KR102102789B1 - 디스인테그린 변이체 및 이의 약학적 용도 - Google Patents

디스인테그린 변이체 및 이의 약학적 용도 Download PDF

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Abstract

α5β1 및 αν인테그린, 예컨대, ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8 의 하나 또는 그 이상에 특이적으로 결합하나 αIIbβ3에 감소된 결합 활성을 가지는 디스인테그린 변이체가 개시된다. 또한 αν인테그린 및 α5β1 인테그린과 연관된 질병의 치료 또는 예방을 위한 디스인테그린 변이체의 용도가 개시된다.

Description

디스인테그린 변이체 및 이의 약학적 용도 {DISINTEGRIN VARIANTS AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF}
본 출원은 32 U.S.C. §119 (e)에 따라 2014년 8월 22일자로 출원된 미국 가출원 제62/040,503호를 우선권 주장의 기초로 하는 것으로, 동법 371조에 따라 2015년 8월 21일자로 출원된 국제출원번호 PCT/US2015/046322이고, 2016년 2월 25일자로 영어로 공개된 국제공개번호 WO2016/029131 A1이며, 이는 참조문헌으로서 그 전체가 본 명세서에서 참고로 인용된다.
본 출원은 서열목록을 포함하며, 서열목록은 2015년 8월 20일에 작성되어 "688947-1 PCT Sequence Listing.txt"의 파일 이름을 가지고, 157,219 바이트의 크기를 가지는 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다. EFS-Web을 통해 제출된 상기 서열목록은 본 명세서의 일부이며 서열목록 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
본 발명은 α5β1 및 αν 인테그린 (예컨대, ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8) 중 하나 이상에 특이적으로 결합하나, αIIbβ3에 대한 감소된 결합 활성을 갖는 디스인테그린 변형체, 및 αν 인테그린 또는 α5β1 인테그린과 연관된 질환의 치료 및 예방을 위한 상기 디스인테그린 변형체의 용도에 관한 것이다.
인테그린은 세포외기질 단백질 또는 이웃 세포에 대한 다른 부착 수용체와 결합하는 막관통 (transmembrane) 수용체이다. 인테그린 α 및 β 서브 유닛의 헤테로다이머 페어링은 하나 또는 그 이상의 기질에 대한 결합 특이성을 부여한다 (Weis et al., 2011, Cold Spring Harb Perspecl Med;l:a006478). 상기 부착 분자 패밀리는 염증, 선천적 및 항원 특이적 면역, 항상성, 상처 치유, 조직 형태발생, 및 세포 성장 조절 및 분화 조절을 포함하는 생물학의 광범위한 맥락에서 중추적인 역할을 한다.인테그린의 조절기능 저하는 혈전성 혈관 질환에 대한 자가면역에서 암 전이에 이르기까지 많은 질병 상태의 병인에 관여한다. 임상적 응용을 위한 인테그린 길항제의 발견 및 개발에 대하여 광범위한 노력이 있었다.
β1, β3, β5, β6 또는 β8 서브 유닛과 쌍을 이루는 αv 서브유닛을 각각 가지는 αv 인테그린은 상처 치유, 혈관생성, 및 암과 연관된 조직 재구성 동안 특히 중요한 것으로 보인다 (Weis et al., 2011, supra). αv 인테그린은 암, 안과 및 정형외과 적응증에 표적이 되고 있다. 인테그린 αvβ3 및 αvβ5는 또한 종양, 관절염, 건선 및 연령 연관 황반 퇴화 (age-related macular degeneration, AMD)와 연관되어 있다. 특히, αvβ3 인테그린은 혈관생성을 매개하고 종양 전이를 억제하는데 중요하고, αvβ6 인테그린은 몇몇 암에서 상향 조절된다. 다른 αv 인테그린(ανβ5, ανβ6 및 ανβ8)은 형질전환 성장인자 β (transforming growth factor β, TGFβ)활성을 매개하는 각막에 존재한다.
인테그린 α5β1, ανβ3 및 ανβ5는 혈관생성의 과정에서 중요한 역할을 하고 이로 제한되지 않으나, 흑생종, 유방암, 전립선암, 결장암 및 신경교종을 포함하는 다양한 악성종양에서 발현되는 것으로 보고되었다 (Staunton et al., 2006, Adv Immunol., 91:111-57). 이러한 인테그린의 종양 내 발현은 종양 (예컨대, 흑색종, 유방암 및 전립선암)의 진행 및 전이와 연관되어 있다(Staunton et al., 2006, supra). 인테그린은 여러 경로를 통해 신호를 보내고 내피 세포의 이동과 증식에 기여하는 것으로 나타났다. 생체 내에서, 인테그린은 종양 신생 혈관 및 종양 세포 자체에서 과발현 되며, 이는 인테그린들의 기능이 다양한 메커니즘을 통해 종양의 진행을 가능하게 하는 것일 수 있음을 암시한다. 인테그린 α5β1, αvβ3 및 αvβ5에 직접적으로 대항하는 길항 항체 및 저분자는 생체 외 및 생체 내에서 혈관신생을 억제하는 것으로 나타났다. 인테그린 α5β1, αvβ3 및 αvβ5의 억제제는 ERK, Akt 및 FAK를 통한 신호전달을 억제할 수 있고, 이를 통해 내피 세포 및 암 세포의 부착, 전이 및 증식이 감소되는 결과를 낳을 수 있다. 이들 길항제는 또한 카스파제 의존성 메커니즘을 통해 세포 사명을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 혈관신생 및 종양 진행과의 연관성에서 인테그린 α5β1, αvβ3 및 αvβ5의 중요한 역할은 이들을 항암 치료에서 매력적인 표적으로 만들었고, 이들 인테그린의 길항제는 임상 시험에서 시험되고 있다.
αvβ3 인테그린은 피브리노겐 (fibrinogen), 피브로넥틴 (fibronectin), 트롬보스폰딘 (thrombospondin), 본발레브란트인자 (von Willebrand factor) 및 비트로넥틴 (vitronectin)을 포함하는 여러 고분자 리간드와 마찬가지로 αIIbβ3 인테그린과 같은 β3 서브유닛을 공유한다. 이러한 모든 리간드는 3개의 아미노산 서열인 RGD (arginine-glycine-aspartic acid)를 함유한다. 피브로넥틴 및 비트로넥틴 또한 α5β1 및 다른 αv 인테그린에 대한 리간드이다. αIIbβ3 인테그린은 혈소판에 있는 주요 막단백질이고 혈소판의 응집에 중요한 역할을 한다. 여러 αIIbβ3 인테그린 길항제가 ACS (acute coronary syndrome)를 가진 환자의 치료를 위해 개발되고 있다. 그러나, 혈소판 응집의 광범위한 억제는 출혈의 위험이 증가하는 것과 연관되기 때문에, 진행되고 있는 연구는 αIIbβ3 인테그린 길항제의 출혈 및 다른 부작용의 감소에 초점이 맞추어져 있다. 다른 적응증에 대한 단일 인테그린 또는 여러 αv 인테그린을 차단하는 약물을 설계하는 것이 필수적이다 (Goodman, 2012, Trends Pharmacol Sci. 2012;33;405-412).
디스인테그린은 혈소판과, 혈관 내피세포 및 몇몇 종양 세포를 포함하는 다른 세포에서 발현하는 인테그린 (예컨대, αIIbβ3, α5β1 및 αvβ3)에 결합하는 저분자 중량 RGD를 함유하는 펩타이드의 패밀리이다. 디스인테그린들의 강력한 항혈소판 활성과 더불어, 디스인테그린의 연구는 심혈관계 질환의 진단과 동맥 혈전증, 골다공증 및 혈관신생과 관련된 종양의 성장 및 전이의 치료제 설계에 대한 새로운 용도를 밝혀냈다. 콜로셀라스마 로도스토마(Colloselasma rhodostoma)의 독액에서 분리된 디스인테그린인 로도스토민 (rhodostomin, Rho)은 혈소판의 당단백질인 αIIbβ3를 차단하여 생체 외 및 생체 내에서 혈소판의 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌다. Rho가 인테그린 αIIbβ3, α5β1 및 αvβ3과 높은 친화도로 결합하며 암세포와 상호작용하는 것 또한 밝혀냈다. 예를 들어, Rho는 종양 세포의 생존도에 영향을 미치지 않으면서, 유방 및 전립선 암종 세포가 미네랄화되지 않은 그리고 미네랄화된 뼈세포외기질에 부착하는 것을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 보고됐다. Rho는 또한 유방 및 전립선 암종 세포의 전이와 침습을 억제한다.
그러나, 로도스토민이 비특이적으로 인테그린 αIIbβ3, α5β1 및 αvβ3과 결합하기 때문에, 로도스토민의 약학적 사용은 혈소판 응집 억제에 의한 출혈과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 그러므로, α5β1 및 αvβ3에 대하여 선택적이나, αIIbβ3에 대한 결합 활성이 감소된 디스인테그린 변이체에 대한 기술의 필요성이 있다. 상기 필요성은 본 발명에 의해 충족되었다.
본 발명은 αIIbβ3에 대한 결합 활성이 감소되어 혈소판 응집에 대한 억제가 약하나, α5β1 및 αv 인테그린(예컨대, ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8) 중 하나 또는 그 이상에 특이적으로 결합하는 로도스토민과 같은 디스인테그린의 링커 영역, RGD 고리 및 C-말단의 하나 또는 그 이상에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 디스인테그린 변이체에 관한 것이다.
따라서, 하나의 일반적인 양태에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 디스인테그린 변이체에 관한 것이다:
(a) 서열번호 332 (SRAGKIC)의 아미노산 서열의 1 내지 5 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 링커;
(b) 서열번호 329 내지 331로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 RGD 고리; 및
(c) 서열번호 334 (PRYH)의 아미노산 서열의 1 내지 4 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 C-말단,
상기 디스인테그린 변이체는 돌연변이 링커, 돌연변이 RGD 고리 및 돌연변이 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 가지지 않는 디스인테그린과 비교하여 αIIbβ3 인테그린에 대한 감소된 결합 활성을 가진다. 바람직하게는, 디스인테그린 변이체는 또한 돌연변이 링커, 돌연변이 RGD 고리 및 돌연변이 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 가지지 않는 디스인테그린과 비교하여 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린 중 적어도 하나에 대한 증가된 결합 활성을 가진다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 이로 제한되지 않으나, 로도스토민 (rhodostomin), 알볼라브린 (albolabrin), 아플라긴 (applagin), 바실리신 (basilicin), 바트로소스타틴 (batroxostatin), 비티스타틴 (bitistatin), 세레베린 (cereberin), 세라스틴 (cerastin), 크로타트록신 (crotatroxin), 듀리신 (durissin), 엘레간틴 (elegantin), 플라보리딘 (flavoridin), 플라보스타틴 (flavostatin), 할리신 (halysin), 할리스타틴 (halystatin), 자라라신 (jararacin), 자라스타틴 (jarastatin), 키스트린 (kistrin), 라체신 (lachesin), 루토신 (lutosin), 몰로신 (molossin), 살모신 (salmosin), 삭사틸린 (saxatilin), 테르게미닌 (tergeminin), 트리메스타틴 (trimestatin), 트리뮤크린 (trimucrin), 트리뮤타제 (trimutase), 유슈리스타틴 (ussuristatin), 및 비리딘 (viridian)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 디스인테그린을 포함하는 임의의 디스인테그린의 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 디스인테그린 변이체는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 디스인테그린의 변이체이다. 더욱 바람직하게는, 디스인테그린 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 로도스토민의 변이체이다.
바람직한 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 서열번호 333 (RIPRGDMP)의 아미노산 서열의 1 내지 3, 5, 7 및 8 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RGD 고리와 본원에서 전술한 돌연변이 링커 및 돌연변이 C-말단 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 서열번호 306 내지 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이 링커를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 서열번호 319 내지 서열번호 328로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이 C-말단을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 서열번호 329 내지 서열번호 331로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이 RGD 고리를 포함하고, 서열번호 306 내지 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이 링커 및 서열번호 319 내지 서열번호 328로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이 C-말단 중 적어도 하나를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 디스인테그린 변이체는 본원에서 전술한 돌연변이 RGD 고리, 돌연변이 링커 및 돌연변이 C-말단을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 서열번호 7 내지 서열번호 179로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에 따른 디스인테그린 변이체는 서열번호 123, 124, 147, 149 및 171로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 일 실시예에 따른 디스인테그린 변이체는 변형 (예컨대, 전달 또는 안정성 향상을 위해)된다. 예를 들어, 디스인테그린 변이체는 페길레이션되거나 결합 파트너 (예컨대, 알부민 또는 Fc)와 결합된다.
본 발명의 다른 일반적인 양태는 본 발명의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 디스인테그린 변이체를 코딩하는 유전자 서열과 작동가능하게 연결된 조절 유전자 (예컨대, 프로모터)를 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵 세포, 효소 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 숙주세포로부터 디스인테그린 변이체를 생산하는 것을 포함하는 본 발명의 디스인테그린 변이체를 만드는 공정에 관한 것이다.
또한 본 발명의 디스인테그린 변이체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일반적인 양태는 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린 중 적어도 하나와 연관된 질병, 바람직하게는 인테그린 α5β1 및 ανβ3 중 적어도 하나와 연관된 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 인테그린과 연관된 질병은 연령 관련 황반 퇴화 (age-related macular degeneration), 당뇨 망막증 (diabetic retinopathy), 각막 혈관신생증 (corneal neovascularizing diseases), 허혈로 유도되는 혈관신생 망막증 (ischaemia-induced neovascularizing retinopathy), 고도 근시 (high myopia), 미숙아 망막병증 (retinopathy of prematurity)으로부터 선택되는 혈관신생과 연관된 눈 질병이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 인테그린과 연관된 질병은 전이성 흑생종, 전이성 전립선암, 전이성 유방암, 결장 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 비소세포성 폐암 및 다형성아교모세포종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암이다.
본 발명의 다른 일반적인 양태는 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린 중 적어도 하나와 연관된 병의 치료가 필요한 대상의 치료를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 디스인테그린 변이체의 용도에 관한 것이다.
상기 디스인테그린 변이체는 돌연변이 링커, 돌연변이 RGD 고리 및 돌연변이 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 가지지 않는 디스인테그린과 비교하여 αIIbβ3 인테그린에 대한 감소된 결합 활성을 가진다. 바람직하게는, 디스인테그린 변이체는 또한 돌연변이 링커, 돌연변이 RGD 고리 및 돌연변이 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 가지지 않는 디스인테그린과 비교하여 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린 중 적어도 하나에 대한 증가된 결합 활성을 가진다.
하기 본 발명의 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 같이 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타난 정밀한 실시예로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도면에서:
도 1은 로도스토민의 상호작용 지도를 보여준다: (A) 로도스트민의 링커 영역, RGD 고리 및 C-말단 영역간 상호작용의 도면; 및 (B) 로도스토민과 인테그린 사이의 상호작용에 수반되는 상기 영역의 아미노산 서열로, 본 발명의 일 실시예에 따라 디스인테그린 변이체에서 돌연변이 될 수 있는 상기 아미노산 서열의 잔기는 X로 표시되어 있다;
도 2는 A375 인간 흑생종 세포의 전이에 대한 다양한 시험 제제의 억제 활성을 나타낸다: (A) 야생형 Rho, (B) 본 발명의 일 실시예에 따른 디스인테그린 변이체인 AR-NP 및 (C) 인산염 완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS);
도 3의 A는 처리되지 않은 대조군 마우스와 비교하여, AR-NP 단백질 또는 ARLDDL로 처리된 C57BL/6 마우스로부터 MATRIGELTM 플러그에서 감소된 혈관 밀도를 나타내는 사진이다;
도 3의 B는 처리되지 않은 대조군 마우스와 비교하여, AR-NP 단백질 또는 ARLDDL 단백질이 매일 2회씩 처리된 C57BL/6 마우스로부터 5일 후 MATRIGELTM 플러그에서 감소된 헤모글로빈 함량을 나타내는 그래프이다;
도 3의 C는 처리되지 않은 대조군 마우스와 비교하여, AR-NP 단백질 또는 ARLDDL 단백질이 매일 1회씩 5일동안 주입된 C57BL/6 마우스로부터 MATRIGELTM 플러그에서 감소된 헤모글로빈 함량을 나타내는 그래프이다;
도 4의 A는 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity, ROP)의 마우스 모델에서 혈관신생을 보여주는 사진 및 AR-NP 단백질로 처리된 ROP 마우스에서 감소된 혈관신생을 나타내는 사진으로, 화살표는 신생 혈관의 혈관 프로파일 (blood vessel profiles, BVPs)을 보여준다;
도 4의 B는 AR-NP 단백질로 처리된 ROP 마우스 모델에서 신생 혈관의 감소된 BVPs를 나타내는 그래프이다;
도 4의 C는 AR-NP 단백질로 처리된 ROP 마우스 모델에서 내피 세포의 감소된 BVPs를 나타내는 그래프이다;
도 5는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 7일동안 AR-NP 단백질 (0.1 μM)이 처리된 마이스 대동맥 고리의 억제를 나타낸다: 상부 패널: 배율 x20에서 찍은 이미지; 하부 패널: 배율 x100에서 찍은 이미지;
도 6은 ARLDDL (0.1 μM 및 1 μM) 및 AR-NP (0.1 μM 및 1 μM) 모두가 4-T1 유방암 세포의 콜로니 형성을 억제하는 것을 보여준다;
도 7은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 AR-NP 단백질 또는 ARLDDL 단백질이 RANKL에 의해 유도되는 파골세포형성을 억제하는 것을 보여준다: AR-NP 단백질 (B 및 C); ARLDDL 단백질 (D); 대조군 (A);
도 8은 ARLDDL (0.1 μM) 및 AR-NP (0.1 μM) 모두 신경아교종의 침습을 현저하게 억제하는 것을 나타낸다;
도 9는 AR-NP가 5 mg/kg에서 Wistar 레트의 혈압 및 심박수에 큰 영향을 미치지 않는 것을 보여준다;
도 10은 SCID 생쥐에서 AR-NP에 의한 A375 흑색종 성장의 억제를 보여준다;
도 11은 K-rasG12D 형질전환 마이스에서 AR-NP (KG)에 의한 종양 성장의 억제를 보여준다; 그리고
도 12는 AR-NP (KG)에 의한 U87을 함유한 생쥐에서 뇌종양 성장의 억제를 보여준다.
다양한 간행물, 기사 및 특허는 본원의 배경 및 명세서 전반에 거쳐 인용되거나 설명된다; 이들 참조문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조문헌으로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 기술, 재료, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 내용을 제공하기 위한 것이다. 상기 논의는 공개되거나 청구된 임의의 발명과 관련하여 이러한 사안 중 일부 또는 전부가 선행기술의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그 외, 본원에서 사용된 일부 용어는 본 명세서에서 정해진 의미를 갖는다. 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 공개 공보는 본원에서 전체적으로 개시한 바와 같이 참조문헌으로서 본원에 통합된다. 첨부된 청구항 및 본원에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 다르게 가리키지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "디스인테그린"은 인테그린의 강력한 용해성 리간드인 시스테인이 풍부한 단백질 부류를 의미하고 세포-세포 및 세포-세포외기질 부착, 전이, 침습, 세포 주기 진행, 분화 및 많은 후생생물의 발달 동안 세포 유형 종분화, 세포사 및 세포자멸사와 같은 많은 과정의 조절에 관여한다. 아미노산 모티프 RGD (Arg-Gly-Asp)는 대부분 모노머 디스인테그린에서 보존되며, 이황화 결합 및 폴리펩타이드 사슬의 주 몸체로부터 튀어나옴으로써 안정화되어 있는 유연한 고리인 인테그린 결합 고리의 첨단에 위치한다. 뱀 독에서 정제된 모든 디스인테그린은 피브리노겐 수용체(예컨대, αv-인테그린, α5β1 인테그린 및 인테그린 αIIbβ3)과 선택적으로 결합하거나 상기 수용체를 표적으로 삼으며, 상기 결합은 이러한 피브리노겐 수용체에 의해 매개되는 다른 생물학적 활동뿐만 아니라 피브리노겐 의존성 혈소판 응집의 억제의 결과를 초래한다. 본 발명에서 유용한 디스인테그린의 예는, 이로 제한되는 것은 아니나, 로도스토민, 트리플라빈 (triflavin), 르키스타틴 (rchistatin), 트리무크린 (trimucrin), 엘레간틴 (elegantin), 트리그라민 (trigramin) 및 아플라긴 (applaggin)을 포함한다. 본 발명에서 유용한 디스인테그린의 예시적인 펩타이드 서열은 서열번호 1 내지 6에서 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "디스인테그린 변이체"는 조작되고 기능적으로 활성인 단백질 또는 이의 폴리펩타이드 또는 임의의 변이체로, 이는 야생형 디스인테그린으로부터 유래되거나 변형되거나 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다. 디스인테그린 변이체는 자연적으로 발생된 디스인테그린과 비교하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 함유한다. 상기 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 자연적으로 발생된 디스인테그린에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 일 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖지 않는 자연적으로 발생된 디스인테그린과 비교하여 αIIbβ3 인테그린에 감소된 결합 활성을 갖는다. 더욱 바람직하게, 디스인테그린 변이체는 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 인테그린 α5β1의 하나 또는 그 이상에 특이적으로 결합한다. 가장 바람직하게, 디스인테그린 변이체는 하나 또는 그 이상의 돌연변이가 없는 자연적으로 발생된 디스인테그린에 비하여 인테그린 ανβ3 및 인테그린 α5β1 중 하나 또는 모두에 대하여 결합 활성이 증가했다.
특정 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 자연적으로 발생된 Rho와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽인 또는 결실을 함유하는 변형된 Rho 단백질을 포함한다. 변형된 Rho 변이체 및/또는 다른 디스인테그린은 사후 번역된 변형체들을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이 RGD 고리" 또는 "돌연변이 RGD 영역"은 디스인테그린의 RGD 고리에 있는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 펩타이드를 의미한다. 야생형 디스인테그린의 RGD 고리는 인테그린에 결합하는 RGD 잔기를 포함한다. 예를 들어, Rho의 RGD 고리는 서열번호 333 (RIPRGDMP)의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이 RGD 고리는 서열번호 333의 아미노산 서열 중 1 내지 3, 5, 7 및 8 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 돌연변이 RGD 고리는 서열번호 329 내지 331로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 돌연변이 링커를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이 링커" 또는 "돌연변이 링커 영역"은 디스인테그린의 링커 영역에 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 펩타이드를 의미한다. 디스인테그린의 링커 영역은 RGD 고리의 N-말단 바로 옆에 위치한다. 예를 들어, Rho의 링커 영역은 서열번호 332 (SRAGKIC)의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이 링커는 서열번호 332의 아미노산 서열 중 1 내지 5 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 돌연변이 링커는 서열번호 306 내지 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 돌연변이 C-말단을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이 C-말단" 또는 "돌연변이 C-말단 영역"은 디스인테그린의 C-말단 영역의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 펩타이드를 의미한다. 디스인테그린의 C-말단 영역은 디스인테그린의 카복실 말단에 위치한다. 예를 들어, Rho의 C-말단은 서열번호 334 (PRYH)의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이 C-말단은 서열번호 334의 아미노산 서열 중 1 내지 4 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 돌연변이 C-말단은 서열번호 319 내지 서열번호 328로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 돌연변이 RGD 고리를 포함하고 디스인테그린의 돌연변이 링커 및 돌연변이 C-말단 중 적어도 하나를 포함한다.
더욱 바람직한 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 본원에서 서술한 디스인테그린의 돌연변이 RGD 고리, 돌연변이 링커 및 돌연변이 C-말단을 포함한다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는 자연적으로 발생된 및 비자연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 자연적으로 발생된 아미노산의 예는, 이로 제한되는 것은 아니나, 전형적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 형성하는 자연적으로 발생된 아미노산인 임의의 20개의 일차 아미노산을 포함한다. 하기 표 1은 20개의 자연적으로 발생된 아미노산의 표이다.
자연적으로 발생된 아미노산
아미노산 3글자 요약 한글자 기호
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르트산 Asp D
시스테인 Cys C
글루타민 Gln Q
글루탐산 Glu E
글라이신 Gly G
히스티딘 His H
이소류신 Ile U
류신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
비자연적으로 발생하는 아미노산은 자연적으로 발생하거나 화학적으로 합성되는 단백질을 형성하지 않는 아미노산이다. 비자연적으로 발생하는 아미노산의 예는, 이로 제한되지 않으나, β-아미노산 (β3 및 β2), 호모 아미노산, 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환 알라닌 유도체, 글라이신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, N-메틸 아미노산 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보존적인 치환"은 아미노산을 순수 전자 전하가 같고 대략적으로 같은 크기 및 같은 모양을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 상기 아미노산의 측쇄에 있는 탄소 및 헤테로 원자의 총 수가 약 4 이상 차이 나지 않은 경우 대략적으로 같은 크기를 갖는다. 아미노산의 측쇄에 있는 가지의 수가 1 이상 차이나지 않을 때, 아미노산은 대략적으로 같은 모양을 가진다. 아미노산의 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐 그룹을 가진 아미노산은 대략 같은 크기 및 모양을 가지는 것으로 여겨진다. 다섯 개의 아미노산 그룹이 아래 나열되었다. 폴리펩타이드에 있는 아미노산이 같은 아미노산 그룹의 다른 아미노산으로 치환되면 보존적인 치환이 일어난다: 그룹 I: 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 C1 내지 C4의 지방족 또는 지방족 측쇄가 치환된 C1 내지 C4의 하이드록실을 가진 비자연적으로 발생된 아미노산 (직선 사슬 또는 단일 가지); 그룹 Ⅱ: 글루탐산, 아스파르트산 및 C1 내지 C4의 지방족 측쇄로 치환된 카르복시산을 가진 비자연적으로 발생된 아미노산 (가지가 없는 또는 한 개의 가지점); 그룹 Ⅲ: 리신, 오르니틴, 아르기닌 및 C1 내지 C4의 지방족 측쇄로 치환된 아민 또는 구아니디노를 가진 비자연적으로 발생된 아미노산 (가지가 없는 또는 한 개의 가지점); 그룹 Ⅳ: 글루타민, 아스파라긴 및 C1 내지 C4의 지방족 측쇄로 치환된 아마이드를 가진 비자연적으로 발생된 아미노산 (가지가 없는 또는 한 개의 가지점); 및 그룹 Ⅴ: 페닐알라닌, 페닐글라이신, 티로신 및 트립토판.
본원에서 사용된 바와 같이, "극도로 보존적인 치환"은 아미노산을 측쇄에 같은 작용기를 가지고 거의 동일한 크기 및 모양을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 가진 아미노산은 상기 아미노산의 측쇄에 있는 탄소 및 헤테로 원자의 총 수가 2개 이상 차이 나지 않은 경우 거의 같은 크기를 가진다. 아미노산이 이들의 측쇄에 같은 수의 가지를 가질 때 거의 같은 모양을 가진다. 극도로 보존적인 치환의 예는 류신에 대한 발린, 세린에 대한 트레오닌, 글루탐산에 대한 아스파르트산 및 페닐알라닌에 대한 페닐글라이신을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는 특히 게놈 DNA, 재조합 DNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원의 핵산 또는 이들의 몇몇 조합을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 단백질을 의미하고, (1) 통상적으로 발견될 수 있는 적어도 일부의 단백질이 없고, (2) 동일한 출처의, 예를 들어, 같은 세포 또는 종의 다른 단백질이 본질적으로 없다. (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되고, (4) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄소 수화물 또는 유래 세포로부터 분리될 경우 자연적으로 발견되는 다른 물질의 적어도 약 50 퍼센트로부터 분리되고, (5) 분리된 단백질이 자연적으로 연결되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연결되지 않고, (6) 자연적으로 연결되지 않거나 (7) 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩타이드에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동 가능하게 연결된다. 바람직하게, 분리된 단백질은 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에 방해되는 자연환경에서 발견되는 물질인 다른 오염 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염원을 실질적으로 함유하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 DNA, RNA, 이들의 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산을 의미하는 것으로 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 자연적으로 발생된 또는 비재조합 세포에 의해, 유전적으로 조작된 또는 재조합 세포에 의해, 또는 화학적으로 합성되어 제조된 단백질을 나타내기 위해 상호 교환하여 사용될 수 있고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 가지는 분자 또는 천연 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 가지는 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 디스인테그린은 구체적으로 변형된 Rho 단백질 또는 이들의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 특정 실시예에서, 디스인테그린은 인테그린의 활성을 억제하는 Rho 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 실시예에서, 디스인테그린은 αν-인테그린 이소형태 예컨대, ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 인테그린 α5β1로부터 선택되는 임의의 그룹을 표적화한다. 일부 다른 구체적인 실시예에서, 인테그린은 αIIbβ3가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "숙주세포"는 임의의 재조합 백터 또는 폴리뉴클레오타이드를 받아들일 수 있거나 받은 개별 세포 또는 세포주이다. 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함하며, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 부모세포와 (형태상 또는 전체 cDNA) 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주세포는 생체 외 또는 생체 내에서 재조합 벡터로 형질감염 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포는 "재조합 숙주세포"로 불릴 수 있다. 적절한 숙주세포는 예컨대, 박테리아, 효모, 진균, 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 활성"은 인테그린 활성에 억제, 차단, 중화, 감소, 폐기 또는 방해 중 하나 또는 그 이상의 결과를 초래하는 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체의 인테그린에의 결합을 의미한다. 특정 실시예에서, 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체는 인테그린에 결합하여 인테그린이 다른 분자 예컨대, ECM 단백질에 결합하는 것으로부터 격리시켜 인테그린의 활성을 억제한다. 특정 다른 실시예에서, 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체는 인테그린과 결합하여 세포 내 인테그린이 다운스트림으로의 신호전달 사건을 유발하는 것을 방지하여 인테그린 활성을 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 사용된 인테그린 활성의 문맥에서 "억제" 또는 "억제하다"는, 이에 제한되지 않으나, 제한, 결합 분석, 전이 분석, 세포자멸사 분석 및 세포 부착 분석을 포함하는 다양한 기능적인 분석에 의해 분석된 인테그린의 활성을 감소시키는 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체의 성질을 의미한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 인테그린은 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8을 포함하는 αν-인테그린 이소형태이다. 다른 특정 구체적인 실시예에서, 인테그린은 α5β1이다. 또한 특정 실시예에서, 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체는 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체가 없는 대조구와 비교하였을 때 인테그린 활성을 약 0%에서 약 100%까지 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "선택적으로 결합하다", "선택적으로 억제하다", "선택적으로 결합", "선택적으로 억제", "구별하여 결합하다", "구별하여 억제하다", "구별하여 결합" 또는 "구별하여 억제"는 하나 또는 그 이상의 다른 인테그린에 대한 특정 표적 인테그린 분자에 대한 차별적인 특이성을 보이는 디스인테그린 또는 디스인테그린 변이체의 성질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 하나 또는 그 이상의 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, α5β1에 선택적으로 결합함으로써 다른 인테그린, 예컨대, αIIbβ3 인테그린보다 하나 또는 그 이상의 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, α5β1에 높은 친화도를 갖는다. 특정 실시예에서, 변형된 Rho 단편을 포함하는 디스인테그린 변이체는 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 인테그린 α5β1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 인테그린의 활성을 선택적으로 억제한다. 바람직한 실시예에서, 변형된 Rho 단편을 포함하는 디스인테그린 변이체는 인테그린 ανβ3 및 인테그린 α5β1 모두를 특이적으로 억제하고, 인테그린 ανβ5 및 인테그린 α5β1 모두 또는 인테그린 ανβ6 및 인테그린 α5β1 모두의 활성을 특이적으로 억제한다. 일부 대체적인 실시예에서, 변형된 Rho 단편을 포함하는 디스인테그린 변이체는 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 인테그린 α5β1 모두의 활성을 특이적으로 억제한다.
본원에서 사용된 용어 "상동성" 또는 "상동성인"은 상응하는 디스인테그린 단편, 예컨대 Rho 단편 사이에 전체적인 서열 유사성 및/또는 동일성의 수준을 의미한다. 높은 서열 상동성은 단백질 활성의 보존을 암시한다. 수 많은 공개적으로 이용 가능한 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램은 서열 상동성을 결정하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 보존적인 또는 비보존적인 아미노산 치환의 적합성 및 서열 상동성의 수준을 결정하는 것은 해당 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상"은 이로 제한되지 않으나, 유제류 (예컨대, 사슴), 곰, 토끼목, 설치류, 새 등과 같은 동물을 포함하는 야생화한 또는 야생 동물뿐만 아니라, 이로 제한되지 않으나, 인간 및 다른 영장류, 설치류 (예를 들어, 마이스, 레트 및 기니피그), 토끼류 (예를 들어, 토끼), 소아과 (예를 들어, 소), 양류 (예를 들어, 양), 양아과 (예를 들어, 염소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 말속 (예를 들어, 말), 개과 (예를 들어, 개), 고양이과 (예컨대, 고양이), 가금류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 기타 갈새 등)를 포함하는 임의의 동물을 의미한다. 상기 용어는 특정 나이 또는 성별에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 남성 또는 여성인지에 관계없이 태아뿐만 아니라 성인 및 신생아 대상이 상기 용어에 포함된다. "치료가 필요한" 대상은 이로운 치료의 결과 및/또는 예방의 결과를 얻기 위해 하나 또는 그 이상의 인테그린의 활성을 억제함으로써 치료될 수 있는 질병 및/또는 상태를 가진 대상이다. 이로운 결과는 증상의 중증도의 감소 또는 증상 발생의 지연, 증가된 수명 및/또는 더욱 신속한 또는 더욱 완벽한 질병의 해결 또는 상태의 해결을 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 통상적인 유형의 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제제 보조제 또는 부형제를 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용된 복용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고 제제의 다른 성분과 상용성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 변형된 화합물의 유도체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인테그린과 연관된 질병"은 의학적 개입이 요구되거나 의학적 개입이 바람직한 인테그린과 연관된 임의의 상태, 질환 또는 증후군을 의미한다. 상기 의학적 개입은 치료, 진단 및/또는 예방을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유효한 양" 또는 "충분한 양"은 특정 질병, 질환, 상태 또는 부작용의 증상을 억제, 예방 또는 치료하는데 치료적으로 유효할 수 있는 본원에서 전술한 디스인테그린 변이체의 양을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는 것"은 특정 질병, 질환, 상태 또는 부작용의 증상에 대한 빈도, 정도, 중증도 및/또는 기간을 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "예방하다", "예방" 또는 "예방하는 것"은 특정 질병, 질환, 상태 또는 부작용의 증상 억제 또는 회피를 의미한다.
디스인테그린 변이체
본 발명에서는 로도스토마 (rhodostoma)에서 유래된 로토스토민 (Rho)과 같은 뱀 독으로부터 디스인테그린 변이체가 ανIIbβ3에 대한 감소된 결합 활성을 가지면서, 하나 또는 그 이상의 αν-인테그린, 예컨대, 하나 또는 그 이상의 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8 및 다른 인테그린(예컨대, α5β1)과 선택적으로 결합하는 다른 능력을 나타낸다는 것을 발견하였다. 특정 인테그린에 대한 선택적인 결합의 능력은 목적하는 디스인테그린의 링커 영역, RGD 고리 및 C-말단의 하나 또는 그 이상에서 아미노산 서열을 돌연변이 시킴으로써 가능했다.
따라서, 본 발명의 하나의 일반적인 양태는 디스인테그린 변이체에 관한 것이다.본 발명의 일 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 αIIbβ3에 대해 감소된 결합 활성을 가지고, α5β1, ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8 중 적어도 하나에 대해 특이적으로 결합한다.
바람직하게, 디스인테그린 변이체는 디스인테그린 변이체 유래의 야생형 디스인테그린과 비교하여 αIIbβ3에 대해 감소된 결합 활성을 가지나, α5β1 및 ανβ3 중 적어도 하나에 대한 결합 활성이 증가된다.
예를 들어, RGD 고리에 있는 Rho 돌연변이가 αVβ3 및/또는 α5β1 인테그린에 대한 특이성을 증가시킬 수 있고, C-말단 영역의 돌연변이는 αIIbβ3에 대한 결합을 감소시킬 수 있고 링커 영역에서의 돌연변이 또한 αIIbβ3에 대한 결합을 감소시킬 수 있으며, 전술한 각각의 상기 세 영역은 야생형 Rho에서 아미노산 잔기 수에 의해 확인될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따라 변형 예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환 될 수 있는 상기 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 "X"로 표시됐다.
본 발명의 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 RGD 고리에서의 돌연변이 즉, 돌연변이 RGD 고리를 포함한다.
일 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 49RXD51의 공통서열을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 7 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 48XRGD51의 공통서열(서열번호 341)을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 25 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 48XRGDXP53의 공통서열(서열번호 342)을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 44 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 48XRGDMX53의 공통서열(서열번호 343)을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 63 내지 78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 46XXPRGD51의 공통서열(서열번호 344)을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 79 내지 94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 48XRXDXP53의 공통서열(서열번호 345)을 갖는 돌연변이 RGD 고리를 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 95 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 C-말단 영역에서의 돌연변이, 즉, 돌연변이 C-말단을 포함한다.
일 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 65PRXXXXX71의 공통서열(서열번호 346)을 갖는 돌연변이 C-말단을 포함한다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 102 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 65PRXXXXX71의 공통서열(서열번호 346)을 갖는 돌연변이 C-말단을 포함하며, 돌연변이 RGD 고리, 예컨대, 본원에서 전술한 돌연변이 RGD 고리를 더 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 RGD 고리는 48ARGDMP53 (서열번호 335)의 공통 서열을 가질 수 있다. 상기 변이체의 예들로, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 115 내지 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 링커 영역에서의 돌연변이, 즉, 돌연변이 링커를 포함한다.
일 실시예에서, 디스인테그린 변이체는 39KKKRTIC47 (서열번호 306)의 공통서열을 갖는 돌연변이 링커를 포함한다. 바람직하게, 디스인테그린 변이체는 돌연변이 RGD 고리, 예컨대, 본원에서 전술한 돌연변이 RGD 고리를 더 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 RGD 고리는 48XRXDXP53의 공통서열(서열번호 345)을 가질 수 있다. 상기 변이체의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 108 내지 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 변이체를 포함한다.
본 발명의 추가 실시예에 따르면, 디스인테그린 변이체는 링커 영역에서의 돌연변이, RGD 고리에서의 돌연변이 및 C-말단 영역에서의 돌연변이를 포함한다. 상기 변이체들의 예는, 이로 제한되지 않으나, 서열번호 120 내지 132 및 134 내지 179로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변이체들을 포함한다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는 본 발명의 관점에서 본 발명의 목적에 적합한 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 디스인테그린 변이체는 부위지정 돌연변이 유발 방법으로 형성될 수 있다. 본 발명의 디스인테그린 변이체는 본 발명의 관점에서 당업계에 현재 공지된 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 세포 기반 방법 (Cell-based method) 및 무세포 (cell-free) 방법은 본 발명의 펩타이드를 제조하는데 적합할 수 있다. 세포 기반 방법은 일반적으로 핵산 컨스트럭트를 생체 외에서 숙주세포 내로 도입하고, 발현에 적합한 조건에서 배양한 다음, 배양배지 또는 숙주 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 펩타이드를 수확한다 (예를 들어 숙주세포를 파괴함으로써). 본 발명은 또한 당업계에 잘 알려져 있는 무세포 생체 외 전사/번역 방법을 사용하여 디스인테그린 변이체를 만드는 방법을 제공한다.
디스인테그린 변이체는 실질적으로 감소된 인테그린 αIIbβ3 수용체 저지 활동 및/또는 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 다른 인테그린, 예컨대, α5β1 중 하나 또는 그이 상에 대한 증가된 특이성을 갖는 상기 폴리펩타이드를 초래하는 변형된 아미노산 서열을 코딩하는 변형된 디스인테그린 핵산 서열로 코딩될 수 있다. 디스인테그린 변이체를 코딩하는 서열은 뱀 독에서 유래된 디스인테그린을 코딩하는 서열을 변형함으로써 얻을 수 있다. 디스인테그린은 로도스토민, 알볼라브린, 아플라긴, 바실리신, 바트로소스타틴, 비티스타틴, 세레베린, 세라스틴, 크로타트록신, 듀리신, 엘레간틴, 플라보리딘, 플라보스타틴, 할리신, 할리스타틴, 자라라신, 자라스타틴, 키스트린, 라체신, 루토신, 몰로신, 살모신, 삭사틸린, 테르게미닌, 트리메스타틴, 트리뮤크린, 트리뮤타제, 유슈리스타틴, 및 비리딘 중 하나로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 본 발명의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 본 발명의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
전형적으로, 변형된 또는 변형되지 않은 이종 펩타이드는 상기에서 전술한 바와 같이, 그 자체, 또는 결합 단백질로서 표현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라, 분비 리더 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 분비 리더 서열은 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 또는 페리플라즈마 (periplasma)로 특정 단백질을 유도할 수 있다. ER은 막 결합 단백질을 다른 단백질과 분리시킨다. ER에 위치되면, 단백질은 더 나아가 분비성 소포, 원형질막, 라이소좀 및 다른 기관을 포함하는 소포로 분배되기 위해 골지체로 전달될 수 있다. 페리플라즈마의 경우, 단백질은 그람 음성균 (예컨대, 대장균)의 페리플라즈마 공간으로 분비된다.
또한, 펩타이드 모이어티 및/또는 정제 태그는 디스인테그린 변이체에 추가될 수 있다. 상기 영역은 폴리펩타이드의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 다른 이유들 중에서, 분비 또는 배설을 일으키고, 안정성을 향상시키며, 정제를 용이하게 하기 위해 펩타이드 모이어티를 폴리펩타이드에 첨가하는 것은 당업계에서 친숙하고 통상적인 기술이다. 적절한 정제 태그는, 예를 들어, V5, 폴리히스티딘, 아비딘 (avidin) 및 비오틴 (biotin)을 포함한다.펩타이드와 비오틴과 같은 화합물과의 결합은 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용하여 수행될 수 있다 (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press). 펩타이드는 또한 방사성 동위원소, 독소, 효소, 형광 라벨, 콜로이드성 금, 핵산, 비노알부민 (vinorelabine) 및 독소루비신 (doxorubicin)과 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용하여 결합될 수 있다 (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press; Stefano et al. (2006).
본 발명의 사용을 위해 적합한 결합 파트너는, 예를 들어, 페투인 (fetuin), 인간 혈청 알부민, 면역글로불린 CH2/CII3 도메인 (Fc), 및/또는 이들 절편의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 결합된 단백질 (예컨대 폴리에틸렌 글라이콜 컨쥬게이트)가 또한 제공된다.
본 발명의 펩타이드는 또한 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, Hunkapiller et al., Nature, 310: 105 1 1 1 (1984); Grant ed. (1992) Synthetic Peptides, A Users Guide, W.H. Freeman and Co.; U.S. Pat. No. 6,974,884를 보라). 예를 들어, 폴리펩타이드의 절편과 일치하는 폴리펩타이드는 당업계에 알려진 펩타이드 합성기 또는 고체-상 (solid-phase) 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
또한, 원한다면, 비전형적인 아미노산 또는 화학적인 아미노산 유사체는 폴리펩타이드 서열로 치환 또는 추가됨으로써 도입될 수 있다. 비전형적인 아미노산은, 이로 제한되지 않으나, 공통 아미노산의 D-아이소머, 2,4-다이아미노부티르산, a-아미노이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노헥산산, Aib, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시크룰린, 시스테인산, t-뷰틸글라이신, t-뷰틸알라닌, 페닐글라이신, 사이클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산 (예컨대, b-메틸아미노산, Ca-메틸아미노산, Na-메틸아미노산, 및 아미노산 유사체)를 일반적으로 포함한다. 또한, 아미노산은 D (우회전의 (dextrorotary)) 또는 L (좌회전의 (levo rotary))일 수 있다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는, 이로 제한되지 않으나, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토 그래피, 하이드록시아파타이드 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 표준 방법에 의해 화학적 합성 및 재조합 세포 배양으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 일 실시예에서, 고성능 액체 크로마토 그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)가 정제에 사용된다. 단백질 리폴딩을 위한 잘 알려진 기술은 펩타이드가 단리 및/또는 정제되는 동안 변성될 때 활성 형태를 재생키시기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는 펩타이드의 용해도 및 순환 반감기를 증가시키기 위해 하나 또는 그 이상의 다양한 친수성 중합체로 변형되거나 공유결합될 수 있다. 펩타이드에 결합되기에 적합한 비단백질성 친수성 중합체는, 이로 제한되지 않으나, 폴리알킬에터 (예로서, 폴리에틸렌 글라이콜 및 폴리프로필렌 글라이콜), 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 폴리옥시알켄, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 덱스트란 및 덱스트란 유도체를 포함한다. 일반적으로, 상기 친수성 중합체는 약 500 내지 약 100,000 달톤, 약 2,000 내지 약 40,000 달톤, 또는 약 5,000 내지 20,000 달톤 범위의 평균 분자량을 갖는다. 상기 펩타이드는 Zallipsky, S. (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165; Monfardini, C, et al. (1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69; U.S. Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192; 4,179,337, or WO 95/34326에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 상기 중합체로 유도시키거나 결합될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 다른 일반적인 양태는 본 발명의 디스인테그린 변이체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 필요에 따라, 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 가스 형태의 제형으로 형성될 수 있다. 하기 방법 및 부형제는 단지 예시적인 것이며 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 당업계에 널리 공지되어 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로 제형화되어 제공된다. 상기 약학적 담체, 부형제 및 희석제는 USP 약학적 부형제 리스트에 나열된 것들을 포함한다. USP 및 NF 부형제는 Categories, p. 2404-2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Md. (ISBN 1-889788-03-1)에 나열되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 (예컨대, 비히클, 보조제, 담체 또는 희석제)는 대중이 쉽게 이용 가능하다. 더욱이, 약학적으로 허용 가능한 보조 물질 (예컨대, pH 조절제, 완충제, 등장성 조절제, 안정제, 습윤제 등)은 대중이 쉽게 이용 가능하다.
적합한 담체는, 이로 제한되지 않으나, 물, 덱스트로스, 트리할로오스, 히스티딘, 글리세롤, 살린, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 담체는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 제형화의 효율성을 향상시켜주는 보조제와 같은 추가적인 제제를 함유할 수 있다. 국소용 담체는 액체 석유, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글라이콜, 에탄올 (95%), 물 중 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트 (5%) 또는 물 중 라우릴 황산나트륨 (5%)을 포함한다. 다른 재료 (예컨대, 항산화제, 습윤제, 점도 안정제, 및 유사한 제제)는 필요에 따라 첨가될 수 있다. 아존 (Azone)과 같은 경피투과 증강제 또한 포함될 수 있다.
상기 투여 형태를 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다. 투여될 조성물 또는 제형은, 임의의 경우에, 치료되는 대상에서 원하는 상태를 달성하기에 충분한 양의 제제를 함유할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 수성 또는 비수성 용매 (예컨대, 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고급 지방산 에스터 또는 프로필렌 글라이콜)에 상기 디스인테그린 변이체를 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사를 위한 제제로 제형화될 수 있고; 만약 원한다면, 통상적인 첨가제 (예컨대, 용해제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제)로 제형화 될 수 있다. 경구 또는 비경구 전달을 위한 다른 제형 또한 당업계의 통상적인 방법으로 사용될 수 있다.
약학적인 투여 형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여될 수 있거나, 본 발명의 약학적 조성물은 다른 약학적으로 활성인 화합물과 조합으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라. 단독 또는 적절한 조합으로 사용될 수도 있다. 상기 대상 조성물은 잠재적인 투여 방식에 따라 제형화된다. 적절한 실시예에서, 약학적 조성물은 비경구 투여, 예컨대 주사를 위한 액상형태로 제형화된다.
치료 방법
본 발명은 또한 필요로 하는 대상에서 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6 및 ανβ8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 인테그린과 연관된 질병을 치료 및/또는 예방하는데 있어 디스인테그린 변이체의 용도에 관한 것이다. 상기 질병으로, 이로 제한되지 않으나, 골다공증, 골 종양 또는 암 성장 및 이와 연관된 증상, 혈관신생과 연관된 종양 성장 및 전이, 뼈로의 암 전이, 악성 종양성 고칼슘 혈증, 혈관신생과 연관된 눈 질환, 파젯병 (Paget's disease), 류마티스 관절염, 및 골 관절염을 포함한다. 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 디스인테그린 변이체 및 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 이로 제한되지 않으나, 연령관련 황반 퇴화, 당뇨 망막 병증, 각막 신생 혈관 질환, 허혈로 유발되는 신생 혈관성 망막병증, 고도근시 및 미숙아 망막병증을 포함하는 혈관신생 관련 눈 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 이로 제한되지 않으나, 암, 눈 관련 질병 (예컨대, 황반 퇴화, 부종)을 포함하는 혈관신생 관련 질병의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 각막에 존재하는 αν-인테그린 (ανβ5, ανβ6 및 ανβ8)에 결합하여 TGFβ (transforming growth factor β)의 활성을 매개하여, 관련 질환을 치료하는 결과를 낳는다. 상기 질병은 눈 질환, 관절염 및 암을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이러한 병리학적 그리고 파괴적인 혈관에 의해 초래되는 관절염의 통증을 완화시키고 관절의 파괴를 예방하는 항혈관신생 약물이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 동시에 다른 전략을 통해 암을 공격하는 "다핵 탄두 (multiple warhead)" 접근의 일부로서 통상적인 화학요법 또는 방사선 치료법과 같이 사용되었을 때 유용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 골다공증의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 골다공증은 폐경기 이후의 에스트로겐 결핍, 2차 골다공증, 류마티스 골다공증, 난소 절제, 파젯병, 골 암, 골 종양, 골 관절염, 증가된 파골세포 형성 및 증가된 파골세포 활성으로부터 선택되는 병적인 상태와 관련이 있다. 또한, 골다공증은, 이로 제한되지 않으나, 난소 절제에 의해 유도된 골다공증 또는 뼈 손실 및 폐경기 이후의 골다공증 또는 골 손실을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 디스인테그린 변이체를 난소 절제 또는 폐경기 후 골다공증을 포함하는 포유류 내 생리학적인 변화의 치료 및/또는 예방을 위해 사용하는 방법이다. 상기 방법은 야생형 디스인테그린에 비하여 인테그린 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, 또는 α5β1 수용체-길항체 활성을 가지고 인테그린 αIIbβ3 수용체 차단 활성이 상당히 감소된 치료적으로 유효한 양의 분리된 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 이는 난소 절제로 유도된 포유류 내 생리학적인 변화의 치료 및/또는 예방을 가져온다.
다른 양태에서, 본 발명은 유효한 양의 본 발명의 디스인테그린 변이체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 상기 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 혈소판 응집을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는 예를 들어, 정맥 내 주사와 같은 전신 주사; 또는 주사 또는 관련 부위에 적용 (예컨대, 상기 부위가 수술 중 노출되었을 때 직접 주사, 또는 상기 부위에 간접 적용); 또는 장애가 피부에 있는 경우의 국소 적용에 의해 치료를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명의 디스인테그린 변이체는 단독요법으로 사용될 수 있다. 대체적으로, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 인테그린 관련 질환의 치료를 위해 표준 식이요법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 치료적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 다른 약학적인 제제와 같이 조합적인 요법으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다른 약학적 제제는 항암제, 항염증제, 면역 조절제 및 항골다공증제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 항암제는 항혈관신생제, 세포독성제 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 약학적 제제는 본 발명의 펩타이드의 투여에 앞서, 함께 또는 후에 투여될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 디스인테그린 변이체는 특히 과발현된 오스테오폰틴 (osteopontin)과 연관된 암에 대하여 효과적이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 오스테오폰틴에 의해 유도된 종양 침습을 억제할 수 있다.
디스인테그린 변이체의 투여는 경구, 협측, 비강, 직장, 비경구, 복강 내, 피내 (intradermal), 경피, 피하, 정맥 내, 동맥 내, 심장 내, 심실 내, 정맥 내, 두개골 내, 기관 내 (intratracheal) 및 척추강 내 등 또는 이식 또는 흡입에 의한 다른 방법을 포함하는 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 설명하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해 결정된다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1: 야생형 Rho 및 Rho 돌연변이 (디스인테그린 변이체)를 발현하는 발현 벡터의 구축
Rho를 코딩하는 DNA는 파키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 우선적으로 사용되는 코돈으로 구성된다. Rho DNA는 EcoRI 인식 부위를 가지고 용이한 정제를 위해 6개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 센스 프라이머 5'-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAGGAATGTGACTGTTCT-3' (서열번호 183)로 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다. 안티센스 프라이머는 Sac II 인식 및 TCA (또는 TTA) 정지 코돈을 가진 5'-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' (서열번호 180) 또는 5'-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' (서열번호 184)의 서열을 가진다. 상기 PCR 산물은 정제된 다음 효모 재조합 벡터 pPICZa A의 Eco RI 및 Sac II 부위에 결합시켰다. 재조합 플라스미드를 사용하여 DH5a 균주를 형질전환 시키고, 저염 LB (1% 트립톤, 0.5% gyah 추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0의 1.5% 한천) 및 25 ㎍/㎕의 항생제 제오신 (Zeocin)을 가진 한천 플레이트에서 콜로니를 선택하였다.
Rho의 돌연변이를 코딩하는 다양한 DNA 컨스트럭트는 Eco RI 및 SCA II 제한효소 부위를 함유하는 프라이머를 가지고 중첩 올리고뉴클레오타이드 전략을 사용하여 PCR로 합성 및 증폭되었다. 예시 목적으로, 표 2에서 몇몇 디스인테그린 변이체의 공통 서열, 및 본 발명의 실시예에 따른 상기 변이체를 구축하는데 사용하는 프라이머를 열거하였고, 여기서 상기 프라이머 서열은 5'에서 3' (왼쪽에서 오른쪽)으로 나타나있다.
본 발명에 포함되는 다른 변이체를 코딩하는 발현 벡터는 본 발명의 관점에서 유사한 방법으로 구축되거나 될 수 있다. 디스인테그린 변이체를 합성 또는 확인하는데 사용한 다양한 프라이머는 서열번호 180 내지 305에 나열되어 있다.
실시예 2: Rho 돌연변이의 발현 및 정제
피키아 파스토리스에서 로도스토민 돌연변이 및 변이체의 단백질은 피키아 EasyComp™ 키트의 프로토콜을 조금 변형한 것에 따라 수행되었다. 간략하게, 로도스토민 또는 다양한 디스인테그린을 코딩하는 DNA를 함유하는 전체 10㎍의 플라스미드를 정제하고 Sac I으로 절단하여 플라스미드를 선형화하였다. 피키아 균주 X33은 lnvitrogenㄾ로부터 피키아 EasyComp™ kit를 사용하여 열 충격 방법에 의해 선형화된 컨스트럭트로 형질전환 되었다. 형질전환체는 단일 크로스오버에 의해 5'AOX1 유전자좌에 통합되었다. Rho 유전자가 피키아 유전자에 통합되었는지를 결정하기 위해 PCR을 사용하여 피키아 통합체를 분석하였고 Lyticase (Sigma)로 세포를 용해시켰다. YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩트론, 2% 글루코오스 및 2% 한천) 및 100 ㎍/㎕ 제오신을 함유하는 한천 플레이트에서 콜로니를 선택하였다. 디스인테그린 단백질 발현이 가장 높은 변이체에 대한 클론을 선별하여 여러 카피의 인테그린 삽입을 가진 클론의 수를 선택하였다.
재조합 Rho 돌연변이는 하기와 같이 제조되었다: 선택된 콜로니를 30℃에서 100 ㎍/㎕의 제오신을 함유하는 YPD 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩트론 및 2% 덱스트로즈)에서 성장시켰다. 48시간 후, 세포를 원심분리하여 수집하고 1 리터의 최소 메탄올 배지 (황산 암모늄은 있고 아미노산은 없는 1.34% 효모 질소 염기 및 4x10-5% 비오틴을 함유)에서 성장시켰다. 전체 1% 메탄올을 2일 동안 매 24시간마다 한번씩 첨가하여 Rho 또는 이의 변이체 발현을 유도하였다. 상층액을 원심분리로 수집하고 5리터 완충액 A (5 mM EDTA, 8 M 우레아 및 10 mM 나트륨-인산 완충액, pH 7.7)로 2회 투석하였다. 최종 용액을 니켈-칼레이트 칼럼에 로딩하고 200 mM 농도의 이미다졸로 구배 용리시켰다. 재조합 로도스토민 및 디스인테그린 변이체는 추가로 HPLC (역상 C18 HPLC)로 정제하였다. 정제된 재조합 디스인테그린 변이체는 트리신-SDS-PAGE로 판단하였을 때 95%를 크게 웃도는 순도를 가졌다.
Figure 112017027512032-pct00001
실시예 3: 다른 av 인테그린 및 α5β1 인테그린에 의해 매개되는 세포 부착을 선택적으로 억제하는 Rho 돌연변이
Rho 돌연변이 및 변이체의 활성억제는 이전에 전술한 세포 부착 억제 분석으로 평가하였다 (Zhang, et al., 1998 J Biol Chem 73:7345-7350). CHO-αIIbβ3 세포의 피브리노겐에 대한 부착, CHO-ανβ3 세포의 피브리노겐에 대한 부착, K562 세포의 피브로넥틴에 대한 부착, HT-29 세포의 비트로넥틴에 대한 부착, 및 HT-29 세포의 피브로넥틴에 대한 부착이 인테그린 αIIbβ3, ανβ3, α5β1, ανβ5 및 ανβ6에 대한 실험된 단백질의 억제 활성을 결정하기 위해 사용되었다. 간략하게, 96-well Immulon-2 미량정량 플레이트 (Costar, Corning, NY)를 50 내지 500 nM의 농도로 기질을 함유하는 100 ㎕의 인산-완충 생리식염수 (PBS: 10 mM 인산 완충액, 0.15 M NaCl, pH 7.4)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이트하였다. 상기 기질 및 이들의 코팅 농도는 피브리노겐 (Fg) 200 ㎍/㎕, 비트로넥틴 (Vn) 50 ㎍/㎕, 및 피브로넥틴 (Fn) 25 ㎍/㎕였다. 비특이적 단백질 결합부위는 각 well을 열 변성된 1%의 소 혈청 알부민 (BSA) 200 ㎕로 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이팅하여 막았다. 열 변성된 BSA를 버리고 각 well을 200 ㎕㎕의 PBS로 2회 워싱하였다.
인테그린 ανβ3 (CHO-ανβ3) 및 αIIbβ3 (CHO-αIIbβ3)를 발현하는 CHO 세포는 Dr. Y. Takada (Scripps Research Institute)로부터 다양하게 제공받았고 DMEM에 보관되었다. 인간 적백혈병 K562 및 결장 선암종 HT-29 세포는 ATCC로부터 구매하여 5%의 FCS를 함유하는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 배지에서 배양하였다. 수확된 K562 및 HT-29 세포를 1 mM EDTA를 함유하는 PBS 버퍼로 워싱하고 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 및 500 mM MnCl2를 함유하는 Tyrode 완충액 (150 mM NaCl, 5 mM KCl 및 10 mM HEPES) [pH 7.35]에서 재현탁시켰다. 세포 (CHO, K562 및 HT-29)를 3x105 cells/㎕로 희석하고, 100 ㎕의 세포를 분석에 사용하였다. Rho 및 이의 돌연변이를 배양된 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. Rho 및 이의 돌연변이를 0.001 내지 500 μM의 농도에서 억제제로 사용하였다. 처리된 세포를 코팅된 플레이트에 넣은 다음 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 반응시켰다. 인큐베이션 용액을 버린 다음 부착되지 않은 세포를 200 ㎕의 PBS로 2번 워싱하여 제거하였다.
결합된 세포를 크리스탈 바이올렛 염색으로 정량화하였다. 간략하게, well을 100 ㎕의 10% 포르말린으로 10분 동안 고정시키고 건조시켰다. 50 ㎕의 0.05% 크리스탈 바이올렛을 상온에서 20분 동안 well에 첨가하였다. 각 well을 200 ㎕의 증류수로 4번 워싱하고 건조시켰다. 150 ㎕의 컬러화 용액 (50% 알코올 및 0.1 아세트산)을 첨가하여 컬러화를 수행하였다. 생성된 흡광도는 600 nm에서 판독되었고 상기 판독은 부착된 세포의 수와 연관이 있었다. 억제는 하기 수학식 1로 정의되었다.
[수학식 1]
% 억제 = 100 - [OD600 (Rho 야생형 또는 디스인테그린이 처리된 시료)/OD600 (처리되지 않은 시료)] x 100
IC50는 특정 인테그린에 의해 매개되는 세포 부착의 50% 억제에 필요한 디스인테그린 변이체의 농도 (nM)로 정의된다. 그러므로, 낮은 IC50는 각각의 인테그린의 세포 부착 활성을 억제하는 데 있어 디스인테그린 변이체의 높은 특이성 또는 잠재성을 나타낸다. IC50 결과는 아래 표 3 내지 14에 요약하였다.
RGD 고리 영역 (R50XD, 48XRGD(서열번호 341), XRGD52XP(서열번호 342), XRGDM53X(서열번호 343), 46X47XPRGD(서열번호 344), 및 ARGD51X52X(서열번호 340)), 링커 영역, 및 C-말단 영역 에 관련있는 일련의 Rho 돌연변이는 재조합으로 발현되고 균질성을 위해 정제되었다. 세포 부착 및 혈소판 응집 분석은 이들의 인테그린-결합 친화도를 결정하기 위해 사용되었다. 이러한 영역에서 하나 또는 그 이상의 변형된 로도스토민 또는 디스인테그린의 변이체는 ανβ3, ανβ5, ανβ6, α5β1 및 αIIbβ3에 대한 다른 선택적인 결합 친화도를 가진다 (표 3 내지 14).
예를 들어, RXD 모티프 내 "Gly50 (G)" 잔기가 Leu (L), Val (V), Ile (I), Glu (E), Asp (D), Gln (Q), Phe (F), Trp (W), His (H), Lys (K), or Arg (R)로 치환된 돌연변이를 가지는 Rho 변이체는 아래의 순서대로 인테그린에 가장 큰 효과를 가진다는 것을 발견하였다: αIIbβ3 (~1686-fold) > α5β1 (~586-fold) > ανβ5 (~348-fold) > ανβ6 (~179-fold)> ανβ3 (~26-fold), 이는 αVβ3에 대한 상기 변이체의 결합이 선택적이라는 것을 보여준다 (표 3). XRGD(서열번호 341) 모티프 내 돌연변이를 가지는 Rho 변이체는 P48 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가지는 Rho 모티프는 아래의 순서대로 인테그린에 가장 큰 효과를 가졌다: α5β1 (-71 -fold) > αIIbβ3 (~41-fold) > ανβ3 (~5-fold) (표 4). XRGDXP(서열번호 342) 모티프 내 M52 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가지는 Rho 변이체는 아래 순서에 따라 인테그린에 가장 큰 효과를 가졌다: αIIbβ3 (~209-fold) > α5β1 (~122-fold) > αVβ3 (~14-fold) (표 5). XRGDMX(서열번호 343) 모티프 내 P53 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가지는 Rho 변이체는 하기 순서에 따라 인테그린에 대하여 그들의 가장 큰 효과를 가졌다: αIIbβ3 (~258-fold) > α5β1 (~45-fold) > αVβ3 (~40-fold) (표 6). XXPRGD(서열번호 344) 모티프 내 R46 및 I47 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 Rho 변이체는 하기 순서에 따라 인테그린에 가장 큰 효과를 가졌다: αIIbβ3 (~73-fold) > α5β1 (~19-fold) > αVβ3 (~10-fold) (표 7). 이러한 결과는 RGD 고리 내 돌연변이가 인테그린 αIIbβ3 및 α5β1의 억제 활성에 대한 상당한 효과를 나타내지만, αVβ3 인테그린은 아니라는 것을 보였다.
RGD 모티프뿐만 아니라 예컨대, 링커 영역 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 변형을 가진 로도스토민 또는 디스인테그린의 돌연변이는 ανβ3, ανβ5, ανβ6, α5β1 또는 αIIbβ3에 선택적으로 결합하는 능력을 보였다 (표 8 내지 14). 예를 들어, 링커 영역에 SRAGKIC(서열번호 332)가 KKKRTIC(서열번호 306), KKARTIC(서열번호 313), MKKGTIC(서열번호 307), IEEGTIC(서열번호 308), LKEGTIC(서열번호 310), AKKRTIC(서열번호 311), KAKRTIC(서열번호 312), KGAGKIC (서열번호 309), KKKATIC(서열번호 314), KKKRAIC(서열번호 315), KAKRAIC(서열번호 316), 및 SKAGTIC(서열번호 317) 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가지는 Rho 변이체는 하기 순서로 인테그린에 가장 큰 영향을 미쳤다: αIIbβ3 (~2-fold) > α5β1 (~5-fold) > αVβ3 (~14-fold) (표 8). 이러한 결과는 Rho의 링커 영역의 돌연변이가 인테그린 αVβ3의 억제 활성에 상당한 효과를 나타났다는 것을 보였다.
C-말단 영역에 PRYH(서열번호 334)가 PGLYG (서열번호 324), PRNRFH(서열번호 321), PRNRFHA(서열번호 322), PRWNDL(서열번호 319), PRNGLYG(서열번호 323), 및 PRNPWNG(서열번호 320) 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가진 Rho 변이체는 하기 순서로 인테그린에 가장 큰 영향을 미쳤다: αIIbβ3 (~13-fold) > αVβ5 (~8-fold) = αVβ6 (~8-fold) > αVβ3 (~4-fold) > α5β1 (~2-fold) (표 9). 이러한 결과는 Rho의 C-말단 영역의 돌연변이가 인테그린 αIIbβ3, αVβ5 및 αVβ6에 억제 활성에 상당한 효과를 나타낸다는 것을 보였다.
C-말단 영역의 PRYH (서열번호 334)가 PGLYG (서열번호 324), PPLYG (서열번호 327), PRLYG (서열번호 328), PGLY(서열번호 325), PYLYG (서열번호 352), 및 PELYG (서열번호 337) 아미노산으로 치환된 돌연변이를 가진 Rho 변이체는 하기 순서로 인테그린에 큰 영향을 미쳤다: αIIbβ3 (~6493-fold) > α5β1 (~40-fold) > ανβ5 (~8-fold) > ανβ6 (~6-fold) > ανβ3 (~1-fold), 이는 인테그린 αIIbβ3 및 α5β1에 상당한 효과를 보이는 것으로 나타났다 (표 10).
인테그린 ανβ3 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 (Rho) 변이체는 Rho의 RGD 고리 영역, 링커 영역 및 C-말단 영역을 변형시킴으로써 성공적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 39KKART-46ARGRGDNP -66DLYG(서열번호 147)는 인테그린 ανβ3 및 α5β1에는 훌륭한 억제 활성을 보이나, αIIbβ3, ανβ5, 및 ανβ6은 그렇지 않았다 (표 11). RGD 고리 및 링커 영역의 돌연변이는 인테그린 ανβ3 및 α5β1을 억제하는 활성은 증가시켰고 인테그린 αIIbβ3를 억제하는 활성은 상당히 감소시켰다. C-말단 영역의 돌연변이는 인테그린 ανβ5, 및 ανβ6를 억제하는 활성을 감소시켰다.
인테그린 ανβ3, ανβ5, 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 (Rho) 변이체는 Rho의 RGD 고리 영역, 링커 영역 및 C-말단 영역을 변형시킴으로써 성공적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 39KKART-46 ARGRGDDL -66GLYG(서열번호 339)는 ανβ3, ανβ5, 및 α5β1에 대해 훌륭한 억제 활성을 보이나, αIIbβ3 및 ανβ6은 그렇지 않았다 (표 12). 링커 영역의 SRAGKIC(서열번호 332)를 KKARTIC(서열번호 313)로 치환한 돌연변이는 RGD 결합 인테그린을 억제하는 활성을 증가시켰다. RGD 고리에서 R46A, 147R, P48A, M52D 및 P53L의 돌연변이는 인테그린 αIIbβ3 및 ανβ6를 억제하는 활성을 감소시켰다. C-말단 영역의 PRYH(서열번호 334)을 PGLYG(서열번호 324)로 치환한 돌연변이는 인테그린 αIIbβ3을 억제하는 활성을 감소시켰다.
인테그린 ανβx 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 (Rho) 변이체는 Rho의 RGD 고리 영역, 링커 영역 및 C-말단 영역를 변형시킴으로써 성공적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 39KKART-46ARGRGDNP-66RYH(서열번호 123)는 인테그린 ανβ3 및 α5β1에 훌륭한 억제를 보이나, αIIbβ3, ανβ5 및 ανβ6은 그렇지 않았다 (표 13). RGD 고리 및 링커 영역의 돌연변이는 인테그린 ανβ3 및 α5β1을 억제하는 활성은 증가시켰고, 인테그린 αIIbβ3를 억제하는 활성을 상당히 감소시켰다. C-말단 영역의 돌연변이는 인테그린 ανβ5 및 ανβ6를 억제하는 활성을 감소시켰다.
실시예 4 Rho 돌연변이에 의한 혈소판 응집 억제
αIIbβ3에 의해 매개되는 혈소판 응집 억제에 대한 디스인테그린 (Rho) 변이체의 능력 또한 실험하였다. 적어도 2주 동안 어떤 치료를 받지 않은 건강한 공여자의 정맥혈 (9 parts) 시료를 3.8% 시트르산나트륨 (1 part)에 수집하였다. 혈소판이 풍부한 혈장 (platelet-rich plasma, PRP)을 수득하기 위해 혈액 시료를 150xg로 10분 동안 원심분리하고 5분 동안 방치하여, PRP를 수득하였다. 혈소판이 부족한 혈장 (platelet-poor p1asma, PPP)는 남은 혈액을 2000xg로 25분 동안 원심분리하여 제조하였다. PPP 혈소판 수는 혈구 검사기로 측정되었고 250,000 혈소판/㎕로 희석하였다. 190㎕의 PRP 용액 및 10㎕의 Rho 또는 PBS 완충액을 Hema Tracer 601 응집기에서 5분동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 200μM 아데노신 다이포스페이트 (adenosine diphosphate, ADP)의 10㎕을 더 추가하여 광 투과에 의한 혈소판 응집 반응을 관찰하였다. 혈소판 응집의 억제에 대한 결과 또한 아래 표 3 내지 14에 요약하였다.
Figure 112019092938500-pct00026
표 3은 RXD 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00027
표 4는 XRGD 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00028
표 5는 ARGDXP 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00029
표 6은 ARGDMX 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00030
표 7은 XXPRGD 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00031
표 8은 돌연변이 RGD 고리, 돌연변이 링커 및/또는 돌연변이 C-말단을 가진 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00032
표 9는 돌연변이 C-말단을 가진 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00033
표 10은 9KKART-46ARGRGDNP-65PXLYG 디스인테그린 변이체에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00034
표 11은 인테그린 αvβ3 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 변이체에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00035
표 12는 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 변이체에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00036
표 13은 인테그린 αvβx 및 α5β1에 특이적인 디스인테그린 변이체에 관한 것이다.
Figure 112019092938500-pct00037
표 14는 링커, RGD 고리 및 C-말단 중 하나 또는 그 이상이 변형된 것에 의한 인테그린 선택성 및 혈소판 응집 억제에 관한 것이다.
실시예 5. 디스인테그린 변이체 및 로도스토민의 야생형의 세포 이동 저해
Transwell 필터는 사용하기 전 2시간 동안 DMEM을 함유하는 혈청에서 균형을 맞췄다. 10% FBS를 함유하는 DMEM은 낮은 이동 필터의 아래 구획에 첨가하였다. 100 ㎕ 부피의 무혈청 DMEM에, Transwell 필터당 2x104 A375 인간 흑색종 세포를 플레이팅하였다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 6시간 동안 이동시킨 다음, 상온에서 15분 동안 메탄올에 필터를 담가 고정시켰다. 로도스토민, AR-NP (동일 서열은 표 13을 보라) 또는 PBS 완충액을 상부 공간에 첨가하였다. 필터를 물로 한번 워싱하고 20% 메탄올/물 수용액 중 0.2% 크리스탈 바이올렛에서 10분 동안 염색하였다. 세포를 면봉으로 세포막 상부 표면으로부터 제거하였다. 세포막의 위쪽으로 이동한 세포를 세포막당 5개의 임의의 영역에서 200x 배율로 계수하였다.
본 연구에서의 Rho, AR-NP 또는 PBS 완충액의 억제 활성은 도 2에 나타난 바와 같다. 간략하게, AR-NP는 A375 인간 흑색종 세포의 이동을 현저하게 억제하였다.
실시예 6: 마트리겔 (Matrigel) 혈관신생 분석에서 디스인테그린 변이체에 의한 혈관신생 억제
VEGF (100 ng/㎕) 및 헤파린 (24-26 U/㎕)를 함유하는 마트리겔을 B6 마이스 내로 피하 주사하였다. 5일 후, 겔을 회수하고, 중랑을 측정하고, 전술한 바와 같이 헤모글로빈 정량 또는 조직학에 따라 처리하였다. 헤모글로빈 함량은 Drabkin 시약 키트 525 (Sigma)로 측정하였다. 조직학적 분석을 위해, 마트리겔 펠릿을 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀에 내장시키고; 4 마이크론 섹션으로 표준 절차에 따라 헤마톡실린-에로인 (hematoxylin-eosin)으로 염색하였다.
VEGF (150 ng) 및 헤파린 (30 IU)를 함유하는 마트리겔™ (Becton Dickinson Lab.)의 분취량 (300 ㎕)을 6 내지 8 주령의 C57BL/6 마이스의 등쪽 부위 내로 피하 주사하였다. 마트리겔™은 빠르게 플러그를 형성하였다. AR-NP (1 mg/kg) 또는 ARLDDL(서열번호 351) (1 mg/kg) (동일 서열은 표 13을 보라)을 24시간이 지난 후에 정맥 내로 투여하였다. 5일 후, 플러그를 채취하여 사진을 찍었다 (상단 패널). Drabkin 방법 및 Drabkin 시약 키트 525 (Sigma) (B&C)로 혈관 형성의 징후로서 신생 혈관을 플러그의 헤모글로빈을 측정함으로써 정량화 하였다. 5일 간의 혈관신생 기간 동안 약물을 한번 주사하였을 때, 분석에서 AR-NP가 ARLDDL(서열번호 351)보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 도 3을 보라.
실시예 7: 미숙아 망막병증 (Retinopathy of Prematurity, ROP)의 과산소/정상 산소 유도 모델에 의한 혈관신생 억제
1주령의 C57BL/6j 마이스 또는 ICR 마이스 및 이들의 모친을 75%±2% 산소에 5일동안 노출시킨 다음 (산소 과잉) 다른 5일 동안 정상 산소 상태로 회복시켜 (산소 과잉 기간, P7 내지 P12) 상대적이 산소과잉 상태를 유도한 다음 추가로 7일 동안 실내 공기 중에서 보관하였다 (혈중 산소의 감소로 유도되는 혈관신생 기간, P12 내지 P19). AR-NP (1 pg)을 12일째에 초자체내 (intravitreous) 경로를 통해 투여하고 상기 마이스를 19일째에 희생시켰다. 노출되지 않은 대조군 동물은 실내 공기 중에 보관하였다. 동물을 21±1℃의 상온 및 12시간의 명암 주기에서 보관하였다. 산소 농도는 산소 농도계로 측정하였다. 산소 노출이 끝나고 (12일) 정상 산소 상태로 회복시킨 후 5일 (17일)에서, 새끼를 죽이고, 망막 혈관신생을 신생 혈관과 내피 세포로 측정하였다.
본 연구의 결과를 도 4에 나타냈다. 분석결과 AR-NP가 망막 마우스 모델에서 혈관신생을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 8: 마이스 대동맥 고리에서 디스인테그린 변이체에 의한 혈관신생 억제 분석
8 내지 12중령 마이스의 흉부 대동맥을 해부하고 대략 폭 0.5 mm로 고리를 자른다. 대동맥 고리는 적절한 억제제 또는 조절제가 포함되어 있거나 포함되지 않은 2.5% FCS 및 30 ng/㎕ VEGF로 보충된 DMEM로 덮인 200 ㎕ 마트리겔에 올려졌다. 실험은 37℃에서 CO2 인큐베이터로 수행되었다. 배양 7일 후, 대동맥 고리를 4% 포름알데하이드로 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도립현미경을 사용하여 각 고리로부터 자라난 새싹의 수를 계수하였다.
마우스의 대동맥 고리를 100 mg/㎕의 피브로넥틴이 함유되어 있는 마트리겔에서 VEGF 및 0.1 μM AR-NP로 인큐베이팅하였다. 배양 배지는 매 3일마다 갈아주었다. 그래프는 7일 배양 후 생겨난 미세혈관을 보여준다. AR-N이 혈관 생성을 상당히 감소시킨 것에 주목하라 (도 5를 보라).
실시예 9: 유방암 세포에서 디스인테그린 변이체의 콜로니 형성 억제
도 6에 있는 대표적인 이미지에서 콜로니 형성 분석의 결과를 나타냈다. 4-TI 유방암 세포를 배지 내 상부 층에 0.35% 한천 및 하부 층에 0.7% 한천을 가진 6-well 접시에 플레이팅 하였다. 배지의 0.3 ㎕를 3일마다 보충하였다. 18일 후, 접시당 세포 클러스터의 수를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 확인하고 계수하였다. 분석 결과 ARLDDL(서열번호 351) (0.1 μM 및 1 μM) 및 AR-NP (0.1 μM 및 1 μM) 모두 4-TI 유방암 세포의 콜로니 형성을 억제하였다.
실시예 10: 디스인테그린에 의한 파골세포 형성 억제
6 내지 8 주령의 SD 레트를 국립 연구소의 동물 센터로부터 얻고 22±1℃ 상온 및 12 시간의 명암 주기를 포함하는 통제된 조건 하에서 유지하였다. 동물은 Purina 연구소 설치류 식단 및 임의의 증류수를 먹였다. 골수세포를 대퇴골과 경골로부터 제거하고 골수강을 20 mM HEPES 및 10% 열로 불활성화된 FBS, 2 mM 글루타민, 페니실린 (100U/㎕) 및 스트렙토마이신 (100 g/㎕)가 보충된 DMEM (Invitrogen, Carlsbad, California)으로 씻어 준비하였다. 비부착세포 (조혈세포)를 24시간 후에 수집하고 파골세포 전구체로서 사용하였다. 세포를 인간 재조합 가용성 RANKL (50 ng/㎕) 및 M-CSF (20 ng/㎕)의 존재 하에서 24-well 플레이트에 1x106에 접종하였다. 배양 배지를 3일마다 교체하였다. 파골세포 형성은 TRAP 염색으로 8일째에 측정하였다. 간략하게, 부착된 세포를 PBS 하에서 10% 포름알데하이드로 고정한 다음 나프톨 (naphthol) AS-MS 포스페이트 및 타르트레이트 (tartrate) 용액으로 37℃에서 1시간 동안 염색하였다. 각 well에 있는 파골세포 유사 세포를 3개 핵 이상을 함유하는 TRAP-양성 다핵 세포의 수를 계수하여 기록하였다.
단백질 약을 D1 내지 D7에 첨가하였다. α5β1 및 ανβ3 듀얼 인테그린 AR-NP에 대한 파골세포 형성의 IC50은 3.61 nM이었다. 도 7에 나타난 바와 같이, AR-NP 단백질 또는 ARLDDL 단백질(서열번호 351)은 처리되지 않은 대조구에 비해 RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성을 억제한다.
실시예 11: 디스인테그린에 의한 신경교종 침습의 억제
인간 신경교종 세포 (U251)을 히알루로난 100 g/㎕를 함유하는 마트리겔을 가진 상부 공간에서 배양하였다. 디스인테그린 변이체를 상부 및 하부 공간 모두에 첨가하였다. 24시간 후, 하부 공간에 있는 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 계수하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, ARLDDL(서열번호 351) (0.1 μM) 및 AR-NP (0.1 μM) 모두 신경교종 침습을 현저하게 억제하였다.
실시예 12: 혈압과 심장 박동에 대한 AR-NP의 효과
Wistar 레트에 이소플루레인 마취 하에서 비침습 방법을 사용하여 꼬리로부터 혈압 및 심장 박동을 기록하였다. 안정적인 측정한 다음 꼬리 정맥으로 AR-NP를 투여하였다. 5 mg/kg의 AR-NP는 혈관 및 심장 박동에 큰 영향을 끼치지 않았다는 것을 주목해라 (도 9). 약리적인 효과를 위한 AR-NP의 일반적인 투여량은 1 mg/kg이다.
실시예 13: AR-NP에 의한 A375 흑색종 성장의 억제
A375 종양 세포 (5x106으로)을 4 내지 5 주령의 SCID 수컷 마이스의 옆구리에 피하 주사하였다. 세포 이식 후 일주일 뒤, 마이스에 AR-NP (KKART-ARGRGDNP; 서열번호 350) (2 mg/kg, 5 일/주, 복강 내)를 주사하였다. 종양 부피는 2틀마다 측정되었다. 약물 치료의 18일 후 종양을 절제하고 중량을 측정하였다. 스케일 바: 1 cm. AR-NP 치료가 종양 성장을 현저하게 억제한 것을 주목하라 (도 10을 보라).
실시예 14: K-rasG12D 형질전환 마이스 내 KG (AR-NP)에 의한 종양 성장 억제
K-RasG12D 형질전환 마이스를 400 mg/L 독시사이클린을 먹여 폐암을 유도하였다. 3.5개월 후, TG 마이스에 AR-NP 2 mg/kg을 한달 동안 이틀 간격으로 복강 내 주사하였다. 15번째 치료 후 2주 뒤, 마이스를 희생시켰다. 폐에 인디아 잉크로 주사하고 Fekete 용액으로 고정시켰다. 폐에 있는 종양 결절의 수를 계수하였다. ** P value < 0.001. 도 11에서 나타난 바와 같이, 디스인테그린 변이체 (AR-NP)는 K-rasG12D 형질전환 마이스에서 종양 성장을 억제하였다.
실시예 15: KG에 의한 U87을 함유한 마이스 내 뇌 종양 성장 억제
NOD-SCID 마우스를 원래대로 구매하고 12시간/12시간의 빛/어둠 주기로 잘 통제되어 있고 습기와 온도가 통제된 환경을 가진 특정 병원체가 없는 동물 사육장에서 먹이고/유지시켰다. 대략 22 내지 25 g의 중량을 가지는 8 내지 10주령 마이스를 사용하였다. 마이스를 Dexdomitor/Zoletil (20 ㎍/kg / 2 mg/kg)의 혼합물로 복강 내 주사하여 마취한 다음 정위 프레임에 위치시키고, 두개골을 절제로 노출시켰다. U87-MG 세포를 수확하고 두개골 내 주사 전에 PBS (phosphate buffered saline) 중 2.5x105 세포/㎕의 밀도로 조절하였다. 브레그마 (Bregma)로부터 미리 설정된 좌표에서 마이크로 주입 펌프 및 30S-게이지 바늘을 가진 10 ㎕의 헤밀턴 주사기로 2 ㎕의 U87-MG 세포를 선조체 (striatum)로 주입하였다. 그 다음 두개골을 깨끗이 하고, 구멍을 뼈 왁스로 채우고, 절개를 봉합하였다.
MRI는 80 μs에서 300 mT/m의 활성 차폐 기울기를 가진 수평의 7.0-T 분광기에서 수행되었다. 종양의 윤곽은 종양과 뇌 조직 사이의 T2WIs에 의해 제공되는 명암에 기초하여 상세하게 윤곽을 나타냈다. 전체 종양 부피 (mm3)는 MR 비전 소프트웨어를 사용하여 종양으로 덮인 슬라이드를 가로지르는 종양 영역을 합쳐 계산하였다. 성장 곡선은 각 시점에서 종양 부피의 변화에 따라 그래프를 그렸다. 종양 이식 후 처음부터 23일 동안, 마이스는 디스인테그린 변이체 (AR-NP)만 또는 혼합물을 가지고 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 하루에 한번 5 mg/kg, 일주일에 5일 동안 치료되었다. 도 12에 있는 결과에 나타난 바와 같이, 디스인테그린 변이체 (AR-NP)는 또한 U87을 함유한 마이스 내 종양 성장을 억제하였다.
본 발명은 상세하게 그리고 이의 구체적인 실시예로 설명되었으나, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 내에서 해당 기술분야의 통상의 기술자에 의해 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있다.
<110> National Cheng Kung University <120> Disintegrin Variants and Pharmaceutical Uses Thereof <130> 688947-1US <150> PCT/US15/46322 <151> 2015-08-21 <150> US 62/040,503 <151> 2014-08-22 <160> 354 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Calloselasma rhodostoma <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(68) <400> 1 Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro 35 40 45 Arg Gly Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Tyr His 65 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Trimeresurus flavoviridis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <400> 2 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ser Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Asp Gln Cys Arg Phe Lys Lys Lys Arg Thr Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Pro Asp Asp Arg Cys Thr 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Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 312 Lys Ala Lys Arg Thr Ile Cys 1 5 <210> 313 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 313 Lys Lys Ala Arg Thr Ile Cys 1 5 <210> 314 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 314 Lys Lys Lys Ala Thr Ile Cys 1 5 <210> 315 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 315 Lys Lys Lys Arg Ala Ile Cys 1 5 <210> 316 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 316 Lys Ala Lys Arg Ala Ile Cys 1 5 <210> 317 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 317 Ser Lys Ala Gly Thr Ile Cys 1 5 <210> 318 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant linker <400> 318 Lys Lys Lys Arg Thr Ile Cys 1 5 <210> 319 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 319 Pro Arg Trp Asn Asp Leu 1 5 <210> 320 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 320 Pro Arg Asn Pro Trp Asn Gly 1 5 <210> 321 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 321 Pro Arg Asn Arg Phe His 1 5 <210> 322 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 322 Pro Arg Asn Arg Phe His Ala 1 5 <210> 323 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 323 Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 1 5 <210> 324 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 324 Pro Gly Leu Tyr Gly 1 5 <210> 325 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 325 Pro Gly Leu Tyr 1 <210> 326 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 326 Pro Asp Leu Tyr Gly 1 5 <210> 327 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 327 Pro Pro Leu Tyr Gly 1 5 <210> 328 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 328 Pro Arg Leu Tyr Gly 1 5 <210> 329 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant RGD <400> 329 Arg Ile Ala Arg Gly Asp Asn Pro 1 5 <210> 330 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant RGD <400> 330 Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro 1 5 <210> 331 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant RGD <400> 331 Ala Arg Gly Arg Gly Asp Asn Pro 1 5 <210> 332 <211> 7 <212> PRT <213> Calloselasma rhodostoma <400> 332 Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys 1 5 <210> 333 <211> 8 <212> PRT <213> Calloselasma rhodostoma <400> 333 Arg Ile Pro Arg Gly Asp Met Pro 1 5 <210> 334 <211> 4 <212> PRT <213> Calloselasma rhodostoma <400> 334 Pro Arg Tyr His 1 <210> 335 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 335 Ala Arg Gly Asp Met Pro 1 5 <210> 336 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhodostomin Variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 336 Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Cys Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Arg Xaa Asp Xaa Xaa Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Xaa Xaa Xaa 65 <210> 337 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C-terminus <400> 337 Pro Glu Leu Tyr Gly 1 5 <210> 338 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ARGDXX peptide, mutation at X <400> 338 Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu 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at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 341 Xaa Arg Gly Asp 1 <210> 342 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence mutant RGD loop, mutation at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 342 Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro 1 5 <210> 343 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of mutant RGD loop, mutation at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 343 Xaa Arg Gly Asp Met Xaa 1 5 <210> 344 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of mutant RGD loop, mutation at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 344 Xaa Xaa Pro Arg Gly Asp 1 5 <210> 345 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of mutant RGD loop, mutation at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 345 Xaa Arg Xaa Asp Xaa Pro 1 5 <210> 346 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of mutant C-terminus, mutation at X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 346 Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 347 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XXXXX-ICXXXRGDXP-XXXXX peptide, mutation at X <400> 347 Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser 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Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 65 70 <210> 350 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AR-NP protein <400> 350 Lys Lys Ala Arg Thr Ile Cys Arg Ile Ala Arg Gly Arg Gly Asp Asn 1 5 10 15 Pro <210> 351 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ARLDDL protein <400> 351 Ala Arg Leu Asp Asp Leu 1 5 <210> 352 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant C terminus <400> 352 Pro Tyr Leu Tyr Gly 1 5 <210> 353 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant RGD loop sequence <400> 353 Ala Arg Gly Arg Gly Asp Asp Leu 1 5 <210> 354 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant RGD loop sequence <400> 354 Ala Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro 1 5

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 46 내지 53 위치에서 아미노산 서열이 서열번호 329,330,331,353 및 354로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 치환된 돌연변이 RGD 고리 및 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 로도스토민의 디스인테그린 변이체:
    (a) 서열번호 1의 39 내지 45 위치에서 아미노산 서열이 서열번호 306 내지 317로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 치환된 돌연변이 링커; 및
    (b) 서열번호 1의 65 내지 68 위치에서 아미노산 서열이 서열번호 319, 323, 324, 326, 327 및 328로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 치환된 돌연변이 C-말단,
    상기 디스인테그린 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 야생형 로도스토민과 비교하여 αIIbβ3 인테그린에 비해 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린 중 하나 이상에 대한 증가된 결합 활성을 가진다.
  2. 청구항 1에 있어서, 돌연변이 RGD 고리, 돌연변이 링커 및 돌연변이 C-말단을 포함하는, 디스인테그린 변이체.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열번호 123, 124, 147, 149 및 171로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 디스인테그린 변이체.
  4. 청구항 1 또는 3에 있어서, 상기 디스인테그린 변이체는 페길레이션되거나 알부민 또는 Fc와 결합된, 디스인테그린 변이체.
  5. 청구항 1 또는 3의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 청구항 1 또는 3의 디스인테그린 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주세포.
  7. 청구항 1 또는 3의 디스인테그린 변이체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 필요로 하는 대상에서 ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, ανβ8 및 α5β1 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인테그린과 연관된 질병의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 질병은 골다공증, 골 종양 또는 암 성장 및 이와 연관된 증상, 혈관신생과 연관된 종양 성장 및 전이, 뼈로의 종양 전이, 악성 종양성 고칼슘 혈증, 혈관신생과 연관된 눈 질환, 파젯병 (Paget's disease), 류마티스 관절염, 및 골 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 인테그린과 연관된 질병은 연령과 연관된 황반 퇴화, 당뇨 망막증, 각막 혈관신생증, 허혈로 유도되는 혈관신생 망막증, 고도 근시, 및 미숙아의 망막증으로부터 선택되는 혈관신생과 연관된 눈 질병인, 약학적 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 인테그린과 연관된 질병은 전이성 흑생종, 전이성 전립선암, 전이성 유방암, 결장 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 비소세포성 폐암 및 다형성아교모세포종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 서열번호 331의 돌연변이 RGD 고리 및 서열번호 313의 돌연변이 링커를 포함하는, 디스인테그린 변이체.
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