody检测GAPDH)。
按照上述步骤，将步骤2中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图7(DMSO为对照)。结果表明，随着细锥香茶菜乙素浓度的不断提高，cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达量均不断上升，cleaved-caspase-8和Bcl-2几乎不表达，Bax的表达量无明显变化。因此，细锥香茶菜乙素通过caspase-9依赖性内源性凋亡通路导致食管鳞癌细胞凋亡，并且是Bax和Bcl-2非依赖性的。
实施例5、细锥香茶菜乙素抑制Akt信号通路和NF-κB信号通路
Akt信号通路和NF-κB信号通路是细胞存活的两个关键通路。因此，需要检测细锥香茶菜乙素对Akt信号通路和NF-κB信号通路的影响。
1、同实施例3步骤二中1。
2、同实施例3步骤二中2。
3、同实施例3步骤二中3。
4、完成步骤3后，将细胞总蛋白进行Western blot(采用Phospho-Akt PathwayAntibody Sampler Kit检测Akt和p-Akt，采用NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit检测IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB，采用GAPDH Antibody检测GAPDH)。
按照上述步骤，将步骤2中的“细锥香茶菜乙素溶液”替换为含0.1％(v/v)DMSO的1640完全培养液，其它步骤均不变中，作为对照。
实验结果见图8(control为对照)。结果表明，细锥香茶菜乙素可以抑制Akt信号通路和NF-κB信号通路：细锥香茶菜乙素抑制Akt信号通路主要通过抑制位点Ser473的磷酸化发挥作用的，其使Akt磷酸化水平(Ser473位点)明显减少而总Akt量出现轻度下降；细锥香茶菜乙素显著抑制NF-κB通路主要是引起作为NF-κB信号激活子的IKKα和IKKβ表达量减少，而作为NF-κB信号抑制子的IκBα随着细锥香茶菜乙素浓度的增加而增加(其它分子(如p-IKKα/β、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB)的表达水平保持不变)。因此，细锥香茶菜乙素抑制可抑制Akt信号通路和NF-κB信号通路，驱动食管鳞癌细胞(如KYSE30细胞、KYSE450细胞)跨越凋亡阈值，导致食管鳞癌细胞凋亡。
实施例6、细锥香茶菜乙素抑制食管鳞癌小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长
1、将30只3-4周龄体重为13～17g的健康无胸腺裸鼠随机分成细锥香茶菜乙素组、顺铂(DDP)组和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：
细锥香茶菜乙素组：首先每只无胸腺裸鼠皮下移植1.2×106个KYSE30细胞，移植后第9天开始腹腔注射细锥香茶菜乙素，以后隔天继续腹腔注射细锥香茶菜乙素，直至上述三组中任一只无胸腺裸鼠的肿瘤生长至2000mm3停止注射。注射剂量均为12mg细锥香茶菜乙素/kg无胸腺裸鼠。
顺铂组：首先每只无胸腺裸鼠皮下移植1.2×106个KYSE30细胞，移植后第9天开始腹腔注射顺铂，以后隔天继续腹腔注射顺铂，直至上述三组中任一只无胸腺裸鼠的肿瘤生长至2000mm3停止注射(讨论：同上)。注射剂量均为2mg顺铂/kg无胸腺裸鼠。
对照组：首先每只无胸腺裸鼠皮下移植1.2×106个KYSE30细胞，移植后第9天开始，腹腔注射0.1％的Pluronic F68溶剂(0.1％的Pluronic F68溶剂为F-68原液使用无菌超纯水稀释100倍得到的；F-68，10％(100X)，货号：24040032，Thermo)，以后隔天继续腹腔注射Pluronic F68溶剂，直至上述三组中任一只无胸腺裸鼠的肿瘤生长至2000mm3停止注射。注射剂量均为200μL。
2、完成步骤1后，测量各小鼠的肿瘤体积并按组取平均值；称量各小鼠的肿瘤重量并按组取平均值；以注射时间为横坐标，平均肿瘤体积为纵坐标，绘制肿瘤生长曲线。
实验结果见图9(a为各组小鼠处死时的状态，b为各组小鼠的肿瘤组织，c为各组小鼠的肿瘤生长曲线，d为各组小鼠的平均肿瘤重量的统计结果；control为对照组，DDP为顺铂组，Rabd-B为细锥香茶菜乙素组)：对照组的平均肿瘤体积从28.02±9.63mm3增加到1368.61±323.07mm3，细锥香茶菜乙素组的平均肿瘤体积从31.92±17.96mm3增加到564.44±115.84mm3，顺铂组的平均肿瘤体积从34.65±23.60mm3增加到595.54±141.33mm3；对照组的平均肿瘤重量为1.011±0.369g，细锥香茶菜乙素组的平均肿瘤重量为0.423±0.174g，顺铂组的平均肿瘤重量为0.376±0.119g。因此，细锥香茶菜乙素和顺铂均可有效抑制肿瘤生长，具有明显肿瘤抑制活性。
3、完成步骤1后，测量各小鼠的体重并按组取平均值。
实验结果见图10(control为对照组，DDP为顺铂组，Rabd-B为细锥香茶菜乙素组)。结果表明，各组小鼠的体重没有显著的减少，各组无显著差异。
4、完成步骤1后，对各小鼠的肝组织、肾组织和肿瘤组织进行HE染色。
实验结果见图11(control为对照组，DDP为顺铂组，Rabd-B为细锥香茶菜乙素组)。结果表明，各组小鼠的肝组织和肾组织均无明显损伤；细锥香茶菜乙素组和顺铂组的肿瘤组织中出现明显的损伤性病理改变，如大空泡化，细胞碎片和坏死巢；对照组的肿瘤组织中弥漫活肿瘤细胞巢，没有看到明显细胞死亡现象。
5、完成步骤1后，按照DeadEndTMFluorometric TUNEL System(Promega公司的产品，产品目录号为G3250)的说明书的步骤对各小鼠的肿瘤组织进行Tunel信号检测。TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记)用于标记DNA被切割的凋亡细胞，是固定组织中的细胞凋亡原位信号。
6、完成步骤1后，对各小鼠的肿瘤组织进行Ki67IHC检测(Ki-67是在增殖细胞中普遍表达的核非组蛋白，与肿瘤细胞增殖和生长密切相关，是一种常用的增殖标志物)。具体步骤如下：取肿瘤组织石蜡切片，常规脱蜡至水，先经0.01mol/L枸橼酸缓冲液微波抗原修复15min；再加入3％(v/v)H2O2水溶液室温孵育10min(目的为消除内源性过氧化氢酶)，加入山羊血清室温封闭30min，然后加入Ki67特异性抗体(Cell Signaling Technology公司的产品，产品目录号为#9027)孵育12h，最后采用通用型二步法检测系统(中杉金桥，PV-9000)识别抗体并进行信号放大，DAB显色。
实验结果见图12(control为对照组，DDP为顺铂组，Rabd-B为细锥香茶菜乙素组，Fluo-12-dUTP为凋亡信号标志，DAPI为细胞核染色，Merge为凋亡信号与细胞核染色叠加合成的信号)。结果表明，对照组中显示出弥漫Ki-67表达，并且无明显tunel信号；细锥香茶菜乙素组和顺铂组中Ki-67几乎不表达，而呈现明显的凋亡信号。

Claims (10)

1.细锥香茶菜乙素在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。
2.细锥香茶菜乙素的应用，为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述食管鳞癌细胞为KYSE30细胞。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述食管鳞癌细胞为KYSE450细胞。
5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述A3)或A4)中，所述细胞周期为G2/M期。
6.一种产品，含有细锥香茶菜乙素；所述产品的功能为如下A1)至A16)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖；A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；A3)影响食管鳞癌细胞周期进程；A4)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；A5)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；A6)诱导食管鳞癌细胞凋亡；A7)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；A8)上调cleaved-caspase-9的表达量；A9)上调cleaved-caspase-3的表达量；A10)上调cleaved-PARP的表达量；A11)抑制细胞存活通路；A12)抑制Akt信号通路；A13)抑制NF-κB信号通路；A14)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长；A15)预防食管鳞癌；A16)治疗食管鳞癌。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于：所述食管鳞癌细胞为KYSE30细胞。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于：所述食管鳞癌细胞为KYSE450细胞。
9.如权利要求6至8任一所述的产品，其特征在于：所述A3)或A4)中，所述细胞周期为G2/M期。
10.如权利要求1、3、4或5所述的应用，或，权利要求6至9任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
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