CN110064046A

CN110064046A - 微肽yy1bm在治疗癌症中的应用

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Publication number: CN110064046A
Application number: CN201910404250.4A
Authority: CN
Inventors: 周翊峰; 张征; 吴思奇; 邓杰琼
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110064046B

Abstract

本发明涉及到微肽YY1BM在治疗癌症中的应用，从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对食管鳞状细胞癌的细胞凋亡的影响，证明了微肽在食管鳞状细胞癌中的重要作用。并且，微肽YY1BM诱导男性食管鳞状细胞癌细胞的凋亡，变化微肽表达量进而阻断YY1与AR的相互作用而抑制eEF2K的转录，继而促进eEF2的活性，从而导致ESCC的凋亡以此达到治疗ESCC的效果。并且，通过微肽YY1BM进行的靶向治疗，上调微肽YY1BM的表达，对男性食管鳞状细胞癌具有临床药用价值。

Description

微肽YY1BM在治疗癌症中的应用

技术领域

本发明涉及一种微肽YY1BM在治疗癌症中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

世界各地的食管鳞状细胞癌(ESCC)在男性中的发病率是女性的2至4倍。以前的研究表明，一些特定于男性的因素导致了这种性别差异，包括吸烟和性激素。2010年的一项调查显示，在中国大约28.1％的成年人现在吸烟，包括52.9％的男性和2.4％的女性。雄激素受体在食管鳞癌中的表达及其与预后的关系。然而目前，男性食管鳞状细胞癌发生的确切分子机制尚不清楚。

长非编码RNA(lncRNAs)被定义为缺乏蛋白质编码潜力的长于200nt的RNA 转录本。IncRNAs作为基因表达的主要调节因子，在包括癌症在内的许多生物功能和疾病中起着重要的作用。然而，到目前为止，还没有关于Y-连锁的lncRNAs 参与癌症的研究。最近的计算和全基因组研究表明，IncRNAs中嵌入了数百种功能性小肽(不到100个氨基酸)。例如，myomixer是由lncRNA编码的一种由 84个氨基酸组成的肌肉特异性肽，它控制肌肉发育过程中肌纤维形成的关键步骤；肌调素被鉴定为一种骨骼肌特异的lncRNA，它通过阻止Ca²⁺摄取到SR来调节肌肉性能。目前尚不清楚小肽是否在肿瘤的发生中起关键作用，尽管最近的一项研究发现了一种由HOXB-AS3lncRNA编码的小肽可以抑制结肠癌的生长。

N6-甲基腺苷(M6A)是真核生物mRNAs和lncRNAs上最丰富的转录后修饰。最近的研究表明，m6A修饰在细胞中是动态的、可逆的，其水平受m6A甲基转移酶和m6A去甲基酶的调节。m6A通过m6A结合蛋白调节基因的表达。这些 m6A相关蛋白在调节m6A修饰的mRNAs和lncRNAs的代谢和功能中起着关键作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种LINC00278编码功能性微肽YY1BM，其在ESCC中充当肿瘤抑制基因，能有效抑制食管鳞状细胞癌细胞。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：微肽YY1BM或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为食管鳞状细胞癌，所述微肽YY1BM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含有微肽YY1BM或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为食管鳞状细胞癌，所述微肽 YY1BM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述食管鳞状细胞癌为男性食管鳞状细胞癌。

进一步地，所述微肽YY1BM是由LINC00278基因所编码。

进一步地，所述LINC00278基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述药物具有以下至少一种功能：

1)降低化学物诱导的食管鳞状细胞癌的发生率；

2)减缓或停止已建立的食管鳞状细胞癌肿瘤灶的生长；

3)减缓或停止已建立的食管鳞状细胞癌肿瘤灶的转移；

4)诱导产生食管鳞状细胞癌特异性并对食管鳞状细胞癌细胞具有杀伤的 CTL细胞。

进一步地，所述微肽YY1BM或其药学上可接受的盐单独作为活性成分，或者，所述微肽YY1BM或其药学上可接受的盐与额外的药物活性化合物联合应用。

进一步地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的辅料。

进一步地，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种。

进一步地，所述药用辅料选自下列之一或其组合：

a)分子量为5000-15000、10000-20000、20000-35000或30000-50000的聚乳酸；

b)分子量为5000-15000、10000-20000、25000-35000或30000-50000的聚乳酸和羟基乙酸的共聚物；

c)乙烯乙酸乙烯酯共聚物；

d)对羧苯基丙烷与癸二酸的共聚物，其中，对羧苯基丙烷∶癸二酸质量比为 10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40；

e)木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白。

进一步地，所述药物可制成多种剂型，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备。

所述药物制剂的给药剂量可根据根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明的有益效果在于：本发明从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对食管鳞状细胞癌的细胞凋亡的影响，证明了微肽在食管鳞状细胞癌中的重要作用。鉴于微肽YY1BM诱导男性食管鳞状细胞癌细胞的凋亡，变化微肽表达量进而阻断YY1与AR的相互作用而抑制eEF2K的转录，继而促进eEF2 的活性，从而导致ESCC的凋亡以此达到治疗ESCC的效果。并且，通过微肽 YY1BM进行的靶向治疗，上调微肽YY1BM的表达，对男性食管鳞状细胞癌具有临床药用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1A至图1D为本发明实施例一中微肽YY1BM对小鼠移植瘤生长的影响的实验数据图及示意图，具体的：

图1A：野生型ESCC细胞和YY1BM敲除ESCC细胞的生长情况(平均±SD， n＝5，*P<0.05)；

图1B和1C：分别为野生型ESCC细胞和YY1BM敲除ESCC细胞在 LINC00278基因敲除后的生长状况(平均±SD，n＝5，*P<0.05)；

图1D：YY1BM敲除ESCC细胞在YY1BM(YY1BM-FLAG)和LINCOO278 重新导入后的生长状况(平均±SD，n＝5，*P<0.05)。

图2A至图2D为本发明实施例二中微肽YY1BM对组织样本增殖与凋亡的影响的实验数据图及示意图，具体的：

图2A：活化caspase-3和eEF2K在LINC00278OE、YY1BM-KO和各自对照的ESCC细胞移植瘤中的表达；

图2B：TUNEL染色在LINC00278OE、YY1BM-KO及相应对照ESCC细胞移植瘤中的表达；

图2C：eEF2K和活化caspase-3在男性食管鳞状细胞癌标本中的表达及 YY1BM在eEF2K和活化caspase-3强、弱标本中的相对表达水平；

图2D：不同浓度YY1BM和svYY1BM处理TE-1和KYSE-30细胞后不同时间点的细胞增殖分析(平均±SD，n＝5，*P<0.05)。

图3为本发明实施例三中LINC00278对男性ESCC患者生存期的影响以及微肽YY1BM对小鼠移植瘤的预后治疗影响的实验数据图及示意图，具体的：

图3A：在苏州队列(281，发现集)和广州队列(288，验证集)，LINC00278 高或低表达的男性ESCC患者的Kaplan-Meier总生存曲线；

图3B：在苏州队列(281，发现集)和广州队列(288，验证集)，存在LINC00278 不同表达和吸烟史的男性ESCC患者的Kaplan-Meier总生存曲线；

图3C：TE-1或KYSE-30细胞皮下移植和瘤内直接注射400μg/ml YY1BM 或svYY1BM的异种移植小鼠的生存数据以及400μg/ml YY1BM或svYY1BM 直接瘤内注射的异种移植瘤中caspase-3和eEF2K的免疫组化染色。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

针对目前对男性食管鳞状细胞癌治疗手段有限的情况，发明人从翻译水平lncRNA所编码的微肽的角度，研究探索微肽YY1BM对男性食管鳞状细胞癌的治疗价值。本发明首先鉴定了编码微肽YY1BM的长非编码RNA LINC00278，其编码框为ORF1。接着验证了微肽在男性ESCC中表达下调。吸烟可通过消除 m6A的修饰而下调该微肽在食管鳞癌中的表达。微肽特异性地与YY1结合，阻断YY1与AR的相互作用，抑制eEF2K的转录，继而促进eEF2的活性，从而导致ESCC的凋亡。总之，实验发现在男性食管鳞状细胞癌中，微肽YY1BM 通过诱导ESCC的凋亡来达到治疗的效果。

在一些实施例中，可采用含有微肽YY1BM或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物可任选地还包含一种或多种额外的药物活性化合物。

本发明的药用辅料可经酶、酸碱或组织液水解或降解。所述的药用辅料选自生物可容性的高分子多聚物、高分子多聚物的混合物或共聚物中的任一种或多种。具体地，所述药用辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种，例如：

c)乙烯乙酸乙烯酯共聚物；

d)对羧苯基丙烷与癸二酸的共聚物，其中，对羧苯基丙烷∶癸二酸质量比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40；

本发明的药物组合物可以用于制备治疗人及动物的各种抗肿瘤药物，具体为抗胰腺癌药物。

本发明的药物可制成多种药物制剂，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备，如，但不限于，(i)把载体支持物粉末与药物混合然后压制成植入剂，即所谓的混合法；(ii)把载体支持物熔化，与待包装的药物相混合，然后固体冷却，即所谓的熔融法；(iii)把载体支持物溶解于溶剂中，把待包装的药物溶解或分散于聚合物溶液中，然后蒸发溶剂，乾燥，即所谓的溶解法；(iv)喷雾干燥法；及(v)冷冻干燥法等。其中溶解法可用于微球的制造，抗癌药物组合物也可包装脂质体中。

本发明的药物可经各种途径给药，如经脉、动脉、皮下、肌肉、皮内、腔内、瘤内、瘤周等。给药途径取决于多种因素，为于肿瘤所在部位获有效浓度，药物可经其它多种途径给予，如选择性地动脉灌注，腔内灌注(intracavitary)，腹腔(intraperitoneal)或胸腔(intrapleural)及椎管内给药。

所述抗肿瘤药物的给药剂量可根据具体给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

以下实施例，如未特别说明，所采用的实验方法均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。6～8周龄雄性裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心(中国上海)。所有细胞系均购自Procell生命科技有限公司。这些细胞系均经DNA指纹图谱分析，传代不到6个月。DMEM、 RPMI-1640和胎牛血清(FBS)购自Invitgen公司。Eca-109、TE-1、KYSE-30细胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长，Het-1A、293T细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长。所有细胞株均在含青霉素/链霉素的培养基中生长，温度37℃，空气湿度为5％CO₂。

实施例一微肽YY1BM对小鼠移植瘤生长的影响

请参见图1A至图1D，实验用小鼠ESCC异种移植模型测定了YY1BM基因敲除对肿瘤生长的影响。

CRISPR/Cas9系统建立YY1BM基因敲除的ESCC细胞系：发明人利用 CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，在两个ESCC细胞株TE-1和KYSE-30中剔除了YY1BM。通过一系列筛选获得了两株独立的YY1BM基因敲除细胞株(TE-1KO和KYSE-30KO)。序列分析表明，两种细胞系均含有ATG密码子突变，从而破坏了YY1BM ORF的翻译。用qRT-PCR和多聚体谱qPCR分别检测敲除细胞系中LINC00278的转录和YY1BM的翻译。YY1BM-敲除细胞系的翻译水平降低，而LINC00278的转录水平在YY1BM-敲除细胞系中没有明显变化。进而表明，YY1BM基因敲除细胞在不影响LINC00278转录的情况下，有效地降低了YY1BM的翻译。

如图1A所示，实验测试了40天左右YY1BM敲除的ESCC细胞与野生型 ESCC细胞(WT-ESCC，图中标示为WT)的生长对比情况，结果表明YY1BM 基因敲除的ESCC细胞的肿瘤生长明显高于野生型ESCC细胞。如图1B和1C 所示，为了研究LINC00278的转录本在ESCC肿瘤生长中的作用，发明人在野生型和YY1BM基因敲除的ESCC细胞中敲除了LINC000278，实验结果表明 LINC00278基因敲除促进野生型ESCC细胞的生长，但对YY1BM基因敲除的 ESCC细胞没有促进作用。实验进一步表明，将全长 -LINC00278(Full-LINC00278-FLAG)或YY1BM(YY1BM-FLAG)导入YY1BM-敲除基因可以逆转肿瘤的生长。此外，如图1D所示，发明人还发现将YY1BM(YY1BM-FLAG)重新导入LINC00278-敲除细胞中可以逆转肿瘤的生长。重新导入全长LINC00278显示出比YY1BM更强的抑制肿瘤生长的作用。且，实验检测到用Full-LINC00278-FLAG比YY1BM-FLAG表达更高的YY1BM肽。即YY1BM对食管鳞癌的生长有明显的促进作用，而LINC00278的非翻译区则增强了YY1BM对食管鳞状细胞癌生长的影响。

实施例二微肽YY1BM对组织样本增殖与凋亡的影响

请参见图2A至图2D，本实施例研究了微肽YY1BM对组织样本增殖与凋亡的影响。本实施例具体实验操作运用免疫组织化学试剂盒以及TUNEL试剂盒。图2A所示，发明人为探究活化caspase-3和eEF2K在LINC00278OE、YY1BM-KO 和各自对照的ESCC细胞移植瘤中的表达。利用免疫组织化学试剂盒对组织细胞样本进行分析，结果表明YY1BM基因敲除的ESCC细胞的显示出eEF2K的高表达和活化caspase-3的低表达。图2B所示，发明人利用TUNEL试剂盒探究分析TUNEL染色在LINC00278高表达(OE)、YY1BM-KO和相应对照ESCC 细胞移植瘤。结果表明YY1BM基因敲除的ESCC细胞显示出低水平细胞凋亡。此外，发明人将50例食管鳞状细胞癌组织中eEF2K和活化caspase-3的表达与 YY1BM的表达的分析。如图2C所示上部：男性食管鳞状细胞癌eEF2K免疫组织化学染色及eEF2K强、弱标本中YY1BM的相对水平。下部：男性食管鳞状细胞癌组织中活化caspase-3的免疫组织化学染色及活化caspase-3强、弱标本中YY1BM的相对表达水平。结果表明：YY1BM的表达与eEF2K的表达呈负相关，与活化caspase3的表达呈正相关。如图2D所示，发明人利用不同浓度YY1BM (200μg/ml和400μg/ml)和svYY1BM(200μg/ml和400μg/ml)处理TE-1 和KYSE-30细胞后不同时间点的细胞增殖分析。结果表明YY1BM对ESCC细胞具有细胞毒作用，影响其细胞增殖。

实施例三LINC00278对男性ESCC患者生存期的影响以及微肽YY1BM 对小鼠移植瘤的预后治疗影响

请参见图3A至图3C，本实施例研究了LINC00278对男性ESCC患者生存期的影响以及微肽YY1BM对小鼠移植瘤的预后治疗影响。

发明人利用食管鳞癌组织中LINC00278的中位表达水平，将食管鳞癌患者分为两组：在苏州队列(发现组，281例)和广州中心队列(验证组，288例) 中LINC00278高表达(相对表达水平>中位表达水平)和低表达(相对表达水平≤中位表达水平)患者。应用log-rank检验和KaplanMeier生存曲线，发明人发现在发现集(中位生存时间为29月vs36月，log秩P＝0.0004，危险率(HR)＝1.848) 和验证集(mst：27月vs39月，log秩P<0.0001，HR＝1.850)。如图3A结果表明，低表达LINC00278患者的OS显著低于高表达LINC00278患者。此外，发明人为确定LINC00278的表达和吸烟在ESCC中起协同作用。如图3B所示，发明人发现低表达LINC00278和当前吸烟者的患者在发现集(mst：28月vs40 月，log秩P<0.0001，HR＝2.818)和验证集(mst：25月vs41月，log秩P<0.0001， HR＝2.613)中的OS都最差。

并且，为探讨YY1BM的体内抗肿瘤作用，发明人将YY1BM(400μg/ml) 瘤内注射于雄性裸鼠移植瘤中，并对其生存时间进行了分析。图3C所示，TE-1 或KYSE-30细胞皮下移植和瘤内直接注射400μg/ml YY1BM或svYY1BM的异种移植雄性小鼠的生存数据以及400μg/mlYY1BM或svYY1BM直接瘤内注射的异种移植瘤中caspase-3和eEF2K的免疫组化染色情况。实验结果表明YY1BM 注射液能显著提高雄性小鼠的存活率，但不能提高雌性小鼠的存活率。此外，IHC 分析显示，雄性小鼠的凋亡率较高，eEF2K的表达较低，而雌性小鼠的凋亡率较低，提示YY1BM瘤内注射可下调eEF2K的表达，诱导细胞凋亡，最终提高雄性小鼠的存活率。

综上所述：本发明从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对食管鳞状细胞癌的细胞凋亡的影响，证明了微肽在食管鳞状细胞癌中的重要作用。鉴于微肽YY1BM诱导男性食管鳞状细胞癌细胞的凋亡，变化微肽表达量进而阻断YY1与AR的相互作用而抑制eEF2K的转录，继而促进eEF2的活性，从而导致ESCC的凋亡以此达到治疗ESCC的效果。并且，通过微肽YY1BM进行的靶向治疗，上调微肽YY1BM的表达，对男性食管鳞状细胞癌具有临床药用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 微肽YY1BM在治疗癌症中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 微肽(YY1BM)

<400> 1

Met Leu Ser Gly Gln Leu Gln Pro Glu Gly Arg Ser Ala Leu Pro Gln

1 5 10 15

Pro Gly Ala Ala Leu

20

<210> 2

<211> 66

<212> RNA

<213> 基因(LINC00278)

<400> 2

augcuaucag gacaacuuca acccgagggg agaucagcuc ucccgcaacc uggugccgcu 60

cucuga 66

Claims

1.微肽YY1BM或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为食管鳞状细胞癌，所述微肽YY1BM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有微肽YY1BM或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为食管鳞状细胞癌，所述微肽YY1BM的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述食管鳞状细胞癌为男性食管鳞状细胞癌。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微肽YY1BM是由LINC00278基因所编码。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LINC00278基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一种功能：

1)降低化学物诱导的食管鳞状细胞癌的发生率；

2)减缓或停止已建立的食管鳞状细胞癌肿瘤灶的生长；

3)减缓或停止已建立的食管鳞状细胞癌肿瘤灶的转移；

4)诱导产生食管鳞状细胞癌特异性并对食管鳞状细胞癌细胞具有杀伤的CTL细胞。

7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微肽YY1BM或其药学上可接受的盐单独作为活性成分，或者，所述微肽YY1BM或其药学上可接受的盐与额外的药物活性化合物联合应用。

8.如权利要求2所述的含有微肽YY1BM或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有药学上可接受的辅料。

9.如权利要求8所述的含有微肽YY1BM或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种。