CN113842466B

CN113842466B - 一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用

Info

Publication number: CN113842466B
Application number: CN202111272451.7A
Authority: CN
Inventors: 江龙光; 周阳; 黄明东; 雪光浦; 李翰林; 陈丹; 袁彩
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN113842466A

Abstract

本发明提供一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用，属于医药技术领域。萘莫司他与递送载体mATF‑HSA结合形成大分子复合物mATF‑HSA:NM，该复合物能够显著抑制乳腺癌细胞的生长和增殖，诱导乳腺癌细胞的调亡，抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，提高了萘莫司他对乳腺癌的疗效，可应用于乳腺癌的防治方面。另外，进一步研究发现萘莫司他通过抑制尿激酶这一丝氨酸蛋白酶从而达到了抑制乳腺癌的增值和转移。本发明不仅提供了萘莫司他的一种新应用，为萘莫司他的应用提供了新的领域，而且还提供了萘莫司他抑制乳腺癌增值和转移的机理，为乳腺癌的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径。

Description

一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用。

背景技术

萘莫司他（Nafamostat，NM）是一种成熟的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂，其结构式为：

该药物已被证明是弥散性血管内凝血，全身性炎症反应和胰腺炎的有效治疗药物。据报道萘莫司他还通过抑制核因子κB（NF-κB）活化在实验性胰腺癌模型中产生有效结果。由于萘莫司他已经被批准作为治疗药物并且其安全性已经确定为高剂量，因此其在一些癌症类型中的抗癌活性在与化疗或其他抗癌联合时可产生有益效果。在具有高相关死亡率的胰腺癌中，体外评估了萘莫司他与吉西他滨或奥沙利铂的组合的协同作用，然而，尚未有专利报道萘莫司他在乳腺癌中的治疗作用。

尿激酶（uPA）是一种细胞外的丝氨酸蛋白水解酶，血浆中的生理浓度约为 2 ng/ml，其半衰期为3-5 min。尿激酶参与了许多生理和病理过程，如纤维蛋白块的降解、炎症细胞的迁移、创伤的愈合、受精过程、血管外血肿的消散、肿瘤细胞的侵袭和转移等。目前关于尿激酶的研究主要集中在血栓溶解和肿瘤转移两个方面。一些肿瘤细胞能够合成并分泌尿激酶激活细胞周围的纤溶酶原来降解肿瘤细胞的胞外基质和基底膜，肿瘤细胞因失去固定而进行迁移，导致肿瘤细胞的侵袭和转移，形成恶性肿瘤。研究表明，尿激酶及其受体（uPAR）是抗癌药物的一个有效靶点，抑制uPA/uPAR的相互作用能够抑制肿瘤的侵袭和转移。因此尿激酶的研究对于癌症的临床预后和抗癌转移具有重要的意义。

乳腺癌是一种复杂且异质性的恶性疾病，在全世界范围内导致女性癌症相关死亡的主要部分。其中三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌的10-20％。与其他类型的乳腺癌相比，这种类型的癌症在性质上具有高度侵袭性，并且导致转移性病例的比例较高。不幸的是，因为尚未确定TNBC的经验证的分子靶标，即使是目前标准的化学治疗方案通常也会受到短期反应和抵抗有效性的限制。因此，TNBC 的划时代治疗的发展代表了提高乳腺癌患者总体存活率的最大挑战之一。根据最近的研究，涉及化学治疗药物和新型靶向药物（如血管生成和表皮生长因子受体抑制剂）的联合治疗方法可能是一种有益的策略。此外，了解癌症侵袭和转移的机制以及控制转移的药物的开发可能会降低 TNBC 相关的死亡率。

在本发明中，通过药物载体与萘莫司他形成大分子复合物的方式，来提高萘莫司他靶向肿瘤的能力以及防止其被水解。我们采用重组蛋白mATF-HSA作为萘莫司他的药物载体，在大量的药物载体中，人血清白蛋白（HSA）是一种理想的药物载体，其在人体血液中大量存在，是一种天然的药物载体，这就避免了非天然药物载体所造成的生物相容性差的问题。尿激酶是尿激酶受体的天然配体，它们之间有非常强的结合力（解离常数在nM数量级以下），ATF结构域是尿激酶中主要与受体结合的区域，对尿激酶与尿激酶受体的结合起到主导的作用。由于肿瘤细胞会过量表达尿激酶受体，所以，可以利用ATF特异性结合到肿瘤部位的尿激酶受体，起到对肿瘤的靶向作用。另外，我们对萘莫司他进行的负载是通过非共价的结合方式，这就避免了萘莫司他结构的改变所造成的药物代谢和药物疗效方面的不确定性。该发明通过制备mATF-HSA:NM这一大分子复合物来提高NM对三阴性乳腺癌的治疗效果，为三阴性乳腺癌的药物研发提供一个新思路。

发明内容

本发明提供一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用。制备mATF-HSA:NM这一分子包裹萘莫司他的大分子复合物，验证mATF-HSA:NM对三阴性乳腺癌的增殖和转移的抑制作用，提供萘莫司他的一种新应用，即在治疗乳腺癌方面的治疗应用。提供了萘莫司他在制备治疗乳腺癌的药物方面的应用，并利用递送载体mATF-HSA提高该药物在治疗乳腺癌上的药用价值。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM，以mATF-HSA为递送载体，萘莫司他埋在mATF-HSA的HSA内部，mATF-HSA与萘莫司他结合形成大分子复合物mATF-HSA:NM。

上述分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM利用分子包裹方法进行制备，包括以下步骤：

（1）将mATF-HSA目的基因片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）连接至pPICZαA载体上构建获得pPICZα-mATF-HSA重组质粒，pPICZα-mATF-HSA重组质粒转入毕赤酵母菌株X-33构建毕赤酵母基因工程菌X-33，甲醇诱导毕赤酵母基因工程菌X-33表达重组蛋白mATF-HSA，纯化获得重组蛋白mATF-HSA（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）；

（2）将mATF-HSA在20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH8.0溶液中搅拌扩散，按1:5~1:50的摩尔比例逐滴滴加萘莫司他，在4℃冰箱内搅拌12~48小时；

（3）反应结束后用10 kDa截留率的透析袋在PBS溶液中对上述产物进行搅拌透析，达到除去未结合的萘莫司他，并用PBS替换mATF-HSA原始Tris-HCl溶液的目的；

（4）步骤（3）的透析产物mATF-HSA:NM，用10 kDa截留率的超滤浓缩管在3500 rpm条件下进行浓缩；

（5）通过测定荧光变化检测mATF-HSA与萘莫司他成功结合。

一种包含上述分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM的在制备预防和/或治疗乳腺癌药物中的应用。

上述应用中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

上述应用中大分子复合物mATF-HSA:NM通过抑制尿激酶介导三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。所述乳腺癌细胞包括人源三阴性乳腺癌MDA-MB231、鼠源三阴性乳腺癌4T1。

一种包含上述分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM的预防和/或治疗乳腺癌的药物。所述药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、注射剂。

通过体外和体内实验验证mATF-HSA:NM抗三阴性乳腺癌的有效性：

（1）在体外通过细胞毒性实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验发现mATF-HSA:NM大大提高了萘莫司他对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用；

（2）通过建立原位4T1三阴性乳腺癌小鼠模型发现mATF-HSA:NM改善了萘莫司他在体内抗三阴性乳腺癌增殖和转移作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明为萘莫司他的一种新应用，即应用于治疗三阴性乳腺癌，通过与mATF-HSA结合形成大分子复合物，能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞的生长和转移，对三阴性乳腺癌具有显著的疗效，可用于三阴性乳腺癌的治疗方面。不同于传统的纳米包裹技术，分子包裹方法制备的mATF-HSA:NM特征在于：（1）萘莫司他埋在HSA内部，形成1：1的非共价大分子复合物化学计量；（2）HSA维持其原生构象；（3）免疫反应很低。而传统的纳米包裹技术中，HSA一定程度上存在变性并且与纳米颗粒交织在一起。分子包裹方法将萘莫司他非共价加载到mATF-HSA中，形成分子复合物而不是纳米颗粒。本发明不仅为三阴性乳腺癌的治疗提供了一种新的治疗药物，还为萘莫司他的应用提供了新的应用领域。

附图说明：

图1为萘莫司他对尿激酶酶活性的浓度依赖性抑制及半数抑制浓度IC₅₀。

图2为外源补加尿激酶并在萘莫司他作用下对尿激酶敲低表达MDA-MB231细胞的（A, B）迁移和侵袭的影响。A和 B为迁移；C和D为侵袭。

图3为mATF-HSA:NM的制备与表征。A：mATF-HSA蛋白的SDS-PAGE电泳胶图；B：分子包裹方法制备mATF-HSA:NM的流程示意图；C：以 250nm 作为激发扫描mATF-HSA:NM；D：HSA:NM 在250 nm-800 nm 发射波长荧光；E：mATF:NM在250 nm-800 nm 发射波长荧光。

图4为萘莫司他及mATF-HSA:NM对一系列细胞的毒性作用。

图5为萘莫司他及mATF-HSA:NM对4T1和MDA-MB231细胞迁移的影响。A和 B：4T1；C和D：MDA-MB231。

图6为萘莫司他及mATF-HSA:NM对三阴性乳腺癌细胞侵袭的影响。A：4T1和MDA-MB231细胞向底部含有血清一侧侵袭图；B：4T1细胞的侵袭程度；C：MDA-MB231细胞的侵袭程度。

图7为萘莫司他及mATF-HSA:NM在体内对三阴性乳腺癌增殖和转移的影响。A：肿瘤外观图；B：肿瘤体积增长图；C：肿瘤接种，给药及解剖时间进度图；D：肿瘤重量统计图；E：肺重量统计图；F：小鼠体重变化图；G：肿瘤和肺组织H＆E染色切片图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围不局限于实施例表述的范围。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 萘莫司他对尿激酶酶活性的浓度依赖性抑制及半数抑制浓度（IC₅₀）

实验方法：

尿激酶的活性测定采用发色底物法（Chromogenic assay）。在100 μL反应体系中（20 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl，0.1% BSA）,将5 nM人源尿激酶与不同浓度(100nM ~ 0.005080526 nM，3倍梯度稀释)的萘莫司他预先孵育15分钟，然后加入80 μM发光底物S2444（Chromogenix）,混匀后立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处检测吸光度，30 s/read 检测30分钟。每个测试至少重复3次。对测得的数据使用软件中的非线性回归（sigmoidal）进行不同化合物IC₅₀的拟合。

实验结果及结论：如附图1所示，萘莫司他对尿激酶的抑制作用极强，两者之间的结合非常牢固，IC₅₀达到了纳摩尔级别（IC₅₀= 5 ± 1.8 nM）。

实施例2 萘莫司他通过抑制尿激酶介导TNBC转移

实验方法：

1、划痕愈合实验

将敲低尿激酶表达的MDA-MB231细胞（MDA-MB231 shuPA，本实验室通过慢病毒感染制备，制备方法参考该文献：Zhou, Y., Chen, D., Xue, G., Yu, S., Yuan, C.,Huang, M., & Jiang, L. Improved therapeutic efficacy of quercetin-loadedpolymeric nanoparticles on triple-negative breast cancer by inhibiting uPA.RSC Advances, 2020, 10(57), 34517–34526. doi:10.1039/d0ra04231e），以5×10⁵个细胞/孔的密度接种在12孔板中。在约24小时观察到细胞完全汇合后用白色移液管尖端刮擦汇合的单层细胞，并用PBS多次洗涤以除去漂浮的细胞。接着分别用50 μM萘莫司他（NM），100 nM尿激酶（uPA）以及两者的组合（50 μM NM+100 nM uPA）处理后，拍摄不同时间点（0小时，12小时和24小时）的细胞迁移图像。图像中间光滑区域表示使用Image J的 MRI伤口愈合工具确定的无细胞区域，结果代表三个独立的实验。

2、Transwell侵袭实验

将100 μL稀释50倍浓度0.2-0.3 mg/mL BD Matrigel涂覆在Corning室的上室，置于37 ℃恒温箱中5小时。将100 μL含5×10⁴个敲低尿激酶表达的MDA-MB231（MDA-MB231shuPA）细胞通过无FBS（胎牛血清）的DMEM培养基接种到上室中，再分别用50 μM 萘莫司他、100 nM 尿激酶以及两者的组合处理后，将500 μL含10％ FBS的完全培养基置于24孔板下室中，将细胞在二氧化碳细胞培养箱（37℃，5％ CO₂）中孵育24小时。然后，用棉签除去残留在膜上侧的细胞，将迁移或侵入膜下侧的细胞在甲醇中固定15分钟，待结存挥发干后用结晶紫染色15分钟，在显微镜下拍摄侵袭到膜下侧的细胞。最后用33％乙酸/水（V/V）洗脱结晶紫，通过酶标仪测定570 nm处的吸光度计算侵袭率。

实验结果及结论：

尿激酶的关键功能之一是促进肿瘤转移。有研究表明敲除尿激酶可抑制癌细胞的侵袭和转移。为了评估尿激酶敲低对三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响，我们使用尿激酶敲低表达的MDA-MB231细胞（MDA-MB231 shuPA）通过外源添加尿激酶进行了划痕愈合实验和Transwell侵袭实验。实验结果如附图2所示，与未给药对照组相比，与尿激酶共培养的MDA-MB231 shuPA细胞的迁移和侵袭能力明显提高。与50 μM萘莫司他孵育后，与对照组相比，仍具有30％尿激酶表达的MDA-MB231 shuPA细胞的迁移和侵袭能力显著降低。但是，当与萘莫司他和尿激酶共培养后，其迁移和侵袭能力略有恢复。以上实验结果表明，RNAi敲低尿激酶表达可在一定程度上抑制MDA-MB231细胞的迁移和侵袭。外源补充尿激酶可以恢复尿激酶敲低细胞（MDA-MB231 shuPA）的迁移和侵袭，然后补加萘莫司他可再次抑制尿激酶敲低细胞的迁移和侵袭。结合实施例1中萘莫司他对尿激酶的极强抑制结果，得出结论，萘莫司他通过抑制尿激酶介导三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

实施例3 mATF-HSA:NM大分子复合物的制备

1、基因工程表达重组蛋白mATF-HSA

将mATF-HSA目的基因片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）连接至pPICZαA载体上，构建获得pPICZα-mATF-HSA重组质粒，pPICZα-mATF-HSA重组质粒转入毕赤酵母菌株X-33构建毕赤酵母基因工程菌X-33，甲醇诱导毕赤酵母基因工程菌X-33表达重组蛋白mATF-HSA，镍柱纯化获得重组蛋白mATF-HSA（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。

mATF-HSA的大量表达与纯化：

将转入目的基因mATF-HSA的毕赤酵母基因工程菌X-33进行培养，并通过补加体积百分数为1%的甲醇诱导菌株表达重组蛋白mATF-HSA，诱导五天后进行纯化。纯化过程大致如下：经过离心抽滤后的上清液逐滴加入用平衡液（500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH7.4）预先平衡好的Ni-NTA层析柱，上清液滴加完毕后，此时大部分mATF-HSA均结合在了镍柱上，用平衡液（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）再次滴加冲洗镍柱，然后滴加除杂液（5 mM咪唑，500mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）进一步除去结合在镍柱上的杂蛋白，最后用洗脱液（500 mM咪唑，500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）将目的蛋白mATF-HSA洗脱下来，用考马斯亮蓝来确定蛋白是否完全洗脱下来，分管收集洗脱液，通过SDS-PAGE进行鉴定。

2、制备mATF-HSA:NM大分子复合物

采用自行开发的稀释、孵育、纯化三步法（DIP方法）来制备mATF-HSA：NM这一大分子复合物。将含有3 μM mATF-HSA的150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH8.0溶液搅拌扩散，然后在搅拌条件下按摩尔比1：5 ~ 1：50的比例逐滴加入萘莫司他（15 μM），接着用锡箔纸完全包住，在避光条件下4℃搅拌结合12小时。反应结束后用10 kDa的透析袋在PBS溶液中对上述产物进行搅拌透析，达到除去未结合的萘莫司他以及用PBS替换mATF-HSA:NM原始Tris-HCl溶液的目的，步骤（3）的透析产物mATF-HSA:NM用10 kDa的超滤浓缩管在3500 rpm条件下进行浓缩。

实验结果及结论：

如附图3A和3B所示，在本发明中我们通过DIP方法制备mATF-HSA:NM这一大分子复合物，作为嵌入药物分子的方法，DIP方法不同于Nab技术，DIP法形成的mATF-HSA:NM具有以下特征：（1）萘莫司他埋在HSA内部，形成1：1的非共价大分子复合物化学计量；（2）HSA维持其原生构象；（3）免疫反应可能很低。而Nab技术中，HSA一定程度上在变性并且与纳米颗粒交织在一起。DIP方法将萘莫司他非共价加载到mATF-HSA中，形成分子复合物而不是纳米颗粒，主要包括三个步骤：稀释，孵育和纯化。通过稀释保证mATF-HSA处于单体状态，与萘莫司他长时间孵育使两者有充分的时间进行结合，最后通过透析除去未结合的萘莫司他，应该强调的是，mATF-HSA：NM是一种单一的大分子，大小约为7.5 nm，具有明确的组成。它在4℃或冻干后至少一个月也是稳定的。除了大小，大分子ATF-HSA载体与Nab之间的另一个关键差异是HSA的折叠，当ATF-HSA保持天然三维结构时，Nab纳米颗粒中的HSA具有不同程度的变性。使用天然HSA分子有三个优点：（1）与变性HSA相比，天然HSA可以被肿瘤摄取更高的量。由于酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC）在一些肿瘤中过表达，可以与天然HSA结合，但不与变性的HSA结合。（2）天然HSA可能比变性的HSA更慢地从血液循环中清除。（3）mATF-HSA:NM中的HSA具有天然构象，可能具有较低的抗原性和更好的组织相容性。

实施例4 mATF-HSA:NM大分子复合物的表征

实验方法：

为了论证萘莫司他是否与mATF-HSA发生了结合作用，通过紫外荧光实验来进行证明。首先使用96孔透明板通过酶标仪扫描不同浓度（1 mM，200 μM，50 μM）的萘莫司他在200-1000 nm波长范围内的吸收，发现均在250 nm处有最大吸收，然后我们以250 nm作为激发波长，使用96孔黑板扫描制备的mATF-HSA:NM、单独萘莫司他及与mATF-HSA孵育15分钟后250-800 nm的荧光发射光谱，通过对发射光谱进行比较确定mATF-HSA是否与萘莫司他结合。即若mATF-HSA与萘莫司他发生结合，则测得的萘莫司他的荧光强度较单独的萘莫司他会大大增强，以此来判断两者通过DIP制备方法是否成功结合形成mATF-HSA:NM大分子复合物。

实验结果及结论：

如附图3C所示，以250 nm作为激发扫描250-800 nm发射波长荧光，测mATF-HSA：NM较单独萘莫司他的荧光变化。mATF-HSA（8 μM）+萘莫司他（40 μM）组mATF-HSA:NM复合物大分子在490 nm处的荧光强度较单独的萘莫司他大大增强，并且单纯的mATF-HSA作为对照在490 nm处没有发射峰。以上结果初步证明mATF-HSA与萘莫司他结合形成mATF-HSA：NM这一大分子复合物。为了进一步验证萘莫司他是与mATF-HSA中mATF部分结合还是与HSA部分结合，又分别测定了HSA：NM以及mATF：NM相较于单独萘莫司他的荧光变化，如附图3D和3E所示，不同浓度（3 μM、8 μM的HSA；15 μM、40 μM的NM）的HSA：NM在490 nm处的荧光较单独的萘莫司他大大增强，而mATF:NM在490nm处的荧光较单独的萘莫司他却没有明显的变化，所以得出结论：mATF-HSA与萘莫司他结合形成大分子复合物，并且结合部位在HSA上。

实施例5 mATF-HSA：NM特异性杀伤三阴性乳腺癌细胞

实验方法：

将细胞接种到96孔板（10,000个细胞/孔）中，24小时后，根据浓度梯度（0、1、2.5、5、10、20μM）分别用萘莫司他、mATF-HSA:NM、mATF-HSA处理乳腺癌细胞或人正常胚肺成纤维细胞HELF。在37℃，5% CO₂ 细胞培养箱中培养24小时后，吸出96孔板中的培养基并用PBS洗涤。然后向每个孔中加入100 μL MTT。4小时后，吸出96孔板中的MTT溶液，向各孔中加入100μL DMSO溶液。在振荡器上孵育30分钟后，用酶标仪在490 nm处测量吸光度，对测得的数据使用软件进行图像处理。

实验结果及结论：

为了确定萘莫司他及mATF-HSA：NM对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用，首先用不同的乳腺癌细胞系进行细胞毒性实验，包括人ER阳性MCF-7细胞，小鼠三阴性4T1细胞和人三阴性MDA-MB231细胞，并且将人胚肺成纤维细胞（HELF）用作对照细胞系。结果如附图4所示，mATF-HSA：NM对4T1和MDA-MB231这两种三阴性乳腺癌表现出浓度依赖性的杀伤作用，对MCF-7及正常细胞HELF毒性较弱，而单独萘莫司他对这四种细胞毒性相较于mATF-HSA:NM均大大降低，且mATF-HSA基本上没有毒性作用，以上结果说明mATF-HSA:NM这一大分子复合物大大提高了萘莫司他特异性杀伤三阴性乳腺癌的效果。另外高浓度萘莫司他对4T1和MDA-MB231的毒性作用也大大强于HELF和MCF-7，这说明萘莫司他在不杀伤正常细胞的情况下能特异性识别并杀伤三阴性乳腺癌细胞，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。

实施例6 mATF-HSA:NM增强萘莫司他抑制TNBC迁移能力

实验方法：

利用划痕愈合实验评估mATF-HSA:NM对三阴性乳腺癌细胞迁移的影响。实验方法与实施例2中的（1）相似。

实验结果及结论：

除了不受控制的生长之外，恶性肿瘤还能够侵入周围的正常组织，然后通过淋巴或循环系统扩散到全身。为了研究mATF-HSA：NM及萘莫司他对细胞迁移的影响，我们用移液管尖端刮擦汇合的细胞层，并分别用不同浓度的mATF-HSA：NM（1、5μM）或萘莫司他（10、50、100μM）处理指定的时间（0、12、24h）。结果如附图5所示，随着作用时间的增加，4T1(图5A和图5B)和MDA-MB231（图5C和图5D）细胞划痕逐渐缩小，但是伴随给药浓度的升高，划痕间距离缩短的幅度大大降低。但是5 μM mATF-HSA:NM处理后细胞的迁移程度远远低于20 μM 萘莫司他。以上实验结果说明萘莫司他能够抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移，并且随着萘莫司他浓度和作用时间的延长，其作用愈加明显，并且mATF-HSA:NM大大增强了萘莫司他抑制三阴性乳腺癌细胞迁移的能力。

实施例7 mATF-HSA：NM增强萘莫司他抑制TNBC侵袭能力

实验方法：

通过Transwell侵袭实验评估mATF-HSA:NM对三阴性乳腺癌细胞侵袭的影响。实验方法与实施例2中的（2）相似。

实验结果及结论：

为了进一步研究mATF-HSA：NM是否也增强了萘莫司他抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭的能力，我们用4T1和MDA-MB231细胞进行了Transwell侵袭实验。结果如附图6所示，4T1和MDA-MB231细胞向底部含有血清一侧侵袭的细胞数均呈剂量依赖性下降，5 μM mATF-HSA：NM处理后细胞的侵袭程度与20 μM 萘莫司他相似，mATF-HSA:NM的抗侵袭能力相较于萘莫司他提高了4倍，且mATF-HSA基本上没有抗侵袭能力。以上结果说明mATF-HSA:NM大大增强了萘莫司他抑制TNBC侵袭的能力。

实施例8 mATF-HSA：NM在体内具有良好抗三阴性乳腺癌增殖和转移的作用

实验方法：

建立了原位4T1乳腺肿瘤模型，以评估mATF-HSA:NM在体内的抗增殖和抗转移功效。将4T1乳腺癌细胞（4ｘ10⁶个）接种到雌性Balb/c小鼠（重约20 g）第四乳腺下的脂肪垫中。当肿瘤体积达到 50-100 mm³时，将小鼠随机分为3组（n = 6）。对小鼠分别使用200 μl生理盐水、萘莫司他、mATF-HSA:NM经过尾静脉注射给药，给药剂量及给药时间点如附图7C所示，并每天记录肿瘤大小和小鼠体重。在种瘤后19天处死小鼠，立即解剖取出肿瘤和肺并进行称重，之后，将肿瘤和肺用福尔马林固定，包埋在石蜡中，切成 5 毫米的切片，并用 H&E 染色以进行进一步的组织学分析。动物的方案和处理是按照护理指南进行的福州大学实验动物使用经福州大学动物伦理委员会批准。

实验结果及结论：

比较了mATF-HSA:NM及萘莫司他在体内对三阴性乳腺癌4T1增殖和转移的抑制作用。与生理盐水对照组相比，mATF-HSA:NM 和萘莫司他均显著抑制了肿瘤的增长，解剖时肿瘤重量显著降低，且mATF-HSA:NM 相较于萘莫司他具有更好的抗肿瘤增殖效果（附图7A,B&D）。肿瘤和肺组织切片的H&E染色结果显示，生理盐水处理的对照组肿瘤生长良好，而mATF-HSA:NM 和萘莫司他治疗组的肿瘤则显示出不同程度的坏死和凋亡（附图7G）。在对照组小鼠的所有肺中均可见明显的转移灶，而经萘莫司他治疗的小鼠转移灶大大减少，在mATF-HSA:NM治疗的小鼠中未观察到转移灶，并且解剖取出的肺的重量也显示，经过mATF-HSA:NM 和萘莫司他的治疗，这两组小鼠的肺相较于对照组有轻微的变轻，这说明对照组小鼠的肺具有大量的肺转移结节，致使小鼠的肺重量增加（附图7E）。以上结果表明mATF-HSA:NM增强了萘莫司他在体内的抗三阴性乳腺癌效果，具有良好的抗增殖和抗转移作用，这与体外结果一致。此外，还发现实验动物的体重没有显着下降，表明mATF-HSA:NM 和萘莫司他对小鼠没有严重的毒副作用（附图7F）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种分子包裹萘莫司他及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

aaaagaggca gtgtacttgg agctcctgat gaatcaaact gtggctgtca gaacggaggt 60

gtatgcgtgt cctacaagta cttctccaga attcgccgat gcagctgccc aaggaaattc 120

cagggggagc actgtgagat agatgcatca aaaacctgct atcatggaaa tggtgactct 180

taccgaggaa aggccaacac tgataccaaa ggtcggccct gcctggcctg gaatgcgcct 240

gctgtccttc agaaacccta caatgcccac agacctgatg ctattagcct aggcctgggg 300

aaacacaatt actgcaggaa ccctgacaac cagaagcgac cctggtgcta tgtgcagatt 360

ggcctaaggc agtttgtcca agaatgcatg gtgcatgact gctctcttgt cgacggtggt 420

ggtggtgatg cacacaagag tgaggttgct catcggttta aagatttggg agaagaaaat 480

ttcaaagcct tggtgttgat tgcctttgct cagtatcttc agcagtgtcc atttgaagat 540

catgtaaaat tagtgaatga agtaactgaa tttgcaaaaa catgtgttgc tgatgagtca 600

gctgaaaatt gtgacaaatc acttcatacc ctttttggag acaaattatg cacagttgca 660

actcttcgtg aaacctatgg tgaaatggct gactgctgtg caaaacaaga acctgagaga 720

aatgaatgct tcttgcaaca caaagatgac aacccaaacc tcccccgatt ggtgagacca 780

gaggttgatg tgatgtgcac tgcttttcat gacaatgaag agacattttt gaaaaaatac 840

ttatatgaaa ttgccagaag acatccttac ttttatgccc cggaactcct tttctttgct 900

aaaaggtata aagctgcttt tacagaatgt tgccaagctg ctgataaagc tgcctgcctg 960

ttgccaaagc tcgatgaact tcgggatgaa gggaaggctt cgtctgccaa acagagactc 1020

aagtgtgcca gtctccaaaa atttggagaa agagctttca aagcatgggc agtagctcgc 1080

ctgagccaga gatttcccaa agctgagttt gcagaagttt ccaagttagt gacagatctt 1140

accaaagtcc acacggaatg ctgccatgga gatctgcttg aatgtgctga tgacagggcg 1200

gaccttgcca agtatatctg tgaaaatcaa gattcgatct ccagtaaact gaaggaatgc 1260

tgtgaaaaac ctctgttgga aaaatcccac tgcattgccg aagtggaaaa tgatgagatg 1320

cctgctgact tgccttcatt agctgctgat tttgttgaaa gtaaggatgt ttgcaaaaac 1380

tatgctgagg caaaggatgt cttcctgggc atgtttttgt atgaatatgc aagaaggcat 1440

cctgattact ctgtcgtgct gctgctgaga cttgccaaga catatgaaac cactctagag 1500

aagtgctgtg ccgctgcaga tcctcatgaa tgctatgcca aagtgttcga tgaatttaaa 1560

cctcttgtgg aagagcctca gaatttaatc aaacaaaatt gtgagctttt tgagcagctt 1620

ggagagtaca aattccagaa tgcgctatta gttcgttaca ccaagaaagt accccaagtg 1680

tcaactccaa ctcttgtaga ggtctcaaga aacctaggaa aagtgggcag caaatgttgt 1740

aaacatcctg aagcaaaaag aatgccctgt gcagaagact atctatccgt ggtcctgaac 1800

cagttatgtg tgttgcatga gaaaacgcca gtaagtgaca gagtcaccaa atgctgcaca 1860

gaatccttgg tgaacaggcg accatgcttt tcagctctgg aagtcgatga aacatacgtt 1920

cccaaagagt ttaatgctga aacattcacc ttccatgcag atatatgcac actttctgag 1980

aaggagagac aaatcaagaa acaaactgca cttgttgagc tcgtgaaaca caagcccaag 2040

gcaacaaaag agcaactgaa agctgttatg gatgatttcg cagcttttgt agagaagtgc 2100

tgcaaggctg acgataagga gacctgcttt gccgaggagg gtaaaaaact tgttgctgca 2160

agtcaagctg ccttaggctt a 2181

<210> 2

<211> 727

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

Lys Arg Gly Ser Val Leu Gly Ala Pro Asp Glu Ser Asn Cys Gly Cys

1 5 10 15

Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Ser Tyr Lys Tyr Phe Ser Arg Ile Arg

20 25 30

Arg Cys Ser Cys Pro Arg Lys Phe Gln Gly Glu His Cys Glu Ile Asp

35 40 45

Ala Ser Lys Thr Cys Tyr His Gly Asn Gly Asp Ser Tyr Arg Gly Lys

50 55 60

Ala Asn Thr Asp Thr Lys Gly Arg Pro Cys Leu Ala Trp Asn Ala Pro

65 70 75 80

Ala Val Leu Gln Lys Pro Tyr Asn Ala His Arg Pro Asp Ala Ile Ser

85 90 95

Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Gln Lys

100 105 110

Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Ile Gly Leu Arg Gln Phe Val Gln Glu

115 120 125

Cys Met Val His Asp Cys Ser Leu Val Asp Gly Gly Gly Gly Asp Ala

130 135 140

His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn

145 150 155 160

Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys

165 170 175

Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala

180 185 190

Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu

195 200 205

His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu

210 215 220

Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg

225 230 235 240

Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg

245 250 255

Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn

260 265 270

Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His

275 280 285

Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys

290 295 300

Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu

305 310 315 320

Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala

325 330 335

Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

340 345 350

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala

355 360 365

Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His

370 375 380

Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala

385 390 395 400

Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys

405 410 415

Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile

420 425 430

Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala

435 440 445

Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala

450 455 460

Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His

465 470 475 480

Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu

485 490 495

Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr

500 505 510

Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn

515 520 525

Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys

530 535 540

Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val

545 550 555 560

Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly

565 570 575

Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

580 585 590

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys

595 600 605

Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val

610 615 620

Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val

625 630 635 640

Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys

645 650 655

Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val

660 665 670

Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala

675 680 685

Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp

690 695 700

Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala

705 710 715 720

Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

725

Claims

1.一种分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM，其特征在于：以mATF-HSA为递送载体，萘莫司他埋在mATF-HSA的HSA内部，mATF-HSA与萘莫司他结合形成大分子复合物mATF-HSA:NM；

其制备方法为利用分子包裹方法进行制备，包括以下步骤：

（1）将mATF-HSA目的基因片段连接至pPICZαA载体上构建获得pPICZα-mATF-HSA重组质粒，pPICZα-mATF-HSA重组质粒转入毕赤酵母菌株X-33构建毕赤酵母基因工程菌X-33，甲醇诱导毕赤酵母基因工程菌X-33表达重组蛋白mATF-HSA，纯化获得重组蛋白mATF-HSA；

（2）将mATF-HSA在20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH8.0溶液中搅拌扩散，按1:5~1:50的摩尔比例逐滴滴加萘莫司他，在4℃冰箱内搅拌12~48小时；

（5）通过测定荧光变化检测mATF-HSA与萘莫司他成功结合；

所述mATF-HSA目的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述重组蛋白mATF-HSA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述mATF源于尿激酶。

2.一种权利要求1所述分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM在制备预防和/或治疗乳腺癌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述大分子复合物mATF-HSA:NM通过抑制尿激酶介导三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述三阴性乳腺癌细胞选自人源三阴性乳腺癌MDA-MB231、鼠源三阴性乳腺癌4T1。

6.一种包含权利要求1所述分子包裹萘莫司他大分子复合物mATF-HSA:NM的预防和/或治疗乳腺癌的药物。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型选自片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、注射剂。