TW201609793A - 去整合蛋白變異體及其醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

專一性結合至一或多個α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8)，但具有與αIIbβ3之降低結合活性的去整合蛋白變異體；以及該去整合蛋白變異體於治療和預防一與αv整合蛋白或α5β1整合蛋白相關之疾病的用途。

Description

去整合蛋白變異體及其醫藥用途 【優先權聲明】
本申請案依美國專利法35 U.S.C.§ 119(e)主張於2014年8月22日提出申請之美國臨時專利申請案第62/040,503號之權益，該美國臨時專利申請案之全文併於此處以供參考。
本發明係關於去整合蛋白變異體，其係專一性結合至一或多個α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8)但具有與αIIbβ3之降低結合活性，以及該去整合蛋白變異體於治療和預防與αv整合蛋白或α5β1整合蛋白相關之一疾病的用途。
整合蛋白係與鄰近細胞上之膜外基質蛋白或其它黏著受器結合之穿膜受器。整合蛋白之α及β次單元之異二聚物配對(heterodimeric pairing)賦予與一或多基質結合之專一性(Weis等人，2011，Cold Spring Harb Perspect Med；1：a006478)。這個家族的黏著分子在生物學廣泛的領域中扮演一重要的角色，包括發炎、先天性及抗源專一性免疫、恆定、傷口痊癒、組織成形(tissue morphogenesis)、及細胞生長與分化之調控。整合蛋 白之異常調控涉及於很多疾病狀態(從自體免疫至血管栓塞疾病，再到癌症轉移)的致病機轉。業經投入廣大的努力於發現和開發用於臨床應用之整合蛋白拮抗劑。
該等αv整合蛋白係各自具有一αv次單元與一β1、β3、β5、β6或β8次單元配對，其等似乎在有關傷口修復、血管新生、及癌症之組織改造(tissue remodeling)過程中特別地重要(Weis等人，2011，見上文)。該等αv整合蛋白可做為癌症、眼科及骨科之適應症之標靶。整合蛋白αvβ3及αvβ5亦與腫瘤、關節炎、乾癬、及老年性黃斑病變(age-related macular degeneration,AMD)有關。特別是，αvβ3整合蛋白在調節血管新生及抑制腫瘤轉移中係重要的，且αvβ6整合蛋白在一些癌症中係增量表現的。其它存在於眼角膜中之αv整合蛋白(αvβ5、αvβ6、及αvβ8)係調節轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGFβ)之活化。
整合蛋白α5β1、αvβ3、及αvβ5已被報告其在血管新生的過程中扮演一重要角色且在多種惡性腫瘤中表現，包括(但不限於)黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、結腸癌、及腦瘤(Staunton等人，2006，Adv Immunol.，91：111-57)。這些整合蛋白之腫瘤內表現(intratumoral expression)與腫瘤(例如黑色素瘤、乳癌、及前列腺癌)之發展與轉移相關(Staunton等人，2006，見上文)。其等已被顯示通過多條途徑傳訊且幫助內皮細胞之轉移與增生。在生物體內，其等在腫瘤之新生血管及腫瘤細胞自身上過度表現，此暗示其功能可經由多種機制使腫瘤之發展成為可能。對抗整合蛋白α5β1、αvβ3、及αvβ5之拮抗性抗體及小分子在生物體外和在生物體內已顯 示可抑制血管新生。整合蛋白α5β1、αvβ3、及αvβ5之抑制因子可以抑制通過ERK、Akt、及FAK之傳訊，導致內皮細胞及癌細胞之黏著、轉移、及增生減少。此等拮抗劑亦被發現通過凋亡蛋白酶依賴(caspase-dependent)機制引起細胞凋亡。因此，整合蛋白α5β1、αvβ3、及αvβ5在血管新生之關鍵性角色及與腫瘤發展之關聯使其成為抗癌療法之有吸引力的目標，且這些整合蛋白之許多拮抗劑已於臨床試驗測試。
αvβ3整合蛋白與αIIbβ3整合蛋白享有相同的β3次單元以及數個大分子配體(1igand)，包括血纖維蛋白原(fibrinogen)、纖維連接蛋白(fibronectin)、凝血栓蛋白(thrombospondin)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、及玻璃黏結蛋白(vitronectin)。此等配體皆含有三重組胺基酸序列：精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)。纖維連接蛋白及玻璃黏結蛋白亦為α5β1及其它αv整合蛋白之配體。αIIbβ3整合蛋白係為血小板上之一主要膜蛋白，且在血小板之凝集上扮演一重要的角色。數種αIIbβ3整合蛋白拮抗劑業經開發用於治療患有急性冠心症(acute coronary syndrome,ACS)的病人。然而，因為廣泛地抑制血小板凝集係伴隨出血風險之增加，發展中的研究係著重於減少出血及其它αIIbβ3整合蛋白拮抗劑之副作用。經由阻斷單一整合蛋白或者多重αv整合蛋白設計用於不同適應症之藥物係必須的(Goodman，2012，Tends Pharmacol Sci.2012；33：405-412)。
去整合蛋白係一含RGD之低分子量胜肽家族，其與表現在血小板及其它細胞(包括血管內皮細胞及一些腫瘤細胞)上之整合蛋白(例如αIIbβ3、α5β1、及αvβ3)結合。除了其有效的抗血小板活性外，去整合蛋 白之研究已呈現在心血管疾病之診斷中以及在動脈栓塞、骨質疏鬆、及血管新生相關之腫瘤生長及轉移之治療藥劑之設計中的新用途。馬來亞蝮素(Rhodostomin，Rho)，一種來自馬來亞蝮蛇之毒液之去整合蛋白，業經發現係通過阻斷血小板醣蛋白αIIbβ3以在生物體外及生物體內抑制血小板凝集。亦發現，Rho可與整合蛋白αIIbβ3、α5β1、及αvβ3以高親和力結合且與癌細胞互相作用。舉例而言，Rho被報告其係以劑量依存之方式抑制乳房及前列腺惡性腫瘤細胞對未礦物化及礦物化之骨細胞外基質之黏著性，但其不影響腫瘤細胞之存活力。Rho亦可抑制乳房及前列腺惡性腫瘤細胞之轉移及入侵。
然而，由於馬來亞蝮素係非專一性地與整合蛋白αIIbβ3、α5β1、及αvβ3結合，馬來亞蝮素之醫藥用途可能造成嚴重的副作用，例如因抑制血小板凝集造成出血。因此，在本技術領域中存在對整合蛋白α5β1及αvβ3具選擇性但對αIIbβ3具有降低之結合活性之去整合蛋白變異體的需求。本發明可滿足此一需求。
本發明係關於在一或多個去整合蛋白(例如馬來亞蝮素)之連接子區域、RGD環、及C-端中，具有一或多個突變之去整合蛋白變異體，其具有對αIIbβ3整合蛋白降低之結合活性，因而對血小板凝集造成弱抑制，但卻與一或多個α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8)專一性地結合。
因此，在一總體方面上，本發明係關於一包含選自由以下 所組成之群組之至少一者的去整合蛋白變異體：(a)一突變連接子(mutant linker)，其係包含至少一位在SEQ ID NO：332(SRAGKIC)胺基酸序列之1至5位點上之突變；(b)一突變RGD環(mutant RGD loop)，其係包含選自由SEQ ID NO：329至331所組成之群組之胺基酸序列；以及(c)一突變C-端(mutant C-terminus)，其係包含至少一位在SEQ ID NO：334(PRYH)胺基酸序列之1至4位點上之突變，其中，相較於一不具有選自由該突變連接子、該突變RGD環、以及該突變C-端所組成之群組之至少一者的去整合蛋白，該去整合蛋白變異體具有與αIIbβ3整合蛋白之降低結合活性。較佳地，相較於一不具有選自由該突變連接子、該突變RGD環、以及該突變C-端所組成之群組之至少一者的去整合蛋白，該去整合蛋白變異體亦具有與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白之至少一者之提高結合活性。
根據本發明之實施態樣，該去整合蛋白變異體可以為任何去整合蛋白之變異體，該任何去整合蛋白包括(但不限於)選自由以下所組成之群組之去整合蛋白：馬來亞蝮素(rhodostomin)、白唇竹葉青蛇素(albolabrin)、百步蛇素(applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(basilicin)、矛頭蝮素(batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(bitistatin)、西部亞種響尾蛇素(cereberin)、角響尾蛇素(cerastin)、西部菱背響尾蛇素(crotatroxin)、南美響尾蛇素(duressin)、麗紋龜殼花蛇素(elegantin)、黃綠龜殼花蛇素(flavoredin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(flavostatin)、日本蝮蛇素(halysin)、 西伯利亞蝮蛇毒解離素(halystatin)、巴西蝮素(jararacin)、巴西蝮蛇毒解離素(jarastatin)、馬來亞紅口蝮素(kistrin)、亞馬遜巨蝮素(lachesin)、西部亞種響尾蛇素(lutosin)、黑尾響尾蛇素(molossin)、韓國亞種短尾蝮素(salmosin)、白眉蝮素(saxatilin)、北美侏儒響尾蛇素(tergeminin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(trimestatin)、台灣龜殼花素(trimucrin)、台灣龜殼花去整合蛋白(trimutase)、烏蘇里蝮素(ussuristatin)、及草原響尾蛇素(viridin)。較佳地，該去整合蛋白變異體係具有選自由SEQ ID NO：1至6所組成之群組之胺基酸序列的去整合蛋白之變異體。更佳地，該去整合蛋白係具有SEQ ID NO：1胺基酸序列的馬來亞蝮素之變異體。
在一較佳實施態樣中，該去整合蛋白變異體係包含一突變RGD環，以及該突變連接子及該突變C-端中之至少一者，該突變RGD環係包含至少一位在SEQ ID NO：333(RIPRGDMP)胺基酸序列之1至3、5、7及8位點上之突變。
在本發明之另一較佳實施態樣中，該去整合蛋白變異體係包含一具有選自由SEQ ID NO：306至SEQ ID NO：318所組成之群組之胺基酸序列的突變連接子。
在本發明之又另一較佳實施態樣中，該去整合蛋白係包含一具有選自該由SEQ ID NO：319至SEQ ID NO：328所組成之群組之胺基酸序列的突變C-端。
在本發明之一較佳實施態樣中，該去整合蛋白變異體係包含一突變RGD環，以及一突變連接子及一突變C-端中之至少一者，該突變 RGD環係具有選自由SEQ ID NO：329至331所組成之群組之胺基酸序列，該突變連接子係具有選自由SEQ ID NO：306至SEQ ID NO：318所組成之群組之胺基酸序列，該突變C-端係具有選自由SEQ ID NO：319至SEQ ID NO：328所組成之群組之胺基酸序列。更佳地，該去整合蛋白包含闡述於本文中之突變RGD環、突變連接子、以及突變C-端。
根據本發明之實施態樣，該去整合蛋白變異體係包含選自由SEQ ID NO：7至SEQ ID No：179所組成之群組之胺基酸序列。較佳地，該根據本發明之一實施態樣之去整合蛋白變異體係包含選自由SEQ ID NO：123、124、147、149、及171所組成之群組之胺基酸序列。
較佳地，根據本發明之一實施態樣之去整合蛋白變異體係經修飾，例如用以改善輸送或穩定性。舉例而言，該去整合蛋白變異體係接上聚乙二醇(pegylated)或與一融合伴侶(fusion partner)，例如白蛋白或抗體的可結晶區(Fc)結合(conjugated)。
在另一總體方面上，本發明係關於一編碼(encoding)本發明之去整合蛋白變異體之多核苷酸，其可為一包含實際上可連結至編碼該去整合蛋白變異體之DNA序列的調控序列(例如啟動子)之表現載體(expression vector)。
本發明亦係關於一包含編碼本發明之去整合蛋白變異體之多核苷酸的重組宿主細胞(recombinant host cell)。該宿主細胞可為一原核細胞、一酵母菌細胞、一昆蟲細胞、或一哺乳動物細胞。
本發明更係關於一用以製造本發明之去整合蛋白變異體之方法，包含自根據本發明之一實施態樣之重組宿主細胞中生產該去整合蛋白變異體。
亦提供一包含一本發明之去整合蛋白變異體及一藥學上可接受之載體的醫藥組合物。
在又另一總體方面上，本發明係關於治療在一有需要之個體中與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白之至少一者相關之疾病，較佳為治療與α5β1及αvβ3整合蛋白之至少一者相關之疾病的方法。該方法包含向該個體投予本發明之醫藥組合物。
在本發明之一實施態樣中，該整合蛋白相關之疾病係一選自由以下所組成之群組之血管新生相關的眼部疾病(angiogenesis-related eye disease)：包含老年性黃斑病變(age-related macular degeneration)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、角膜神經血管增生病變(corneal neovascularizing disease)、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變(ischaemia-induced neovascularizing retinopathy)、高度近視(high myopia)、及早熟性視網膜病變(retinopathy of prematurity)。
在本發明之另一實施態樣中，該整合蛋白相關之疾病係一選自由以下所組成之群組之癌症：包含轉移性黑色素瘤、轉移性前列腺癌、轉移性乳癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、及多形性神經膠母細胞瘤。
在另一總體方面上，本發明係關於利用本發明之去整合蛋白變異體製造可治療有需要之個體中與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白中至少一者相關之疾病的藥劑。
上述發明內容及以下實施方式應搭配附圖閱讀以獲得更清楚的理解。應了解，本發明不限於圖式所示之明確實施態樣。
在圖式中：第1圖係說明馬來亞蝮素之相互作用圖：(A)說明馬來亞蝮素之連接子區域、RGD環、及C-端區域之間的相互作用；以及(B)參與在馬來亞蝮素與整合蛋白之間相互作用區域之胺基酸序列，根據本發明之一實施態樣之去整合蛋白變異體，其中可被突變之胺基酸殘基被標示為「X」；第2圖顯示多種試劑對A375人類黑色素瘤細胞遷移所產生的抑制性：(A)野生型Rho、(B)AR-NP，一種根據本發明之一實施態樣之去整合蛋白變異體、及(C)磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)；第3A圖係照片，其顯示與未處理之控制組小鼠相較，以AR-NP蛋白或ARLDDL蛋白處理之C57BL/6小鼠在基質膠(MATRIGELTM plug)中之血管密度降低；第3B圖係一長條圖，其顯示與未處理之控制組小鼠相較，以AR-NP蛋白或ARLDDL蛋白一天處理兩次，5天後之C57BL/6小鼠在基質 膠中之血紅素含量降低；第3C圖係一長條圖，其顯示與未處理之控制組小鼠相較，以AR-NP蛋白或ARLDDL蛋白一天處理一次，服用5天之C57BL/6小鼠在基質膠中之血紅素含量降低；第4A圖係顯示在一早熟性視網膜病變(ROP)老鼠模式中之血管新生，及以AR-NP蛋白處理可減少ROP老鼠之血管新生的照片，箭頭處顯示新血管之血管輪廓(BVPs)；第4B圖係一長條圖，其顯示以AR-NP蛋白處理可減少ROP老鼠的新血管之BVPs；第4C圖係一長條圖，其顯示以AR-NP蛋白處理可減少ROP老鼠的內皮細胞之BVPs；第5圖顯示相較於未處理之控制組，以AR-NP蛋白(0.1μM)處理7天可抑制小鼠主動脈環上的生長：上圖：以20倍放大倍率拍攝之影像；下圖：以100倍放大倍率拍攝之影像；第6圖顯示ARLDDL蛋白(0.1μM & 1μM)及AR-NP蛋白(0.1μM & 1μM)兩者皆可抑制4-T1乳癌細胞之群落產生；第7圖顯示相較於未處理之控制組，AR-NP蛋白或ARLDDL蛋白可抑制RANKL引發之蝕骨細胞生成(RANKL-induced osteoclastogenesis)：AR-NP蛋白(B及C)；ARLDDL蛋白(D)；控制組(A)； 第8圖顯示ARLDDL蛋白(0.1μM)及AR-NP蛋白(0.1μM)兩者皆可明顯地抑制神經膠瘤入侵；第9圖顯示在Wistar大鼠中5mg/kg之AR-NP蛋白對血壓及心跳速率影響並不顯著；第10圖顯示在SCID小鼠中A375黑色素瘤之生長被AR-NP蛋白所抑制，比例尺：1公分；第11圖顯示在K-rasG12D基因轉殖小鼠中腫瘤之生長被AR-NP(KG)蛋白所抑制；以及第12圖顯示在患U87腫瘤小鼠(U87-bearing mice)中腦腫瘤之生長被AR-NP(KG)蛋白所抑制。
在先前技術及整篇說明書中引用或闡述了許多出版品、文章、及專利；此等文獻之全文係各自併於此處以供參考。包括在本發明說明書中之文件、技術、材料、設備、文章或諸如此類之討論係為了提供本發明之內容。此等討論並非承認任意或所有這些材料成為任何所揭露或請求之發明的先前技術。
除非另外定義，此處所用之所有技術及科學術語係具有與本發明所屬技術領域中一般知識者通常所了解之相同意義。否則，此處所用之該等術語具有如本發明書所定之意義。本文所引用之所有專利、已公開專利申請案、及出版品係併於此處以供參考如全文闡述於此。須注意除 非內文另外明確指出，否則本文及後述申請專利範圍所用之單數型式之「一」、「該」係包括複數型式。
如本文所用，「去整合蛋白」意指一類富含半胱胺酸之蛋白質，其係整合蛋白之有效的可溶性配體，且參與調控許多過程，例如細胞-細胞以及細胞-細胞外基質黏著、轉移及入侵、細胞週期進程、許多後生動物生長過程中之分化及細胞型式特化、細胞死亡及凋亡。胺基酸主體之RGD(精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸)在大多數單體去整合蛋白中係保守的，且位在彎曲環(整合蛋白結合環)之尖端上，其藉由雙硫鍵而穩定並自多胜肽鍊之主體上凸出。所有自蛇毒中純化之去整合蛋白皆選擇性地結合至血纖維蛋白原受器或標記血纖維蛋白原受器(例如αv-整合蛋白、α5β1整合蛋白、及整合蛋白αIIbβ3)，與其結合將會導致血纖維蛋白原依賴之血小板(fibrinogen-dependent platelet)凝集及其他由此等血纖維蛋白原受器所調節之生物活性被抑制。在本發明中有用的去整合蛋白之例子包括(但不限於)：馬來亞蝮素、黃綠竹葉青素(triflavin)、鋸鱗蝰素(echistatin)、台灣龜殼花素、麗紋龜殼花蛇素、赤尾鮐素(trigramin)、百步蛇素。可用於本發明之去整合蛋白之例示性胜肽序列係提供於SEQ ID NO：1至6。
如本文所用，「去整合蛋白變異體」意指經設計、功能性活化之蛋白質、或其多胜肽或任意衍生物，其係包含自野生型去整合蛋白衍生或修飾或突變之胺基酸序列。相較於自然存在之去整合蛋白，去整合蛋白變異體係含有一或多個突變。該一或多個突變可以是對自然存在之去整合蛋白取代(substitution)、刪除(deletion)、或插入(insertion)一或多個胺基酸。在一實施態樣中，相較於不具有該一或多個突變之自然存在之去整合蛋白，去整合蛋白變異體對αIIbβ3整合蛋白具有較低的結合活性。更佳地，一去整合蛋白變異體係與去整合蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、 αvβ8之一或多者及整合蛋白α5β1專一性地結合。最佳地，相較於自然存在之不具有該一或多個突變之去整合蛋白，該去整合蛋白變異體具有與變異體αvβ3及變異體α5β1之一或二者之較高的結合活性。
在某些實施態樣中，去整合蛋白變異體係包含一來自毒液之經修飾Rho蛋白，其相較於自然存在之Rho係含有至少一胺基酸之取代、插入或刪除。經修飾之Rho變異體及/或不同之去整合蛋白更包含轉譯後之修飾。
在一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係包含一突變RGD環。於本文中，「突變RGD環」或「突變RGD區域」意指一包含一或多個橫跨去整合蛋白RGD環之胺基酸序列中之突變的胜肽。野生型去整合蛋白之RGD環係包含與整合蛋白結合之RGD殘基。舉例而言，Rho之RGD環係包含SEQ ID NO：333(RIPRGDMP)胺基酸序列。在本發明之較佳實施態樣中，一突變RGD環係包含至少一位在SEQ ID NO：333胺基酸序列1至3、5、7、及8位點上之突變。更佳地，突變RGD環係包含選自由SEQ ID NO：329至331所組成之群組之胺基酸序列。
在另一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係包含突變連接子。於本文中，「突變連接子」或「突變連接子區域」意指一包含一或多個橫跨去整合蛋白連接子區域之胺基酸序列中之突變的胜肽。去整合蛋白之連接子區域係位在緊鄰RGD環之N端。舉例而言，Rho之連接子區域係包含SEQ ID NO：332(SRAGKIC)之胺基酸序列。在本發明之較佳實施態樣中，突變連接子係包含至少一位在SEQ ID NO：332胺基酸序列1至5位點上之突變。更佳地，突變連接子係包含選自由SEQ ID NO：306至SEQ ID NO：318所組成之群組之胺基酸序列。
在又另一實施態樣中，本發明之一去整合蛋白變異體係包含 突變C-端。於本文中，「突變C-端」或「突變C-端區域」意指一包含一或多個在去整合蛋白C-端區域之胺基酸序列中之突變的胜肽。去整合蛋白之C-端區域係位在去整合蛋白的羧基端。舉例而言，Rho之C-端係包含SEQ ID NO：334(PRYH)之胺基酸序列。在本發明之較佳實施態樣中，突變C-端係包含至少一位在SEQ ID NO：334胺基酸序列1至4位點上之突變。更佳地，突變C-端係包含選自由SEQ ID NO：319至SEQ ID NO：328所組成之群組之胺基酸序列。
在較佳實施態樣中，本發明之一去整合蛋白變異體係包含去整合蛋白之突變RGD環，以及去整合蛋白之突變連接子及突變C-端之至少一者。
在更多較佳實施態樣中，本發明之一去整合蛋白變異體係包含如本文所述之去整合蛋白之突變RGD環、突變連接子、以及突變C-端。
本發明之一去整合蛋白變異體可包括自然存在及非自然存在之胺基酸。自然存在之胺基酸之例子包括(但不限於)一般形成胜肽、多胜肽、及蛋白質之20個基本、自然存在之胺基酸之任一者。下表1係表列20個自然存在之胺基酸。
非自然存在之胺基酸係自然產生或者化學合成之非蛋白胺基酸。非自然存在之胺基酸之例子包括(但不限於)β-胺基酸(β3及β2)、同源胺基酸、脯胺酸及丙酮酸之衍生物、三取代丙胺酸衍生物、甘胺酸衍生物、環取代苯丙胺酸及酪胺酸衍生物、線性核心胺基酸、N-甲基胺基酸等。
於本文中，「保守性取代」係指以另一具有相同淨電荷及接近相同大小與形狀之胺基酸對一胺基酸進行取代。當其在側鏈中之碳及雜原子之總數差距不超過約4時，具脂肪族或經取代脂肪族胺基酸側鏈之胺基酸係具有接近相同之大小。當其側鏈之分支數差距不超過1時，其具有 接近相同之形狀。在其側鏈具苯基或經取代苯基之胺基酸被認為係具有大約相同之大小與形狀。下列為五組胺基酸。以另一來自同一組之胺基酸取代一多胜肽中之胺基酸係導致保守性取代：第1組：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、及具有C1-C4脂肪族或C1-C4經羥基取代之脂肪族側鏈(直鏈或單分支)之非自然存在胺基酸；第2組：谷胺酸、天門冬胺酸、及具有經羧酸取代之C1-C4脂肪族側鏈(未分支或一分支點)之非自然存在胺基酸；第3組：賴胺酸、鳥胺酸、精胺酸、及具有經胺或胍基取代之C1-C4脂肪族側鏈(未分支或一分支點)之非自然存在胺基酸；第4組：谷氨醯胺酸、天冬醯胺酸、及具有經醯胺取代之C1-C4脂肪族側鏈(未分支或一分支點)之非自然存在胺基酸；第5組：苯丙胺酸、苯甘胺酸、酪胺酸、及色胺酸。
於本文中，「高度保守性取代」係指以另一在側鏈具有相同官能基且大小與形狀幾乎相同之胺基酸對一胺基酸進行取代。當其在側鏈中之碳及雜原子之總數差距不超過約2時，具脂肪族或經取代脂肪族胺基酸側鏈之胺基酸係具有幾乎相同之大小。當其在側鏈具有相同數目之分支時，其具有幾乎相同之形狀。高度保守性取代之例子包括纈胺酸取代白胺酸、蘇胺酸取代絲胺酸、天門冬胺酸取代谷胺酸、及苯甘胺酸取代苯丙胺酸。
於本文中，術語「分離蛋白(isolated protein)」或「分離多胜肽(isolated polypeptide)」意指經由核酸(包括，特別是，基因體DNA、cDNA、重組DNA、重組RNA、或合成起始點之核酸、或其組合)編碼之蛋白質，其中係(1)無至少某些常見之蛋白質、(2)實質上無來自相同來源，例如來自相同細胞或物種之其它蛋白質、(3)由來自不同物種之細胞所表現、(4)由自然存在於來源細胞所分離之至少50%的多核苷酸、脂質、碳水化合 物或其他材料、(5)與自然狀態下連接「分離蛋白」之全部或部分多胜肽不相連(經由共價或非共價相互作用)、(6)與在自然狀態下不相連之多胜肽協同性連接(經由共價或非共價相互作用)、或(7)在自然狀態下不存在。較佳地，該分離蛋白係本質上不含其他汙染性蛋白質或多胜肽或者在其自然環境發現會干擾其醫藥、診斷、預防或研究之用途的其他汙染物。
於本文中，術語「多核苷酸」、「核苷酸」、「寡核苷酸」、及「核酸」係可交換使用來意指包含DNA、RNA、其衍生物、或其組合之核酸。
於本文中，可交換使用術語「多胜肽」及「蛋白質」來表示由自然存在且非重組細胞、基因改造或重組細胞、或化學合成所產生，且包含具有原生蛋白質之胺基酸序列或在原生序列上刪除、添加、及/或取代一或多個胺基酸的分子之蛋白質。根據本發明，該去整合蛋白特別係涵蓋經修飾Rho蛋白或其片段或其變異體之多胜肽或蛋白質。在某些具體實施態樣中，去整合蛋白係涵蓋抑制整合蛋白活性之Rho蛋白或其片段或其變異體。在某些具體實施態樣中，去整合蛋白係以αv-整合蛋白同功型(例如選自αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及整合蛋白α5β1之任意群組)為標靶。在某些其它具體實施態樣中，整合蛋白不為αIIbβ3。
於本文中，「宿主細胞」係個別細胞或者細胞培養物，該細胞培養物可為或已為任意重組載體或多核苷酸之一接受者。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代，且該子代因自然、偶發、或蓄意之突變及/或改變而不須與原親代細胞完全相同(在型態上或在總DNA補體上)。宿主細胞包括以本發明之重組載體或多核苷酸在生物體外或生物體內轉染(transfect)或感染(infect)之細胞。包含本發明之重組載體之宿主細胞可稱作「重組宿主細胞」。合適之宿主細胞包括原核或真核細胞，包括，舉例而言，細菌、 酵母菌、真菌、植物、昆蟲、及哺乳動物細胞。
於本文中，術語「結合活性」意指去整合蛋白或去整合蛋白變異體與整合蛋白之結合，其導致對整合蛋白活性之抑制、阻斷、中和、降低、消除、或影響之一或多者。在某些實施態樣中，去整合蛋白或去整合蛋白變異體係經由結合至整合蛋白及隔絕整合蛋白而與其它分子(例如其它ECM蛋白)結合來抑制整合蛋白活性。在某些其它實施態樣中，去整合蛋白或去整合蛋白變異體係經由結合至整合蛋白及阻止整合蛋白觸發細胞內下游訊息傳遞活動來抑制整合蛋白活性。
於本文中，術語「抑制」在本文之整合蛋白活性的上下文中，意指去整合蛋白或去整合蛋白變異體之性質，其降低整合蛋白之活性，可經由多種功能性檢測方法，包括但不限於結合分析法、轉移分析法、凋亡分析法、及細胞黏著分析法進行分析。在本發明之某些實施態樣中，整合蛋白係一包括αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8之αv-整合蛋白同功型。在某些其它具體實施態樣中，整合蛋白係α5β1。在某些進一步的實施態樣中，相較於不具有去整合蛋白或去整合蛋白變異體之控制組，去整合蛋白或去整含蛋白變異體可抑制大約0%至100%之整合蛋白活性。
於本文中，術語「選擇性結合」、「選擇性抑制」、「差別性結合」、「差別性抑制」意指對一特定標的整合蛋白分子展現與其它一或多個整合蛋白不同之專一性的去整合蛋白或去整合蛋白變異體之性質。舉例而言，本發明之去整合蛋白變異體係選擇性地結合至整合蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α5β1之一或多者，因此對整合蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α5β1之一或多者係具有較其它整合蛋白(例如αIIbβ3)為高之親和力。在某些實施態樣中，包含經修飾Rho片段之去整合蛋白變異體係選擇性地抑制選自由整合蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及整合蛋白α5β1所組成之 群組之一或多個整合蛋白之活性。在較佳實施態樣中，去整合蛋白變異體係包含專一性抑制整合蛋白αvβ3及整合蛋白α5β1二者、抑制整合蛋白αvβ5及整合蛋白α5β1二者、或抑制整合蛋白αvβ6及整合蛋白α5β1二者之活性之經修飾Rho片段。
術語「同源性」、「同源的」於本文係意指在對應去整合蛋白片段(例如Rho片段)之間，整個序列相似性及/或相同性之程度。高度序列同源性表示保有蛋白質活性。一些公開可取得之演算法或軟體程式係可用於決定序列同源性。決定額外保守性或非保守性胺基酸取代之適當性及序列同源性之程度係在本技術領域之知識者的能力範圍內。
於本文中，「個體」意指任意動物，包括(但不限於)人類及其他靈長目動物、嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、及天竺鼠)、兔類動物(lagomorphs)(例如兔子)、牛屬動物(例如牛)、綿羊(ovine)(例如綿羊(sheep))、山羊(caprine)(例如山羊(goat))、豬(porcine)(例如豬(swine))、馬科動物(例如馬)、犬(例如狗)、貓(feline)(例如貓(cat))、家禽(例如雞、火雞、鴨、鵝、其它鶉雞類鳥等)、及野生的或野生動物，包括(但不限於)動物，例如有蹄動物(例如鹿)、熊、兔類動物、嚙齒動物、鳥等。該術語不傾向被限制於特定年紀或性別。因此，成年及新生個體以及胎兒，無論是雄性或雌性，皆包含於該術語中。「有治療需要」之個體係指經由抑制一或多個整合蛋白活性治療疾病及/或情況，以達到有利之治療及/或預防的結果之個體。有利之結果係包括減緩症狀之嚴重性或延遲症狀之開始、延長壽命及/或更快或更完全消除該疾病或情況。
「藥學上可接受之載體」意指任意習用形式之非毒性固體、半固體或液體填料、稀釋劑、封裝原料、配方助劑、或賦形劑。藥學上可接受之載體係在所利用之劑量及濃度下對接受者呈非毒性且與配方中之其 它成份相容。
於本文中，「藥學上可接受之鹽」意指化合物之衍生物，其中該親代化合物係經由產生其酸或鹼鹽來進行修飾。
於本文中，「與整合蛋白相關之疾病」意指任何需要醫學介入或對其而言醫學介入係合意者之與整合蛋白相關之病況、病症、或症候群。此醫學介入可包括治療、診斷、及/或預防。
於本文中，「有效量」或「足夠量」意指本發明所述去整合蛋白變異體之有效劑量以抑制、預防、或治療特定疾病、病症、病況、或副作用之症狀。
術語「治療」意指降低特定疾病、病症、病況、或副作用之症狀之發生頻率、範圍、嚴重性及/或持續時間。
術語「預防」意指抑制或避免特定疾病、病症、情況、或副作用之症狀。
去整合蛋白變異體
在本發明中已發現多種來自蛇毒之去整合蛋白(例如來自馬來亞蝮蛇之馬來亞蝮素(Rho))之變異體，表現與一或多個αv-整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8中一或多者)及其它整合蛋白(例如α5β1)選擇性結合，及與αIIbβ3之降低的結合活性的不同能力。經由在感興趣之去整合蛋白之連接子區域、RGD環、及C-端之一或多處上突變胺基酸序列，使其可具有與某些整合蛋白選擇性結合之能力。
因此，本發明之一總體方面係關於去整合蛋白變異體。根據本發明之一實施態樣，去整合蛋白變異體係具有與αIIbβ3之降低的結合活性，且專一性地結合至α5β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8之至少 一者。
較佳地，相較於衍生出該去整合蛋白變異體之野生型去整合蛋白，該去整合蛋白變異體係具有與αIIbβ3之降低的結合活性，但具有與α5β1、αvβ3之至少一者之提高的結合活性。
舉例而言，已發現在RGD環上的Rho突變(例如46XXXRXDXX53)可增加對αvβ3及/或α5β1整合蛋白之專一性，在C-端區域的突變(例如65XXXX68)可造成與αIIbβ3之較少結合(因此對血小板凝集之抑制較弱及較少之出血副作用)，及在連接子區域的突變(例如39XXXXXIC45)亦可減少與αIIbβ3之結合，其中三個區域各自係以在野生型Rho中之胺基酸殘基數目來辨別，且根據本發明之實施態樣，可被修飾(例如經由插入、刪除、或取代)之胺基酸殘基係獨立地被標示為「X」。
根據本發明之實施態樣，去整合蛋白變異體包含在RGD環中之突變(例如46XXXRXDXX53)，即，一突變RGD環。
在一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列(consensus sequence)49RXD51之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：7至24所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列48XRGD51之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：25至42所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列48XRGDXP53之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：43至61所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通 序列48XRGDMX53之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：62至78所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列46XXPRGD51之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：79至94所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列48XRXDXP53之突變RGD環。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：95至101所組成之群組者。
根據本發明之其它實施態樣，一去整合蛋白變異體係包含一在C-端區域中之突變(例如65XXXX68)，即，突變C-端。
在一實施態樣中，一去整合蛋白變異體包含一具有共通序列65PRXXXXX71之突變C-端。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：102至107所組成之群組者。
在另一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列65PRXXXXX71之突變C-端，且更包含一如本文所述之突變RGD環。舉例而言，該突變RGD環可具有48ARGDMP53(SEQ ID NO：335)共通序列。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：115至119所組成之群組者。
根據本發明之又其它實施態樣，一去整合蛋白變異體係包含一在連接子區域中之突變(例如39XXXXXIC45)，即，突變連接子。
在一實施態樣中，一去整合蛋白變異體係包含一具有共通序列39KKKRTIC47(SEQ ID NO：306)之突變連接子。較佳地，該去整合蛋白變異體更包含一如本文所述之突變RGD環。舉例而言，該突變RGD環可具有48XRXDXP53共通序列。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺 基酸序列選自由SEQ ID NO：108至114所組成之群組者。
根據本發明進一步的實施態樣，一去整合蛋白變異體係包含一在連接子區域中之突變(例如39XXXXXIC45)、一在RGD環中之突變(例如46XXXRXDXX53)、及一在C-端區域中之突變(例如65XXXX68)。此等變異體之例子包括但不限於那些具有胺基酸序列選自由SEQ ID NO：120至179所組成之群組者。
鑒於本揭露，適合本發明之目的之任意方法可用來製造本發明之去整合蛋白變異體。舉例而言，去整合蛋白變異體可經由定點突變(site-directed mutagenesis)方法來建構。鑒於本揭露，本發明之去整合蛋白變異體可利用本技術領域已知之方法表現。以細胞為基礎(cell-based)之方法及無細胞(cell-free)方法係適用於生產本發明之胜肽。以細胞為基礎之方法一般涉及將核酸構築(nucleic acid construct)在生物體外引入宿主細胞中及在適合表現之條件下培養該宿主細胞，然後自培養基或者宿主細胞中(例如經由打破宿主細胞)，或自兩者中收取胜肽。本發明亦提供使用廣為本技術領域所知在體外轉錄/轉譯之無細胞方法去生產去整合蛋白變異體之方法。
去整合蛋白變異體可經由一能編碼經修飾胺基酸序列的經修飾去整合蛋白核苷酸序列來編碼，而使得該多胜肽實質上降低對整合蛋白αIIbβ3受器阻斷活性及/或提高對αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8、及其它整合蛋白(例如α5β1)之一或多者的專一性。經由修飾用於衍生自蛇毒之去整合蛋白之編碼序列，可獲得用於去整合蛋白變異體之編碼序列。去整合蛋白變異體可選自馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花 蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、及草原響尾蛇素。
因此，本發明之另一總體方面係關於一編碼本發明之去整合蛋白變異體之多核苷酸。本發明之又另一總體方面係關於一包含編碼本發明之去整合蛋白變異體之多核苷酸之宿主細胞。
一般而言，不論經修飾或未經修飾的異源胜肽係可如上所述由其自身表現，或以融合蛋白表現，且不僅可包括分泌訊號，而且可包括分泌性前導序列(leader sequence)。本發明之分泌性前導序列係可引導某些蛋白質至內質網(endoplasmic reticulum，ER)或間質體(periplasma)。ER係將膜結合蛋白與其他蛋白質分開。一旦被定位於ER，蛋白質可進一步被引導至高基氏體(Golgi apparatus)以分配至液胞(vesicle)(包括分泌性液胞、細胞膜、溶小體(lysosome)、及其他胞器)。在間質體的狀況下，蛋白質係分泌至葛蘭氏陰性菌(Gram negative bacterium)(例如大腸桿菌)之間質空間(periplasma space)中。
此外，去整合蛋白變異體可額外添加胜肽官能基(peptide moiety)及/或純化標籤。此等區域可在多胜肽之最終製備前移除。為了引發分泌或排出、改善穩定性、及促進純化等諸多原因而對多胜肽添加胜肽官能基為本領域熟悉且例行的技術。合適之純化標籤包括，舉例而言，V5、多組胺酸(polyhistidine)、抗生物素(avidin)、生物素(biotin)。將胜肽與化合物，例如生物素結合可使用本技術領域中所熟知之技術來達成。(Hermanson編著(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press)。亦可 使用本技術領域已知之技術將胜肽與放射性同位素、毒素、酵素、螢光標籤、膠態金、核酸、溫諾平(vinorelbine)、及艾徽素(doxorubicin)結合。(Hermanson編著(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press；Stefano等人(2006))。
適合用於本發明之融合伴侶包括，舉例而言，胎球蛋白(fetuin)、人類血清白蛋白、免疫球蛋白CH2/CH3區域(Fc)、及/或其一或多個片段。亦提供經結合之蛋白質，例如聚乙二醇的結合物。
本發明之胜肽亦可以本領域已知之技術化學合成(例如，見Hunkapiller等人Nature，310：105 111(1984)；Grant編著(1992)Synthetic Peptides,A Users Guide，W.H.Freeman and Co.；美國專利6,974,884))。舉例而言，可以使用胜肽合成器或透過使用本領域已知的固相方法合成一對應多胜肽片段之多胜肽。
此外，如果需要，可以取代或插入的方式在多胜肽序列中加入非典型胺基酸或化學胺基酸類似物。非典型胺基酸包括但不限於常見胺基酸之D-異構物、2,4-二胺基丁酸、a-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、胺基丁酸(Abu)、2-胺基丁酸、γ-胺基丁酸、-胺基己酸(Ahx)、6-胺基己酸、胺基異丁酸(Aib)、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、高瓜胺酸、磺基丙胺酸、三級丁基甘胺酸、三級丁基丙胺酸、苯甘胺酸、環己基丙胺酸、b-丙胺酸、氟胺基酸、設計者胺基酸(designer amino acid)，例如b-甲基胺基酸、鈣-甲基胺基酸、鈉-甲基胺基酸、及一般胺基酸類似物。此外，胺基酸可以為D(右旋的)或L(左旋的)。
本發明之去整合蛋白變異體係可經由標準方法而自化學合成及重組細胞培養物中回收及純化，該方法包含但不限於硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水作用 層析法、親合力層析法、氫氧基磷灰石層析法、及凝集素層析法。在一實施態樣中，選用高效液相層析法(HPLC)來純化。當多胜肽在分離及/或純化之過程中發生變性時，可選用熟知用於再摺疊(refolding)蛋白質之技術以產生具活性之構型。
本發明之去整合蛋白變異體可以一或多個各樣親水性聚合物進行修飾或與其共價結合以增加該胜肽之可溶性及循環半衰期。用於與胜肽結合之適宜非蛋白親水性聚合物包括但不限於聚烷基醚，如以下例子所列示：聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化烯烴、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素及纖維素衍生物、聚葡萄糖、及聚葡萄糖衍生物。一般而言，此等親水性聚合物的平均分子量係在約500道爾頓(dalton)至約100,000道爾頓，約2,000道爾頓至約40,000道爾頓，或約5,000道爾頓至約20,000道爾頓的範圍。該胜肽可利用下列文獻所述之任意方法而與該等聚合物一起衍生或與之結合：Zallipsky,S.(1995)Bioconjugate Chem.，6：150-165；Monfardini,C.等人(1995)Bioconjugate Chem.，6：62-69；美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337，或WO 95/34326。
醫藥組合物
本發明之另一總體方面係關於一包含一本發明之去整合蛋白變異體及一藥學上可接受載體之醫藥組合物。視需要，該醫藥組合物可被調配成固體、半固體、液體或氣態型態之製劑，例如錠片、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、噴霧劑。以下方法及賦形劑係僅為示例且不具任何限制性。
在一些實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係與本技術 領域所知之廣泛的藥學上可接受之載體、賦形劑、及稀釋劑一起形成配方而提供。這些醫藥載體、賦形劑及稀釋劑係包括於USP藥學賦形劑一覽表所列者。USP and NF Excipients,Listed by Categories,p.2404-2406,USP 24 NF 19,United States Pharmacopeial Convention Inc.，Rockville,Md.(ISBN 1-889788-03-1)。藥學上可接受之賦形劑，例如載劑、佐劑、載體、或稀釋劑係大眾可輕易取得。此外，藥學可接受之輔助物質，例如pH調整劑及緩衝劑、張力調整劑、穩定劑、潤濕劑及諸如此類係大眾可輕易取得。
適宜之載體包括(但不限於)水、葡萄糖、海藻糖、組胺酸、甘油、生理食鹽水、乙醇、及其組合。該載體可包含額外之輔劑，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、或促進該配方之效果的佐劑。外用的載體包括液體石油、十六酸異丙脂、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯單月桂酸酯(polyoxyethylene monolaurate)(5%)於水中的溶液、或月桂基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)(5%)於水中的溶液。視需要可添加其它材料，例如抗氧化劑、保濕劑、黏度安定劑、及相似劑。亦可包括透皮促進劑(percutaneous penetration enhancer)，例如月桂氮酮(Azone)。
用於製備該等劑型之實際方法對本領域之通常知識者係已知的，或係顯然的。所投用之組合物或配方，不論在何情況下，係包含足以在接受治療的個體內達到所需狀態之劑量。
根據某些實施態樣，本發明之去整合蛋白變異體係可藉由在水性或非水性溶劑，例如植物或其他相似的油、合成之脂肪酸甘油酯、較高脂肪酸之酯類、或丙二醇內溶解、懸浮或乳化而調配成供注射用之製劑，並如需要，可添加習用添加物，例如助溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、及防腐劑。亦可使用如本技術領域中所習用之其它以口服或注射方式遞送的配方。
在醫藥劑型中，本發明之醫藥組合物可以其藥學上可接受鹽類之形式投藥，或其亦可單獨使用或適當地與其它具藥學活性的化合物聯合與組合。該組合物係根據可能的投藥方式之型態來調配。在一較佳實施態樣中，該醫藥組合物係調配成以注射的方式投藥，例如調配成供注射之液體形式。
治療方法
本發明亦係關於對有需求的個體使用該去整合蛋白變異體來治療及/或預防與一或多種選自由α5β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8所組成之群組的整合蛋白相關之疾病。此等疾病包括但不限於骨質酥鬆症、骨腫瘤或骨癌生長及與其相關之症狀、血管新生相關之腫瘤生長及轉移、骨骼中之腫瘤轉移、惡性腫瘤引起之高血鈣症、血管新生相關之眼部疾病、派傑氏症(Paget’s disease)、風濕性關節炎、及退化性關節炎。該方法包含對該有治療需求之個體投予一有效治療劑量的醫藥組合物，包含本發明之去整合蛋白變異體及藥學上可接受載體。
在本發明之一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係用於治療及/或預防一血管新生相關之眼部疾病，其包括但不限於老年性黃斑病變、糖尿病視網膜病變、角膜神經血管增生病變、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變、高度近視、及早熟性視網膜病變。
在本發明之另一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係用於治療及/或預防一血管新生相關之疾病，包括但不限於癌症、眼部相關疾病、例如黃斑部退化、水腫。
在另一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體與存在於眼角膜之αv-整合蛋白(αvβ5、αvβ6、及αvβ8)結合，調節轉化生長因子β (TGFβ)之活化以治療相關疾病。這些疾病包括眼部疾病、關節炎、及癌症。在另一方面，該發明之多胜肽係一抗血管新生藥物，用於緩解關節炎疼痛並預防因這些疾病引起且具破壞性血管所造成的關節損壞。證據也證實該發明之多胜肽與習知化學療法或放射性療法結合時，可同時透過不同策略成為有用攻擊癌症的「多重彈頭」方法之一部分。
在本發明之又另一實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體係用於治療及/或預防骨質酥鬆症。骨質酥鬆症係與選自由以下所組成之群組的病理狀態有關：停經後雌激素不足、續發性骨質酥鬆症、風濕性關節炎、卵巢切除、派傑氏症、骨癌、骨腫瘤、退化性關節炎、蝕骨細胞形成增加、蝕骨細胞活性增加。此外，該骨質酥鬆症包括但不限於卵巢切除引起之骨質酥鬆症或骨質流失、及停經後骨質酥鬆症或骨質流失。
本發明之又另一實施態樣係一利用該去整合蛋白變異體於治療及/或預防在哺乳類(包括人類)中因卵巢切除或停經後骨質酥鬆症所引起之病理性變化的方法。該方法包括對該有需要之哺乳類投予有效治療劑量之分離多胜肽、或其藥學上可接受之鹽類，其相較於野生型去整合蛋白具有對整合蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、或α5β1受器的拮抗活性，及實質上降低對整合蛋白αIIbβ3受器之阻斷活性，因此可治療及/或預防哺乳類動物因卵巢切除所引起之生理變化。
在另一方面，本發明提供一用於抑制血小板凝集之方法，包含對一有該等治療需求之個體投予有效量之本發明之去整合蛋白變異體或本發明之醫藥組成物。
本發明之去整合蛋白變異體係可經由全身性注射，例如經由靜脈注射；或經由注射或施加至相關位點，例如經由直接注射、或當該位點在手術中暴露時直接施加至該位點；或舉例而言，如果該疾病係位於皮 膚上，可經由局部施用而投予至一有治療需求之個體。
本發明之去整合蛋白變異體係可作為單一藥物治療。或者，本發明之去整合蛋白變異體可與標準方案結合使用以治療整合蛋白相關疾病。舉例而言，本發明之多胜肽可與具有效治療劑量之一或多種其它藥劑一併使用。較佳地，另一藥劑係選自由以下所組成之群組：抗癌藥劑、抗發炎藥劑、免疫調整藥劑、及抗骨質酥鬆藥劑。較佳地，抗癌藥劑係選自由以下所組成之群組：抗血管新生藥劑、細胞毒性藥劑、及抗腫瘤藥劑。其它藥劑可以在本發明之胜肽投予之前、同時、或之後投予。
在一些實施態樣中，本發明之去整合蛋白變異體對於對抗與高度表現造骨蛋白(osteopontin)有關之癌症特別有效。在較佳實施態樣中，本發明之多胜肽可抑制造骨蛋白所引起之腫瘤入侵。
去整合蛋白變異體可以多種方式投予，包括經口、口腔、鼻腔、直腸、腸胃外、腹膜、皮內、經皮、皮下、靜脈、動脈、心內、心室內(intraventricular)、顱內、氣管內、及脊髓投藥等，或除此之外可透過植入或吸入方式投藥。
以下本發明之實例係為進一步說明本發明之本質。應了解以下實例並非用以限制本發明，且本發明之保護範圍係由後附申請專利範圍來界定。
實例 實例1：表現野生型Rho及Rho突變種(去整合蛋白變異體)之表現載體的建構
編碼Rho之去氧核醣核酸(DNA)係由在畢赤酵母(Pichia pastoris)中優先使用之密碼子所組成。Rho DNA係經由聚合酶連鎖反應(PCR)與具有Eco R1辨認區(recognition site)以及編碼六個組胺酸殘基 以用於促進純化之正股引子(sense primer)5’-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAGGAATGTGACTGTTCT-3’(SEQ ID NO：183)放大。反股引子(antisense primer)具有5’-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3’(SEQ ID NO：180)或5’-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3’(SEQ ID NO：184)序列，包含Sac II辨認區及TCA(或TTA)終止密碼子。純化PCR產物然後接合(ligate)至酵母菌重組載體(pPICZα A)之Eco R1及Sac II區。該重組質體係用來轉殖(transform)DH5α菌株，且以低鹽溶菌肉湯(LB)(在pH 7.0下1%胰化蛋白、0.5%酵母菌萃取物、0.5%氯化鈉、1.5%瓊脂)及25微克/毫升(μg/ml)抗生素吉歐黴素(Zeocin)在瓊脂平板上篩選群落。
編碼Rho之突變體之多種DNA構成物(DNA construct)係經由利用重疊寡核苷酸策略之PCR與含有EcoRI及SacII限制酶切位點之引子來合成及放大。為了說明之目的，表2列出一些去整合蛋白變異體之共通序列，及根據本發明之實施態樣用於建構這些變異體之引子，其中引子序列係以5’至3’呈現(左至右)。
鑒於本揭露，編碼包含於本發明之其它變異體的表現載體已經用相似之方式建構或可用相似之方式建構。多種用於合成或確認去整合蛋白變異體之引子係列於SEQ ID NO：180至305。
實例2 Rho突變體之表現及純化
在Pichia pastoris中馬來亞蝮素突變體及變異體之蛋白質表現係根據稍微修飾之Pichia EasyCompTM套組操作說明進行。簡言之，含有編碼馬來亞蝮素或去整合蛋白之變異體之DNA的共10微克質體係以SacI酵素作用後將形成線性質體。Pichia菌株X33係經由熱休克方法，使 用來自Invitrogen®之EasyCompTM套組將線性質體轉殖到Pichia基因體。該轉殖株經由單一交叉在5’AOX1基因座整合。使用PCR擴增技術分析轉殖之Pichia菌株以確定Rho基因是否已整合入該Pichia基因體，且菌株係經由酶解酶(Lyticase)(Sigma)溶解。群落係在含有酵母浸出蛋白腖葡萄糖(YPD)(1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖、及2%瓊脂)及100微克/毫升吉歐黴素之瓊脂平板上篩選。為了挑選表現最高去整合蛋白之變異體的群落，篩選若干具多複本去整合蛋白插入之群落。
重組Rho突變體係如下製造：經篩選之群落係在30℃下含有100微克/毫升吉歐黴素之YPD培養基(1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、及2%葡萄糖)中生長。48小時後，經由離心收集細胞及在1升之最小甲醇培養基(含有1.34%具硫酸銨不具胺基酸之酵母菌氮基底、及4x10-5%生物素)中生長。每24小時添加一次總共1%之甲醇以引發Rho或變異體之表現，歷時2天。經由離心收集上清液並以5升之緩衝液A(5mM EDTA、8M尿素、及10mM鈉-磷酸鹽緩衝液、pH 7.7)透析。該最終溶液係裝入鎳-螯合管柱且以200mM咪唑(imidazole)之梯度洗滌。經由HPLC(反相C18 HPLC)進一步純化該重組馬來亞蝮素及去整合蛋白之變異體。經純化之去整合蛋白的重組變異體，經由tricine-SDS-PAGE判斷，具有大於95%之純度。
實例3 經由抑制細胞黏附實驗分析Rho突變種對不同αv整合蛋白及α5β1整合蛋白的選擇性
Rho突變體及變異體之抑制活性係經由如前所述之細胞黏著抑制實驗來評估(Zhang等人，1998 J Biol Chem 73：7345-7350)。CHO-αIIbβ3細胞至血纖維蛋白原、CHO-αvβ3細胞至血纖維蛋白原、K562細胞至纖網蛋白(fibronectin)、HT-29細胞至玻璃黏結蛋白、及HT-29細胞至纖網蛋白之黏結係用來測定受試蛋白對整合蛋白αIIbβ3、αvβ3、α5β1、αvβ5、及αvβ6之抑制活性。簡言之，96-孔Immulon-2微量滴定板(Costar，紐約州康寧市(Corning,NY))係以含有50至500nM之上述基質蛋白的100微升經磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS：10mM磷酸鹽緩衝液，0.15M氯化鈉、pH 7.4)塗覆，且在4℃下過夜培養。基質及其塗覆濃度係血纖維蛋白原(Fg)200微克/毫升、玻璃黏結蛋白(Vn)50微克/毫升、及纖網蛋白(Fn)25微克/毫升。實驗中具非專一性蛋白質之結合作用係經由在每個孔中加入200微升之熱變性1%牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem)在室溫下共同培養1.5小時來阻斷，之後去除熱變性BSA且以200微升之PBS清洗每個孔兩次。
表現整合蛋白αvβ3(CHO-αvβ3)及αIIbβ3(CHO-αIIbβ3)之CHO細胞係由Y.Takada博士(斯克里普斯學術機構(Scripps Research Institute))所提供且保存於DMEM中。人類紅血球性白血病K562及結腸直腸腺癌HT-29細胞係購自ATCC且培養於含有5%FCS之洛斯維-帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)-1640培養基中。在含有1mM EDTA之PBS緩衝液中清洗收穫之K562及HT-29細胞，且在含有1mM MgSO4、2mM CaCl2、及500μM MnCl2之台氏緩衝液(Tyrode’s buffer)(150mM NaCl、5mM KCl、及10mM Hepes，pH7.35)中再懸浮。稀釋 細胞(CHO、K562、及HT-29)至3x105細胞/毫升，且100微升之該細胞係用於該實驗。添加Rho及其突變體至經培養細胞且在37℃、5% CO2下培養15分鐘。Rho及其變異體係作為抑制劑在0.001至500μM下使用。然後將該經處理細胞添加進該經塗覆盤並在37℃、5% CO2下反應1小時。之後去除該培養溶液，且經由以200微升之PBS清洗兩次來移除未黏著細胞。
經由結晶紫染色法計量黏結細胞。簡言之，以100微升之10%福馬林固定該孔10分鐘並乾燥。然後添加50微升之0.05%結晶紫進入該孔在室溫下20分鐘。以200微升之蒸餾水清洗每個孔四次並乾燥。染色係經由添加150微升之染色溶液(50%酒精及0.1%乙酸)達成。吸光度之結果係在600奈米吸收光譜下讀取，且該讀取值係對應黏結細胞之數量。抑制係被定義為%抑制=100-[OD600(Rho野生型或去整合蛋白處理之樣品)/OD600(未處理之樣品)] x 100。
IC50係被定義為抑制50%由特定整合蛋白所調節之細胞黏結所需之去整合蛋白變異體濃度(nM)。因此，具較低之IC50的去整合蛋白變異體表示其在抑制各自之整合蛋白的細胞黏結活性中具有較好之專一性與活性效力，因此去整合蛋白變異體對該各自之整合蛋白有較高的結合活性(或選擇性)。IC50之結果總結如下述表3至14。
一系列涉及RGD環區域(R50XD、48XRGD、ARGD52XP、ARGDM53X、46X47XPRGD、及ARGD51X52X)、連接子區域(39X40X41X42X43X)、及C-端區域(66X67X68X69X70X、66XLYG、D67XY)之Rho突變體係重組地表現及純化至一致性。使用細胞黏結及血小板凝集實驗測定其整合蛋白-結合親合力。已發現，馬來亞蝮素之變異體或在這些區域具一或多個修飾之去整合蛋白對αvβ3、αvβ5、αvβ6、α5β1、及αIIbβ3具有不同之選擇性結合親合力(表3至14)。
舉例而言，已發現在RXD結構區域(motif)具有某些突變之Rho變異體，其中該「Gly50(G)」殘基係被Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Glu(E)、Asp(D)、Gln(Q)、Phe(F)、Trp(W)、His(H)、Lys(K)、或Arg(R)取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~1686倍)>α5β1(~586倍)>αvβ5(~348倍)>αvβ6(~179倍)>αvβ3(~26倍)，顯示其對αvβ3之結合選擇性(表3)。在XRGD結構區域具有突變之Rho變異體，其中該P48殘基係被其他胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：α5β1(~71倍)>αIIbβ3(~41倍)>αvβ3(~5倍)(表4)。在ARGDXP結構區域具有突變之Rho變異體，其中該M52殘基係被其他胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~209倍)>α5β1(~122倍)>αVβ3(~14倍)(表5)。在ARGDMX結構區域具有突變之Rho變異體，其中該P53殘基係被其他胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~258倍)>α5β1(~45倍)>αVβ3(~40倍)(表6)。在XXPRGD結構區域具有突變之Rho變異體，其中該R46及I47殘基係被其他胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~73倍)>α5β1(~19倍)>αVβ3(~10倍)(表7)。這些結果顯示在RGD環中之突變在整合蛋白αIIbβ3及α5β1中展現對抑制活性之顯著影響，但對αVβ3整合蛋白則否。
馬來亞蝮素之突變體或具有除RGD結構區域外之一或多個修飾(例如在連接子區域或C-端中)的去整合蛋白展現選擇性結合至αVβ3、αVβ5、αVβ6、α5β1、或αIIbβ3的能力(表8至14)。舉例而言，在連接子區域(39X40X41X42X43X)具有突變之Rho變異體，其中該SRAGK係被KKKRT、KKART、MKKGT、IEEGT、MKEGT、AKKRT、KAKRT、KKART、KKKAT、KKKRA、KAKRA、及SKAGT胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對 整合蛋白效果：αIIbβ3(~2倍)>α5β1(~5倍)>αVβ3(~14倍)(表8)。這些結果顯示在Rho連接子區域之突變展現在整合蛋白αVβ3中對抑制活性之顯著影響。
在C-端區域(66X67X68X69X70X)具有突變之Rho變異體，其中該RYH係被RYH、RNGL、RGLYG、RGLY、RDLYG、RDLY、RNGLYG、及RNPWNG胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~13倍)>αVβ5(~8倍)=αVβ6(~8倍)>αVβ3(~4倍)>α5β1(~2倍)(表9)。這些結果顯示在Rho之C-端區域之突變展現在整合蛋白αIIbβ3、αVβ5、αVβ6中對抑制活性之顯著影響。
在C-端區域66XLYG具有突變之Rho變異體，其中該殘基66位置係被G、P、R、K、Y、D及E胺基酸取代，依以下順序具有其最高之對整合蛋白效果：αIIbβ3(~6493倍)>α5β1(~40倍)>αvβ5(~8倍)>αvβ6(~6倍)>αvβ3(~1倍)，顯示其對整合蛋白αIIbβ3及α5β1之顯著影響(表10)。
經由修飾去整合蛋白(Rho)之RGD環區域、連接子區域、及C-端區域，成功地得到對整合蛋白αvβ3及α5β1具專一性之去整合蛋白(Rho)變異體。舉例而言，突變體39KKART-46ARGRGDNP-66DLYG展現良好的對整合蛋白αvβ3及α5β1抑制活性，但對αIIbβ3、αvβ5、及αvβ6則無(表11)。在RGD環及連接子區域中之突變提高其在抑制整合蛋白αvβ3及α5β1之活性，且顯著地降低其在抑制整合蛋白αIIbβ3之活性。在C-端區域中之突變降低其在抑制整合蛋白αvβ5及αvβ6之活性。
經由修飾去整合蛋白(Rho)之RGD環區域、連接子區域、及C-端區域，成功地得到對整合蛋白αvβ3、αvβ5、及α5β1具專一性之去整合蛋白(Rho)變異體。舉例而言，突變體39KKART-46ARARGDDL-66GLYG 展現優異的對整合蛋白αvβ3、αvβ5、及α5β1抑制活性，但對αIIbβ3及αvβ6則無(表12)。在連接子區域中SRAGK變成KKART之突變提高其在抑制RGD-結合整合蛋白之活性。在RGD環中R46A、I47R、P48A、M52D、及P53L突變降低其在抑制整合蛋白αIIbβ3及αvβ6之活性。在C-端區域中66RYH變成66GLYG之突變降低其在抑制整合蛋白αIIbβ3之活性。
經由修飾去整合蛋白(Rho)之RGD環區域、連接子區域、及C-端區域，成功地得到對整合蛋白αvβx及α5β1具專一性之去整合蛋白(Rho)變異體。舉例而言，突變體39KKART-46ARGRGDNP-66DLYG展現優異的對整合蛋白αvβ3及α5β1抑制活性，但對αIIbβ3、αvβ5、及αvβ6則無(表11)。在RGD環及連接子區域中之突變提高其在抑制整合蛋白αvβ3及α5β1之活性，且顯著地降低其在抑制整合蛋白αIIbβ3之活性。在C-端區域中之突變降低其在抑制整合蛋白αvβ5及αvβ6之活性。
實例4 Rho突變體對抑制血小板凝集活性測試
亦測試去整合蛋白(Rho)變異體抑制經由αIIbβ3調節之血小板凝集的能力。收集來自至少兩星期未接受任何藥物治療之健康捐贈者之靜脈血樣品，以9(靜脈血)：1(3.8%檸檬酸鈉)比例混合。以150 x g離心血液樣品10分鐘，離心後靜置5分鐘吸取上清液以得到富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)。再經由2000x g離心25分鐘，自剩餘血液中之上清液吸取貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。血小板凝集之計算係在血液分析儀上測量且被稀釋至250,000血小板/微升。在Hema Tracer 601血小板凝集計中，在37℃下培養190微升之PRP及10微升之Rho或PBS緩衝液的溶液5分鐘。進一步添加10微升之200μM二磷酸腺苷(ADP)以經由光透射監測血小板凝集反應。血小板凝集之抑制結果係總結於下述表3至14。
實例5 去整合蛋白變異體及野生型馬來亞蝮素抑制人類黑色素瘤細胞遷移的能力
細胞遷移培養盤(transwell filter)在使用前於含有DMEM之血清中平衡2小時。添加含有10% FBS之DMEM至細胞遷移培養盤之下方隔室。在100毫升不含血清之DMEM中，每個細胞遷移培養盤上方加入2 x 104個A375人類黑色素瘤細胞。細胞在37℃、5% CO2下遷移6小時，且接著經由在室溫下將該細胞遷移培養盤浸入甲醇中15分鐘來固定。添加馬來亞蝮素、AR-NP蛋白(共通序列見表13)、或PBS緩衝液入上腔中。以水清洗細胞遷移培養盤一次，且在20%甲醇/水中以0.2%結晶紫溶液染色10分鐘。以棉花棒將細胞自細胞遷移培養盤膜之上表面移除。自每張膜上五個隨機範圍中，以200倍放大倍率計算轉移至膜之下表面的細胞。
本研究中Rho蛋白、AR-NP蛋白、或PBS緩衝液之抑制活性如第2圖所示。簡言之，AR-NP蛋白明顯地抑制A375人類黑色素瘤細胞之遷移。
實例6：去整合蛋白變異體在基質膠血管新生實驗(Matrigel Angiogenesis Assay)中抑制血管新生能力
皮下注射含有VEGF(100奈克/毫升)之基質膠及肝素(24至26U/ml)至B6小鼠。為量化血紅素或組織學，5天後回收、秤重及處理該膠。血紅素之計算係以德瑞金(Drabkin)試劑套組525(Sigma)測量。組織學分析中，以4%聚甲醛中固定該基質膠團塊，並包埋在石蠟中；經由標準程序以蘇木精-伊紅染色4微米之切面。
皮下注射含有VEGF(150奈克)及肝素(30IU)之部分(300微升)MATRIGELTM(碧帝實驗室(Becton Dickinson Lab.))至6週至8週齡之C57BL/6小鼠的背部。該MATRIGELTM快速地形成基質膠。24小 時後靜脈投予一次AR-NP蛋白(1毫克/公斤)或ARLDDL蛋白(1毫克/公斤)(共通序列見表13)。5天後，取出及拍攝該基質膠(上部分圖)。經由以德瑞金方法及德瑞金試劑套組525(Sigma)(B&C)測量基質膠之血紅素，做為血管形成之指示來量化新生血管。分析顯示當在5天血管新生期間只注射一次藥物時，AR-NP蛋白係較ARLDDL蛋白更有效。見第3圖。
實例7：利用早熟性視網膜病變(ROP)之高氧/常氧-誘發模式測量去整合蛋白變異體抑制血管新生的能力
暴露一周齡之C57BL/6J小鼠或ICR小鼠及其母親至75%±2%氧氣維持5天(高氧)，接著回到常氧的環境維持另外5天(高氧期間：P7至P12)以誘發相對低氧的環境，且接著進一步在室內空氣中住7天(低氧-誘發血管新生期間：P12至P19)。在第12天透過玻璃體內途徑投予AR-NP蛋白(1皮克(pg))，且在第19天犧牲小鼠。未暴露之控制組動物係養在室內空氣中。動物係保持在一衡定在21±1℃之溫度及12小時光-暗循環下。氧氣濃度係以血氧計測量。在氧氣暴露(第12天)結束及回到常氧之環境後5天(第17天)，犧牲實驗小鼠，且以新生血管及內皮細胞評估視網膜血管新生。
本研究之結果係顯示於第4圖中，分析顯示AR-NP蛋白顯著地降低在老鼠模式之視網膜中之血管新生。
實例8：小鼠主動脈環實驗測試去整合蛋白變異體抑制血管新生能力
解剖出8至12週齡之小鼠之主動脈環，且切成大約0.5毫米寬之環。該主動脈環係固定於200毫升之基質膠中，以由2.5% FCS補充之DMEM及具有或不具有抑制劑或控制劑之30奈克/毫升之VEGF覆蓋。該實驗係在CO2培養箱中、37℃下進行。培養7天後，以4%甲醛固定該 主動脈環，並以結晶紫染色。自每個環長出之芽的數目以倒立顯微鏡計算。
老鼠之主動脈環以VEGF及0.1μM AR-NP蛋白在含有100毫克/毫升纖網蛋白之基質膠中之培養。每3天更換培養基。圖顯示培養7天後微血管之萌芽。AR-NP蛋白顯著地降低血管之萌芽(見第5圖)。
實例9：去整合蛋白變異體抑制乳癌細胞群落形成能力
在第6圖中之代表性影像顯示4-T1乳癌細胞群落形成實驗之結果。以培養基中0.35%瓊脂在上層及0.7%瓊脂在下層之形式，將4-T1乳癌細胞植入6孔盤中。每3天補充0.3毫升培養基。18天後，經由結晶子染色及計算來確認每個培養皿中細胞群聚之數目。分析顯示，ARLDDL蛋白(0.1μM & 1μM)及AR-NP蛋白(0.1μM & 1μM)兩者皆抑制4-T1乳癌細胞之群落形成。
實例10：去整合蛋白變異體抑制蝕骨細胞生成的能力
6至8週齡之SD大鼠係得自國研院動物中心(Animal Center of National Laboratory)且養在受控環境下，包括21±1℃之室內溫度及12小時光-暗循環。動物係以任意取食之普瑞納實驗室嚙齒動物飼料(Purina Laboratory Rodent Diet)及蒸餾水餵養。骨髓細胞係經由自股骨及脛骨中移除來製備，且以由20mM HEPES及10%熱去活化之FBS、2mM麩醯胺酸、盤尼西林(100U/ml)、及鏈黴素(100克/毫升)補充之DMEM(Invitrogen，加州卡爾斯巴德(Carlsbad,California))沖洗該骨髓腔。在24小時後收集非黏著之細胞(造血細胞)且用作蝕骨細胞前驅物。細胞係以1 x 106個細胞/孔，植入存在有人類重組可溶性RANKL(50奈克/毫升)及M-CSF(20奈克/毫升)之24孔盤中。每3天置換培養基。在第8天以TRAP染色測量蝕骨細胞之形成。簡言之，黏著細胞係在PBS中以10%甲醛固定3分鐘，然後以萘酚AS-MX磷酸鹽及酒石酸鹽溶液在37℃下染 色1小時。藉由計算TRAP陽性及含有三個細胞核以上之多核細胞的數目，評分在每個孔中之類蝕骨細胞。
在第1天至第7天添加去整合蛋白變異體蛋白質藥物。其中AR-NP具對抗α5β1及αvβ3整合蛋白之去整合蛋白變異體，抑制蝕骨細胞生成之IC50係3.61nM。如第7圖所示，與未處理之控制組相較，AR-NP蛋白或ARLDDL蛋白皆具抑制RANKL誘發之蝕骨細胞生成能力。
實例11：去整合蛋白變異體抑制神經膠瘤細胞入侵能力
人類神經膠瘤細胞(U251)與含有100克/毫升玻尿酸之基質膠在上腔中培養。添加去整合蛋白變異體入上腔及下腔兩者中。24小時後，以結晶紫染色及計算在下腔中之細胞。如第8圖所示，ARLDDL蛋白(0.1μM)及AR-NP蛋白(0.1μM)兩者皆明顯地抑制神經膠瘤細胞入侵能力。
實例12：去整合蛋白變異體AR-NP在血壓及心跳速率上之影響
血壓及心跳速率係自在異氟烷(isoflurane)麻醉下之Wistar大鼠之尾巴以非侵入方式記錄。在得到穩定測量後自尾靜脈投予AR-NP蛋白。實驗結果顯示5毫克/公斤之AR-NP蛋白並不顯著地影響血壓及心跳速率(第9圖)。一般用於藥理作用之AR-NP蛋白劑量係1毫克/公斤。
實例13：去整合蛋白變異體AR-NP抑制A375黑色素瘤生長能力
皮下注射A375腫瘤細胞(5 x 106個)至4至5週齡之雄性SCID小鼠之側腹中。細胞植入一週後，以AR-NP(KKART-ARGRGDNP)蛋白(2毫克/公斤，5天/週，腹腔注射)注射小鼠。每兩天測量腫瘤體積。藥物處理18天後切除腫瘤並秤重。比例尺：1公分。實驗結果顯示經由AR-NP蛋白處理後顯著地抑制腫瘤生長(見第10圖)。
實例14：在K-rasG12D基因轉殖小鼠中測試去整合蛋白變異體AR-NP抑 制腫瘤生長能力
以400毫克/升之去氧羥四環素餵養K-RasG12D基因轉殖小鼠，以誘發肺癌。3.5週後，2毫克/公斤之AR-NP蛋白以兩天的間距腹腔注射基因轉殖小鼠，維持一個月。第15次藥物注射後兩週，犧牲小鼠。以印度墨(India ink)注射肺，且在費克特溶液(Fekete’s solution)中固定。計算在肺上之腫瘤團塊之數目。**代表P值<0.001。如第11圖所示，在K-rasG12D基因轉殖小鼠中，去整合蛋白變異體AR-NP蛋白具抑制肺腫瘤生長能力。
實例15：在U87腦瘤小鼠模式中測試去整合蛋白變異體AR-NP抑制腦腫瘤生長能力
NOD-SCID小鼠原來係購買及餵養/保持在特別之具良好控制環境(具有12小時/12小時之光/暗循環，及受控制之濕度及溫度)之無病原動物飼養所。使用重大約22克至25克之8週至10週齡之小鼠。以得麻效/舒泰(Dexdomitor/Zoletil)(20微克/公斤/2毫克/公斤)之混合物腹腔麻醉小鼠，然後放置在立體定位架中，經由切開術將顱骨暴露。在顱內注射前收穫U87-MG細胞，並在磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中調整至2.5 x 105個細胞/微升之密度。在自前囟(Bregma)指定之座標使用微量注射幫浦及10毫升漢彌爾頓注射器(Hamilton syringe)配合30S-線規(gage)針頭，注射2微升之U87-MG腦瘤細胞至紋狀體。然後清理顱骨，以骨臘將洞封住，及縫合切口。
MRI係在80微秒中以300毫特斯拉/公尺(mT/m)之主動屏蔽梯度在水平7.0特斯拉光譜儀中進行。腫瘤之輪廓係基於腫瘤及腦組織之間T2WI之比較來勾畫。使用MR視覺軟體(MR vision software)藉由加總被腫瘤覆蓋之切片的腫瘤面積，計算總腫瘤體積(立方毫米)。在每個 時間點隨著腫瘤體積之變化繪製生長曲線。在腫瘤植入後23天開始，一天一次，一週5天，通過小鼠尾靜脈注射5毫克/公斤去整合蛋白變異體AR-NP。如在第12圖中之結果所顯示，去整合蛋白變異體AR-NP具有抑制在U87腦瘤小鼠模式中之腦腫瘤生長的能力。
雖然已詳述本發明細節，且參照其特定實施態樣，對本技術領域之具通常知識者而言，在不背離期精神與範圍下可在其中作多種變化及修飾係顯然的。
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<213> 馬來亞蝮蛇
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<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 55
<210> 56
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 56
<210> 57
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 57
<210> 58
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 58
<210> 59
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RXGDXP胜肽，在X突變
<400> 59
<210> 60
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 60
<210> 61
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDXP胜肽，在X突變
<400> 61
<210> 62
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 62
<210> 63
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 63
<210> 64
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 64
<210> 65
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 65
<210> 66
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 66
<210> 67
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 67
<210> 68
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 68
<210> 69
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 69
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 70
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 71
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 73
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 74
<210> 75
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 75
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 76
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 77
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRGDMX，在X突變
<400> 78
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 79
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXPRGD，在X突變
<400> 80
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 81
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXPRGD，在X突變
<400> 82
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXPRGD，在X突變
<400> 83
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 85
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 86
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 87
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 92
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 93
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXPRGD，在X突變
<400> 94
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRXDXP，在X突變
<400> 97
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRXDXP，在X突變
<400> 98
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRXDXP，在X突變
<400> 99
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRXDXP，在X突變
<400> 100
<210> 101
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XRXDXP，在X突變
<400> 101
<210> 102
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRGDMP-PRXXXXXX，在X突變
<400> 102
<210> 103
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 103
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<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 104
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<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRGDMP-PRXXXXX，在X突變
<400> 105
<210> 106
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRGDMP-PRXXXXX，在X突變
<400> 106
<210> 107
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 107
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 108
<210> 109
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 109
<210> 110
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 110
<210> 111
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 111
<210> 112
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 112
<210> 113
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 113
<210> 114
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKKRT-XRXDXP胜肽，在X突變
<400> 114
<210> 115
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 115
<210> 116
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 116
<210> 117
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 117
<210> 118
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 118
<210> 119
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARGDMP-PRXXXXX胜肽，在X突變
<400> 119
<210> 120
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 120
<210> 121
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 121
<210> 122
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 122
<210> 123
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 123
<210> 124
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 124
<210> 125
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 125
<210> 126
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 126
<210> 127
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 127
<210> 128
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 128
<210> 129
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 129
<210> 130
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 130
<210> 131
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 131
<210> 132
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 132
<210> 133
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 133
<210> 134
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 134
<210> 135
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 135
<210> 136
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 136
<210> 137
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 137
<210> 138
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 138
<210> 139
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 139
<210> 140
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 140
<210> 141
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 141
<210> 142
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 142
<210> 143
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 143
<210> 144
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 144
<210> 145
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 145
<210> 146
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX peptide胜肽，在X突變
<400> 146
<210> 147
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 147
<210> 148
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 148
<210> 149
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 149
<210> 150
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 150
<210> 151
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 151
<210> 152
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 152
<210> 153
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 153
<210> 154
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 154
<210> 155
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 155
<210> 156
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 156
<210> 157
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 157
<210> 158
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 158
<210> 159
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 159
<210> 160
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 160
<210> 161
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 161
<210> 162
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突
<400> 162
<210> 163
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 163
<210> 164
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 164
<210> 165
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 165
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 166
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 167
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 168
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 169
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 171
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 172
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 173
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 174
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<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 175
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<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 176
<210> 177
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 177
<210> 178
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
<400> 178
<210> 179
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX胜肽，在X突變
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反股引子
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<212> DNA
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<223> 正股引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 182
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 183
<210> 184
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 184
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 189
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<211> 23
<212> DNA
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<223> 反股引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
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<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 205
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 209
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<210> 211
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<210> 212
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 212
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<212> DNA
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<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
<400> 216
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
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<211> 14
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
<400> 220
<210> 221
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 221
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 222
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 224
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 226
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 232
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<223> 正股引子
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<223> 正股引子
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 258
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 259
<210> 260
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 260
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 261
<210> 262
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 262
<210> 263
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
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<210> 266
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
<400> 267
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 正股引子
<400> 269
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<211> 16
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<210> 272
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 反股引子
<400> 272
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 274
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 275
<210> 276
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 276
<210> 277
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 277
<210> 278
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反股引子
<400> 278
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正股引子
<400> 279
<210> 280
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反股引子
<400> 280
<210> 281
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反股引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反股引子
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<223> 突變連接子
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 突變連接子
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 突變連接子
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<212> PRT
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<223> 突變連接子
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 突變連接子
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<211> 7
<212> PRT
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<223> 突變連接子
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<212> PRT
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<223> 突變C-端
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變C-端
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<211> 6
<212> PRT
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<223> 突變C-端
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 突變C-端
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 突變C-端
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變C-端
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 突變C-端
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突變C-端
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<220>
<223> 突變C-端
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變C-端
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<212> PRT
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<220>
<223> 突變RGD
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突變RGD
<400> 330
<210> 331
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變RGD
<400> 331
<210> 332
<211> 7
<212> PRT
<213> 馬來亞蝮蛇
<400> 332
<210> 333
<211> 8
<212> PRT
<213> 馬來亞蝮蛇
<400> 333
<210> 334
<211> 4
<212> PRT
<213> 馬來亞蝮蛇
<400> 334
<210> 335
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 335
<210> 336
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變連接子
<400> 336

Claims (16)

  1. 一種去整合蛋白變異體(disintegrin variant)，其係包含選自由以下所組成之群組之至少一者：(a)一突變連接子(mutant linker)，其係包含至少一位在SEQ ID NO：332(SRAGKIC)胺基酸序列之1至5位點上之突變；(b)一突變RGD環(mutant RGD loop)，其係包含選自由SEQ ID NO：329至331所組成之群組之胺基酸序列；以及(c)一突變C-端(mutant C-terminus)，其係包含至少一位在SEQ ID NO：334(PRYH)胺基酸序列之1至4位點上之突變，其中，相較於一去整合蛋白不具有該選自由該突變連接子、該突變RGD環、以及該突變C-端所組成之群組之至少一者，該去整合蛋白變異體具有以下至少一者：降低與αIIbβ3整合蛋白之結合活性、以及提高與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白中之至少一者之結合活性。
  2. 如請求項1所述之去整合蛋白變異體，其中該去整合蛋白係選自由以下所組成之群組：馬來亞蝮素(rhodostomin)、白唇竹葉青蛇素(albolabrin)、百步蛇素(applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(basilicin)、矛頭蝮素(batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(bitistatin)、西部亞種響尾蛇素(cereberin)、角響尾蛇素(cerastin)、西部菱背響尾蛇素(crotatroxin)、南美響尾蛇素(duressin)、麗紋龜殼花蛇素(elegantin)、黃綠龜殼花蛇素(flavoridin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(flavostatin)、日本蝮蛇素(halysin)、西伯利亞蝮蛇毒解離素(halystatin)、巴西蝮素(jararacin)、巴西蝮蛇毒解離素(jarastatin)、馬來亞紅口蝮素(kistrin)、亞馬遜巨蝮素(lachesin)、 西部亞種響尾蛇素(lutosin)、黑尾響尾蛇素(molossin)、韓國亞種短尾蝮素(salmosin)、白眉蝮素(saxatilin)、北美侏儒響尾蛇素(tergeminin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(trimestatin)、台灣龜殼花素(trimucrin)、台灣龜殼花去整合蛋白(trimutase)、烏蘇里蝮素(ussuristatin)、及草原響尾蛇素(viridin)。
  3. 如請求項1或2所述之去整合蛋白變異體，其係包含一突變RGD環，以及該突變連接子及該突變C-端中之至少一者，該突變RGD環係包含至少一位在SEQ ID NO：333(RIPRGDMP)胺基酸序列之1至3、5、7及8位點上之突變。
  4. 如請求項1或2所述之去整合蛋白變異體，其中該突變連接子係包含選自由SEQ ID NO：306至SEQ ID NO：318所組成之群組之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2所述之去整合蛋白變異體，其中該突變C-端係包含選自由SEQ ID NO：319至SEQ ID NO：328所組成之群組之胺基酸序列。
  6. 如請求項1或2所述之去整合蛋白變異體，其係包含一突變RGD環，以及一突變連接子及一突變C-端中之至少一者，該突變RGD環係具有選自由SEQ ID NO：329至331所組成之群組之胺基酸序列，該突變連接子係具有選自由SEQ ID NO：306至SEQ ID NO：318所組成之群組之胺基酸序列，該突變C-端係具有選自由SEQ ID NO：319至SEQ ID NO：328所組成之群組之胺基酸序列。
  7. 如請求項6所述之去整合蛋白變異體，其係包含該突變RGD環、該突變連接子、以及該突變C-端。
  8. 如請求項1所述之去整合蛋白變異體，其係包含選自由SEQ ID NO：123、 124、147、149、及171所組成之群組之胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2所述之去整合蛋白變異體，其中該去整合蛋白變異體係接上聚乙二醇或與白蛋白或抗體的可結晶區(Fc)結合。
  10. 一種編碼(encoding)如請求項1至9中任一項所述之去整合蛋白變異體之多核苷酸。
  11. 一種重組宿主細胞(recombinant host cell)，其係包含一編碼如請求項1至9中任一項所述之去整合蛋白變異體之多核苷酸。
  12. 一種醫藥組合物，其係包含該如請求項1至9中任一項所述之去整合蛋白變異體及一藥學上可接受之載體。
  13. 如請求項12所述之醫藥組合物，其係用於治療在一有需要之個體中與至少一選自由αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白所組成之群組的整合蛋白相關之疾病。
  14. 如請求項13所述之醫藥組合物，其中該整合蛋白相關疾病係一選自由以下所組成之群組之血管新生相關的眼部疾病(angiogenesis-related eye disease)：老年性黃斑病變(age-related macular degeneration)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、角膜神經血管增生病變(corneal neovascularizing disease)、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變(ischaemia-induced neovascularizing retinopathy)、高度近視(high myopia)、及早熟性視網膜病變(retinopathy of prematurity)。
  15. 如請求項13所述之醫藥組合物，其中該整合蛋白相關疾病係一選自由以下所組成之群組之癌症：轉移性黑色素瘤、轉移性前列腺癌、轉移性乳癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、 及多形性神經膠母細胞瘤。
  16. 一種使用如請求項1至9中任一項所述之去整合蛋白變異體在製造藥劑的用途，該藥劑係用於治療在一有需要之個體中與至少一選自由αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白所組成之群組的整合蛋白相關之一疾病。
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