PT2100968E - Método de produção de proteína tat-hoxb4h recombinante para utilização como um estimulante de hematopoiese in vivo - Google Patents
Método de produção de proteína tat-hoxb4h recombinante para utilização como um estimulante de hematopoiese in vivo Download PDFInfo
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Description
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DESCRIÇÃO
"MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA TAT-HOXB4H RECOMBINANTE PARA UTILIZAÇÃO COMO UM ESTIMULANTE DE HEMATOPOIESE IN VIVO"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método novo e não óbvio de produção de uma proteína de fusão TAT-H0XB4 marcada com histidina C-terminal (TAT-H0XB4H) contendo pelo menos 6 resíduos de histidina na extremidade C-terminal. 0 método de produção proporciona vantagens inesperadas de maior estabilidade e rendimento, o que permite uma administração in vivo bem-sucedida desta proteína.
Antecedentes da Invenção 0 interesse crescente na medicina regenerativa tem alimentado a pesquisa de células estaminais específicas de órgãos ou autorrenováveis. A população mais bem estudada de células autorrenováveis é as células estaminais hematopoiéticas (HSCs), uma vez que são opções inovadoras para o tratamento de doenças desde o cancro até doença metabólica até imunodeficiências . 0 processo de formação de células sanguíneas pelo qual os glóbulos vermelhos e brancos são substituídos através da divisão de HSCs localizadas na medula óssea é chamado hematopoiese. As HSCs têm as propriedades chaves de serem capazes de se autorrenovarem e diferenciarem em células maduras das linhagens linfoide e mieloide. No entanto, os mecanismos genéticos responsáveis pelo controlo dos 2 resultados da autorrenovação e diferenciação da divisão das HSC permanecem, em grande parte, desconhecidos.
Atualmente, o transplante de HSCs humanas de medula óssea adulta, sangue periférico mobilizado e sangue do cordão umbilical (UCB) têm sido utilizados clinicamente para tratar cancros hematopoiéticos (leucemias e linfomas) e para ajudar a recuperação do sistema imunitário de quimioterapia de alta dose de cancros não hematopoiéticos. No entanto, o transplante eficaz requer uma quantidade substancial de HSCs de diferentes fontes e pode exigir expansão.
As HSCs podem ser provenientes de medula óssea, sangue periférico e UCB. A extração das células de medula óssea requer cirurgia e um a procedimento doloroso e, por conseguinte, torna-se uma abordagem menos favorável. A utilização de células sanguíneas periféricas é também um problema devido à dificuldade de se obter HSCs qualificadas a partir do doente com hematopoiese comprometida que sofre de doença ou quimioterapia. Os UCBs são relativamente mais fáceis de obter e a qualidade das HSCs é muito maior, contudo, o número de HSCs obtidas a partir desta abordagem é ainda limitado. 0 número de células de cada extração é suficiente para uma criança, mas pode ser insuficiente para um adulto. Para superar este problema potencial é, de facto, necessária uma nova abordagem que facilite a proliferação de HSC in vitro pelo processo de autorrenovação de células estaminais interveniente para o transplante de HSC.
Foi indicado que os fatores de transcrição desempenham um papel crítico na regulação da expressão de genes e na diferenciação de células estaminais (Orkin, S. H. Nature 3
Reviews Genetics 1, 57-64, 2000) . O fator de transcrição muda vários processos celulares através da ligação a alvos genéticos específicos e esta regulação depende também da sua concentração celular. Foi anteriormente determinado que um grupo de fatores de transcrição chamado caixa homeótica de ligação a ADN (HOX) desempenha um papel principal na embriogénese. Recentemente, determinou-se também que a família HOX está envolvida no desenvolvimento de HSCs (Buske, C. et al., J. Hematol. 71, 301-308, 2000). A regulação da autorrenovação das HSC pelo fator de transcrição HOX foi estudada pelo Dr. Guy Sauvageau da Universidade de Montreal. O grupo de Sauvageau mostrou que o gene da caixa homeótica HOXB4 é crítico na regulação da autorrenovação das HSC pela sua capacidade para manter a população de HSC na medula óssea. Os genes de HOX expressos em células sanguíneas foram observados pela primeira vez em linhas de células de humanos e ratos. Alguns tipos de genes HOX são expressos ubiquamente em vários tipos de células, enquanto outros são expressos especificamente em certos tipos de células ou certos pontos no tempo durante o desenvolvimento. Por exemplo, oito membros do conjunto de HOXB humanos são expressos na fase inicial do desenvolvimento de eritrócitos. No entanto, os genes HOXB tais como HOXB4 e HOXB7 são também expressos nas células T e células B. O grupo de Sauvageau confirmou que nove genes HOXA, oito HOXB e quatro HOXC são expressos nas células da medula óssea CD34+. Entre estas células da medula óssea CD34+, os HOXB2, HOXB9 e HOXA10 estão muito enriquecidos em células progenitoras de eritrócitos. No entanto, nenhuns genes HOX são expressos nas células CD34”. Foi recentemente demonstrado que o gene da caixa homeótica B4 (HOXB4) expande eficazmente HSCs numa forma de proteína retroviral ou recombinante. As proteínas TAT-HOXB4 recombinantes foram utilizadas para expandir células estaminais à escala laboratorial sem o risco de inserção retroviral ou co- 4 cultura com células estromais da medula óssea (ver Krosl, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003) . Por conseguinte, a proteína HOXB4 é regularmente utilizada como um estimulante para promover a expansão de HSCs in vitro (Figura 1).
Evidência recente indicou que adicionando um marcador de sequência de proteína TAT na extremidade N-terminal do HOXB4, pode introduzir-se H0XB4 exógeno numa célula. Esta sequência TAT coordena o transporte de HOXB4 do lado extracelular para o lado intracelular. Depois de entrar no citosol, ο HOXB4 pode ser redobrado na sua conformação nativa pela chaperona HSP90. A TAT-HOXB4 é capaz de promover a proliferação de HSC até 2-6 vezes (Amsellem, S. et al., Nature Medicine 9, 1423-1427, 2003; Krosl, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003). No entanto, o rendimento da proteína TAT-HOXB4 recombinante a partir de E. coli utilizando um procedimento de purificação regular é demasiado baixo.
Num esforço para aumentar o rendimento da proteína TAT-H0XB4 recombinante foi desenvolvido um método de preparação de uma proteína TAT-HOXB4H com mais seis resíduos de histidina inseridos na extremidade C-terminal, o que resultou num rendimento de 3-4 vezes em comparação com o da proteína original após purificação. A proteína recombinante resultante (TAT-HOXB4H) contém 6 resíduos de histidina na extremidade C-terminal. Este método foi descrito em pormenor no pedido PCT PCT/CN2006/000646.
Foi demonstrado que a proteína TAT-HOXB4H recombinante pode ser utilizada para expandir células estaminais do sangue periférico ou UCB humano e as células estaminais expandidas mantinham a sua pluripotência. Além disso, as células 5 estaminais tratadas com a proteína TAT-H0XB4H recombinante incorporadas na medula óssea de ratos diabéticos não obesos com imunodeficiência combinada grave (NOD-SCID) e em leucócitos humanos foram detetadas em glóbulos brancos periféricos, indicando reconstituição imunológica e da hematopoiese nos ratos.
No entanto, as proteínas TAT-H0XB4H recombinantes nunca foram antes utilizadas como um estimulador da hematopoiese in vivo, especificamente, para melhorar a reconstituição hematopoiética, expansão, repopulação da medula óssea e para aumentar o número de células estaminais circulantes periféricas, particularmente após quimioterapia ou irradiação. Krosl et al. (2003) e Amsellem et al. (2003) não foram capazes de obter grandes quantidades de proteína HOXB4 altamente estável para ser utilizada em estudos clínicos para expandir as HSCs. Na presente invenção, a quantidade total de proteína TAT-HOXB4H obtida após purificação vai geralmente desde 6-10 mg a partir de uma cultura de 1 litro, enquanto a quantidade total de proteína TAT-HOXB4 obtida após purificação de uma cultura de 1 litro utilizando os métodos da técnica anterior vai geralmente desde 1-2 mg. O plasmídeo pTAT-HA-HOXB4 utilizado para expressar a proteína TAT-HOXB4 utilizando os métodos da técnica anterior foi uma oferta do Dr. Guy Sauvageau, Universidade de Montreal, Canadá. O método de purificação da proteína TAT-HOXB4H utilizando a presente invenção apresenta claramente o aumento de rendimento de proteína necessário para administração in vivo. Krosl et al. (2003) referiu também que a maior parte da sua proteína TAT-HOXB4 era perdida após 4 h de incubação em meio com soro. A presente invenção mostra uma estabilidade significativamente alta da proteína TAT-HOXB4H mesmo após 4 semanas, o que é um fator chave para a utilização da proteína TAT-HOXB4 em estudos clínicos. 6 A EP 1889916A divulgou no Exemplo 2 a purificação e produção de proteína TAT-H0XB4H recombinante utilizando uma coluna de HisTrap, MonoSP e Sephadex PD-10. No entanto, não há qualquer ensinamento implícito de um processo de redobragem adicional e conservação em IMDM ou DMEM da proteína TAT-H0XB4H eluída na divulgação da EP 1889916A. De acordo com o método aqui divulgado pode ser proporcionada uma proteína TAT-H0XB4H recombinante com alta pureza e estabilidade melhorada e ser utilizada em aplicação clínica, especialmente em corpos vivos.
Rozema et al. (in J. Amer. Chem. Soc. 117(8): 2373-2374, 1995) divulgou a utilização de detergente e ciclodextrina (como chaperonas artificiais) para redobragem da proteína. Rozema et al. divulgou também o passo de remoção do composto hidrófobo por passagem através de um filtro de 0,22 mM para remover agregados proteicos grandes e concentração com um filtro de corte de 10 000 MM para remover o detergente e a CD. No entanto, Rozema et al. não ensina claramente o passo de ultrafiltração ou dez vezes de troca de tampão numa Centricon com uma solução contendo diferentes concentrações de beta-ciclodextrina (duas vezes com cada uma de beta-ciclodextrina 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM e 5 mM em tampão de conservação IMDM) por centrifugação a 1000-2500 x g durante 10 min, como aqui descrito.
Sumário É aqui descrito um método novo e não óbvio de produção de uma proteína TAT-HOXB4 com alto rendimento e estabilidade, e a observação que a proteína TAT-HOXB4H recombinante, quando administrada a um indivíduo necessitado da mesma, aumenta o número de HSCs tanto na medula óssea como no sangue periférico in vivo. 7
Um aspeto aqui descrito refere-se a um método de produção de uma proteína TAT-H0XB4H. 0 método compreende: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que codifica a proteína; (b) expressar a proteína na célula hospedeira; (c) recolher uma solução impura da proteína expressa; (d) purificar a proteína da solução por: (i) aplicação da solução a uma coluna HisTrap; (ii) lavagem da coluna HisTrap; (iii) eluição da proteína parcialmente purificada da coluna HisTrap para produzir uma solução de proteína parcialmente purificada; (iv) aplicação da solução de proteína parcialmente purificada a uma coluna MonoSP; (v) lavagem da coluna MonoSP; (vi) eluição da proteína purificada da coluna MonoSP na forma desnaturada; (e) redobrar a proteína desnaturada eluída utilizando compostos hidrófobos por: (i) combinação da proteína desnaturada eluída e uma solução de compostos hidrófobos para formar uma solução de proteína e compostos hidrófobos; (ii) dessalinização da solução de proteína e compostos hidrófobos para obter uma solução de proteína dessalinizada e composto hidrófobo; (iii) remoção dos compostos hidrófobos da solução de proteína dessalinizada utilizando ultraf iltração num tubo de Centricon ou uma célula de agitação; e (f) conservar a proteína purificada em IMDM ou DMEM. É aqui descrito um método para melhorar a mobilização de HSCs da medula óssea para o sangue periférico. 0 método compreende: a) administrar uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H produzida pelos métodos aqui descritos a um indivíduo necessitado da mesma, e b) permitir que a proteína TAT-H0XB4H aumente o número absoluto de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea do indivíduo, melhorando, desse modo, a mobilização de células estaminais hematopoiéticas para o sangue periférico do indivíduo. 8
Outro aspeto aqui descrito refere-se a um método para melhorar o tempo de recuperação de um doente que sofreu transplante de HSCs, irradiação ou quimioterapia. 0 método compreende: a) administrar uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H produzida pelos métodos aqui descritos a um indivíduo necessitado da mesma e b) permitir que a proteína TAT-H0XB4H aumente o número absoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo.
Um aspeto aqui descrito refere-se a uma composição farmacêutica para a mobilização de HSCs da medula óssea para o sangue periférico num indivíduo necessitado da mesma. A composição farmacêutica aqui descrita inclui uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H produzida pelos métodos aqui descritos, suficiente para aumentar o número absoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo, melhorando, desse modo, a mobilização de HSCs para o sangue periférico do indivíduo. A composição farmacêutica aqui descrita pode ser administrada a um doente que sofreu transplante autólogo de HSCs para melhorar o tempo de recuperação após o transplante de HSCs. A composição farmacêutica aqui descrita pode ser administrada a um doente insensível ao fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) como um substituto de G-CSF para a mobilização de HSCs para o sangue periférico. A composição farmacêutica aqui descrita pode ser administrada a um dador de HSC permitindo, desse modo, a recolha de uma quantidade suficiente de HSCs para transplante num procedimento muito menos invasivo a partir do sangue periférico em vez da medula óssea do referido dador. 9
Outro aspeto aqui descrito refere-se ao tratamento de doenças provocadas por deficiência hereditária de HSCs administrando sistemicamente uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H recombinante produzida pelos métodos aqui descritos ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que sofre das doenças. A proteína TAT-H0XB4H recombinante administrada, aumenta, desse modo, o número absoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo.
Um outro aspeto aqui descrito refere-se a um método para melhorar o tempo de recuperação após transplante de HSCs administrando sistemicamente uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H recombinante produzida pelos métodos aqui descritos ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo necessitado da mesma.
Ainda um outro aspeto aqui descrito refere-se a um método para melhorar a recuperação de HSCs num doente sujeito a irradiação ou quimioterapia, administrando sistemicamente uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H recombinante produzida pelos métodos aqui descritos ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo necessitado da mesma.
Breve Descrição das Figuras
Os aspetos anteriores e as vantagens aqui descritas podem tornar-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada em relação aos desenhos apensos nos quais: A Figura 1 mostra uma representação esquemática da mobilização de HSCs de células CD34 para o sangue periférico (PB) por expansão in vivo. 10 A Figura 2 mostra a representação esquemática da construção e clonagem de pTAT-HOXB4H no vetor pET21b modificado. A Figura 3 representa a sequência de ADN de pTAT-HOXB4H. Os 6 resíduos adicionais de histidina introduzidos nas extremidades N- e C-terminais em pTAT-H0XB4H estão sublinhados e a TAT está realçada. A Figura 4 mostra a sequência proteica da proteína TAT-HOXB4H. A Figura 5 mostra a demonstração em gel de poliacrilamida-10% de SDS (1,5 mm) da purificação da proteína TAT-HOXB4H. O gel de poliacrilamida-SDS foi revelado com azul de coomassie. Faixa 1, marcadores de peso molecular (M), 0,3 pg de proteína; faixa 2, lisado celular de células BL21(DE3)pLysS não induzidas que expressam proteína TAT-HOXB4H, 1 pg de proteína; faixa 3, lisado celular de células BL21 (DE3)pLysS induzidas que expressam a proteína TAT-HOXB4H com IPTG 1 mM, 1 pg de proteína; faixa 4, TAT-HOXB4H purificada, 0,7 mg de proteína; faixa 5, TAT-HOXB4 purificada (0,2 mg de proteína). O plasmídeo pTAT-HA-HOXB4 utilizado para expressar a proteína TAT-HOXB4 (faixa 5) foi uma oferta do Dr. Guy Sauvageau, Universidade de Montreal, Canadá. Nas faixas 4 e 5 foram carregados volumes iguais de frações que foram recolhidas da coluna MonoSP. A Figura 6 mostra a análise em gel de poliacrilamida-SDS da estabilidade da proteína TAT-HOXB4H purificada conservada em PBS durante 0 horas (A) e 16 horas (B) a 4 °C. M representa marcadores de peso molecular, 0 representa 0 horas de incubação a 4 °C, 16 representa 16 horas de incubação a 4 °C. 11 A Figura 7 mostra a estabilidade da proteína TAT-H0XB4H conservada a 4 °C e -20 °C em PBS e tampão de conservação, IMDM, analisada por poliacrilamida-10% de SDS seguida de revelação com coomassie. As setas indicam as bandas da proteína TAT-HOXB4H. A Figura 8A mostra o efeito estimulante do G-CSF no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de ratos analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 8B mostra o efeito de PBS no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de ratos analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 8C mostra o efeito estimulante de TAT-HOXB4H no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de ratos analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 9A mostra o efeito estimulante de G-CSF no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de macaco rhesus analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 9B mostra o efeito estimulante de TAT-HOXB4H em conjunto com G-CSF no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de macaco rhesus analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 9C mostra o efeito estimulante de TAT-HOXB4H no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de macaco rhesus analisadas por um citómetro de fluxo. A Figura 9D mostra o efeito de PBS no número de células estaminais CD34+ na medula óssea de macaco rhesus analisadas por um citómetro de fluxo. 12 A Figura 10 mostra efeito da proteína TAT-HOXB4H na recuperação hematopoiética em ratos NOD-SCID. A Figura 11 mostra efeito da proteína TAT-HOXB4H na recuperação hematopoiética em ratos Balb/c após quimioterapia com cisplatina.
Descrição Detalhada
I. A Proteína TAT-HOXB4H A presente invenção refere-se a um método novo e não óbvio de produção de uma proteína TAT-HOXB4, proporcionando vantagens inesperadas de maior estabilidade e rendimento, o que permite a administração in vivo desta proteína. A proteína TAT-HOXB4H é uma construção compreendendo três elementos: TAT, HOXB4 e um marcador de histidina. Ο HOXB4 é um membro da família HOX de fatores de transcrição e promove a expansão de HSC. A TAT permite que a unidade HOXB4 seja transportada para dentro da célula. O marcador de histidina permite um maior rendimento inicial a partir de fontes de expressão recombinante, embora o método de produção aumente ainda mais o rendimento da proteína. O pTAT-HOXB4H foi construído como se mostra na Figura 2 e a sequência de ADN é mostrada na Figura 3. A proteína TAT-HOXB4H recombinante refere-se a uma proteína de fusão TAT-HOXB4 com mais seis resíduos de histidina ligados na extremidade C-terminal (Figura 4).
Salvo indicação em contrário, a sequência de aminoácidos de uma proteína (isto é, a sua "estrutura primária" ou "sequência primária") pode ser escrita da extremidade amino-terminal para a extremidade carboxi-terminal. Em sistemas não biológicos (por exemplo, aqueles que utilizam 13 síntese em estado sólido), a estrutura primária de uma proteína (a qual inclui também localizações de ligação dissulfureto (cisteína)) pode ser determinada pelo utilizador.
Uma "supressão" refere-se a uma alteração numa sequência de aminoácidos ou nucleótidos devido à ausência de um ou mais resíduos de aminoácidos ou nucleótidos. Os termos "inserção" ou "adição" referem-se a alterações numa sequência de aminoácidos ou nucleótidos resultante da adição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou nucleótidos, respetivamente, numa molécula ou representação da mesma, em comparação com uma sequência de referência, por exemplo, a sequência presente na molécula natural. Uma "substituição" refere-se à substituição de um ou mais aminoácidos ou nucleótidos por aminoácidos ou nucleótidos diferentes, respetivamente.
As sequências semelhantes ou homólogas (por exemplo, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência) às sequências aqui divulgadas também fazem parte desta aplicação. Nalguma forma de realização, a identidade de sequência pode ser cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Alternativamente, há identidade substancial quando os segmentos de ácido nucleico podem hibridizar em condições de hibridização seletivas (por exemplo, condições de hibridização altamente estringentes), com o complemento da cadeia. Os ácidos nucleicos podem estar presentes nas células inteiras, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
Os cálculos da "homologia" ou "identidade de sequência" entre duas sequências (os termos são aqui utilizados indistintamente) são realizados como se segue. As 14 sequências são alinhadas para efeitos de comparação ótima (por exemplo, pode ser introduzidas lacunas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou ácido nucleico para alinhamento ótimo e as sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). Numa forma de realização preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para efeitos de comparação é pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 60% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os residuos de aminoácidos ou nucleótidos em posições de aminoácidos ou posições de nucleótidos correspondentes são em seguida comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido que na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que têm de ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação das sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas utilizando um algoritmo matemático. Numa forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453), o qual foi incorporada no programa GAP do pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um 15 peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda noutra forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinada utilizando o programa GAP do pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto
particularmente preferido de parâmetros (e aquele que pode ser utilizado se o profissional não tiver a certeza que parâmetros podem ser aplicados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de identidade ou homologia de sequência da invenção) são uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de prolongamento de lacuna de 4 e uma penalidade de lacuna de desvio de grelha de 5. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos pode ser também determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando um quadro de ponderação de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. II. Métodos de Preparação da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante A. Clonagem e Expressão
Os sistemas para clonagem e expressão de proteínas numa variedade de células hospedeiras são conhecidos na técnica. As células adequadas para produzir proteínas são descritas em, por exemplo, Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Resumidamente, as células 16 hospedeiras adequadas incluem células de mamíferos, células de inseto, células vegetais, células de levedura ou células procarióticas, por exemplo, E. coli. As células de mamíferos disponíveis na técnica para expressão de proteínas heterólogas incluem linhas de células linfocitárias (por exemplo, NSO), células HEK293, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células COS, células HeLa, células de rim de cria de hamster, células de oócitos e células de um animal transgénico, por exemplo, célula epitelial mamária. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos para conter sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências. Os vetores podem conter também um plasmídeo ou esqueleto virai. Para pormenores, ver Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muitas técnicas estabelecidas utilizadas com vetores, incluindo a manipulação, preparação, mutagénese, sequenciação e transfeção de ADN, são descritas em Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et ai. eds., John Wiley & Sons (1992).
Um outro aspeto da divulgação proporciona um método de introdução do ácido nucleico numa célula hospedeira. Para células eucarióticas, as técnicas de transfeção adequadas podem incluir fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfeção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, electroporação e transfeção utilizando um bacteriófago. A introdução de ADN pode ser seguida de um 17 método de seleção (por exemplo, resistência a fármacos) para selecionar células que contêm o ácido nucleico. B. Purificação e Redobragem A proteína TAT-H0XB4H pode ser inicialmente isolada a partir da célula hospedeira recombinante por quaisquer meios apropriados conhecidos na técnica. Por exemplo, a proteína pode ser removida do sobrenadante das células, se a proteína for capaz de ser segregada, ou a proteína pode ser removida de um lisado celular. A proteína TAT-H0XB4H pode ser purificada utilizando métodos cromatográficos que compreendem: (a) aplicar o lisado celular ou sobrenadante das células, se a proteína for segregada para a solução, numa coluna HisTrap; b) lavar a coluna HisTrap com um tampão; (c) eluir a proteína parcialmente purificada da coluna HisTrap (d) aplicar a proteína parcialmente purificada obtida da coluna HisTrap numa coluna MonoSP; (e) lavar a coluna MonoSP com um tampão; (f) eluir a proteína TAT-H0XB4H purificada da coluna MonoSP. 0 lisado celular ou sobrenadante das células, se a proteína for capaz de ser segregada para a solução, pode ser clarificado por centrifugação a 20 000 x g durante 30 min a 4 °C, o sobrenadante ajustado a imidazole 10 mM e carregado nas colunas quelantes HisTrap (Amersham Pharmacia). A coluna pode ser lavada com ureia 8 M, HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0 e imidazole 10 mM para remover proteínas não ligadas. A proteína TAT-HOXB4 parcialmente pura pode ser eluída da coluna HisTrap com alta concentração de imidazole e sal. 18
Para purificação adicional, a proteína parcialmente purificada obtida da coluna HisTrap pode ser aplicada na coluna MonoSP (Amersham Pharmacia). A coluna pode ser lavada com ureia 4 M, HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, pH 6,5 para remover as proteínas não ligadas. A TAT-HOXB4H ligada pode ser eluída com teor alto de sal. A proteína TAT-HOXB4H purificada recolhida deste procedimento de purificação está na forma desnaturada.
Além disso, a proteína TAT-HOXB4H desnaturada eluída da coluna MonoSP pode ser redobrada utilizando compostos hidrófobos por (i) combinação da proteína desnaturada eluída e de uma solução de compostos hidrófobos para formar uma solução de proteína e compostos hidrófobos; (ii) dessalinização da solução de proteína e compostos hidrófobos para obter um solução de proteína dessalinizada e compostos hidrófobos; e (i i i) remoção dos compostos hidrófobos da solução de proteína dessalinizada utilizando ultrafiltração.
Como aqui utilizado, o termo "compostos hidrófobos" refere-se a quaisquer compostos hidrófobos capazes de impedir que a proteína desejada forme agregados insolúveis durante o passo de remoção do sal de desnaturação. Os compostos hidrófobos adequados para serem utilizados na presente invenção são descritos em Oganesyan et al., Pharmagenomics (2004) 71,22-26. Os compostos hidrófobos adequados incluem, mas não se limitam a, Triton X-100, tween-20 ou compostos de polibenzeno. A ultrafiltração ou troca de tampão pode ser realizada por uma Centricon ou célula de agitação. As condições para ultrafiltração ou troca de tampão podem variar, como é reconhecido pelos especialistas na técnica, dependendo dos tipos de proteína desejada. 19
Numa forma de realização aqui descrita, o composto hidrófobo na solução dessalinizada contendo proteína H0XB4H desnaturada é removido por 5-10 vezes de troca de tampão (cada realizada por centrifugação a 1000-2500 x g durante 10 min) com solução contendo concentrações baixas a altas de compostos hidrófobos grandes como as beta-ciclodextrina, de acordo com o que a proteína HOXB4H desnaturada é redobrada na forma nativa da mesma.
Numa forma de realização, a proteína TAT-HOXB4H purificada pode ser conservada em meio IMDM comercialmente disponível (HyClone) (tampão de conservação 1) a 4 °C ou -20 °C.
Noutra forma de realização, a proteína TAT-HOXB4H purificada pode ser conservada em meio DMEM (HyClone) comercialmente disponível (tampão de conservação 2) a 4 °C ou -20 °C.
Numa forma de realização, o marcador de His na extremidade C-terminal da TAT-HOXB4H pode ser removido antes da administração in vivo.
Noutra forma de realização, o marcador de His na extremidade N-terminal da TAT-HOXB4H pode ser removido antes da administração in vivo.
Noutra forma de realização ambos os marcadores de His nas extremidades N- e C-terminais podem ser removidos antes da administração in vivo. C. Preparação de uma Composição Farmacêutica A TAT-HOXB4H pode ser utilizada como uma composição farmacêutica quando combinada com um veículo 20 farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição pode conter, além da proteína TAT-HOXB4H e veiculo, vários diluentes, enchimentos, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes e outros materiais bem conhecidos na técnica. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativo(s). As caracteristicas do veiculo podem depender da via de administração. É especialmente vantajoso formular as composições na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As especificações para as formas unitárias de dosagem aqui descritas são ditadas e diretamente dependentes das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido, e pelas limitações inerentes na técnica de formulação de um tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.
As vias de administração típicas incluem, sem limitação, oral, tópica, parentérica (por exemplo, por via sublingual ou por via bucal), sublingual, retal, vaginal e intranasal. O termo parentérica como aqui utilizado inclui injeções subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intratecal, intrameática, injeção intrauretral ou técnicas de infusão. A composição farmacêutica é formulada de forma a permitir que os ingredientes ativos ali contidos fiquem biodisponíveis após 21 administração da composição a um doente. As composições que podem ser administradas a um doente tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um ou mais compostos aqui descritos na forma de aerossol pode conter uma multiplicidade de unidades de dosagem.
Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína TAT-H0XB4H é administrada por via oral, o agente de ligação pode estar na forma de um comprimido, cápsula, pó, solução ou elixir. Quando administrada na forma de comprimido, a composição farmacêutica aqui descrita pode conter adicionalmente um veículo sólido tal como uma gelatina ou um adjuvante. 0 comprimido, cápsula e pó contêm desde cerca de 5 a 95% de agente de ligação, e preferencialmente desde cerca de 25 a 90% de agente de ligação. Os exemplos são sacarose, caulino, glicerina, dextrinas de amido, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etilcelulose. Podem estar presentes corantes e/ou aromatizantes. Pode ser utilizado um invólucro de revestimento. Quando administrado na forma líquida pode ser adicionado um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos de origem animal ou vegetal tal como óleo de amendoim, óleo mineral, óleo de soja ou óleo de sésamo, ou óleos sintéticos. A forma líquida da composição farmacêutica pode conter ainda soro fisiológico, dextrose ou solução de outro sacárido, ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol. Quando administrada na forma líquida, a composição farmacêutica contém desde cerca de 0,5 a 90% em peso do agente de ligação, e preferencialmente desde cerca de 1 a 50% do agente de ligação.
Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína TAT-HOXB4H é administrada por injeção intravenosa, cutâneo 22 ou subcutânea, o agente de ligação pode estar na forma de uma solução aquosa apirogénica, aceitável por via parentérica. A preparação de tais soluções de proteínas aceitáveis por via parentérica, tendo devidamente em conta o pH, isotonicidade, estabilidade e semelhantes, está dentro da perícia na técnica. Nalgumas formas de realização, a composição farmacêutica para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea pode conter, além do agente de ligação um veículo isotónico tal como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer com Lactato, ou outro veículo como conhecido na técnica. A composição farmacêutica aqui descrita pode conter também estabilizantes, conservantes, tampões, antioxidantes ou outros aditivos conhecidos para os especialistas na técnica.
Ao pôr em prática o método de tratamento ou utilização aqui descrito, uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína TAT-H0XB4H é administrada a um indivíduo, por exemplo, mamífero (por exemplo, um humano). Como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade total de cada componente ativo da composição farmacêutica ou método que é suficiente para apresentar um benefício significativo para o doente, por exemplo, melhoria dos sintomas, cura ou aumento da taxa de cura de tais condições. Quando aplicado a um ingrediente ativo particular, administrado sozinho, o termo refere-se a esse ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma associação, o termo refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, quer administrados em associação, sucessivamente ou simultaneamente. 23 A quantidade de proteína TAT-H0XB4H na composição farmacêutica aqui descrita pode depender da natureza e gravidade da condição a ser tratada, e da natureza de tratamentos anteriores que o doente sofreu, e da idade e género do doente. Em última análise, o médico assistente pode decidir sobre a quantidade de ingrediente ativo com a qual vai tratar cada doente particular. Inicialmente, o médico assistente pode administrar doses baixas de ingrediente ativo e observar a resposta do doente. Podem ser administradas doses maiores de ingrediente ativo até ser obtido o efeito terapêutico ótimo para o doente e, nessa altura, em geral, a dosagem não é mais aumentada. Considera-se que as várias composições farmacêuticas utilizadas para pôr em prática o método aqui descrito podem conter cerca de 1 yg até cerca de 1 mg de proteína TAT-H0XB4H por kg de peso corporal. Os exemplos de gamas de dosagem que podem ser administradas a um indivíduo podem ser escolhidas de: 1 yg/kg a 1 mg/kg, 1 yg/kg a 0,5 mg/kg, 1 yg/kg a 0,1 mg/kg, 10 yg/kg a 0,5 mg/kg, 10 yg/kg a 0,1 mg/kg, 100 yg a 0,5 mg/kg, 250 yg/kg a 0,5 mg/kg. Além disso, exemplos de gamas de dosagem que podem ser escolhidas de: 50 yg a 100 mg, 100 yg a 50 mg, 500 yg a 50 mg, 1 mg a 50 mg. A duração da terapia intravenosa utilizando a composição farmacêutica aqui descrita pode variar, dependendo da gravidade da doença a ser tratada e da condição e resposta idiossincrática potencial de cada doente particular. Numa forma de realização, é considerado que a duração de cada aplicação da proteína TAT-HOXB4H pode situar-se na gama de 12 a 24 horas de administração intravenosa contínua. Noutra forma de realização, a duração de aplicação da proteína TAT-H0XB4H pode durar enquanto continuar a radiação ou quimioterapia do doente. A proteína TAT-HOXB4 pode ser administrada na gama de 10-100 yg/kg por via intravenosa, duas vezes por dia durante 4,5 a 5 dias. Um ciclo do tratamento pode ser suficiente para expandir as 24 HSCs in vivo. Em última análise, o médico assistente pode decidir sobre a duração apropriada da terapia intravenosa utilizando a composição farmacêutica aqui descrita. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados para avaliar uma gama de dosagem a ser utilizada em humanos. A dosagem de tais compostos pode situar-se numa gama de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A dose terapeuticamente eficaz da TAT-H0XB4H pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios de culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir uma gama de concentração circulante no plasma que inclui a IC5o (isto é, a concentração da proteína de ensaio que consegue metade da inibição máxima dos sintomas) como determinada em culturas de células. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser seguidos por um bioensaio adequado. Os exemplos de bioensaios adequados incluem, mas não se limitam a, medição das células estaminais CD34+ nas células mononucleares utilizando anticorpos marcados com sondas fluorescentes (por exemplo, FITC) contra as células estaminais CD34+ e a medição da percentagem de células LY5 nas HSCs do sangue periférico ou medula óssea por citometria de fluxo. É 25 esperado que os polinucleótidos e proteínas aqui descritos exibam uma ou mais das utilizações ou atividades biológicas (incluindo aquelas associadas aos ensaios aqui citados) identificadas abaixo. As utilizações ou atividades descritas para as proteínas aqui descritas podem ser proporcionadas por administração ou utilização de tais proteínas ou pela administração ou utilização de polinucleótidos que codificam tais proteínas (tais como, por exemplo, em terapias de genes ou vetores adequados para introdução de ADN). III. Métodos de Estimulação da Hematopoiese In Vivo A. Doentes Necessitados de Tratamento
As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser utilizadas para tratar doenças, as quais incluem, mas não se limitam a, distúrbios autoimunes, distúrbios de imunodeficiência e distúrbios hematológicos. Além disso, as composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizadas para melhorar o tempo de recuperação após transplante de HSCs . A composição farmacêutica aqui descrita inclui, mas não se limita ao tratamento de doentes que sofrem ou suscetíveis a linfomas, leucemias, doença de Hodgkin e distúrbios mieloproliferativos. Além disso, as doenças hereditárias provocadas por deficiência de HSC e anemia aplástica podem ser tratadas pela composição farmacêutica da presente invenção.
Além do mais, a composição farmacêutica aqui descrita pode ser utilizada nos dadores de HSC e doentes insensíveis ao G-CSF. 26
Numa forma de realização aqui descrita, a TAT-H0XB4H é o único agente ativo administrado para mobilização de HSCs, e o fluorouracilo (5-FU) não é administrado ao dador, quer como pré-tratamento quer como um esquema de terapia de associação.
As doenças ou condições adicionais associadas ao aumento da sobrevivência celular que podem ser tratadas pela composição farmacêutica aqui descrita incluem, mas não se limitam a, progressão e/ou metástases de malignidades e distúrbios relacionados tais como leucemia (incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocitica aguda (incluindo mieloblástica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica e eritroleucemia)) e leucemias crónicas (por exemplo, leucemia mielocitica (granulocitica) crónica e leucemia linfocitica crónica)), sindrome mielodisplásica policitemia vera, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença não-Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, e tumores sólidos incluindo, mas não se limitando a, sarcomas e carcinomas tais como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, cancro pancreático, cancro da mama, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma das células renais, hepatoma, carcinoma das vias biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de 27
Wilm, cancro cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma das células pequenas do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma. A presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos, linhas de células, espécies ou géneros animais, e reagentes particulares descritos abaixo. A terminologia utilizada para descrever formas de realização particulares não pretende limitar o âmbito da presente invenção, o qual pode ser apenas limitado pelas reivindicações apensas. Como aqui utilizado, as formas singulares "um," "a" e "o" incluem as referências plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" é uma referência a uma ou mais células e inclui equivalentes das mesmas conhecidas dos especialistas na técnica. A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o geralmente entendido por um técnico médio na matéria à qual pertence esta invenção. Embora possam ser utilizados quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos na prática ou avaliação da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são referidas para descrever e divulgar, por exemplo, as construções e metodologias que são descritas nas publicações que podem ser utilizadas com a invenção presentemente descrita. As publicações discutidas acima e ao longo do texto são proporcionadas exclusivamente pela sua divulgação antes da data efetiva do presente pedido. Nada aqui é para ser 28 interpretado como um reconhecimento que os inventores não estão intitulados para anteceder essa divulgação em virtude de invenção anterior.
Definições
Uma "célula estaminal" é uma célula pluripotente ou multipotente com a capacidade de se autorrenovar, para permanecer indiferenciada, e para se tornar diferenciada. As células estaminais podem dividir-se ilimitadamente, pelo menos durante o tempo de vida do animal onde residem naturalmente. As células estaminais não são terminalmente diferenciadas, isto é, elas não estão no final de uma via de diferenciação. Quando uma célula estaminal se divide, cada célula filha pode permanecer uma célula estaminal ou pode embarcar num rumo que leva à diferenciação terminal. Uma célula estaminal "quimérica" é uma célula estaminal com uma porção do seu ADN pertencente a um organismo heterólogo.
Uma célula "hematopoiética" é uma célula envolvida no processo de hematopoiese, isto é, o processo de formação de células sanguíneas maduras a partir de células precursoras. No adulto, a hematopoiese ocorre na medula óssea. Numa fase anterior durante o desenvolvimento, a hematopoiese ocorre em sítios diferentes durante as diferentes fases do desenvolvimento; as células sanguíneas primitivas surgem no saco vitelino, e mais tarde, as células sanguíneas são formadas no fígado, baço e medula óssea. A hematopoiese sofre uma regulação complexa, incluindo regulação por hormonas, por exemplo, eritropoietina; fatores de crescimento, por exemplo, fatores de estimulação de colónias; e citocinas, por exemplo, interleucinas. 29 0 termo "vetor", como aqui utilizado, pretende referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmideo", o qual refere-se a uma volta circular de ADN de cadeia dupla na qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que podem ser ligados segmentos de ADN adicionais no genoma virai. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissómicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissómicos de mamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, desse modo, são repetidos juntamente com o genoma do hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de coordenar a expressão de genes ao qual estão operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmideo" e "vetor" podem ser utilizados indistintamente já que o plasmideo é a forma de vetor mais geralmente utilizada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como os vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados), os quais têm funções equivalentes. "Transformação," como aqui utilizado, refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método utilizado para inserção: por exemplo, transformação por captação direta, transfeção, infeção e semelhantes. Para métodos particulares de 30 transfeção, ver mais abaixo. O polinucleótido exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um epissoma ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
Em geral, o termo "proteína" refere-se a qualquer polímero de dois ou mais aminoácidos individuais (quer sejam, ou não, naturais) ligados através de ligações peptídicas, como ocorrem quando o átomo de carbono do carboxilo do grupo ácido carboxílico ligado ao carbono α de um aminoácido (ou resíduo de aminoácido) se liga covalentemente ao átomo de azoto amino do grupo amino ligado ao carbono α de um aminoácido adjacente. Estas uniões de ligação peptídica, e os átomos compreendendo os mesmos (isto é, átomos de carbono a, átomos de carbono do carboxilo (e seus átomos de oxigénio substituintes), e os átomos de azoto do amino (e seus átomos de hidrogénio substituintes)) formam o "esqueleto polipeptídico" da proteína. Além disso, como aqui utilizado, o termo "proteína" é entendido como incluindo os termos "polipéptido" e "péptido" (o qual, por vezes, pode ser aqui utilizado indistintamente). Analogamente, os fragmentos, análogos, derivados e variantes de proteínas podem ser aqui referidos como "proteínas" e devem ser considerados como sendo uma "proteína," salvo indicação em contrário. O termo "fragmento" de uma proteína refere-se a um polipéptido compreendendo menos do que a totalidade dos resíduos de aminoácidos da proteína. Como pode ser entendido, um "fragmento" de uma proteína pode ser uma forma da proteína truncada na extremidade amino, na extremidade carboxilo e/ou internamente (tal como por excisão-união natural) e pode ser também uma variante e/ou derivado. Um "domínio" de uma proteína é também um fragmento e compreende os resíduos de aminoácidos da proteína necessários para conferir atividade bioquímica correspondente à proteína natural. 31 "Recombinante" como aqui utilizado para descrever uma molécula de ácido nucleico significa um polinucleótido de origem genómica, ADNc, virai, semissintético ou sintético, o qual, em virtude da sua origem ou manipulação não está associado à totalidade ou uma porção do polinucleótido com o qual está associado na natureza. 0 termo "recombinante" como utilizado em relação a uma proteína ou polipéptido significa um polipéptido produzido por expressão de um recombinante polinucleótido.
Uma molécula (tal como um polipéptido ou polinucleótido) "isolada," "purificada," "substancialmente isolada" ou "substancialmente pura" é uma que foi manipulada para existir numa concentração maior do que na natureza. Por exemplo, uma proteína objeto está isolada, purificada, substancialmente isolada ou substancialmente purificada quando foram removidos pelo menos 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais dos materiais proteicos não objeto com os quais está associada na natureza. Como aqui utilizada, uma molécula "isolada," "purificada," "substancialmente isolada" ou "substancialmente purificada" inclui moléculas recombinantes.
Um "rato SCID" é um modelo de rato para a síndrome de imunodeficiência combinada grave (SCID), a qual origina defeitos graves no desenvolvimento do sistema imunitário. Estes ratos são deficientes, ou carecem completamente, de linfócitos T e B. A mutação SCID surge para impedir a recombinação de genes dos recetores de antigénios, originando uma ausência de linfócitos T e B funcionais. Os outros tipos de células hematopoiética parecem desenvolver-se e funcionar normalmente. Os ratos SCID suportam prontamente a diferenciação de linfócitos normal e podem 32 ser reconstituídos com linfócitos normais de ratos singénicos ou alogénicos, ou com linfócitos humanos. Estes ratos suportam também o crescimento de tumores alogénicos e xenogénicos. Por conseguinte, os ratos SCID, os quais permitem o crescimento disseminado de um número de tumores humanos, em particular de distúrbios hematológicos e melanoma maligno, podem ser utilizados para investigar malignidades.
Os termos "objeto," "indivíduo," "hospedeiro" e "doente" são aqui utilizados indistintamente para referir um animal vivo, incluindo um humano e um animal não humano. 0 indivíduo pode ser, por exemplo, um organismo possuindo células imunitárias capazes de responder a estimulação antigénica e de transdução do sinal estimulador e inibidor através da ligação ao recetor da superfície celular. 0 indivíduo pode ser um mamífero, tal como um mamífero humano ou não humano, por exemplo, cães, gatos, porcos, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, ratazanas e ratos. 0 termo "indivíduo" não exclui indivíduos que são totalmente normais em relação a uma doença, ou normais em todos os aspetos. 0 termo "tratamento" refere-se a uma medida terapêutica ou preventiva. 0 tratamento pode ser administrado a um indivíduo possuindo um distúrbio médico ou que, em última análise, pode adquirir o distúrbio, a fim de prevenir, curar, atrasar, reduzir a gravidade, ou melhorar um ou mais sintomas, de um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou a fim de prolongar a sobrevivência de um indivíduo além do esperado na ausência desse tratamento. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade do composto objeto que pode desencadear uma resposta desejada, por exemplo, uma resposta biológica ou 33 médica de um tecido, sistema, animal ou humano que é procurada, por exemplo, por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico.
Exemplos
Os exemplos específicos seguintes são para ser interpretados como meramente ilustrativos e não limitativos do resto da divulgação de forma alguma. Sem mais pormenorização, julga-se que um especialista na técnica pode, com base na descrição aqui, utilizar a presente invenção na sua total extensão.
Exemplo 1: Construção do Plasmideo pET21b-His-pTAT-HOXB4-His (a) A modificação do plasmideo pET21b contendo o marcador de His N- e C-terminal e o péptido sinal TAT. 0 vetor de expressão pET21 b contendo o marcador de His N-terminal e um péptido sinal TAT foi gerado inserindo os oligonucleótidos 5'-TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAA CGCCGCCAGCGCCGCCGGCG-3' (mensageiro) e 5'-CTAGCGGCGCTGGCGGC GTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3' (antimensageiro) no plasmideo pET21 b. 0 Marcador de His C-terminal já se encontra presente no vetor pET21 b. (b) Clonaqem de HOXB4 no vetor de expressão pET21b modificado
Um fragmento de ADN contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de H0XB4 e uma sequência de codificação de 6 histidinas adicional foi obtida por amplificação por PCR utilizando o plasmideo MGC54130 (GeneDiscovery, Taipei, 34
Taiwan. N° Cat. 5533346) como a cadeia molde e o fragmento de ADNc H0XB4 gerado por PCR foi subclonado no vetor de expressão pET21b modificado. A construção do plasmídeo e as seguências de ácidos nucleicos são mostradas nas Figuras 2 e 3.
Exemplo 2: Expressão da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante em E. coli 0 vetor de expressão pET21 b-His-TAT-H0XB4-His foi transformado na estirpe de E. coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen). As células transformadas foram cultivadas de um dia para o outro a 37 °C. As culturas multiplicadas de um dia para o outro foram diluídas até uma OD600 inicial de 0,05. As culturas foram em seguida multiplicadas a uma OD600 de 0,5 a 37 °C, induzidas com isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo 1 mM (IPTG) a 37 °C durante 3 h, com agitação vigorosa.
Exemplo 3: Purificação da Proteína TAT-HOXB4H recombinante
Após indução, as células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em Tampão A (Ureia 8 M, HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM e NaCl 100 mM, pH 8,0) . A suspensão celular foi feita passar três vezes através de uma prensa Francesa e o lisado celular clarificado por centrifugação a 20 000 x g durante 30 min a 4 °C, o sobrenadante ajustado a 10 mM de imidazole e carregado nas colunas guelantes HisTrap (Amersham Pharmacia). As proteínas ligadas foram eluídas com imidazole 50, 100 e 250 mM em tampão A. As frações contendo TAT-HOXB4H foram carregadas numa coluna MonoSP em Tampão B (ureia 4 M, HEPES 20 mM e NaCl 50 mM, pH 6,5), eluídas com NaCl 1,5 M e HEPES 20 mM (pH 8,0). 35
Exemplo 4: Renaturação da Proteína TAT-H0XB4H Recornbinante A proteína TAT-H0XB4H nas frações eluídas foi solubilizada e desnaturada numa solução contendo sal de desnaturação (por exemplo, cloridrato de guanidina) e, em seguida, foi misturada com tampão de D-PBS-T (0,1% de Triton X-l 00 em PBS 2x) . A proporção da solução da proteína TAT-HOXB4H relativamente ao tampão de D-PBS-T foi de 1:4. A mistura resultante foi adicionada a um tubo de Centricon 10K (50 mL ou 15 mL) pré-tratado com água (10 mL ou 3 mL) e, em seguida, centrifugada a 3000 rpm durante 10 min. Neste passo, o sal de desnaturação é substituído por tampão de D-PBS-T, no qual o Triton X-100 é capaz de se ligar com a região hidrófoba da proteína HOXB4H.
Este passo de ultrafiltração ou troca de tampão utilizando Centricon 10K foi realizado dez vezes com soluções contendo concentrações diferentes de beta-ciclodextrina (duas vezes com cada um de beta-ciclodextrina 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM e 5 mM em tampão de conservação IMDM por centrifugação a 1000-2500 x g durante 10 min. A amostra remanescente no tubo de Centricon 10K foi recolhida e conservada a -80°C. A homogeneidade da proteína TAT-HOXB4H purificada foi analisada por gel de poliacrilamida-SDS seguida de revelação com coomassie (figura 5). Como se mostra na figura 5, a TAT-HOXB4H purificada de HisTrap e MonoSP resultou num rendimento de 3-4 vezes em comparação com o da proteína TAT-HOXB4. O plasmídeo pTAT-HA-HOXB4 foi uma oferta do Dr. Guy Sauvageau, Universidade de Montreal, Canadá. Este plasmídeo foi transformado em BL21 (DE3)pLysS (Novagen) e a purificação da proteína TAT-HOXB4 foi realizada como descrito em Krosl et al, 2003. 36
Exemplo 5: Estabilidade da Proteína TAT-H0XB4H recombinante A estabilidade da TAT-H0XB4H foi medida por análise em gel de poliacrilamida-SDS. Após conservação, a TAT-H0XB4H inteira pode ser degradada em fragmentos de 30 kD e 10 kD. Como se mostra na figura 6, a proteína TAT-H0XB4H produzida pelo método aqui descrito foi estável mesmo após 16 horas de conservação em PBS a 4 °C.
Além disso, a estabilidade da proteína TAT-H0XB4H conservada a 4 °C e -20 °C em PBS e tampão de conservação IMDM foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 10% seguida de revelação com coomassie. Como se mostra na figura 7, quando foi utilizado IMDM como um tampão de conservação, a estabilidade da proteína TAT-HOXB4H foi mantida mesmo após 4 semanas.
Exemplo 6: Efeito da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante na Hematopoiese em Ratos Balb/c de Tipo Selvagem
Utilizou-se ratos Balb/c para investigar o possível efeito da proteína TAT-HOXB4H recombinante na mobilização de HSCs da medula óssea para o sangue periférico. A proteína TAT-HOXB4H recombinante em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) foi administrada por injeção subcutânea quatro vezes por dia durante 4 dias. Para examinar a dose-sensibilidade, grupos experimentais (n=21) receberam uma dose que foi desde 1 yg, 5 yg, 10 yg, 15 yg ... até 100 yg por kg de PC per rato. Um grupo separado de ratos de controlo recebeu apenas soro fisiológico tamponado com fosfato e outro grupo de ratos de controlo foram injetados por via subcutânea duas vezes por dia durante 4 dias com uma dose de 5 yg por kg de PC de G-CSF por rato. 37
Foi recolhido sangue periférico de todos os ratos e analisado por um citómetro de fluxo para obter a percentagem de células estaminais CD34+ nas células mononucleares (MNC). Os resultados são indicados como a média ± d.p. no Quadro 1.
Quadro 1
Grupo (Experimental/Controlo) TAT-HOXB4H (pg/kg) CD34+/MNC (%) 1 1 0 ± 0,03 2 5 0,3 ± 0,05 3 10 0,45 ± 0,03 4 15 0,42 ± 0,01 5 20 0,38 ± 0,05 6 25 0,41 ± 0,02 7 30 0,35 ± 0,21 8 35 0,33 ± 0,11 9 40 0,29 ± 0, 16 10 45 0,46 ± 0,01 11 50 0,45 ± 0,02 12 55 0,42 ± 0,06 13 60 0,44 ± 0,02 14 65 0,41 ± 0,04 15 70 0,41 ± 0,03 16 75 0,49 ± 0,01 17 80 0,45 ± 0,04 18 85 0,46 ± 0,07 19 90 0,44 ± 0,02 20 95 0,41 ± 0,01 21 100 0,42 ± 0,05 Controlo (PBS) 0 0, 002 Controlo (G-CSF) 0 0,5 ± 0,03 38 A percentagem de CD34+/MNC no sangue periférico colhido de ratos tratados é mostrada no Quadro 1. Os grupos experimentais tratados com TAT-H0XB4H 3-21 (receberam uma dose de 10 yg ou mais por kg de PC) apresentaram substancialmente o mesmo efeito de mobilização que o grupo de controlo tratado com G-CSF.
As medulas ósseas de ratos tratados com TAT-HOXB4H (Grupo Exp. 3 recebeu uma dose de 10 yg por kg de PC), ratos tratados com G-CSF e ratos injetados com PBS foram ainda sujeitas a fenotipagem utilizando anticorpo conjugado com FITC contra CD34+ (Becton Dickinson) e analisadas por um citómetro de fluxo. A medula óssea de ratos tratados com TAT-HOXB4H (Figura 5C) parece ser mais rica em células estaminais CD34+ do que a medula óssea de ratos injetados com G-CSF (Figura 5A) e PBS (Figura 5B) . Por conseguinte, estes resultados indicam que a injeção de proteínas TAT-HOXB4H recombinantes resulta num maior número de HSCs tanto na medula óssea como no sangue periférico de ratos.
Exemplo 7: Efeito da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante na Hematopoiese em Macacos Rhesus
Macacos rhesus machos adultos foram utilizados para investigar a eficácia da proteína TAT-HOXB4H recombinante em macacos. O grupo experimental I (n=5) foi injetado por via intravenosa com 10 yg por kg de PC de proteína TAT-H0XB4H recombinante quatro vezes por dia durante 4 dias. O grupo experimental II (n=5) foi injetado por via intravenosa com 10 yg por kg de PC de TAT-HOXB4H quatro vezes por dia e injetado por via subcutânea com 5 yg por kg de PC de G-CSF durante 4 dias. O grupo de controlo I recebeu apenas PBS e o grupo de controlo II foi injetado por via subcutânea duas vezes por dia durante 4 dias com 39 uma dose de 5 yg por kg de PC de G-CSF. Foram colhidos sangues periféricos de todos os macacos e analisados por um citómetro de fluxo para obter a percentagem de células estaminais CD34+ nas células mononucleares (MNC). Os resultados são apresentados no Quadro 2.
Quadro 2
Grupo (Experimental/Controlo) CD34+/MNC (%) I. TAT-H0XB4H (10 yg/kg) 0, 62 II. TAT-HOXB4H (10 yg/kg) + G-CSF (5 yg/kg) 0,38 Controlo 1 (PBS) 0,07 Controlo 2 (G-CSF, 5 yg/kg) 0,28
Como se mostra no Quadro 2, os macacos (grupo experimental I) tratados com TAT-H0XB4H mostraram apenas um efeito de mobilização significativamente melhor do que os macacos tratados com G-CSF (grupo de controlo II). Os macacos tratados com TAT-HOXB4H e G-CSF (grupo experimental II) mostraram um efeito de mobilização ligeiramente melhor do que os macacos tratados com G-CSF (grupo de controlo II).
Os espécimes de medula óssea de macacos tratados com TAT-H0XB4H, G-CSF ou PBS foram ainda sujeitos a fenotipagem utilizando anticorpo conjugado com FITC contra CD34+ (Becton Dickinson) e analisados por um citómetro de fluxo. Os espécimes de medula óssea de macacos tratados com TAT-H0XB4H (Figura 6C) parecem significativamente mais ricos em células estaminais CD34+ do que os espécimes de medula óssea de macacos injetados com G-CSF (Figura 6A) , TAT-H0XB4H + G-CSF (Figura 6B) e PBS (Figura 6D). 40
Exemplo 8: Efeito da Proteina TAT-HOXB4H Recombinante sobre a Recuperação Hematopoiética em Ratos NOD-SCID
Injetou-se 104 células Lin‘/CD34+ humanas em ratos NOD-LtSz-scid/scid (NOD-SCID) irradiados (2,5 Gy) , juntamente com 105 células auxiliares CD34~ irradiadas. Os ratos são divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo (n=28) foi injetado por via intravenosa com 10 yg por kg de PC de proteina TAT-HOXB4H recombinante duas vezes por dia, e o outro (n=28) recebeu PBS duas vezes por dia. A presença de células CD45+ humanas nas células sanguíneas periféricas de todos os ratos foi medida periodicamente por citometria de fluxo após transplante. A recuperação hematopoiética foi avaliada como o número de ratos cujas células CD45+ humanas atingiram níveis >0,1% no sangue periférico (PB) após transplante. Como se mostra na Figura 7, observou-se uma recuperação hematopoiética melhorada nos ratos injetados com proteína TAT-HOXB4H recombinante.
Exemplo 9: Efeito da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante sobre a Recuperação Hematopoiética em ratos Balb/c Após Quimioterapia com Cisplatina
Ratos Balb/c com 5 semanas de idade foram repetidamente injetados por via intravenosa com cisplatina até o número de células Ly5 (CD45 murídeo) no sangue periférico dos ratos diminuir até aproximadamente 10% do número original. Os ratos tratados com cisplatina são divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo (n=28) foi injetado por via intravenosa com 10 yg por kg de PC de proteína TAT-HOXB4H recombinante duas vezes por dia e o outro (n=28) recebeu PBS duas vezes por dia. A presença de células Ly5 nas células sanguíneas periféricas de todos os ratos foi medida periodicamente por citometria de fluxo após 41 transplante. A taxa de recuperação hematopoiética foi avaliada como a percentagem do número de células Ly5 no sangue periférico relativamente ao número original. Como se mostra na Figura 8, observou-se uma recuperação hematopoiética melhorada nos ratos injetados com proteína TAT-H0XB4H recombinante.
Os modelos animais utilizados nestas experiências foram reconhecidos na técnica como indiciadores dos resultados que serão obtidos em doentes humanos. Ver, por exemplo, Broxmeyer et al. (2005) The Journal of Experimental Medicine, 201, 1307 -1318; Larochelle et al. (2006) Blood 107, 3772-3778. <110> Taiwan Advance Bio-Pharm Inc.
<120> Método de produção de proteína TAT-HOXB4H recombinante para utilização como um estimulante da hematopoiese in vivo <130> P37302 <150> US 12/042,097 <151> 2008 03 04 <160> 4 <210> 1 <211> 57
<212> ADN <213> Sequência artificial <4 0 0> TATGCACCAC CACCACCACC ACTACGGCCG CAAGAAACGC CGCCAGCGCC 50 GCCGGCG 57
<210> 2 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência artificial 42 <400> CTAGCGGCGC TGGCGGCGTT TCTTGCGGCC GTAGTGGTGG TGGTGGTGGT 50 GCA <210> 3 <211> 840 <212> ADN <213> Sequência artificial <4 0 0>
ATGCACCACC CCGCGCTAGC ACCCCAAGTT AGCGACCACT CTTCCAGCCG GCT ACGCGGC CCGCCGCCCC ACCCGCCGGG GCAGCAGCCC CCGTCCCACT AGTTCACGTG GCTCTCGGAC TTTCACTACA CGCGCTCTGC GCATGAAGTG GGTGGTGCGG CCCCCGCGCG ACCACCACCA CTACGGCCGC AAGAAACGCC GCCAGCGCCG 50 ATGGCTATGA GTTCTTTTTT GATCAACTCA AACTATGTCG 100 CCCTCCATGC GAGGAATATT CACAGAGCGA TTACCTACCC 150 C6CCCGGGTA CTACGCCGGC GGCCAGAGGC GAGAGAGCAG 200 GAGGCGGGCT TCGGGCGGCG CGCGGCGTGC ACCGTGCAGC 250 CTGCCGGGAC CCTGGGCCCC CGCCGCCTCC GCCACCACCC 300 CGCCACCGCC CGGTCTGTCC CCTCGGGCTC CTGCGCCGCC 350 GCCCTCCTCC CGGAGCCCGG CCAGCGCTGC GAGGCGGTCA 400 CCCGCCGCCT CCCTGCGCCC AGAACCCCCT GCACCCCAGC 450 CCGCGTGCAA AGAGCCCGTC GTCTACCCCT GGATGCGCAA 500 AGCACGGTAA ACCCCAATTA CGCCGGCGGG GAGCCCAAGC 550 CGCCTACACG CGCCA6CAGG TCTTGGAGCT GGAGAAGGAA 600 ACCGCTACCT GACACGGCGC CGGAGGCTGG AGATCGCCCA 650 CTCTCCGAGC GCCAGATCAA GATCTGGTTC CAGAACCGGC 700 GAAAAAAGAC CACAAGTTGC CCAACACCAA GATCCGCTCG 750 CAGGCTCAGC CG6AGGGCCC CCTGGCCGGC CCAATGGAGG 800 CTCCTCGAGC ACCACCACCA CCACCACTGA 840
<210> 4 <211> 280 <212> PRT <213> Sequência artificial <4 0 0> 43 Met H1S HÍS HÍS HÍS HÍS HiS Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin 1 5 10 Phe 15 Arg Arg Arg Ala ser 20 Met Ala Met ser Ser 25 Leu He Asn Ser 30 ASfl Tyr Vai ASP pro 35 Lys Phe Pro Pro cys 40 Glu Glu Tyr ser Gin 45 ser ASP Tyr Leu Pro 50 ser ASp His ser Pro 55 Gly Tyr Tyr Ala cly 60 Gly Gin Arg Arg Glu 65 Ser ser Phe Glrs pro 70 Glu Ala Gly Phe Gly 75 Arg Arg Ala Ala cys 80 Thr vai Gin Arg Tyr 85 Ala Ala cys Arg Asp 90 Pro Gly pro pro pro pro pro pro pro pro Pro Pro pro pro Pro 95 100 105 Pro pro Gly Leu Ser pro Arg Ala pro Ala Pro Pro Pro Ala Gly 110 115 120 Ala Leu Leu Pro Glu pro Gly Gin Arg Cys Glu Ala vai Ser ser 125 Ala Gin 130 135 Ser pro Pro pro Pro Pro Cys Asn Pro Leu His Pro Ser 140 145 150 Pro Ser His Ser Ala cys Lys Glu Pro val vai Tyr pro Trp Met 155 160 165 Arg Lys val His Vai Ser Thr vai Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Gly 170 175 180 Glu Pro tys Arg ser Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Gin Gin val Leu 185 190 Thr 195 Glu Leu Glu Lys Glu phe HÍS Tyr Asn Arg Tyr Leu Arg Arg 200 Ala 205 Glu 210 Arg Arg vai Glu Xle Ala His Leu Cys Leu ser Arg Gin 215 220 225 lie Lys He Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp 230 235 Ala Ala 240 His Lys Leu pro Asn Thr Ly$ lie Arg Ser Gly Gly Gly 245 250 Gly Gly 255 ser Ala Gly Gly pro pro Gly Arg pro Asn pro Arg Ala 260 His His 265 270 Leu Leu Glu His HiS His His Ter .275 280
Lisboa , 21 de Maio de 2014
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES Método de produção de uma proteína TAT-H0XB4 compreendendo: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que codifica uma proteína de fusão TAT-H0XB4 marcada com histidina C-terminal (TAT-H0XB4H) contendo pelo menos 6 resíduos de histidina na extremidade exterminai ; (b) expressar a proteína na célula hospedeira; (c) recolher uma solução impura da proteína expressa; (d) purificar a proteína da solução por: (i) aplicação da solução numa coluna HisTrap; (ii) lavagem da coluna HisTrap; (iii) eluição da proteína parcialmente purificada da coluna HisTrap para produzir uma solução de proteína parcialmente purificada; (iv) aplicação da solução da proteína parcialmente purificada numa coluna MonoSP; (v) lavagem da coluna MonoSP; (vi) eluição da proteína purificada da coluna MonoSP na forma desnaturada; (e) redobrar a proteína desnaturada eluída utilizando compostos hidrófobos por: (i) combinação da proteína desnaturada eluída e uma solução de compostos hidrófobos para formar uma solução de proteína e compostos hidrófobos; (ii) dessalinização da solução de proteína e compostos hidrófobos para obter uma solução de proteína dessalinizada e compostos hidrófobos; 2 (iii) remoção dos compostos hidrófobos da solução de proteína dessalinizada utilizando ultrafiltração num tubo de Centricon ou uma célula de agitação; e (f) conservar a proteína purificada em IMDM ou DMEM.
- 2. Método da reivindicação 1, em que o tampão de lavagem da coluna HisTrap compreende Ureia 8 M, HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0 e imidazole 10 mM.
- 3. Método da reivindicação 1, em que o tampão de eluição para eluir a proteína parcialmente purificada da coluna HisTrap compreende pelo menos imidazole 50 mM em Ureia 8 M, HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0 .
- 4. Método da reivindicação 1, em que o tampão de eluição para eluir a proteína parcialmente purificada da coluna HisTrap compreende imidazole 50-100 mM ou imidazole 100-250 mM.
- 5. Método da reivindicação 1, em que o tampão de lavagem da coluna MonoSP compreende ureia 4 M, HEPES 20 mM e NaCl 50 mM, pH 6,5.
- 6. Método da reivindicação 1, em que o tampão de eluição para eluir a proteína purificada da coluna MonoSP compreende NaCl 1,5 M e HEPES 20 mM, pH 8,0.
- 7. Método da reivindicação 1, em que os compostos hidrófobos compreendem Triton X-100, tween-20 ou compostos de polibenzeno. 3
- 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1-7, compreendendo ainda remover um marcador de His da extremidade N-terminal e/ou da extremidade C-terminal da proteína TAT-H0XB4H.
- 9. Método da reivindicação 1, em que o processo de ultrafiltração é realizado utilizando dez vezes Centricon 10K com solução contendo concentrações diferentes de beta-ciclodextrina. Lisboa, 21 de Maio de 2014
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