CN110215511B - 微肽asrps在治疗癌症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种微肽ASRPS在治疗癌症中的应用，从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对三阴性乳腺癌血管生成的影响，证明了微肽在三阴性乳腺癌中的重要作用。微肽ASRPS影响三阴性乳腺癌血管的生成，通过变化微肽表达量进而影响信号转导与活化转录因子3(STAT3)的活化，从而影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达，进而影响三阴性乳腺癌的血管生成能力。通过体内和体外实验证明，微肽ASRPS通过STAT3‑VEGF通路明显抑制乳腺癌血管的生成，对三阴性乳腺癌的治疗具有临床药用价值。

Description

微肽ASRPS在治疗癌症中的应用

技术领域

本发明涉及一种微肽ASRPS在治疗癌症中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内，乳腺癌占所有癌症发病率的10％，女性恶性肿瘤发病率的25-30％，女性相关肿瘤死亡率的15％。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型，占所有乳腺癌的15％。TNBC对雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的表达呈阴性，缺乏HER2扩增或过表达。三阴性乳腺癌与其他乳腺癌相比，具有发病年纪轻、恶性程度高、易复发转移、生存率低等特点，加上三阴性乳腺癌缺少内分泌治疗和靶向治疗的靶点，所以三阴性乳腺癌成为了乳腺癌治疗领域中的难题之一。

信号转导与活化转录因子3(STAT3)是信号传导活化转录因子家族的重要成员，在细胞中起到传递信号和启动基因转录的双重作用。许多研究已经证明组成型STAT3在多种人类肿瘤中激活。有证据表明，异常的STAT3信号通过抑制凋亡，诱导细胞增殖、血管生成、侵袭和转移，诱发炎症和免疫抑制来促进癌症的发生和发展。

长链非编码RNA是指长度超过200nt的RNA分子，其广泛存在于真核生物中，可以在多种层面上(表观遗传调控、转录调控及转录后调控等)调控基因的表达水平。之前人们对于长链非编码RNA的定义就是不编码蛋白的转录本，但是近年来的研究表明，长链非编码RNA上存在许多短的开放阅读框，有可能编码一些微肽，而且这些微肽可能具有某些生理功能。

报道表明，许多lncRNA通过编码和翻译微肽来调节生物途径和过程。例如，LINC00961编码负调节mTORC1激活和肌肉再生的SPAR肽；LncRNA HOXB-AS3编码53-aa肽，抑制结肠癌的生长；LncRNA-Six1编码一个7.26kDa的微肽，激活Six1基因以促进细胞增殖和肌肉生长；肌肉调节蛋白是由骨骼肌特异性LncRNA编码的骨骼肌生理调节因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种LINC00908编码功能性微肽ASRPS，其在TNBC中抑制肿瘤血管生成，进而能有效抑制乳腺癌细胞。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：微肽ASRPS或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为三阴性乳腺癌，所述微肽ASRPS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含有微肽ASRPS或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为三阴性乳腺癌，所述微肽ASPRS的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步地，所述微肽ASRPS是由LINC00908基因所编码。

进一步地，所述LINC00908基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述药物具有以下至少一种功能：

1)降低化学物诱导的三阴性乳腺癌的发生率；

2)减缓或停止已建立的三阴性乳腺癌肿瘤灶的生长；

3)减缓或停止已建立的三阴性乳腺癌肿瘤灶的转移；

4)诱导产生三阴性乳腺癌特异性并对三阴性乳腺癌细胞具有杀伤的CTL细胞。

进一步地，所述微肽ASRPS或其药学上可接受的盐单独作为活性成分，或者，所述微肽ASRPS或其药学上可接受的盐与额外的药物活性化合物联合应用。

进一步地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的辅料。

进一步地，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与癸二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种。

进一步地，所述药用辅料选自下列之一或其组合：

a)分子量为5000-15000、10000-20000、20000-35000或30000-50000的聚乳酸；

b)分子量为5000-15000、10000-20000、25000-35000或30000-50000的聚乳酸和羟基乙酸的共聚物；

c)乙烯乙酸乙烯酯共聚物；

d)对羧苯基丙烷与癸二酸的共聚物，其中，对羧苯基丙烷∶癸二酸质量比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40；

e)木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白。

进一步地，所述药物可制成多种剂型，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备。

所述药物制剂的给药剂量可根据根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明的有益效果在于：本发明从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对三阴性乳腺癌血管生成的影响，证明了微肽在三阴性乳腺癌中的重要作用。鉴于微肽ASRPS影响三阴性乳腺癌血管的生成，通过变化微肽表达量进而影响信号转导与活化转录因子3(STAT3)的活化，从而影响VEGF的表达，进而影响三阴性乳腺癌的血管生成能力。通过体内和体外实验证明，微肽ASRPS通过STAT3-VEGF通路明显抑制乳腺癌血管的生成，对三阴性乳腺癌的治疗具有临床药用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1A至图1D为本发明实施例一中微肽ASRPS基因敲除(ASRPS-KO)促进TNBC肿瘤生长的实验数据图及示意图，具体的：

图1A：ASRPS-KO能促进异种移植小鼠肿瘤的生长(平均±SD，n＝5，*P<0.05)。

图1B：LINC00908敲除WT-TNBC细胞可促进裸鼠移植瘤的生长(平均±SD，n＝5，*P<0.05)。

图1C：LINC00908敲除ASRPS-KO TNBC细胞不能促进异种移植小鼠肿瘤的生长(平均±SD，n＝5，*P>0.05)。

图1D：ASRPS-KO可促进异种移植小鼠肿瘤生长，但ASRPS过表达和全长LINC00908-TNBC细胞均不能促进异种移植小鼠肿瘤的生长(平均±SD，n＝5，*P<0.05)。

图2A至图2D为本发明实施例二中微肽ASRPS抑制肿瘤血管生成的实验数据图及示意图，具体的：

图2A：人脐静脉内皮细胞发芽试验。用MDA-MB-231条件培养液刺激胶原中的球体(平均±SD，n＝3，*P<0.05)。

图2B：上图：Matrigel Plug体内试验。将Matrigel与条件培养液和HUVECs混合，皮下注射；下图：通过苏木精-伊红染色浸润宿主细胞，对Matrigel塞内血管形成的组织学评价的代表性图像。

图2C：将ASRPS-OE、ASRPS-KO及相应对照的MDA-MB-231细胞接种于裸鼠皮下。肿瘤发生后，进行肿瘤的固定和切片。切片用抗CD31抗体免疫组化染色(平均±SD，n＝3，*P<0.05)。

图2D：上图：人TNBC组织的免疫组织化学。下图：Western blot检测ASRPS的表达。

图3为本发明实施例三中微肽ASRPS抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌血管生成的实验数据图及示意图，具体的：

图3A：用抗CD31抗体对MMTV-PyMT小鼠原位肿瘤进行免疫组化染色(平均±SD，n＝3，*P<0.05)。

图3B：MMTV-PyMT小鼠经乳腺脂肪垫注射ASRPS或svASRPS，肿瘤用抗CD31抗体免疫组化染色(平均±SD，n＝3，*P<0.05)。

图4为本发明实施例四中微肽ASRPS对TNBC患者生存期的影响以及微肽ASRPS对小鼠移植瘤的预后治疗影响的实验数据图及示意图，具体的：

图4A：在苏州队列(112，发现集)和广州队列(105，验证集)中ASRPS高表达或低表达的TNBC患者的Kaplan-Meier总生存曲线。

图4B：用MDA-MB-231细胞、ASRPS和svASRPS移植裸鼠的Kaplan-Meier生存曲线(横坐标表示小鼠乳腺脂肪垫注射细胞后的时间，每组小鼠10只)。

图4C：用ASRPS或svASRPS经乳腺脂肪垫注射裸鼠，原位肿瘤用抗CD31抗体免疫组化染色(平均±SD，n＝3，*P<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

针对目前对三阴性乳腺癌治疗手段有限的情况，发明人从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对三阴性乳腺癌血管生成的影响，证明了微肽在三阴性乳腺癌中的重要作用。微肽ASRPS影响三阴性乳腺癌血管的生成，发明人从翻译水平lncRNA所编码的微肽的角度，研究探索微肽ASRPS对三阴性乳腺癌的治疗价值。本发明首先鉴定了编码微肽ASRPS的长非编码RNA LINC00908。接着通过变化微肽表达量进而影响信号转导与活化转录因子3(STAT3)的活化，从而影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达，进而影响三阴性乳腺癌的血管生成能力。总之，本发明发现微肽ASRPS通过STAT3-VEGF通路明显抑制乳腺癌血管的生成，对三阴性乳腺癌的治疗具有临床药用价值。

在一些实施例中，可采用含有微肽ASRPS或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物可任选地还包含一种或多种额外的药物活性化合物。

本发明的药用辅料可经酶、酸碱或组织液水解或降解。所述的药用辅料选自生物可容性的高分子多聚物、高分子多聚物的混合物或共聚物中的任一种或多种。具体地，所述药用辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与癸二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种，例如：

a)分子量为5000-15000、10000-20000、20000-35000或30000-50000的聚乳酸；

b)分子量为5000-15000、10000-20000、25000-35000或30000-50000的聚乳酸和羟基乙酸的共聚物；

c)乙烯乙酸乙烯酯共聚物；

d)对羧苯基丙烷与癸二酸的共聚物，其中，对羧苯基丙烷∶癸二酸质量比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40；

e)木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白。

本发明的药物组合物可以用于制备治疗人及动物的各种抗肿瘤药物，具体为抗三阴性乳腺癌药物。

本发明的药物可制成多种药物制剂，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备，如，但不限于，(i)把载体支持物粉末与药物混合然后压制成植入剂，即所谓的混合法；(ii)把载体支持物熔化，与待包装的药物相混合，然后固体冷却，即所谓的熔融法；(iii)把载体支持物溶解于溶剂中，把待包装的药物溶解或分散于聚合物溶液中，然后蒸发溶剂，乾燥，即所谓的溶解法；(iv)喷雾干燥法；及(v)冷冻干燥法等。其中溶解法可用于微球的制造，抗癌药物组合物也可包装脂质体中。

本发明的药物可经各种途径给药，如经脉、动脉、皮下、肌肉、皮内、腔内、瘤内、瘤周等。给药途径取决于多种因素，为于肿瘤所在部位获有效浓度，药物可经其它多种途径给予，如选择性地动脉灌注，腔内灌注，腹腔或胸腔及椎管内给药。

所述抗肿瘤药物的给药剂量可根据具体给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

以下实施例，如未特别说明，所采用的实验方法均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。6～8周龄雌性裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心(中国上海)。所有细胞系均购自Procell生命科技有限公司。这些细胞系均经DNA指纹图谱分析，传代不到6个月。所有细胞株均在含青霉素/链霉素的培养基中生长，温度37℃，空气湿度为5％CO₂。

实施例一ASRPS基因敲除促进TNBC肿瘤生长

请参见图1A至图1D，实验用小鼠TNBC异种移植模型测定了ASRPS基因敲除对肿瘤生长的影响。

发明人用小鼠TNBC异种移植模型研究ASRPS基因敲除对肿瘤生长的影响。肿瘤体积线图显示，ASRPS基因敲除的TNBC细胞的肿瘤生长明显高于野生型TNBC细胞(图1A)。为了研究LINC00908的转录本在TNBC肿瘤生长中的作用，我们在野生型和ASRPS基因敲除的TNBC细胞中敲除了LINC00908。我们发现LINC00908基因敲除促进野生型TNBC细胞的生长，但对ASRPS基因敲除的TNBC细胞没有促进作用(图1B和图1C)。

此外，我们发现在ASRPS基因敲除中重新引入全长LINC00908或ASRPS都能逆转肿瘤的生长(图1D)。结果表明，ASRPS对TNBC肿瘤的生长有明显的促进作用，而LINC00908的非翻译区则无此作用。

实施例二 微肽ASRPS抑制肿瘤血管生成

请参见图2A至图2D，微肽ASRPS抑制肿瘤血管生成。

发明人将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养在由MDA-MB-231细胞和Hs578T细胞制备的条件培养基中，经ASRPS过表达和敲除处理。利用基于三维球体的体外血管生成实验，过表达的ASRPS使HUVECs产生的芽比对照短，与WT相比，敲除ASRPS强烈促进了芽的生长(图2A)。接下来，我们在体内进行了Matrigel塞式血管生成试验。当基质凝胶与ASRPS过表达细胞培养液混合时，基质凝胶塞呈浅白色，而剔除ASRPS组则呈鲜红色，HE结果显示ASRPS越多，血管越多(图2B)。接下来，发明人用小鼠异种移植模型确定ASRPS过表达和基因敲除对肿瘤血管生成的影响。发明人发现敲除的ASRPS显示明显的血管内皮细胞标记物CD31的表达，过表达的ASRPS产生少量的微血管(图2C)。此外，根据ASRPS的表达水平，我们将人TNBC组织分为高、中、低三组。ASRPS高表达与CD31低表达相关，低ASRPS组CD31高表达(图2D)。

实施例三 微肽ASRPS抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌血管生成

请参见图3A至图3B，微肽ASRPS对MMTV-PyMT小鼠乳腺癌血管生成的作用。

为了深入了解ASRPS对乳腺癌血管生成的影响，发明人将ASRPS应用于与MMTV-PyMT小鼠交配的186B/6小鼠，产生MMTV-PyMT；ASRPS+/+小鼠。抗CD31免疫组化染色显示MMTV-PyMT、ASRPS+/+小鼠肿瘤血管募集减少(图3A)。此外，为了研究外源性ASRPS治疗对血管生成的影响，我们将ASRPS注射到MMTV-PyMT小鼠的乳腺垫内，证明了ASRPS能显著抑制原发肿瘤的血管生成(图3B)。总之，微肽ASRPS在MMTV-PyMT小鼠模型中具有重要的抗血管生成作用。

实施例四 微肽ASRPS对TNBC患者生存期的影响以及微肽ASRPS对小鼠移植瘤的预后治疗影响

请参见图4A至图4C，本实施例研究微肽ASRPS对TNBC患者生存期的影响以及微肽ASRPS对小鼠移植瘤的预后治疗影响。

发明人为探讨微肽ASRPS的表达是否与TNBC患者的总生存期(OS)有关，发明人将TNBC患者分为两组：在苏州队列(发现集，112例)和广州中心队列(验证集，105例)中ASRPS高表达(相对表达水平>中位表达水平)和ASRPS低表达(相对表达水平≤中位表达水平)患者。应用log-rank检验和KaplanMeier生存曲线，发明人发现在发现集(中位生存时间(mst)为：28月vs 46月，log秩P＝0.018，危险率(HR)＝2.579)和验证集(mst：26月vs 42月，log秩P＝0.025，HR＝2.465)低表达ASRPS的患者的OS显著低于高表达ASRPS的患者。因此，下调的ASRPS水平与TNBC患者的不良预后相关(图4A)

并且，为探讨ASRPS的体内抗肿瘤作用，首先裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞。当肿瘤达到约100mm³时，小鼠静脉注射ASRPS和svASRPS。与对照组对比，注射微肽ASRPS的小鼠存活率增加(图4B)。此外，用抗CD31抗体对原发性肿瘤进行免疫组织化学染色，结果显示ASRPS明显抑制肿瘤血管生成(图4C)。这些结果表明，微肽ASRPS能有效抑制三阴性乳腺癌血管生成，从而提高整体生存率。

综上所述：本发明从翻译水平lncRNA编码的微肽角度，研究微肽对三阴性乳腺癌血管生成的影响，证明了微肽在三阴性乳腺癌中的重要作用。鉴于微肽ASRPS影响三阴性乳腺癌血管的生成，通过变化微肽表达量进而影响信号转导与活化转录因子3(STAT3)的活化，从而影响VEGF的表达，进而影响三阴性乳腺癌的血管生成能力。通过体内和体外实验证明，微肽ASRPS通过STAT3-VEGF通路明显抑制乳腺癌血管的生成，对三阴性乳腺癌的治疗具有临床药用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 微肽ASRPS在治疗癌症中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 微肽(ASRPS)

<400> 1

Met Thr Thr Lys Met Arg Arg Leu Arg Pro Ser Ala Pro Ser Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gln Glu Gln Glu Ala Glu Val Val Glu Gly Cys Phe Pro Ala Val

20 25 30

Thr Glu Thr Pro Phe Ala Pro Ala Tyr Ile Lys Lys Arg Gly Gly Arg

35 40 45

Ile Trp Ser Ser Asp Pro Arg Ser Asp Gly Glu His

50 55 60

<210> 2

<211> 183

<212> RNA

<213> 基因(LINC00908)

<400> 2

augacuacua agaugaggag gcucaggccu agugcuccua gcgggcuugg ucaagagcag 60

gaggcggagg ugguggaagg cuguuucccu gcggugacag aaacuccauu ugcaccagcu 120

uacauuaaaa aaagaggagg gagaauaugg ucgagugacc ccaggaguga uggggagcac 180

uga 183

Claims (7)

1.微肽ASRPS在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为三阴性乳腺癌，所述微肽ASRPS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有微肽ASRPS的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为三阴性乳腺癌，所述微肽ASRPS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微肽ASRPS是由如SEQ ID NO.2所示序列的LINC00908基因所编码。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一种功能：

1)减缓已建立的三阴性乳腺癌肿瘤灶的生长；

2)减缓已建立的三阴性乳腺癌肿瘤灶的转移。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微肽ASRPS作为唯一活性成分，或者，所述微肽ASRPS与额外的药物活性化合物联合应用。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与癸二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种。

Images