JP2017525394A - ディスインテグリンバリアントとその医薬用途 - Google Patents

Abstract

αＩＩｂβ３との結合活性は減ずるもののα５β１及びαｖインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８など）のうち１つ以上と特異的に結合するディスインテグリンバリアントを開示する。このディスインテグリンバリアントをαｖインテグリン又はα５β１インテグリンに関連した疾患の治療と予防のために使用することも開示する。【選択図】図１

Description

本発明は、αＩＩｂβ３との結合活性は減ずるもののα５β１及びαｖインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８など）のうち１つ以上と特異的に結合するディスインテグリンバリアントと、このディスインテグリンバリアントをαｖインテグリン又はα５β１インテグリンに関連した疾患の治療と予防のために使用することに関する。

インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質又は隣接細胞上の他のアドヘシン受容体と結合する膜貫通受容体である。インテグリンのαサブユニットとβサブユニットからなるヘテロ二量体の形成により、１種以上の基質への結合特異性がもたらされる（非特許文献１）。このアドヘシン分子ファミリーは、炎症、先天性免疫、抗原特異的免疫、恒常性、創傷治癒、組織の形態形成、細胞の増殖と分化の制御をはじめとする生物学の幅広い分野で重要な役割を果たす。インテグリンの異常調節は、血栓性血管疾患への自己免疫からがん転移まで多岐にわたる病態の原因に関連する。臨床応用のためにインテグリンアンタゴニストの発見と開発に対しては甚大な努力が向けられてきた。

αｖインテグリンは、それぞれ、αｖサブユニットにβ１、β３、β５、β６、又はβ８サブユニットが組み合わさっており、創傷修復、血管形成、及びがんに関連した組織リモデリング中に特に重要と考えられている（非特許文献１）。αｖインテグリンは、がん、眼科的適応症、及び整形外科的適応症の標的とされている。また、インテグリンαｖβ３とαｖβ５は、腫瘍、関節炎、乾癬、及び加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）にも関連している。特に、αｖβ３インテグリンは、血管形成の仲介と腫瘍移動の抑制に重要であり、αｖβ６はある種のがんで上方調節される。角膜に存在する他のαｖインテグリン（αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８）は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の活性化を仲介している。

インテグリンα５β１、αｖβ３、及びαｖβ５は、血管形成過程で重要な役割を果たし、さまざまな悪性腫瘍（例えば、これらに限定されるわけではないものの、黒色腫、乳がん、前立腺がん、大腸がん、及び神経膠腫など）で発現している（非特許文献２）。これらのインテグリンの腫瘍内での発現は、黒色腫、乳がん、及び前立腺がんなどの腫瘍の進行と転移に関連している（非特許文献２）。これらのインテグリンは、複数の経路でシグナルを伝達し、内皮細胞の移動と増殖に寄与することが明らかになっている。生体内で、これらは、腫瘍新生血管及び腫瘍細胞自体で過剰発現している。このことは、これらのインテグリンの機能が腫瘍の進行を複数の機構で促進しているかもしれないことを示唆している。α５β１、αｖβ３、及びαｖβ５に対するアンタゴニストとして働く抗体及び小分子が、生体外及び生体内で血管形成を抑制することが示されている。インテグリンα５β１、αｖβ３、及びαｖβ５のインヒビターは、ＥＲＫ、Ａｋｔ、及びＦＡＫを介したシグナル伝達を阻害することができ、これにより、内皮細胞及びがん細胞の接着、移動、及び増殖を減少させる。また、こうしたアンタゴニストは、カスパーゼ依存性機構を介した細胞死を引き起こすことが分かっている。そこで、血管形成と腫瘍進行への関与におけるインテグリンα５β１、αｖβ３、及びαｖβ５の重要な役割のため、これらは抗がん治療の魅力的な標的となっており、これらのインテグリンのアンタゴニストが数多く臨床試験で試されてきた。

αｖβ３インテグリンは、αＩＩｂβ３インテグリンと同じβ３サブユニット、並びに、フィブリノゲン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子、及びビトロネクチンをはじめとするいくつかの高分子リガンドを共有している。これらのリガンドは、全て、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の３つからなるアミノ酸配列を含んでいる。フィブロネクチン及びビトロネクチンはα５β１及び他のαｖインテグリンのリガンドでもある。αＩＩｂβ３インテグリンは、血小板の主要な膜タンパク質であり、血小板の凝集で重要な役割を果たす。急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者の治療のために、αＩＩｂβ３インテグリンアンタゴニストがいくつか開発されている。しかし、血小板凝集の広範な抑制は出血の危険性を高めるため、現在進行中の研究は、出血やαＩＩｂβ３インテグリンアンタゴニストのその他の副作用を減らすことを焦点としている。異なる適応症のために一種のインテグリン又は複数種のαｖインテグリンをブロックすることで薬剤を設計することが必須である（非特許文献３）。

ディスインテグリンは、αＩＩｂβ３、α５β１、及びαｖβ３などのインテグリンに結合する低分子量ＲＧＤ含有ペプチドのファミリーであり、血小板、並びに、血管内皮細胞及びいくつかの腫瘍細胞をはじめとする他の細胞で発現している。研究により、ディスインテグリンが、その強力な抗血小板活性に加えて、心臓血管疾患の診断、並びに、動脈血栓症、骨粗鬆症、並びに血管形成に関連する腫瘍成長及び転移の治療薬の設計において新たな用途を有することが明らかとなっている。ロドストミン（Ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）（Ｒｈｏ）は、マレーマムシの毒に由来するディスインテグリンであり、血小板糖タンパク質αＩＩｂβ３を遮断することで生体外及び生体内で血小板凝集を抑制することが分かっている。また、Ｒｈｏが、インテグリンαＩＩｂβ３、α５β１、及びαｖβ３と高い親和性で結合し、がん細胞と相互作用することができることも分かっている。例えば、Ｒｈｏは、腫瘍細胞の生存率に影響せず、用量依存的に、石灰化していない骨細胞外マトリックス及び石灰化した骨細胞外マトリックスの両方への乳癌細胞及び前立腺癌細胞の接着を阻害することが報告されている。また、Ｒｈｏは乳癌細胞及び前立腺癌細胞の移動と浸潤を阻害する。

しかし、ロドストミンは、インテグリンαＩＩｂβ３、α５β１、及びαｖβ３に非特異的に結合するため、医薬に使用すると、血小板凝集の阻害に起因する出血などの重篤な副作用を引き起こすおそれがある。そこで、インテグリンα５β１とαｖβ３への選択性を有し、且つ、αＩＩｂβ３への結合活性が低減されたディスインテグリンバリアントが本技術分野で求められている。本発明はこうした需要を満たすものである。

Ｗｅｉｓ等、２０１１年、Ｃｏｌｓ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ、１巻、ａ００６４７８ Ｓｔａｕｔｏｎ等、２００６年、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、９１巻、１１１−５７頁 Ｇｏｏｄｍａｎ、２０１２年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ、２０１２年、３３巻、４０５−４１２頁

本発明は、ロドストミンなどのディスインテグリンのリンカー領域、ＲＧＤループ、及びＣ末端の１箇所以上に、１つ以上の変異を有し、αＩＩｂβ３インテグリンへの結合活性が低減していて、血小板凝固の抑制が弱いものの、α５β１及びαｖインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８など）のうち１つ以上と特異的に結合するディスインテグリンバリアントに関する。

従って、全体的態様において、本発明は、
（ａ）配列番号３３２のアミノ酸配列（ＳＲＡＧＫＩＣ）の１から５番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異リンカー、
（ｂ）配列番号３２９から３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む変異ＲＧＤループ、及び
（ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列（ＰＲＹＨ）の１から４番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異Ｃ末端、
からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前述した、変異リンカー、変異ＲＧＤループ、及び変異Ｃ末端からなる群より選択される少なくとも１つを有しないディスインテグリンと比べて、αＩＩｂβ３への結合活性が低減しているディスインテグリンバリアントに関する。また、このディスインテグリンバリアントは、前述した、変異リンカー、変異ＲＧＤループ、及び変異Ｃ末端からなる群より選択される少なくとも１つを有しないディスインテグリンと比べて、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つへの結合活性が向上していることが好ましい。

本発明の実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは任意のディスインテグリンのバリアントであってもよく、こうしたディスインテグリンとして、これらに限定されるわけではないものの、ロドストミン、アルボラブリン（ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）、バシリシン（ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、バトロキソスタチン（ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、セレベリン（ｃｅｒｅｂｅｒｉｎ）、セラスチン（ｃｅｒａｓｔｉｎ）、クロタトロキシン（ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、ズリシン（ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、エレガンチン（ｅｌｅｇａｎｔｉｎ）、フラボリジン（ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）、フラボスタチン（ｆｌａｖｏｓｔａｔｉｎ）、ハリシン（ｈａｌｙｓｉｎ）、ハリスタチン（ｈａｌｙｓｔａｔｉｎ）、ジャララシン（ｊａｒａｒａｃｉｎ）、ジャラスタチン（ｊａｒａｓｔａｔｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）、ラチェシン（ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（ｌｕｔｏｓｉｎ）、モロシン（ｍｏｌｏｓｓｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、サキサチリン（ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、テルゲミニン（ｔｅｒｇｅｍｉｎｉｎ）、トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）、トリムクリン（ｔｒｉｍｕｃｒｉｎ）、トリムターゼ（ｔｒｉｍｕｔａｓｅ）、ウスリスタチン（ｕｓｓｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、及びビリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ）からなる群より選択されるディスインテグリンが挙げられる。ディスインテグリンバリアントは配列番号１から６のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するディスインテグリンのバリアントであることが好ましい。ディスインテグリンバリアントは配列番号１のアミノ酸配列を有するロドストミンのバリアントであることがさらに好ましい。

好ましい実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、配列番号３３３のアミノ酸配列（ＲＩＰＲＧＤＭＰ）の１−３、５、７、及び８番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む変異ＲＧＤループと、本明細書に記載の変異リンカー及び変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む。

本発明の別の好ましい実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、配列番号３０６から配列番号３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異リンカーを含む。

本発明のさらに別の好ましい実施形態では、、ディスインテグリンバリアントは、配列番号３１９から配列番号３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異Ｃ末端を含む。

本発明の好ましい実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、配列番号３２９から配列番号３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異ＲＧＤループと、配列番号３０６から配列番号３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異リンカー及び配列番号３１９から配列番号３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む。ディスインテグリンバリアントは、本明細書に記載した、変異ＲＧＤループ、変異リンカー、及び変異Ｃ末端を含むことがさらに好ましい。

本発明の実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは配列番号７から配列番号１７９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のある実施形態に係るディスインテグリンバリアントは、配列番号１２３、１２４、１４７、１４９、及び１７１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

本発明のある実施形態に係るディスインテグリンバリアントは、例えば送達性又は安定性を改善するために、修飾されることが好ましい。例えば、ディスインテグリンバリアントは、ＰＥＧ化される、又は、アルブミン若しくはＦｃなどの融合パートナーと結合される。

本発明の別の全体的態様は、本発明に係るディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、ディスインテグリンバリアントをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、プロモーターなどの制御配列を含む発現ベクターであってもよい。

本発明は、本発明に係るディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞であってもよい。

本発明は、さらに、本発明のある実施形態に係る組換え宿主細胞からディスインテグリンバリアントを製造することを含む、本発明に係るディスインテグリンバリアントの製造方法に関する。

本発明に係るディスインテグリンバリアントと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供される。

本発明のさらに別の全体的態様は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連する疾患、特に、インテグリンα５β１及びαｖβ３の少なくとも１つに関連する疾患を、治療を必要とする対象において、治療する方法に関する。この方法は、本発明に係る医薬組成物を対象に投与することを含む。

本発明の一実施形態では、インテグリン関連疾患は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生症、虚血誘発性血管新生網膜症、高度近視、及び未熟児網膜症からなる群より選択される血管形成関連眼疾患の１種である。

本発明の別の実施形態では、インテグリン関連疾患は、転移性黒色腫、転移性前立腺がん、転移性乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、及び多形性膠芽腫からなる群より選択されるがんの１種である。

本発明の別の全体的態様は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連する疾患を、治療を必要とする対象において、治療するための薬剤の製造における、本発明に係るディスインテグリンバリアントの使用に関する。

添付の図面と組み合わせて読めば、上記の発明の概要及び下記の発明を実施するための形態の理解がより捗るだろう。ただし、本発明は図面に示した実施形態そのものに限定されるわけではないことを理解されたい。

ロドストミンの相互作用地図を示す。（Ａ）ロドストミンのリンカー領域、ＲＧＤループ、及びＣ末端領域の間の相互関係を示す。（Ｂ）ロドストミンとインテグリンとの間の相互作用に関連する領域のアミノ酸配列。本発明の実施形態に係るディスインテグリンバリアントにおいて変異を導入してもよい残基を『Ｘ』で示している。 Ａ３７５ヒト黒色腫細胞の移動における様々な試験薬剤の阻害活性を示す。（Ａ）野生型Ｒｈｏ、（Ｂ）ＡＲ−ＮＰ（本発明の実施形態に係るディスインテグリンバリアント）、（Ｃ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）。 （Ａ）ＡＲ−ＮＰタンパク質又はＡＲＬＤＤＬで処理したＣ５７ＢＬ／６マウスによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）ｐｌｕｇでの血管密度が、未処理対照マウスと比較して、減少していることを示す写真。（Ｂ）ＡＲ−ＮＰタンパク質又はＡＲＬＤＤＬタンパク質で毎日２回処理して５日後のＣ５７ＢＬ／６マウスによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）ｐｌｕｇのヘモグロビン含量が、未処理対照マウスと比較して、減少していることを示すグラフ。（Ｃ）５日の間に毎日１回投与してＡＲ−ＮＰタンパク質又はＡＲＬＤＤＬタンパク質で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）ｐｌｕｇのヘモグロビン含量が、未処理対照マウスと比較して、減少していることを示すグラフ。 （Ａ）未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルでの血管形成と、ＡＲ−ＮＰタンパク質で処理したＲＯＰマウスでの血管形成の減少とを示す写真。矢印は新しい血管の血管プロファイル（Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ：ＢＶＰ）を示す。（Ｂ）ＡＲ−ＮＰタンパク質で処理した未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルで新しい血管のＢＶＰが減少したことを示すグラフ。（Ｃ）ＡＲ−ＮＰタンパク質で処理した未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルで内皮細胞のＢＶＰが減少したことを示すグラフ。 ７日間のＡＲ−ＮＰタンパク質（０．１μＭ）により、未処理対照群と比較して、マウスの大動脈環が阻害されたことを示す。上段パネル：２０倍の倍率で撮影した写真。下段パネル：１００倍の倍率で撮影した写真。 ＡＲＬＤＤＬ（０．１μＭ及び１μＭ）及びＡＲ−ＮＰ（０．１μＭ及び１μＭ）の両方が４−Ｔ１乳がん細胞のコロニー形成を阻害したことを示す。 ＡＲ−ＮＰタンパク質又はＡＲＬＤＤＬタンパク質が、未処理対照群と比べて、ＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞形成を阻害したことを示す。ＡＲ−ＮＰタンパク質（Ｂ及びＣ）、ＡＲＬＤＤＬタンパク質（Ｄ）、対照（Ａ）。 ＡＲＬＤＤＬ（０．１μＭ）及びＡＲ−ＮＰ（０．１μＭ）の両方が神経膠腫の浸潤を著しく阻害したことを示す。 ５ｍｇ／ｋｇのＡＲ−ＮＰがウィスターラットの血圧及び心拍数に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。 ＡＲ−ＮＰによるＳＣＩＤマウスでのＡ３７５メラノーマの成長の阻害を示す。スケールバーは１ｃｍ。 ＡＲ−ＮＰ（ＫＧ）によるＫ−ｒａｓＧ１２Ｄトランスジェニックマウスでの腫瘍成長の阻害を示す。 ＡＲ−ＮＰ（ＫＧ）によるＵ８７保持マウスでの脳腫瘍成長の阻害を示す。

背景技術ならびに本明細書全体を通して、様々な刊行物、記事、及び特許を引用あるいは記載したが、こうした参考文献の内容を参照により本明細書で援用するものとする。本明細書に含まれている文書、法令、材料、装置、記事などの議論は、本発明の文脈を提供するためのものである。こうした議論は、当該事項の何れか又は全てが、本明細書に記載の又は特許請求の範囲に記載のいずれかの発明に関する先行技術の一部を形成すると自白するものではない。

特段の定義を設けていない限り、本願明細書で用いた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者にとって一般的に理解されるのと同じ意味である。特段の定義を設けている場合、本明細書で用いたいくつかの用語は明細書で規定したとおりの意味である。本明細書で引用した全ての特許、公開特許出願、及び公報を、それらが本明細書に記載されているかのように、参照により援用する。本明細書及び特許請求の範囲で、単数の表記は、文脈が明白にそうでないことを示していない限り、複数も包含する。

本明細書では、『ディスインテグリン』は、インテグリンの強力な可溶性リガンドで、多くの過程（細胞−細胞間及び細胞−細胞外マトリックス間の接着、移動、及び浸潤、細胞周期の進行、分化、及び多くの後生動物門に属する生物の成長段階での細胞型スペシエーション、細胞死、並びに、アポトーシスなど）の制御に関連しているシステインリッチタンパク質の一類を指す。多くの単量体ディスインテグリンでは、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）アミノ酸モチーフが保存されている。このモチーフは柔軟性ループであるインテグリン結合ループの先端に位置している。このループは、ジスルフィド結合により安定化されており、ポリペプチド鎖の主体から突出している。ヘビ毒から精製したディスインテグリンの全てが、αｖインテグリン、α５β１インテグリン、及びインテグリンαＩＩｂβ３などのフィブリノゲン受容体に結合し又はそれを標的とする。この結合は、フィブリノゲン依存的血小板凝集並びにフィブリノゲン受容体により仲介されている他の生物活性の阻害をまねく。本発明に役立つディスインテグリンの例としては、これらに限定されるわけではないものの、ロドストミン、トリフラビン（ｔｒｉｆｌａｖｉｎ）、リチスタチン（ｒｃｈｉｓｔａｔｉｎ）、トリムクリン、エレガンチン、トリグラミン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎ）、アプラギンが挙げられる。本発明に役立つディスインテグリンのペプチド配列の例としては、配列番号１から６のものがある。

本明細書では、『ディスインテグリンバリアント』は、野生型ディスインテグリンに由来する又はそれを修飾した又はそれを変異させたアミノ酸配列を含む改変機能活性タンパク質、又は、ポリペプチド若しくはその誘導体を指す。ディスインテグリンバリアントは、天然ディスインテグリンと比べて、１つ以上の変異を含有する。この１つ以上の変異は、天然ディスインテグリンに対する、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入であってもよい。一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、１つ以上の変異を有しない天然ディスインテグリンと比べて、αＩＩｂβ３インテグリンへの結合活性が低減している。ディスインテグリンバリアントは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８、並びにインテグリンα５β１のうち１つ以上に特異的に結合することがさらに好ましい。ディスインテグリンバリアントは、１つ以上変異を有しない天然ディスインテグリンと比べて、インテグリンαｖβ３及びインテグリンα５β１の一方又は両方への結合活性が向上していることが最も好ましい。

いくつかの実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、天然のＲｈｏと比べて少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含有する毒由来修飾Ｒｈｏタンパク質を含む。修飾されたＲｈｏバリアント及び／又は多種ディスインテグリンは、さらに、翻訳後修飾も受け得る。

一実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは変異ＲＧＤループを含む。本明細書では、『変異ＲＧＤループ』又は『変異ＲＧＤ領域』は、ディスインテグリンのＲＧＤループにまたがるアミノ酸配列に１つ以上の変異を含むペプチドを指す。野生型ディスインテグリンのＲＧＤループはインテグリンに結合するＲＧＤ残基を含む。例えば、ＲｈｏのＲＧＤループは配列番号３３３のアミノ酸配列（ＲＩＰＲＧＤＭＰ）を含む。本発明の好ましい実施形態では、変異ＲＧＤループは、配列番号３３３のアミノ酸配列の１−３、５、７、及び８番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む。変異ＲＧＤループは配列番号３２９から３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。

別の実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは変異リンカーを含む。本明細書では、『変異リンカー』又は『変異リンカー領域』は、ディスインテグリンのリンカー領域にまたがるアミノ酸配列に１つ以上の変異を含むペプチドを指す。ディスインテグリンのリンカー領域はＲＧＤループに直ぐに続くＮ末端に位置している。例えば、Ｒｈｏのリンカー領域は配列番号３３２のアミノ酸配列（ＳＲＡＧＫＩＣ）を含む。本発明の好ましい実施形態では、変異ＲＧＤループは、配列番号３３２のアミノ酸配列の１−５番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む。変異リンカーは配列番号３０６から３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。

さらに別の実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは変異Ｃ末端を含む。本明細書では、『変異Ｃ末端』又は『変異Ｃ末端領域』は、ディスインテグリンのＣ末端領域にまたがるアミノ酸配列に１つ以上の変異を含むペプチドを指す。ディスインテグリンのＣ末端領域はディスインテグリンのカルボキシル末端に位置している。例えば、ＲｈｏのＣ末端は配列番号３３４のアミノ酸配列（ＰＲＹＨ）を含む。本発明の好ましい実施形態では、変異Ｃ末端は、配列番号３３４のアミノ酸配列の１−４番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む。変異Ｃ末端は配列番号３１９から３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。

好ましい実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、変異ＲＧＤループと、ディスインテグリンの変異リンカー及び変異Ｃ末端のうち少なくとも１つとを含む。

好ましい実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、本明細書に記載のディスインテグリンの、変異ＲＧＤループ、変異リンカー、及び変異Ｃ末端を含む。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含んでもよい。天然アミノ酸の例としては、これらに限定されるわけではないものの、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を一般的に形成する２０種の主要天然アミノ酸が挙げられる。以下の表１は、この２０種の天然アミノ酸の一覧である。

非天然アミノ酸は、自然には生じず、或いは、化学的に合成された、非タンパク質性アミノ酸である。非天然アミノ酸の例としては、これらに限定されるわけではないものの、βアミノ酸（β３及びβ２）、ホモアミノ酸、プロリン及びピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニン及びチロシン誘導体、直鎖アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸などが挙げられる。

本明細書では、『保存的置換』とは、あるアミノ酸を正味荷電が同じで大きさと形がほぼ同じである別のアミノ酸と置換することである。脂肪族アミノ酸又は置換脂肪族アミノ酸の側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖にある炭素とヘテロ原子の総数の違いがおよそ４つまでであれば、およそ同じ大きさである。これらのアミノ酸は、その側鎖にある分岐の数の違いが１つまでであれば、およそ同じ形である。フェニル基又は置換フェニル基を側鎖に有するアミノ酸は、およそ同じ大きさと形をしていると考えられる。以下にアミノ酸の５つのグループを示す。あるポリペプチドのあるアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸に置換することは保存的置換である。
グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖又はＣ１−Ｃ４ヒドロキシル基置換脂肪族側鎖（直鎖又は単分岐）を有する非天然アミノ酸
グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸、カルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（直鎖又は単分岐）を有する非天然アミノ酸
グループＩＩＩ：リシン、オルニチン、アルギニン、及びアミン又はグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（直鎖又は単分岐）を有する非天然アミノ酸
グループＩＶ：グルタミン、アスパラギン、及びアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（直鎖又は単分岐）を有する非天然アミノ酸
グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、及びトリプトファン

本明細書では、『高度に保存的置換』とは、あるアミノ酸を側鎖に同じ官能基を有し大きさと形がほとんど同じである別のアミノ酸と置換することである。脂肪族アミノ酸又は置換脂肪族アミノ酸の側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖にある炭素とヘテロ原子の総数の違いが２つまでであれば、ほとんど同じ大きさである。これらのアミノ酸は、その側鎖にある分岐の数が同じであれば、ほとんど同じ形である。高度に保存的置換の例としては、ロイシンをバリンに、セリンをスレオニンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、フェニルアラニンをフェニルグリシンに置換することが挙げられる。

本明細書では、『単離タンパク質』又は『単離ポリペプチド』という用語は、とりわけ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、若しくは合成起源の核酸、又はこれらの組み合わせをはじめとする核酸によりコードされるタンパク質であって、（１）通常みつかるだろうタンパク質の少なくともいくつかを含まない、（２）同一起源（例えば、同一細胞又は種）に由来する他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞により発言される、（４）起源細胞から単離したときに通常みつかるだろうポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）『単離タンパク質』が天然では結合されているポリペプチドの全て又は一部に（共有結合相互作用によっても非共有結合相互作用によっても）結合されておらず、（６）天然では結合されていないポリペプチドに（共有結合相互作用又は非共有結合相互作用によって）動作可能なように結合されており、又は（７）天然では生じない、タンパク質を指す。単離タンパク質は、天然環境でみつかる、医薬、診断、予防、又は研究での使用を妨げるだろう他の混入タンパク質若しくはポリペプチド又は他の混入物質を実質的に含まないことが好ましい。

本明細書では、『ポリヌクレオチド』、『ヌクレオチド』、『オリゴヌクレオチド』、及び『核酸』という用語は、相互に置換可能に用いられており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの誘導体、又はこれらの組み合わせを含む核酸を指す。

本明細書では、『ポリペプチド』及び『タンパク質』という用語は、相互に置換可能に用いられており、天然由来及び非組換え細胞により生産されたタンパク質、遺伝子操作若しくは遺伝子組換え細胞により生産されたタンパク質、又は化学合成により生産されたタンパク質を指し、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は、天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、追加、及び／若しくは置換を有する配列を有する分子を含む。本発明によれば、ディスインテグリンは、修飾Ｒｈｏタンパク質又はその断片又はそのバリアントを特に包含するポリペプチド又はタンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、ディスインテグリンは、インテグリン活性を阻害するＲｈｏタンパク質又はその断片若しくはバリアントを包含する。いくつかの特定の実施形態では、ディスインテグリンは、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６及びαｖβ８、並びにインテグリンα５β１から選択される任意のグループなどのαｖインテグリンアイソフォームを標的とする。いくつかの他の特定の実施形態では、インテグリンはαＩＩｂβ３ではない。

本明細書では、『宿主細胞』は、任意の組換えベクター又はポリヌクレオチドのレシピエントになり得る又はレシピエントとなっている個別の細胞又は培養細胞である。宿主細胞は、単一宿主細胞を継代したものを含み、こうした継代物は、天然な、偶発的な、又は意図的な変異及び／又は変化により、もとの親細胞と完全に（形態又は全ＤＮＡ相補体が）同一でなくてもかまわない。宿主細胞は、組換えベクター又は本発明に係るポリヌクレオチドをインビトロ又はインビボで導入又は感染された細胞を含む。本発明に係る組換えベクターを含む宿主細胞は、『組換え宿主細胞』と呼ぶこともできる。適切な宿主細胞として、例えば、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞をはじめとする原核細胞又は真核細胞が挙げられる。

本明細書では、『結合活性』という用語は、インテグリン活性の阻害、遮断、中和、低減、無効化、又は妨害の１つ以上につながるディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントがインテグリンに結合することを指す。いくつかの実施形態では、ディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントは、インテグリンに結合し、インテグリンを他の分子（例えば、他のＥＣＭタンパク質）との結合から隔離することで、インテグリン活性を阻害する。いくつかの他の実施形態では、ディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントは、インテグリンに結合し、インテグリンが細胞内で下流シグナル伝達イベントを引き起こすことを防ぐことで、インテグリン活性を阻害する。

本明細書では、『阻害』という用語は、インテグリン活性に関する文脈において、種々の機能分析（これらに限定されるわけではないものの、バインディングアッセイ、マイグレーションアッセイ、アポトーシスアッセイ、及び、細胞接着アッセイなど）により解析した際のディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントがインテグリンの活性を減らす性質を指す。本発明に係るいくつかの実施形態では、インテグリンは、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８をはじめとするαｖインテグリンアイソフォームである。いくつかの他の特定の実施形態では、インテグリンはα５β１である。いくつかのさらなる実施形態では、ディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントは、これらのディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントが存在しない対照と比べて、約０％から約１００％だけインテグリン活性を阻害する。

本明細書では、『選択的に結合する』、『選択的に阻害する』、『選択的結合』、『選択的阻害』、『特異的に結合する』、『特異的に阻害する』、『特異的結合』、又は『特異的結合』という用語は、特定の標的インテグリン分子に対して１種以上の他のインテグリンを上回る差異的特異性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示すディスインテグリン又はディスインテグリンバリアントの性質を指す。例えば、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１の１種以上に選択的に結合し、そして、αＩＩｂβ３インテグリンなどの他のインテグリンよりもインテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１の１種以上に高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、修飾Ｒｈｏ断片を含むディスインテグリンバリアントは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びインテグリンα５β１からなる群より選択される１種以上のインテグリンの活性を選択的に阻害する。好ましい実施形態では、修飾Ｒｈｏ断片を含むディスインテグリンバリアントは、インテグリンαｖβ３とインテグリンα５β１の両方、インテグリンαｖβ５とインテグリンα５β１の両方、又はインテグリンαｖβ６とインテグリンα５β１の両方の活性を特異的に阻害する。いくつかの代替的実施形態では、修飾Ｒｈｏ断片を含むディスインテグリンバリアントは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びインテグリンα５β１の活性の全てを特異的に阻害する。

本明細書では、『相同性』又は『相同（的）』という用語は、Ｒｈｏ断片などの対応するディスインテグリン断片間での全体的な配列の相似性及び／又は同一性の水準を指す。高い配列相同性はタンパク質活性が保存されていることを示唆する。配列相同性を求めるために数多くの公開されたアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを使用することができる。保存的又は非保存的置換の適否と配列相同性の水準を決定することは当業者の能力の範囲である。

本明細書では、『対象』は、任意の動物（これらに限定されるわけではないものの、ヒト、他の霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ギニアピッグ）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、ボバイン（Ｂｏｖｉｎｅｓ）（例えば、ウシ）、オバイン（Ｏｖｉｎｅｓ）（例えば、ヒツジ）、カプリン（Ｃａｐｒｉｎｅｓ）（例えば、ヤギ）、ポーキン（Ｐｏｒｃｉｎｅｓ）（例えば、ブタ（Ｓｗｉｎｅ））、エキン（Ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ウマ）、ケイナイン（Ｃａｎｉｎｅｓ）（例えば、イヌ）、フェリン（ｆｅｌｉｎｅｓ）（例えば、ネコ）、及び家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、他の家禽の鳥など）を含む）、並びに、野生化動物又は野生動物（これらに限定されるわけではないものの、有蹄動物（例えば、シカ）、クマ、ウサギ目、齧歯類、鳥類などの動物を含む）を指す。この用語は特定の年齢又は性別に限定されることを意図するものではない。そのため、成体及び新生児の対象並びに胎児も雌雄を問わずこの用語に包含される。『治療を必要とする』対象とは、インテグリンの活性を１種以上阻害することで、有益な治療及び／又は予防効果が得られ、治療することができる疾患及び／又は病気を有する対象のことである。有益な成果としては、症状の重症度の低下、症状の発現の遅延、寿命の延長、及び／又は、疾患若しくは病気のより急速な若しくはより完全な解消が挙げられる。

『医薬的に許容可能な担体』は、任意の従来の種類の、非毒性で、固体、半固体、又は液体の、充填剤、希釈剤、封入材料、製剤助剤、又は添加剤を指す。医薬的に許容可能な担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、製剤の他の成分と両立し得るものである。

本明細書では、『医薬的に許容可能な塩』は、親化合物がその酸塩又は塩基塩（ａｃｉｄ ｏｒ ｂａｓｅ ｓａｌｔｓ）を作ることで修飾されている化合物誘導体を指す。

本明細書では、『インテグリン関連疾患』は、医学的介入が必要な又は医学的介入が望ましい、インテグリンに関連する任意の病気、障害、又は症候群を指す。こうした医学的介入としては、治療、診断、及び／又は、予防を挙げることができる。

本明細書では、『有効量』又は『十分量』は、特定の疾患、障害、病気、又は副作用の症状を阻害、予防、又は治療するために治療上有効であり得る本明細書に記載のディスインテグリンバリアントの量を指す。

『治療』という用語は、特定の疾患、障害、病気、又は副作用の症状の頻度、程度、重症度、及び／又は持続時間を減らすことを意味する。

『予防』という用語は、特定の疾患、障害、病気、又は副作用の症状を阻害又は防ぐことを意味する。

（ディスインテグリンバリアント）
本発明では、ヘビ毒由来のディスインテグリン（マレーマムシ由来のロドストミン（Ｒｈｏ）など）のバリアントが、αｖＩＩｂβ３への結合活性は低減するものの、αｖインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８など）及び他のインテグリン（α５β１など）の１種以上に選択的に結合するという異なった能力を示すことを発見した。いくつかのインテグリンへの選択的結合能は、問題のディスインテグリンの、リンカー領域、ＲＧＤループ、及びＣ末端のうち１つ以上でのアミン酸配列を変異させることにより可能となった。

従って、本発明の全体的態様はディスインテグリンバリアントに関する。本発明に係る一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、αＩＩｂβ３との結合活性が低減しており、且つ、α５β１、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８のうち少なくとも１種に特異的に結合する。

ディスインテグリンバリアントは、αＩＩｂβ３との結合活性が低減しているものの、ディスインテグリンバリアントの由来となった野生型ディスインテグリンと比べて、α５β１及びαｖβ３の少なくとも一方との結合活性が向上していることが好ましい。

例えば、ＲＧＤループのＲｈｏ変異（例えば、^４６ＸＸＸＲＸＤＸＸ^５３）がαＶβ３及び／又はα５β１インテグリンへの特異性を向上させることができ、Ｃ末端領域での変異（例えば、^６５ＸＸＸＸ^６８）がαＩＩｂβ３への結合性を低下させ（そして、血小板凝集抑制を弱め、出血副作用を低減す）ることができ、また、リンカー領域での変異（例えば、^３９ＸＸＸＸＸＩＣ^４５）もαＩＩｂβ３への結合性を低下させることができる。なお、上述した３つの領域はそれぞれ野生型Ｒｈｏでのアミノ酸残基番号により特定しており、本発明の実施形態に従って（例えば、挿入、欠失、又は置換により）修飾可能なアミノ酸残基をそれぞれ独立に『Ｘ』で示している。

本発明の実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは、ＲＧＤループでの変異（例えば、^４６ＸＸＸＲＸＤＸＸ^５３）、即ち、変異ＲＧＤループを含む。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４９ＲＸＤ^５１のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号７から２４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４８ＸＲＧＤ^５１のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号２５から４２のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４８ＸＲＧＤＸＰ^５３のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号４３から６１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４８ＸＲＧＤＭＸ^５３のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号６２から７８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４６ＸＸＰＲＧＤ^５１のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号７９から９４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^４８ＸＲＸＤＸＰ^５３のコンセンサス配列を有する変異ＲＧＤループを含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号９５から１０１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

本発明の別の実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは、Ｃ末端領域での変異（例えば、^６５ＸＸＸＸ^６８）、即ち、変異Ｃ末端を含む。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^６５ＰＲＸＸＸＸＸ^７１のコンセンサス配列を有するＣ末端を含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号１０２から１０７のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^６５ＰＲＸＸＸＸＸ^７１のコンセンサス配列を有するＣ末端を含み、さらに、本明細書で記載したような変異ＲＧＤループをさらに含む。例えば、変異ＲＧＤループは、^４８ＡＲＧＤＭＰ^５３（配列番号３３５）のコンセンサス配列を有していてもよい。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号１１５から１１９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

本発明のさらに別の実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは、リンカー領域での変異（例えば、^３９ＸＸＸＸＸＩＣ^４５）、即ち、変異リンカーを含む。

一実施形態では、ディスインテグリンバリアントは、^３９ＫＫＫＲＴＩＣ^４７（配列番号３０６）のコンセンサス配列を有する変異リンカーを含む。ディスインテグリンバリアントは本明細書で記載したような変異ＲＧＤループをさらに含むことが好ましい。例えば、変異ＲＧＤループは、^４８ＸＲＸＤＸＰ^５３を有していてもよい。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号１０８から１１４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

本発明のさらなる実施形態によれば、ディスインテグリンバリアントは、リンカー領域での変異（例えば、^３９ＸＸＸＸＸＩＣ^４５）、ＲＧＤループでの変異（例えば、^４６ＸＸＸＲＸＤＸＸ^５３）、及びＣ末端領域での変異（例えば、^６５ＸＸＸＸ^６８）を含む。こうしたバリアントの例としては、これらに限定されるわけではないものの、配列番号１２０から１７９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは、本開示に鑑み、本発明の目的に適した任意の方法により、作ることができる。例えば、ディスインテグリンバリアントは、部位特異的変異導入法により構築することができる。本発明に係るディスインテグリンバリアントは、本開示に鑑み、本技術分野で周知の方法を用いて、発現させることができる。本発明のペプチドの産生には細胞系を用いた方法及び無細胞系を用いた方法が適している。細胞系を用いた方法は、一般的に、インビトロで核酸構築物を宿主細胞に導入し、この宿主細胞を発現に適した条件で培養し、その後、培地及び宿主細胞の一方又は両方から（例えば、宿主細胞の破砕などにより）ペプチドを回収することを伴う。また、本発明は、本技術分野で周知の無細胞インビトロ転写／翻訳法を用いたディスインテグリンバリアントの生産法を提供する。

ディスインテグリンバリアントは、αＩＩｂβ３受容体遮断活性が実質的に低減しており、並びに／又は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８、並びに他のインテグリン（α５β１など）の１種以上への特異性が向上しているポリペプチドとなる修飾アミノ酸配列をコードする修飾ディスインテグリンヌクレオチド配列によりコードされ得る。ディスインテグリンバリアントのコード配列は、蛇毒由来のディスインテグリンのコード配列を修飾することで得ることができる。ディスインテグリンは、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン、及びビリジンのいずれかから選択できる。

本発明の別の全体的態様は、本発明に係るディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらに別の全体的態様は、本発明に係るディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。

典型的には、修飾されているか否かを問わず、異種ペプチドは、上述したようにそのまま発現させたり、或いは、融合タンパク質として発現させたりしてもよく、また、当該ペプチドは、分泌シグナルのみならず分泌リーダー配列を含んでもよい。本発明に係る分泌リーダー配列は、いくつかのタンパク質を小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ＥＲ）又はペリプラズムに向かわせることができる。ＥＲは膜結合性タンパク質を他のタンパク質と隔てている。タンパク質は、一旦ＥＲに集まると、さらに、分泌小胞などの小胞、原形質膜、リソソーム、及び他の細胞小器官への分配のためにゴルジ体に向かわせられ得る。ペリプラズムの場合、タンパク質は、大腸菌などのグラム陰性細菌のペリプラズム間隙内に分泌される。

さらに、ペプチド部分構造及び／又は精製タグをディスインテグリンバリアントに付加することもできる。こうした領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。分泌又は排出を新たに生じさせるために、安定性を向上させるために、精製を促進するために、或いは他の理由で、ペプチド部分構造をポリペプチドに付加することは、本技術分野で慣用されるルーチンの技術である。適した精製タグとしては、例えば、Ｖ５、ポリヒスチジン、アビジン、及びビオチンが挙げられる。ビオチン等の化合物とペプチドの結合は、本技術分野で周知の技術を用いて行うことができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編、『Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ』、アカデミックプレス社、１９９６年）。また、ペプチドは、本技術分野で周知の技術を用いて、放射性同位体、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド金、核酸、ビノレルビン、及びドキソルビシンに結合することもできる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミックプレス社、１９９６年、及び、Ｓｔｅｆａｎｏ等、２００６年）。

本発明での使用に適した融合パートナーとしては、例えば、フェツイン、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンＣＨ２／ＣＨ３ドメイン（Ｆｃ）、及び／又は、これらの断片の１つ以上が挙げられる。ポリエチレングリコール結合体などの結合タンパク質も提供される。

本発明に係るペプチドは、本技術分野で周知の技術を用いて、化学的に合成することもできる（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１０巻、１０５−１１１頁、１９８４年、Ｇｒａｎｔ編、『Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ』、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー、１９９２年、及び米国特許第６９７４８８４号明細書を参照）。例えば、あるポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機を利用して、又は、本技術分野で周知の固相法の利用を介して、合成することができる。

さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸アナログを置換又は追加としてポリペプチド配列に導入できる。非古典的アミノ酸としては、これらに限定されるわけではないものの、普通のアミノ酸のＤ体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２ーアミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など）、及び一般的なアミノ酸アナログが挙げられる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）でもＬ（左旋性）でもよい。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは、標準的な方法により、化学合成物又は組換え培養細胞から回収精製できる。こうした方法としては、これらに限定されるわけではないものの、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。一実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（『ＨＰＬＣ』）を精製に用いる。単離及び／又は精製中にポリペプチドが変性した場合、活性立体配座を取り戻すために、タンパク質をリフォールドするための周知技術を用いることができる。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは、ペプチドの可溶性と循環半減期を増すために、種々の親水性ポリマーの１つ以上で修飾されても又はこれらに共有結合されてもよい。ペプチドへの結合に適した非タンパク質性親水性ポリマーとしては、これらに限定されるわけではないものの、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールに代表されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース及びセルロース誘導体、デキストラン及びデキストラン誘導体が挙げられる。一般的に、こうした親水性ポリマーは、約５００から約１０００００ダルトン、約２０００から約４００００ダルトン、又は約５０００から約２００００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。Ｓ．Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６巻、１５０−１６５頁、１９９５年、Ｃ．Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６巻、６２−６９頁、１９９５年、米国特許第４６４０８３５号明細書、米国特許第４４９６６８９号明細書、米国特許第４３０１１４４号明細書、米国特許第４６７０４１７号明細書、米国特許第４７９１１９２号明細書、米国特許第４１７９３３７号明細書、又は国際公開第９５／３４３２６号に記載の方法のいずれかを用いて、ペプチドを上述したポリマーで誘導体化したり上述したポリマーに結合したりできる。

（医薬組成物）
本発明の別の全体的態様は、本発明に係るディスインテグリンバリアントと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。必要に応じて、医薬組成物は、固体、半固体、液体、又は気体状の製剤（錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル剤など）に製剤化することができる。以下に示す方法及び添加剤は単なる例示に過ぎず、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、本技術分野で広く多くが周知である、医薬的に許容可能な、担体、添加剤、及び希釈剤を含む製剤として提供される。こうした医薬的に許容可能な、担体、添加剤、及び希釈剤としては、米国薬局方の医薬品添加剤のリスト（『ＵＳＰ ａｎｄ ＮＦ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ』、２４０４−２４０６頁、ＵＳＰ２４ＮＦ１９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル（ＩＳＢＮ１−８８９７８８−０３−１））に列記されたものなどが挙げられる。医薬的に許容可能な添加剤（ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤など）は公知であり容易に利用可能である。さらに、医薬的に許容可能な補助物質（ｐＨ調節及び緩衝材、等張化剤、安定剤、湿潤剤など）も公知であり容易に利用可能である。

適した担体としては、これらに限定されるわけではないものの、水、デキストロース、トレハロース、ヒスチジン、グリセロール、生理食塩水、エタノール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。担体は、製剤の有効性を高める追加の剤（湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝材、又はアジュバントなど）を含んでもよい。局所用担体としては、流動石油、イソプロピルパルミテートポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、ポリオキシエチレンモノラウレート水溶液（５％）、又はラウリル硫酸ナトリウム水溶液（５％）が挙げられる。他の材料（抗酸化剤、保湿剤、粘度安定剤、及び同種の剤など）を必要に応じて添加することもできる。Ａｚｏｎｅなどの経皮浸透促進剤を配合することもできる。

当業者にとって、こうした剤形の実際の製造法は、周知又は明白である。投与される組成物又は製剤は、いずれにせよ、治療対象を望ましい状態にするために十分な量の剤を含むだろう。

いくつかの実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、水性溶媒又は非水性溶媒（植物油又は他の同種の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸又はプロピレングリコールのエステルなど）中に、溶解、懸濁、又は乳化し、必要に応じて、従来の添加物（可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤）を配合することで、注射用製剤に製剤化できる。経口送達又は非経口送達のための他の製剤も本技術分野で周知のとおり用いることができる。

医薬剤形では、本発明に係る医薬組成物は、医薬的に許容可能な塩の形態で投与することができるし、また、単独で若しくは他の医薬活性化合物と適切に関連させて又は組み合わせて用いることもできる。対象組成物は将来の投与法に合わせて製剤化される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、注射用液状形態など、非経口投与用に製剤化される。

（治療法）
また、本発明は、治療を必要とする患者でのα５β１、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８からなる群より選択される１種以上のインテグリンと関連する疾患の治療及び／又は予防におけるディスインテグリンバリアントの使用に関する。こうした疾患としては、これらに限定されるわけではないものの、骨粗鬆症、骨腫瘍成長又は骨肉腫成長及びその関連症状、血管形成関連腫瘍成長及び転移、骨での腫瘍転移、悪性腫瘍誘導性高カルシウム血症、血管形成関連眼疾患、パジェット病、関節リュウマチ、及び骨関節炎が挙げられる。本方法は、医薬有効量の本発明に係るディスインテグリンバリアントと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを含む。

本発明の一実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、血管形成関連眼疾患の治療及び／又は予防のために使用される。こうした血管形成関連眼疾患としては、これらに限定されるわけではないものの、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生症、虚血誘発性血管新生網膜症、高度近視、及び未熟児網膜症が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、血管形成関連疾患の治療及び／又は予防のために使用される。こうした血管形成関連疾患としては、これらに限定されるわけではないものの、がん、眼関連疾患（黄斑変性症など）、浮腫が挙げられる。

別の実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、角膜に存在するαｖインテグリン（αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８）に結合し、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の活性化を仲介し、関連疾患の治療を成し遂げる。こうした疾患としては、眼疾患、関節炎、及びがんが挙げられる。さらなる態様では、本発明に係るポリペプチドは、関節炎痛の緩和のため、並びに、病的及び破壊的な血管による骨関節破壊の予防のための、抗血管新生薬である。また、本発明に係るポリペプチドは、従来の化学療法又は放射線療法と組み合わせると、異なる戦略で同時にがんを攻撃する『多弾頭』アプローチの一環として、役立つことが明らかとなる可能性がある。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、骨粗鬆症の治療及び／又は予防のために使用される。骨粗鬆症は、閉経後のエストロゲンの不足、続発性骨粗鬆症、関節リュウマチ、卵巣摘出、パジェット病、骨肉腫、骨腫瘍、骨関節炎、破骨細胞形成増加、及び破骨細胞活性増加から選ばれる病状と関連している。さらに、骨粗鬆症として、これらに限定されるわけではないものの、卵巣摘出誘導性骨粗鬆症若しくは骨粗鬆、又は、閉経後骨粗鬆症若しくは骨粗鬆が挙げられる。

本発明のさらに別の実施形態は、卵巣摘出骨粗鬆症又は閉経後骨粗鬆症により誘導されるヒトをはじめとする哺乳類での生理学的変化の治療及び／又は予防のためにディスインテグリンバリアントを使用する方法である。本方法は、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、又はα５β１受容体アンタゴニスト活性を有し、野生型ディスインテグリンと比べて、インテグリンαＩＩｂβ３受容体遮断活性が実質的に低減している単離ポリペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を医薬有効量でそれを必要としている哺乳類に投与し、これにより、卵巣摘出により誘導された哺乳類で生理学的変化を治療及び／又は予防することを含む。

別態様では、本発明は、本発明に係るディスインテグリンバリアント又は本発明に係る医薬組成物をこうした治療を必要とする対象に有効量で投与することを含む、血小板凝集阻害法を提供する。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは、全身注射（静脈注射など）又は関連部位への注射若しくは塗布（直接の注射、若しくは、部位が手術で露出したときの当該部位への直接の塗布）又は局所的塗布（皮膚上の障害の場合）などにより、治療を必要とする対象に投与できる。

本発明に係るディスインテグリンバリアントは、単剤療法に使用することができる。この代わりに、本発明に係るディスインテグリンバリアントを、インテグリン関連疾患を治療するために、標準レジメンと組み合わせて使用することもできる。例えば、本発明に係るペプチドは、治療有効量の１種以上の他の医薬剤との併用療法に使用することができる。別の医薬剤は、抗がん剤、抗炎症剤、免疫調節剤、及び抗骨粗鬆症剤からなる群より選択されることが好ましい。抗がん剤は、抗血管形成剤、細胞毒性剤、及び抗新生物剤からなる群より選択されることが好ましい。他の医薬剤は、本発明に係るペプチドの投与に先立って、この投与とともに、又はこの投与後に投与することができる。

いくつかの実施形態では、本発明に係るディスインテグリンバリアントは、オステオポンチンの高発現に関連するがんに対して特に有効である。好ましい実施形態では、本発明に係るポリペプチドはオステオポンチン誘導性腫瘍浸潤を阻害することができる。

ディスインテグリンバリアントの投与は、経口投与、口腔投与、経鼻投与、経直腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、気管内投与、及びくも膜下投与などをはじめとする種々の方法で、又は、他の方法としては、移植若しくは吸入により、実行することができる。

以下の本発明の実施例は本発明の性質をさらに詳しく説明するためのものである。以下の実施例は本発明を制限するものではなく、発明の権利範囲は添付の特許請求の範囲により定められることを理解されたい。

［実施例］
［実施例１：野生型Ｒｈｏ及びＲｈｏ変異体（ディスインテグリンバリアント）を発現する発現ベクターの構築］
ＲｈｏをコードするＤＮＡをピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で優先的に使用されるコドンから構成した。ＲｈｏＤＮＡを、センスプライマー（Ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号１８３）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。このセンスプライマーは、ＥｃｏＲＩ認識部位を持ち、精製を助けるための６つのヒスチジン残基をコードしている。アンチセンスプライマー（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）は、ＳａｃＩＩ認識部位とＴＣＡ（又はＴＴＡ）停止コドンを持つ、５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８０）又は５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８４）の配列を有する。ＰＣＲ産物は、精製後、酵母組換えベクターｐＰＩＣＺαＡのＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩ部位にライゲートした。この組換えプラスミドを用いＤＨ５α株を形質転換し、低塩ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣＬ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）と２５μｇ／ｍｌの抗生物質ゼオチンを含む寒天プレート上でコロニーを選別した。

Ｒｈｏの変異体をコードする様々なＤＮＡ構築物を合成し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩ制限酵素認識部位を含むプライマーによる重複オリゴヌクレオチド戦略を用いたＰＣＲにより増幅した。図示するため、表２に、本発明に係る実施形態におけるいくつかのディスインテグリンバリアントのコンセンサス配列とこうしたバリアントを構築するために用いたプライマーを列記する。プレイマー配列は、５’から３’（左から右）の順に示している。

本発明に包含される他のバリアントをコードする発現ベクターは、本開示に鑑み、同様に構築された又は同様に構築できる。ディスインテグリンバリアントの合成又は確認に用いられる様々なプライマーを配列番号１８０から３０５に列記する。

［実施例２：Ｒｈｏ変異体の発現と精製］
ピキア・パストリスでのロドストミン変異体及びバリアントのタンパク質発現を、Ｐｉｃｈｉａ ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）キットのプロトコルに従い若干の修正を加えて行った。簡単に説明すると、まず、ロドストミン又はディスインテグリンのバリアントをコードするＤＮＡを含有するプラスミド合計１０μｇを精製し、プラスミドを直線化するためにＳａｃＩで切断した。インビトロジェン（登録商標）社のＰｉｃｈｉａ ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）を用いて、ヒートショック法により、ピキア株Ｘ３３を直線化構築物で形質転換した。形質転換体はシングルクロスオーバーにより５’ＡＯＸ１座位が組み換えられた。Ｒｈｏ遺伝子がピキアゲノムに組み込まれたか否かを確かめるため、ＰＣＲを用いてピキア組み込み体を解析し、細胞をＬｙｔｉｃａｓｅ（シグマ社）により溶解させた。ＹＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、及び２％寒天）と１００μｇ／ｍｌのゼオチンを含む寒天プレート上でコロニーを選別した。複数コピーのディスインテグリン挿入を含むクローンを多数選別し、ディスインテグリンタンパク質の発現が最も高い変種のクローンを選んだ。

組換えＲｈｏ変異体を以下の手順で得た。１００μｇ／ｍｌのゼオチンを含有するＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び２％デキストロース）中、３０℃で、コロニーを培養し、選別した。４８時間後、細胞を遠心分離により集め、最少メタノール培地（１．３４％酵母窒素ベース（硫酸アンモニウム含有、アミノ酸不含）及び４×１０^−５％ビオチンを含有する培地）１リットル中で培養した。合計で１％のメタノールを２４時間毎に１回添加し、Ｒｈｏ又はバリアントの発現を２日間誘導した。上清を遠心分離により集め、緩衝液Ａ（５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝材、ｐＨ７．７）５リットルで透析を２回行った。最終溶液をニッケルキレートカラムに添加し、２００ｍＭイミダゾール勾配で溶出した。さらに、ＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ）により組換えロドストミンとディスインテグリンバリアントを精製した。精製した組換えディスインテグリンバリアントは、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めて、９５％超の純度を有していた。

［実施例３：Ｒｈｏ変異体による異なるαｖインテグリン及びα５β１インテグリンにより仲介される細胞接着の阻害］
Ｒｈｏ変異体及びバリアントの阻害活性を周知の細胞接着阻害アッセイにより評価した（Ｚｈａｎｇ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、第７３巻、７３４５−７３５０頁、１９９８年）。ＣＨＯ−αＩＩｂβ３細胞のフィブリノゲンへの接着、ＣＨＯ−αｖβ３細胞のフィブリノゲンへの接着、Ｋ５６２細胞のフィブロネクチンへの接着、ＨＴ−２９細胞のビトロネクチンへの接着、及びＨＴ−２９細胞のフィブロネクチンへの接着を用いて、αＩＩｂβ３、αｖβ３、α５β１、αｖβ５、及びαｖβ６への被験タンパク質の阻害活性を求めた。簡単に説明すると、まず、９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク）を５０−５００ｎＭの濃度で基質を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸緩衝剤、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１００μｌでコートし、４℃で一晩インキュベートした。基質とコーティング濃度は、フィブリノゲン（Ｆｇ）２００μｇ／ｍｌ、ビトロネクチン（Ｖｎ）５０μｇ／ｍｌ、及びフィブロネクチン（Ｆｎ）２５μｇ／ｍｌである。各ウェルに熱変性した１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）２００μｌを加え室温で１．５時間インキュベートすることで非特異的タンパク質結合部位をブロックした。熱変性ＢＳＡを捨て、各ウェルをＰＢＳ２００μｌで２回洗った。

インテグリンαｖβ３（ＣＨＯ−αｖβ３）とαＩＩｂβ３（ＣＨＯ−αＩＩｂβ３）を発現するＣＨＯ細胞は、Ｙ．Ｔａｋａｄａ博士（スクリプス研究所所属）のご厚意により提供頂いたものであり、ＤＭＥＭ中で維持した。ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞及び結腸直腸腺癌ＨＴ−２９細胞は、ＡＴＣＣから購入し、５％ＦＣＳを含有するロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で培養した。採取したＫ５６２及びＨＴ−２９細胞を１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液で洗い、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、２ｍＭのＣａＣｌ_２、及び５００μＭのＭｎＣｌ_２を含有するタイロード緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）［ｐＨ７．３５］に再懸濁した。細胞（ＣＨＯ、Ｋ５６２、及びＨＴ−２９）を３×１０^５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬの細胞をアッセイに用いた。Ｒｈｏ及びその変異体を培養細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で、１５分間、インキュベートした。Ｒｈｏ及びそのバリアントは０．００１−５００μＭの濃度で阻害剤として用いた。その後、被験細胞をコートしたプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で、１時間、反応させた。その後、インキュベーション溶液を捨て、接着していない細胞を２００μＬのＰＢＳで２回洗い除去した。

接着している細胞をクリスタルバイオレット染色により定量化した。簡単に説明すると、まず、ウェルを１００μＬの１０％ホルマリンで１０分間固定し、乾燥した。その後、５０μＬの０．０５％クリスタルバイオレットを室温で２０分間ウェルに加えた。各ウェルを２００μＬの蒸留水で４回洗い、乾燥した。発色は１５０μＬの発色液（５０％アルコール及び０．１％酢酸）を加えて行った。この結果得られる吸光度を６００ｎｍで測定し、測定値と接着細胞数の相関を求めた。阻害活性は、％阻害＝１００−［ＯＤ_６００（Ｒｈｏ野生型又はディスインテグリン処理サンプル）／ＯＤ_６００（未処理サンプル）］×１００として求めた。

ＩＣ_５０は、特定のインテグリンにより仲介される細胞接着の５０％阻害に必要なディスインテグリンバリアントの濃度（ｎＭ）として求めた。従って、ＩＣ_５０が低いことは、対応するインテグリンの細胞接着活性を阻害するディスインテグリンバリアントの特異性又は有効性が高く、そして、対応するインテグリンへのディスインテグリンバリアントの結合活性（又は選択性）が高いことを意味する。ＩＣ_５０の結果は以下の表３から１４にまとめて示す。

ＲＧＤループ領域（Ｒ^５０ＸＤ、^４８ＸＲＧＤ、ＡＲＧＤ^５２ＸＰ、ＡＲＧＤＭ^５３Ｘ、^４６Ｘ^４７ＸＰＲＧＤ、及びＡＲＧＤ^５１Ｘ^５２Ｘ）、リンカー領域（^３９Ｘ^４０Ｘ^４１Ｘ^４２Ｘ^４３Ｘ）、及びＣ末端領域（^６６Ｘ^６７Χ^６８Χ^６９Χ^７０Χ、^６６ＸＬＹＧ、Ｄ^６７ＸＹ）に関する一連のＲｈｏ変異体を、組み換え発現し、精製して、均質物を得た。細胞接着アッセイ及び血小板凝集アッセイを用い、インテグリン結合親和性を求めた。これらの領域に１つ以上の修飾を有するロドストミン又はディスインテグリンのバリアントが、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１、及びαＩＩｂβ３に異なる選択的結合親和性を有することが分かった（表３から１４）。

例えば、ＲＸＤモチーフにいくつかの変異を持つＲｈｏバリアント（『Ｇｌｙ５０（Ｇ）』残基が、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、又はＡｒｇ（Ｒ）で置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒１６８６倍）＞α５β１（≒５８６倍）＞αｖβ５（≒３４８倍）＞αｖβ６（≒１７９倍）＞αｖβ３（≒２６倍）。即ち、αｖβ３への結合選択性が示された（表３）。ＸＲＧＤモチーフに変異を持つＲｈｏバリアント（Ｐ^４８残基が他のアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。α５β１（≒７１倍）＞αＩＩｂβ３（≒４１倍）＞αｖβ３（≒５倍）（表４）。ＡＲＧＤＸＰモチーフに変異を持つＲｈｏバリアント（Ｍ^５２残基が他のアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒２０９倍）＞α５β１（≒１２２倍）＞αｖβ３（≒１４倍）（表５）。ＡＲＧＤＭＸモチーフに変異を持つＲｈｏバリアント（Ｐ^５３残基が他のアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒２５８倍）＞α５β１（≒４５倍）＞αｖβ３（≒４０倍）（表６）。ＸＸＰＲＧＤモチーフに変異を持つＲｈｏバリアント（Ｒ^４６及びＩ^４７残基が他のアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒７３倍）＞α５β１（≒１９倍）＞αｖβ３（≒１０倍）（表７）。以上の結果から、ＲＧＤループの変異は、インテグリンαＩＩｂβ３及びα５β１での阻害活性に顕著な効果を示すものの、αｖβ３インテグリンには示さないことが分かった。

ＲＧＤモチーフに加えて、例えば、リンカー領域又はＣ末端に、１つ以上の修飾を持つロドストミン又はディスインテグリンの変異体は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１、又はαＩＩｂβ３への選択的結合能を示した（表８から１４）。例えば、リンカー領域（^３９Ｘ^４０Ｘ^４１Ｘ^４２Ｘ^４３Ｘ）に変異を持つＲｈｏバリアント（ＳＲＡＧＫが、ＫＫＫＲＴ、ＫＫＡＲＴ、ＭＫＫＧＴ、ＩＥＥＧＴ、ＭＫＥＧＴ、ＡＫＫＲＴ、ＫＡＫＲＴ、ＫＫＡＲＴ、ＫＫＫＡＴ、ＫＫＫＲＡ、ＫＡＫＲＡ、及びＳＫＡＧＴといったアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒２倍）＞α５β１（≒５倍）＞αｖβ３（≒１４倍）（表８）。以上の結果から、Ｒｈｏのリンカー領域の変異は、インテグリンαｖβ３での阻害活性に顕著な効果を示すことが分かった。

Ｃ末端領域（^６６Ｘ^６７Ｘ^６８Ｘ^６９Ｘ^７０Ｘ）に変異を持つＲｈｏバリアント（ＲＹＨが、ＲＹＨ、ＲＮＧＬ、ＲＧＬＹＧ、ＲＧＬＹ、ＲＤＬＹＧ、ＲＤＬＹ、ＲＮＧＬＹＧ、及びＲＮＰＷＮＧといったアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒１３倍）＞αｖβ５（≒８倍）＝αｖβ６（≒８倍）＞αｖβ３（≒４倍）＞α５β１（≒２倍）（表９）。以上の結果から、ＲｈｏのＣ末端領域の変異は、インテグリンαＩＩｂβ３、αｖβ５、及びαｖβ６での阻害活性に顕著な効果を示すことが分かった。

Ｃ末端領域（^６６ＸＬＹＧ）に変異を持つＲｈｏバリアント（６６位がＧ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、及びＥアミノ酸に置換されたもの）は以下の順番でインテグリンに最大効果を示した。αＩＩｂβ３（≒６４９３倍）＞α５β１（≒４０倍）＞αｖβ５（≒８倍）＞αｖβ６（≒６倍）＞αｖβ３（≒１倍）。即ち、インテグリンαＩＩｂβ３及びα５β１への顕著な効果が示された（表１０）。

ＲｈｏのＲＧＤループ領域、リンカー領域、及びＣ末端領域を修飾することで、インテグリンαｖβ３及びα５β１に特異的なディスインテグリン（Ｒｈｏ）バリアントが成功裏に得られた。例えば、変異体^３９ＫＫＡＲＴ−^４６ＡＲＧＲＧＤＮＰ−^６６ＤＬＹＧは、インテグリンαｖβ３及びα５β１への素晴らしい阻害活性を示したものの、αＩＩβ３、αｖβ５、及びαｖβ６には示さなかった（表１１）。ＲＧＤループ及びリンカー領域の変異は、インテグリンαｖβ３及びα５β１での阻害活性を増加させ、インテグリンαＩＩｂβ３での阻害活性を顕著に減少させた。Ｃ末端領域の変異は、インテグリンαｖβ５及びαｖβ６を阻害する活性を減少させた。

ＲｈｏのＲＧＤループ領域、リンカー領域、及びＣ末端領域を修飾することで、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１に特異的なディスインテグリン（Ｒｈｏ）バリアントが成功裏に得られた。例えば、変異体^３９ＫＫＡＲＴ−^４６ＡＲＡＲＧＤＤＬ−^６６ＧＬＹＧは、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１への素晴らしい阻害活性を示したものの、αＩＩβ３及びαｖβ６には示さなかった（表１２）。リンカー領域でＳＲＡＧＫをＫＫＡＲＴに変える変異は、ＲＧＤ結合インテグリンを阻害する活性を増加させた。ＲＧＤループでのＲ４６Ａ、Ｉ４７Ｒ、Ｐ４８Ａ、Ｍ５２Ｄ、及びＰ５３Ｌといった変異は、インテグリンαＩＩｂβ３及びαｖβ６を阻害する活性を減少させた。Ｃ末端領域の^６６ＲＹＨを^６６ＧＬＹＧに変える変異はαＩＩｂβ３を阻害する活性を減少させた。

ＲｈｏのＲＧＤループ領域、リンカー領域、及びＣ末端領域を修飾することで、インテグリンαｖβｘ及びα５β１に特異的なディスインテグリン（Ｒｈｏ）バリアントが成功裏に得られた。例えば、変異体^３９ＫＫＡＲＴ−^４６ＡＲＧＲＧＤＮＰ−^６６ＤＬＹＧは、インテグリンαｖβ３及びα５β１への素晴らしい阻害活性を示すものの、αＩＩβ３、αｖβ５、及びαｖβ６には示さない（表１１）。ＲＧＤループ及びリンカー領域の変異は、インテグリンαｖβ３及びα５β１での阻害活性を増加させ、インテグリンαＩＩｂβ３での阻害活性を顕著に減少させた。Ｃ末端領域の変異は、インテグリンαｖβ５及びαｖβ６を阻害する活性を減少させた。

［実施例４：Ｒｈｏ変異体による血小板凝集の抑制］
ディスインテグリン（Ｒｈｏ）バリアントがαＩＩｂβ３により仲介される血小板凝集を抑制する能力にちついても試験した。静脈血サンプル（９部）を、少なくとも２週間一切投薬を受けていない健康なドナーから採取し、３．８％クエン酸ナトリウム（１部）に溶かし集めた。多血小板血漿（ＰＲＰ）を得るために、血液サンプルを、１５０×ｇで１０分間遠心分離し、５分静置し、ＰＲＰを集めた。残りの血液を２０００×ｇで２５分間遠心分離し、少血小板血漿（ＰＰＰ）を採取した。ＰＰＰ血小板を血液分析機で測定し２５００００血小板／μｌに希釈した。１９０μｌのＰＲＰ及び１０μｌのＲｈｏ又はＰＢＳ緩衝液をＨｅｍａ Ｔｒａｃｅｒ６０１血小板凝集計内で３７℃で５分間インキュベートした。光透過率により血小板凝集の応答を測定するため、１０ｍＬの２００μＭアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をさらに加えた。血小板凝集の抑制についての結果は以下の表３から１４にまとめて示す。

［実施例５：ディスインテグリンバリアント及び野生型ロドストミンによる細胞移動の阻害］
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルターは、使用前に、ＤＭＥＭ含有血清中で２時間平衡化したＤＭＥＭ含有１０％ＦＢＳを移動フィルターの下部コンパートメントに加えた。１００ｍｌの無血清ＤＭＥＭに溶かして、２×１０^４Ａ３７５ヒト黒色腫細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルター毎に撒いた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で、６時間、移動するに任せ、その後、フィルターを室温で１５分間メタノールに浸けることで固定した。ロドストミン、ＡＲ−ＮＰ（コンセンサス配列は表１３を参照）、又はＰＢＳ緩衝液を上部チャンバに加えた。フィルターを水で１回洗い、２０％メタノール／水に溶かした０．２％クリスタルバイオレットの溶液で１０分間染色した。膜の上部表面から綿棒で細胞を除去した。膜の下面に移動した細胞を、各膜につきランダムに選んだ５箇所の領域で、２００倍の倍率で計数した。

この研究でのＲｈｏ、ＡＲ−ＮＰ、又はＰＢＳ緩衝液の阻害活性を図２に示す。簡単に説明すると、ＡＲ−ＮＰはＡ３７５ヒト黒色腫細胞の移動を著しく阻害した。

［実施例６：Ｍａｔｒｉｇｅｌ血管形成アッセイでのディスインテグリンバリアントによる血管形成の阻害］
ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びヘパリン（２４−２６Ｕ／ｍｌ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌをＢ６マウスに皮下注射した。５日後にゲルを回収し、計量し、周知のヘモグロビン定量法又は組織学により処理した。ヘモグロビン含量はＤｒａｂｋｉｎ試薬キット５２５（シグマ社）で測定した。組織学的解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌペレットを４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、４ミクロンの切片を標準的手法でヘマトキシリン−エオシン染色することにより行った。

ＶＥＧＦ（１５０ｎｇ）及びヘパリン（３０ＩＵ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂ．製）のアリコート（３００μｌ）を６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は迅速にプラグを形成した。ＡＲ−ＮＰ（１ｍｇ／ｋｇ）又はＡＲＬＤＤＬ（１ｍｇ／ｋｇ）（コンセンサス配列は表１３を参照）を２４時間後に１回静脈内に投与した。５日後に、プラグを採取し、撮影した（上部パネル）。Ｄｒａｂｋｉｎ法及びＤｒａｂｋｉｎ試薬キット５２５（シグマ社）を用いて、血管形成の指標として、プラグのヘモグロビンを測定し、新生血管を定量化した（Ｂ及びＣ）。この解析により、５日の血管形成期間の間に１回だけ薬剤を注射する場合、ＡＲ−ＮＰがＡＲＬＤＤＬよりも効果的であることが示された。図３参照。

［実施例７：未熟児網膜症（ＲＯＰ）の高酸素状態／正常酸素状態モデルによる血管形成阻害］
１週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊマウス又はＩＣＲマウス及びこれらの母親を５日間７５％±２％の酸素に曝し（高酸素状態）、その後、相対的な高酸素状態を誘導するため、さらに５日間正常酸素正常に戻し（高酸素期間、Ｐ７からＰ１２）、その後、さらに７日間大気中で飼育した（高酸素状態誘導性血管形成期、Ｐ１２からＰ１９）。ＡＲ−ＮＰ（１ｐｇ）を１２日目に硝子体経路を介して投与し、マウスを１９日目に殺処分した。非曝露対照動物は大気中で飼育した。動物は２１±１℃の一定温度及び１２時間の明暗周期で飼育した。酸素濃度は酸素濃度計で測定した。酸素曝露の終わり（１２日目）と正常酸素正常への復帰の５日後（１７日目）に、仔を殺し、新生血管及び内皮細胞により網膜血管新生を評価した。

この研究の結果を図４に示す。この解析により、ＡＲ−ＮＰが網膜症マウスモデルでの血管形成を顕著に減少させることが示された。

［実施例８：マウス大動脈環でのディスインテグリンバリアントによる血管形成の阻害］
８から１２週齢のマウスの胸大動脈を摘出し、およそ０．５ｍｍ幅の環状に切断した。。大動脈環を２００ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ内に埋設した。このＭａｔｒｉｇｅｌはＤＭＥＭでコートされている。このＤＭＥＭは、適切な阻害剤又は対照剤の有無を問わず、２．５％のＦＣＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが足されている。実験はＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で行った。培養後７日後に、大動脈環を４％ホルムアルデヒドで固定しクリスタルバイオレットで染色した。倒立顕微鏡を用いて、各環から成長した萌芽（ｓｐｒｏｕｔ）を計数した。

マウス大動脈環を１００ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ中でＶＥＧＦ及び０．１μＭ ＡＲ−ＮＰとともに培養した。培地は３日毎に交換した。図は、培養７日後の微小血管の発芽を示している。ＡＲ−ＮＰが血管発芽を顕著に減少させることに注目されたい（図５参照）。

［実施例９：乳がん細胞でのディスインテグリンバリアントによるコロニー形成の阻害］
図６の代表的な写真はコロニー形成アッセイの結果を示している。４−Ｔ１乳がん細胞を、上層が０．３５％寒天で下層が０．７％寒天の培地が入った６ウェルディッシュにまいた。０．３ｍＬの培地を３日毎に足した。１８日後に、ディッシュ毎の培養細胞数をクリスタルバイオレット染色で同定し計数した。この解析により、ＡＲＬＤＤＬ（０．１μＭ及び１μＭ）及びＡＲ−ＮＰ（０．１μＭ及び１μＭ）の両方が４−Ｔ１乳がん細胞のコロニー形成を阻害したことが示された。

［実施例１０：ディスインテグリンバリアントによる破骨細胞形成の阻害］
６から８週齢のＳＤラットを、米国国立研究所動物センターから入手し、２２±１℃の室温及び１２時間の明暗周期をはじめとする管理された条件下で飼育した。動物は、Ｐｕｒｉｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔを給餌し、蒸留水を随意に与えた。大腿骨と脛骨から髄腔を取り除き、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を髄腔に流すことにより、骨髄細胞を準備した。非接着性細胞（造血細胞）を２４時間後に集め、破骨細胞前駆体として用いた。細胞を、ヒト組換え可溶性ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）が入った２４ウェルプレートに、１×１０^６細胞／ウェルの濃度でまいた。培地は３日毎に交換した。８日目に破骨細胞形成をＴＲＡＰ染色により測定した。簡単に説明すると、付着細胞を１０％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で３分間固定し、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩と酒石酸塩溶液とを用いて３７℃で１時間染色した。各ウェルの破骨細胞様細胞を、ＴＲＡＰ陽性で３つより多くの核を含む多核細胞の数を計数することで、得点化した。

タンパク薬物を１から７日目に加えた。α５β１及びαｖβ３の二重インテグリンＡＲ−ＮＰの破骨細胞形成のＩＣ_５０は３．６１ｎＭであった。図７に示すように、ＡＲ−ＮＰタンパク質又はＡＲＬＤＤＬタンパク質は、未処理対照群と比べて、ＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞形成を阻害した。

［実施例１１：ディスインテグリンによる神経膠腫浸潤の阻害］
ヒト神経膠腫細胞（Ｕ２５１）を、１００ｇ／ｍｌのヒアルロナンを含有するＭａｔｒｉｇｅｌを含む上部チャンバで培養した。ディスインテグリンバリアントを上部チャンバと下部チャンバの両方に加えた。２４時間後、下部チャンバの細胞をクリスタルバイオレットを用いて染色し計数した。図８に示すように、ＡＲＬＤＤＬ（０．１μＭ）及びＡＲ−ＮＰ（０．１μＭ）は両方とも神経膠腫の浸潤を著しく阻害した。

［実施例１２：血圧及び心拍数へのＡＲ−ＮＰの影響］
イソフルラン麻酔下のウィスターラットで非侵襲的方法を用いて尻尾から血圧及び心拍数を記録した。安定した測定値が得られた後に、ＡＲ−ＮＰを尾静脈から投与した。５ｍｇ／ｋｇのＡＲ−ＮＰがウィスターラットの血圧及び心拍数に有意な影響を及ぼさなかったことに注目されたい（図９）。薬理作用をもたらすＡＲ−ＮＰの通常の投与量は１ｍｇ／ｋｇである。

［実施例１３：ＡＲ−ＮＰによるＡ３７５黒色腫成長の阻害］
Ａ３７５腫瘍細胞（５×１０^６）を４から５週齢のオスのＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射した。細胞移植１週間後に、ＡＲ−ＮＰ（ＫＫＡＲＴ−ＡＲＧＲＧＤＮＰ）（２ｍｇ／ｋｇ、５日／週、腹腔注射）をマウスに注射した。腫瘍体積を２日毎に測定した。薬物処理１８日後に腫瘍を摘出し計量した。スケールバーは１ｃｍである。ＡＲ−ＮＰ処理により腫瘍成長が著しく阻害されたことに注目されたい（図１０参照）。

［実施例１４：Ｋ−ｒａｓＧ１２ＤトランスジェニックマウスでのＫＧ（ＡＲ−ＮＰ）による腫瘍成長の阻害］
肺がんを誘導するため、Ｋ−Ｒａｓ^Ｇ１２Ｄマウスに４００ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンを給餌した。３．５ヶ月後、ＴＧ（トランスジェニック）マウスに、１月の間、２日おきに、２ｍｇ／ｋｇのＡＲ−ＮＰを腹腔注射した。１５回目の処理の２週間後にマウスを殺処分した。肺に墨汁を注入しフェケテ溶液で固定した。肺上の腫瘍小結節を計数した。＊＊はＰ値＜０．００１を示す。図１１に示すように、ディスインテグリンバリアント（ＡＲ−ＮＰ）はＫ−ｒａｓＧ１２Ｄトランスジェニックマウスでの腫瘍成長を阻害した。

［実施例１５：ＫＧによるＵ８７保持マウスでの脳腫瘍成長の阻害］
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、購入したものに由来し、特定病原体未感染の飼育場で、１２時間／１２時間の明／暗周期並びに制御された湿度及び温度の良く制御された環境下、繁殖飼育したものである。８から１０週齢で２２から２５ｇのマウスを用いた。マウスを、デクスドミトール／ゾレチル（２０μｇ／ｋｇ／２ｍｇ／ｋｇ）の混合物で腹腔麻酔し、定位固定フレームにのせ、頭蓋を切開して露出させた。Ｕ８７−ＭＧ細胞を採取し、注射前に、リン酸緩衝生理食塩水で２．５×１０^５細胞／μＬの濃度に調節した。マイクロインフュージョンポンプと３０Ｓゲージニードルの付いた１０ｍｌハミルトンシリンジを用いてｌ２μＬのＵ８７−ＭＧ細胞をブレグマから線条体の所定座標に注射した。頭蓋をきれいにして、穴を骨蝋で塞ぎ、切開部を縫合した。

８０μｓで３００ｍＴ／ｍのアクティブシールディンググラディエントを有する水平型７．０−Ｔ分光計内でＭＲＩを行った。腫瘍組織と脳組織との間のＴ２ＷＩｓによりもたらされるコントラストに基づいて腫瘍の輪郭を描画した。ＭＲ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて、腫瘍にカバーされたスライスを横断する腫瘍面積を合計することで全腫瘍体積（ｍｍ^３）を計算した。各時間での腫瘍体積の変化として成長曲線をプロットした。腫瘍移植後２３日から始めて、１週間に５日、１日当り１回、５ｍｇ／ｋｇで、ディスインテグリンバリアント（ＡＲ−ＮＰ）単独又は混合物を、尾静脈を介して、マウスに静脈注射した。図１２に示すように、ディスインテグリンバリアント（ＡＲ−ＮＰ）もＵ８７保持マウスでの腫瘍成長を阻害した。

詳細に且つ特定の実施形態を参照して本発明について説明したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変形例及び修正例が可能であることは、当業者にとって自明であろう。

（関連出願の相互参照）
本出願は、合衆国法典第３５編第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年８月２２日に出願された米国仮出願第６２／０４０５０３号の優先権の利益を主張する。当該仮出願の内容を参照により本明細書で援用する。

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は配列表を含む。この配列表は、ファイル名が「688947-1 PCT Sequence Listing.txt」、作成日時が２０１５年８月２０日、サイズが１５７２１９バイトのＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、その内容を参照により本明細書で援用する。

［付記］
［付記１］
（ａ）配列番号３３２のアミノ酸配列（ＳＲＡＧＫＩＣ）の１から５番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異リンカー、
（ｂ）配列番号３２９から３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む変異ＲＧＤループ、及び
（ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列（ＰＲＹＨ）の１から４番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異Ｃ末端、
からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
前記変異リンカー、前記変異ＲＧＤループ、及び前記変異Ｃ末端からなる群より選択される前記少なくとも１つを有しないディスインテグリンと比べて、αＩＩｂβ３インテグリンへの低下した結合活性、並びに、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つへの向上した結合活性の少なくとも１つを有する、ディスインテグリンバリアント。

［付記２］
前記ディスインテグリンは、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、アルボラブリン（ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）、バシリシン（ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、バトロキソスタチン（ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、セレベリン（ｃｅｒｅｂｅｒｉｎ）、セラスチン（ｃｅｒａｓｔｉｎ）、クロタトロキシン（ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、ズリシン（ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、エレガンチン（ｅｌｅｇａｎｔｉｎ）、フラボリジン（ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）、フラボスタチン（ｆｌａｖｏｓｔａｔｉｎ）、ハリシン（ｈａｌｙｓｉｎ）、ハリスタチン（ｈａｌｙｓｔａｔｉｎ）、ジャララシン（ｊａｒａｒａｃｉｎ）、ジャラスタチン（ｊａｒａｓｔａｔｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）、ラチェシン（ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（ｌｕｔｏｓｉｎ）、モロシン（ｍｏｌｏｓｓｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、サキサチリン（ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、テルゲミニン（ｔｅｒｇｅｍｉｎｉｎ）、トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）、トリムクリン（ｔｒｉｍｕｃｒｉｎ）、トリムターゼ（ｔｒｉｍｕｔａｓｅ）、ウスリスタチン（ｕｓｓｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、及びビリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ）からなる群より選択される、付記１に記載のディスインテグリンバリアント。

［付記３］
配列番号３３３のアミノ酸配列（ＲＩＰＲＧＤＭＰ）の１−３、５、７、及び８番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む変異ＲＧＤループと、前記変異リンカー及び前記変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む、付記１又は２に記載のディスインテグリンバリアント。

［付記４］
前記変異リンカーは配列番号３０６から３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、付記１から３のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアント。

［付記５］
前記変異Ｃ末端は配列番号３１９から３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、付記１から４のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアント。

［付記６］
配列番号３２９から配列番号３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異ＲＧＤループと、配列番号３０６から配列番号３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異リンカー及び配列番号３１９から配列番号３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む、付記１から６のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアント。

［付記７］
前記変異ＲＧＤループ、前記変異リンカー、及び前記変異Ｃ末端を含む、付記６に記載のディスインテグリンバリアント。

［付記８］
配列番号１２３、１２４、１４７、１４９、及び１７１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、付記１に記載のディスインテグリンバリアント。

［付記９］
ＰＥＧ化されている、又は、アルブミン若しくはＦＣと結合されている、付記１から８のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアント。

［付記１０］
付記１から９のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチド。

［付記１１］
付記１から９のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。

［付記１２］
付記１から９のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアントと、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

［付記１３］
αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連するインテグリン関連疾患を、治療を必要とする対象において、治療するための方法であって、付記１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

［付記１４］
前記インテグリン関連疾患は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生症、虚血誘発性血管新生網膜症、高度近視、及び未熟児網膜症からなる群より選択される血管形成関連眼疾患の１種である、付記１３に記載の方法。

［付記１５］
前記インテグリン関連疾患は、転移性黒色腫、転移性前立腺がん、転移性乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、及び多形性膠芽腫からなる群より選択されるがんの１種である、付記１３に記載の方法。

［付記１６］
αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連する疾患を、治療を必要とする対象において、治療するための薬剤の製造における、付記１から９のいずれか１つに記載のディスインテグリンバリアントの使用。

Claims (16)

1. （ａ）配列番号３３２のアミノ酸配列（ＳＲＡＧＫＩＣ）の１から５番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異リンカー、
   （ｂ）配列番号３２９から３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む変異ＲＧＤループ、及び
   （ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列（ＰＲＹＨ）の１から４番目の位置に少なくとも１つの変異を含む変異Ｃ末端、
   からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
   前記変異リンカー、前記変異ＲＧＤループ、及び前記変異Ｃ末端からなる群より選択される前記少なくとも１つを有しないディスインテグリンと比べて、αＩＩｂβ３インテグリンへの低下した結合活性、並びに、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つへの向上した結合活性の少なくとも１つを有する、ディスインテグリンバリアント。
2. 前記ディスインテグリンは、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、アルボラブリン（ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）、バシリシン（ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、バトロキソスタチン（ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、セレベリン（ｃｅｒｅｂｅｒｉｎ）、セラスチン（ｃｅｒａｓｔｉｎ）、クロタトロキシン（ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、ズリシン（ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、エレガンチン（ｅｌｅｇａｎｔｉｎ）、フラボリジン（ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）、フラボスタチン（ｆｌａｖｏｓｔａｔｉｎ）、ハリシン（ｈａｌｙｓｉｎ）、ハリスタチン（ｈａｌｙｓｔａｔｉｎ）、ジャララシン（ｊａｒａｒａｃｉｎ）、ジャラスタチン（ｊａｒａｓｔａｔｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）、ラチェシン（ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（ｌｕｔｏｓｉｎ）、モロシン（ｍｏｌｏｓｓｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、サキサチリン（ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、テルゲミニン（ｔｅｒｇｅｍｉｎｉｎ）、トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）、トリムクリン（ｔｒｉｍｕｃｒｉｎ）、トリムターゼ（ｔｒｉｍｕｔａｓｅ）、ウスリスタチン（ｕｓｓｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、及びビリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ）からなる群より選択される、請求項１に記載のディスインテグリンバリアント。
3. 配列番号３３３のアミノ酸配列（ＲＩＰＲＧＤＭＰ）の１−３、５、７、及び８番目の位置のうちに少なくとも１つの変異を含む変異ＲＧＤループと、前記変異リンカー及び前記変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む、請求項１又は２に記載のディスインテグリンバリアント。
4. 前記変異リンカーは配列番号３０６から３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアント。
5. 前記変異Ｃ末端は配列番号３１９から３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアント。
6. 配列番号３２９から配列番号３３１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異ＲＧＤループと、配列番号３０６から配列番号３１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異リンカー及び配列番号３１９から配列番号３２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する前記変異Ｃ末端の少なくとも１つとを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアント。
7. 前記変異ＲＧＤループ、前記変異リンカー、及び前記変異Ｃ末端を含む、請求項６に記載のディスインテグリンバリアント。
8. 配列番号１２３、１２４、１４７、１４９、及び１７１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のディスインテグリンバリアント。
9. ＰＥＧ化されている、又は、アルブミン若しくはＦＣと結合されている、請求項１から８のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアント。
10. 請求項１から９のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチド。
11. 請求項１から９のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
12. 請求項１から９のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアントと、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
13. αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連するインテグリン関連疾患を、治療を必要とする対象において、治療するための方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
14. 前記インテグリン関連疾患は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生症、虚血誘発性血管新生網膜症、高度近視、及び未熟児網膜症からなる群より選択される血管形成関連眼疾患の１種である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記インテグリン関連疾患は、転移性黒色腫、転移性前立腺がん、転移性乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、及び多形性膠芽腫からなる群より選択されるがんの１種である、請求項１３に記載の方法。
16. αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、及びα５β１インテグリンの少なくとも１つに関連する疾患を、治療を必要とする対象において、治療するための薬剤の製造における、請求項１から９のいずれか１項に記載のディスインテグリンバリアントの使用。