KR101903339B1

KR101903339B1 - 방사선 또는 화학적 손상을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR101903339B1
Application number: KR1020187005800A
Authority: KR
Inventors: 자미 아버만; 라파엘 고로데스키
Original assignee: 플루리스템 리미티드
Priority date: 2011-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2018-10-01
Also published as: HK1244502A1; KR20180027610A; JP6030114B2; JP2017061472A; IL267417A; JP2014508799A; IL267417B; EP3260533A1; EP2689008A1; IL228470A0; WO2012127320A1; EP3260533B1; KR101835917B1; JP6548714B2; US20200306319A1; JP6266726B2; KR20140020290A; IL254694B; IL228470A; IL254694A0

Abstract

유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방사선 또는 화학적 손상을 치료하는 방법이 기술된다. 유착성 간질세포를 제조하는 방법 및 상기 세포를 포함하는 약제학적 조성물도 역시 기술된다.

Description

방사선 또는 화학적 손상을 치료하는 방법{Methods for treating radiation or chemical injury}

[관련 출원에 관한 교차 참조]

본 출원은 2011년 3월 22일자로 제출된 미국 특허출원 제13/069,130호, 2011년 6월 15일자로 제출된 미국 특허출원 제13/161,334호, 2011년 6월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제61/497,400호, 및 2012년 2월 6일자로 제출된 미국 가특허출원 제61/595,485호의 유익을 주장하고, 이들의 개시들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

본 발명은 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로부터 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

조혈 줄기세포(HSC)은 골수성 및 림프성 계열들 둘 다의 혈액 세포 유형 모두를 발생시키는 전구체 세포가다. 따라서, HSC는 적혈구 세포, 혈소판 및 림프구들, 뿐만 아니라 대부분의 다른 혈액 세포의 생산을 위해 필요하다. HSC는 골수에 있는 구분된 소와들(niche)과 생체내에서 친밀하게 연관되고, 이는 종합적으로 세포-세포 접촉들 또는 짧은 범위의 상호작용들을 통해 HSC 분화 및 자가-재생(self-renewal)을 매개하는 분자적 신호들을 제공한다. 이들 소와들은 골수세포, 즉 대식세포, 섬유모세포, 지방세포 및 내피세포를 포함하는 조혈 유도성 미세환경(microenvironment), 또는 간질(stroma)의 일부이다. 골수세포는 세포외 기질(ECM) 단백질 및 세포-세포 접촉을 용이하게 하는 기저막 성분을 제공하여 미세환경의 기능적 본질(integrity)을 유지시킨다. 그들은 조절된 조혈세포 분화 및 증식을 위해 필요한 다양한 용해성 또는 정착성 사이토카인도 역시 제공한다. HSC 및 간질 간의 상호작용들은 HSC의 생존가능성을 보존하고 그들의 분화를 방지하도록 요구된다.

HSC는 질환 또는 이러한 신속하게 분열하는 세포의 군집에게 독성을 가진 물질들에 대한 노출로 인해 손실될 수 있다. 예를 들면, 해로운 수준의 방사선에 대한 노출은 HSC 사망을 초래한다. 암의 화학요법에 사용되는 것들을 포함하는 화학물질도 역시 HSC를 죽일 수 있다. HSC가 결핍된 환자은 산소 운반(적혈구들)으로부터 응고(혈소판)까지, 면역(T 세포, B 세포)까지에 이르는 기능들을 위해 필요한 충분한 수의 혈액 세포를 더이상 생산하지 못한다. HSC의 완전한 손실은 환자가 HSC 이식에 의해 치료되지 않는 경우라면 며칠 내에 사망을 유발한다. HSC의 수가 감소되기는 하지만 완전하게 손실되지는 않은 환자이라도 빈혈, 출혈, 감염, 및 기타 생명-위협 병태의 중대한 위험에 놓이게 된다.

HSC 이식이 개체가 불충분한 수의 HSC를 가지는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있더라도, 이식된 세포의 낮은 생존율은 주요한 문제점이 된다. 정맥 내로 이식된 HSC가 그들의 수혈 이후 수분 이내에 순환으로부터 제거되고 골수에서 관찰된 것으로 잘 보고되어 있다. HSC 이식 이후 3 내지 5시간째, 공여자 세포는 수여자의 말초혈액에서 전혀 검출되지 않는다(Askenasy et al., Stem Cells 2002, 20: 301-10). 그러나, 이식된 세포의 거의 대부분은 수혈된 직후 파괴된다. 결론적으로, 수여자의 골수의 콜로니화는 효율이 낮고 수혈된 세포의 1 내지 5%만이 이식 2 내지 3일 이후에 수여자의 골수에서 검출된다(Kerre et al., J. Immunol. 2001, 167: 3692-8; Jetmore et al., Blood 2002, 99: 1585-93).

여러 출판물이 중간엽 줄기세포과 공동-이식될 때 HSC의 더 높은 접목(engraft) 효율들을 기술하여 왔다(Gurevitch et al., Transplantation 1999, 68: 1362-8; Fan et al., Stem Cells 2001, 19: 144-50). 인간-양 접목 모델에서 인간 중간엽 줄기세포의 공동-이식은 동물에서 인간 HSC 키메라 골수의 장기간(long-term) 접목의 증진을 유도하는 점도 역시 기술되었다(Almeida-Porada et al., Blood 2000, 95: 3620-7). HSC 및 중간엽 줄기세포의 동시적 주사는 조혈작용(hematopoiesis)을 가속시킬 수 있다(Zhang et al., Stem Cells 2004, 22: 125662; Liu et al., Zhonghua XueYe XueZa Zhi. 2005, 26: 385-8). 중간엽 줄기세포는 인간 개체들에서 HSC의 접목을 촉진하는 데 사용되어 왔다(Koc ON, J. Clin. Oncol. 2000, 18:307-316; Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. 2005, 11: 389-98). 외관상으로, 중간엽 줄기세포는 이식된 HSC의 귀소, 자가-재생 및 작정(commitment) 잠재력을 매개하고 균형 잡도록 돕는 지지(supporting) 사이토카인을 생산하고, HSC의 귀소 및 증식을 위해 필요한 손상된 조혈 미세환경을 재건하고, 또한 이식편 대 숙주병(GvHD)을 유발할 수 있는 공여자 유래된 T 세포를 저해하여 조혈성 접목에 기여한다(Charbord & Moore, Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005, 1044: 159-67; 미국 특허 제6,010,696호; 제6,555,374호).

중간엽 줄기세포가 HSC 접목을 용이하게 할 수 있더라도, 그들은 일상적인 임상적 적용을 위해 충분한 수로 광범위하게 입수가능하지 않다. 유사하게, 특히 HSC 수여자와 매칭되어 덜 파괴될 것 같은 HSC의 적당한 공급을 제공하는 것이 어려울 수 있다. 이에 따라, 조혈 체계가 방사선 또는 화학물질에 대한 노출에 의해서와 같이 손상되었던 개체들을 치료하는 데 사용될 수 있는 대안의 치료법을 위한 충족되지 않은 임상적 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출의 하나 이상의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포(adherent stromal cells)의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 소정의 구현예에서, 방사선은 이온화 방사선이다. 소정의 구현예에서, 이온화 방사선은 방사선요법(radiotherapy)이다. 소정의 구현예에서, 노출은 이온화 방사선에 대한 우연한 노출이다.

일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출의 효과는 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상, 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 충격의 하나 이상일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 본 양태의 일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출의 효과는 호흡계에 대한 손상, 신경계에 대한 손상, 위창자계에 대한 손상, 심혈관계에 대한 손상, 피부에 대한 손상, 또는 신장계에 대한 손상의 하나 이상일 수 있다. 소정의 구현예에서, 신경학적 증상은 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 또는 기면증이다.

일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출은 진행중일 수 있다.

일정 구현예에서, 개체는 화학요법도 역시 받고 있다.

일정 구현예에서, 투여는 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경막내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의할 수 있다. 소정의 구현예에서, 투여는 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의한다.

일정 구현예에서, 개체에게 외인성 조혈 줄기세포는 투여되지 않는다.

일정 구현예에서, 본 발명은 첫 번째 투여에 이어서 약 2 내지 약 21일째 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량 및 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 투여는 근육내 주사에 의할 수 있다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 노출 이후 약 0 내지 약 1일, 2일, 또는 3일째 투여되고, 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량은 이후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일째 투여된다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 방사선에 대한 노출 이전에 투여된다. 본 발명의 본 다른 양태의 일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 방사선에 대한 노출 이전 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일째 투여된다. 일정 구현예에서, 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 적어도 일부도 역시 방사선에 대한 노출 이전에 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학요법의 하나 이상의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법을 받은 개체를 치료하는 방법이 제공된다.

일정 구현예에서, 화학요법의 효과는 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상, 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 충격의 하나 이상일 수 있다. 마찬가지로, 일정 구현예에서, 화학요법의 효과는 호흡계에 대한 손상, 신경계에 대한 손상, 위창자계에 대한 손상, 심혈관계에 대한 손상, 피부에 대한 손상, 또는 신장계에 대한 손상의 하나 이상일 수 있다. 소정의 구현예에서, 신경학적 증상은 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 또는 기면증이다.

일정 구현예에서, 화학요법은 진행중일 수 있다.

일정 구현예에서, 개체는 방사선에 대해서도 역시 노출된다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 화학요법 이전에 투여된다. 본 발명의 본 다른 양태의 일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 화학요법 이전 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일째 투여된다. 일정 구현예에서, 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 적어도 일부도 역시 화학요법 이전에 투여된다.

또 다른 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집(repopulation)을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 손상된(compromised) 내인성 조혈 체계를 가지는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.

일정 구현예에서, 내인성 조혈세포의 재군집은 내인성 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 내인성 조혈세포의 재군집은 CD45를 발현하는 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, 내인성 조혈 체계는 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된다.

일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법은 진행중이다.

일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법의 효과는 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상, 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 충격의 하나 이상일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 본 양태의 일정 구현예에서, 방사선 또는 화학요법의 효과는 호흡계에 대한 손상, 신경계에 대한 손상, 위창자계에 대한 손상, 심혈관계에 대한 손상, 피부에 대한 손상, 또는 신장계에 대한 손상의 하나 이상일 수 있다. 소정의 구현예에서, 신경학적 증상은 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 또는 기면증이다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 방사선에 대한 노출 이전에 투여된다. 일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 노출 이전 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일째 투여된다.

또 다른 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.

일정 구현예에서, 특정된 기간은 0 내지 10일 이내이다. 소정의 구현예에서, 특정된 기간은 7 내지 10일 이내이다. 보다 다른 구현예에서, 특정된 기간은 5 내지 6일 이내이다. 보다 다른 구현예에서, 특정된 기간은 2 내지 4일 이내이다. 추가적인 구현예에서, 특정된 기간은 1 내지 2일 이내이다. 일정 구현예에서, 특정된 기간은 약 1일 이내이다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이전에 투여된다. 일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량은 노출 이전 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일째 투여된다.

일정 구현예에서, 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량의 투여는 첫 번째 치료적 유효량의 투여 이후 약 2 내지 약 21일째일 수 있다. 소정의 구현예에서, 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량의 투여는 첫 번째 치료적 유효량의 투여 이후 약 2 내지 약 10일째일 수 있다. 다른 구현예에서, 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량의 투여는 첫 번째 치료적 유효량의 투여 이후 약 2 내지 약 5일째일 수 있다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량의 투여는 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의할 수 있다.

일정 구현예에서, 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 투여는 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의할 수 있다.

일정 구현예에서, 첫 번째 치료적 유효량 및 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량의 투여는 근육내 주사에 의할 수 있다.

보다 또 다른 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해, 적어도 한 번의 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 개체에게 외인성 조혈 줄기세포과 함께 노출에 이어지는 매칭 기간 이후에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 개체와 매칭되는 외인성 조혈 줄기세포를 찾는 데 요구되는 시간의 기간은 "매칭 기간(matching period)"이라고도 언급된다.

본 발명의 본 양태의 일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법은 진행중이다.

일정 구현예에서, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법의 효과는 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상, 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 충격의 하나 이상일 수 있다. 마찬가지로, 일정 구현예에서, 방사선 또는 화학요법의 효과는 호흡계에 대한 손상, 신경계에 대한 손상, 위창자계에 대한 손상, 심혈관계에 대한 손상, 피부에 대한 손상, 또는 신장계에 대한 손상의 하나 이상일 수 있다. 소정의 구현예에서, 신경학적 증상은 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 또는 기면증이다.

일정 구현예에서, 본 발명은 외인성 조혈 줄기세포를 개체와 매칭하는 단계를 더 포함할 수 있다. 개체와 매칭되는 외인성 조혈 줄기세포를 찾는 데 요구되는 시간의 기간은 "매칭 기간"이라고도 언급된다.

일정 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 동종이형의 제대혈 또는 골수세포과 매칭된다.

일정 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 개체와는 매칭되지만 유착성 간질세포는 조혈 줄기세포과 매칭되지 않고/않거나 유착성 간질세포는 수여자 개체와 매칭되지 않는다.

또 다른 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해 및/또는 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 무균의 포장으로 유착성 간질세포의 치료적 유효량, 및 치료적 유효량의 투여를 위한 지침들:을 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 키트가 제공된다.

일정 구현예에서, 무균의 포장은 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입을 위해 제작된다.

일정 구현예에서, 본 발명은 내인성 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해, 두 번째 무균의 포장으로 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 더 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량은 외인성 조혈 줄기세포과 함께 두 번째 무균의 포장으로 포장된다.

일정 구현예에서, 외인성 조혈세포는 동종이형의 제대혈 또는 골수세포가다.

일정 구현예에서, 첫 번째 및 상기 두 번째 무균의 포장들은 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입을 위해 제작된다.

보다 또 다른 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다.

또 다른 양태에 따르면, 화학요법의 효과를 경감하도록 화학요법을 받은 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다.

보다 또 다른 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출 및 화학요법의 효과를 경감하도록 방사선에 대한 노출 및 화학요법에 이어서 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다.

보다 추가적인 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하도록/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하도록 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다.

또 다른 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하도록 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 유도하도록/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하도록 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다.

보다 추가적인 일 양태에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해, 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 개체에게 외인성 조혈 줄기세포과 함께 노출에 이어지는 매칭 기간 이후에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 개체를 치료하기 위한 유착성 간질세포가 제공된다. 개체와 매칭되는 외인성 조혈 줄기세포를 찾는 데 요구되는 시간의 기간은 "매칭 기간"이라고 언급된다.

또 다른 양태에서, 임의의 개시된 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

추가적인 양태에서, 무균의 포장으로 임의의 개시된 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 투여하기 위한 지침들을 포함하는 키트가 제공된다.

또 다른 양태는 임의의 개시된 방법의 실행을 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도를 제공한다.

한 가지 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도로서, 치료는 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도가 제공된다.

한 가지 양태에 따르면, 화학요법을 받는 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도로서, 치료는 화학요법의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도가 제공된다.

한 가지 양태에 따르면, 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도로서, 치료는 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하도록/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도가 제공된다.

한 가지 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도로서, 치료는 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 유도하도록 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계:를 포함하는, 용도가 제공된다.

한 가지 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 유착성 간질세포의 용도로서, 치료는 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 내인성 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해, 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 개체에게 외인성 조혈 줄기세포과 함께 노출에 이어지는 매칭 기간 이후에 투여하는 단계:를 포함하는, 용도가 제공된다. 개체와 매칭되는 외인성 조혈 줄기세포를 찾는 데 요구되는 시간의 기간은 "매칭 기간"이라고도 언급된다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포는 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양된다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이고, 유착성 간질세포는 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양된다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포는 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 생물반응기로 배양되었던 태반의 유착성 간질세포가다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 태반의 유착성 간질세포의 약 60% 미만은 이소형 대조군과 대비하여 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이 마커 CD200에 대해 양성이다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 태반의 유착성 간질세포의 약 60% 미만은 이소형 대조군과 대비하여 면역형광법에 의해 검출된 바와 같이 마커 OCT-4에 대해 양성이다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포는 Flt-3 리간드, IL-6, 및 SCF를 분비한다.

앞서 말한 몇몇 양태 중 임의의 소정의 구현예에서, 개체에게 외인성 조혈 줄기세포는 투여되지 않는다.

다른 양태에 따르면, 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 개체에게 유착성 세포의 적어도 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.

다른 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계의 특정된 용량 요법으로 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 유착성 세포의 용도로서, 특정된 용량 요법은 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 10일 이내의 투여를 위한 유착성 세포의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도가 제공된다.

다른 양태에 따르면, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내의 투여를 위한, 무균의 포장으로 유착성 세포의 치료적 유효량을 포함하는, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 키트가 제공된다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감시킨다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 내인성 조혈세포는 개체의 조혈 체계에 의해 생산되었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집은 개체의 내인성 조혈 체계에서 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함한다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 내인성 조혈세포의 재군집은 CD45 마커를 발현하는 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함한다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 개체는 방사선에 노출된 적이 있었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 방사선 노출은 진행중이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 개체는 조혈 체계를 손상시키는 화학물질에 노출된 적이 있었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 개체는 화학요법으로 치료된 적이 있었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 화학요법은 진행중이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 태반의 유착성 간질세포의 약 60% 미만은 이소형 대조군과 대비하여 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이 마커 CD200에 대해 양성이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 태반의 유착성 간질세포의 약 60% 미만은 이소형 대조군과 대비하여 면역형광법에 의해 검출된 바와 같이 마커 OCT-4에 대해 양성이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 간질세포는 Flt-3 리간드, IL-6, 및 SCF를 분비한다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이고, 유착성 세포는 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 생물반응기로 배양되었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포의 기원은 태반이고, 유착성 세포는 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 근육내 주사에 의해 투여된다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 적어도 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 또는 열 번까지 투여된다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 적어도 두 번 투여되고, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 간격으로 투여된다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 유착성 세포는 적어도 두 번 근육내로 투여되고, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 간격으로 투여된다.

또 다른 양태에 따르면, 손상된 조혈 체계로 고생하는 개체의 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 유착성 세포의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

다른 양태에 따르면, 유착성 세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 유착성 세포의 두 번째 치료적 유효량을 개체에게 외인성 조혈 줄기세포과 함께 노출에 이어지는 매칭 기간 이후에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 개체와 매칭되는 외인성 조혈 줄기세포를 찾는 데 요구되는 시간의 기간은 "매칭 기간"이라고도 언급된다. 일정 구현예에서, 조혈 줄기세포는 동종이형의 제대혈 또는 골수세포과 매칭된다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도한다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감시킨다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서 방사선은 이온화 방사선이다.

보다 또 다른 양태에 따르면, 유착성 세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 특정된 기간 이내에 투여하는 단계, 및 유착성 세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 각각의 치료적 유효량들의 유착성 세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이고, 유착성 세포는 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도한다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감시킨다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서 방사선은 이온화 방사선이다.

다른 일 양태에 따르면, 개체에게 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 특정된 기간 이내의 투여를 위한, 첫 번째 무균의 포장 내의 유착성 세포의 첫 번째 치료적 유효량; 노출에 이어지는 매칭 기간 이후에 투여를 위한, 선택적으로 조혈 줄기세포과 함께 제공되는 유착성 세포의 두 번째 무균의 포장 내의 두 번째 치료적 유효량; 그리고 첫 번째 및 두 번째 치료적 유효량들의 투여를 위한 지침들을 포함하는, 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 키트가 제공된다. 이들 구현예에서, 조혈 줄기세포는 본 키트의 일부로서 제공된다. 소정의 구현예에서 조혈세포는 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포로서 제공된다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도한다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감시킨다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서 방사선은 이온화 방사선이다.

다른 양태에 따르면, 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계의 특정된 용량 요법으로 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 유착성 세포의 용도로서, 특정된 용량 요법은: 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 10일 이내의 유착성 세포의 첫 번째 치료적 유효량, 및 두 번째 특정된 기간 이후에 유착성 세포의 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도가 제공된다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도한다. 일정 구현예에서, 치료법은 개체에서 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감시킨다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서 방사선은 이온화 방사선이다.

기술된 구현예의 보다 다른 특징에 따르면, 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량은 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포를 더 포함하고, 여기에서 두 번째 특정된 기간은 매칭된 세포를 개체와 매칭하는 매칭 기간이다.

보다 다른 양태에 따르면, 노출된 개체에게 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방사선 또는 화학물질에 노출되었던 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서 방사선은 이온화 방사선이다. 일정 구현예에서, 노출은 미치료된 경우라면 일반적으로 약 1 내지 2일(예로, 30 Gy 초과의 이온화 방사선(IR)의 노출), 2일 내지 2주(예로, 약 8 내지 30 Gy IR의 노출), 또는 약 2 내지 4주(예로, 약 2 내지 8 Gy IR의 노출) 이내에 개체에게 치명적일 노출이다.

보다 또 다른 양태에 따르면, 노출된 개체에게 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방사선병 또는 독성 화학물질에 대한 노출과 연관된 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 방사선병은 급성이다. 일정 구현예에서, 독성 화학물질은 화학요법의 일부분으로서 투여된다. 이들 구현예의 어느 하나에서, 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상(예로, 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 또는 기면증), 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 및 충격을 포함한다. 일정 구현예에서, 방사선 또는 화학요법은 호흡계에 대한 손상, 신경계에 대한 손상, 위창자계에 대한 손상, 심혈관계에 대한 손상, 피부에 대한 손상, 또는 신장계에 대한 손상을 유발한다.

이들 양태의 일정 다양한 구현예에서, 투여의 시기, 용량의 횟수, 및 투여의 경로(들)은 상기에 기술된 바와 같다.

이들 다양한 양태의 소정의 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 개체에게 투여되지 않는다.

달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있더라도, 적합한 방법 및 물질들은 하기에 기술된다. 모순의 경우라면, 정의들을 포함하는 본 특허 명세서가 통제할 것이다. 또한, 물질들, 방법, 및 실시예은 단지 설명을 위한 것이고 제한하려는 것이 아니다.

본 발명은 세포 확장의 방법 그리고 세포 및 이에 의해 생산된 조정된 배지의 용도들을 포함한다. 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하는 방법이 본 발명 내에 포괄된다. 또한 화학요법의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법을 받은 개체를 치료하는 방법이 본 발명 내에 포괄된다. 이들 방법은 방사선 조사 또는 화학요법에 이어서 개체에게 투여된 유착성 간질세포가 개체의 생존을 촉진한다는 점과 손상된 조혈 체계를 가진 개체에서 유착성 간질세포가 개체의 내인성 조혈 체계의 회복을 용이하게 하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하는 점에 대한 본 발명자의 인식으로부터 유래한다.

본 발명의 원리 및 작동은 도면들 및 첨부된 상세한 설명들을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 구현예를 자세하게 설명하기 이전에, 본 발명이 그의 출원에서 다음의 상세한 설명에서 개시되거나 실시예에 의해 예시된 세부사항들에 제한되지 않는 점이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구현예일 수 있고 다양한 방식들로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 문체 및 용어학은 설명의 목적을 위한 것이고 제한으로서 간주되지 않는 점이 이해되어야 한다.

본 발명을 실행하면서, 본 발명자은 태반, 지방 조직, 또는 골수로부터 얻은 유착성 세포가 3D 배양 조건에서 효율적으로 증식될 수 있는 점을 밝혔다. 이에 따라, 태반, 지방 조직, 또는 골수로부터 얻은 유착성 세포, 및 이로부터 생산된 조정된 배지가 이식, 조직 재생 및 생체내 HSC 지지와 같은 치료법에 사용될 수 있다.

하기 본 명세서에서 그리고 다음의 실시예 섹션에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자은 3D 세팅들에서 지방, 골수, 및 태반-유래된 유착성 세포를 확장시킬 수 있었다. 이에 따라 증식된 세포는 유착 및 재군집 검정법에 의해 입증된 바와 같이(실시예 1 참고), 동결건조-보존에 이어서 생존가능한 것으로 확인되었다. 태반 유래된 유착성 세포의 유동 세포측정법 분석은 구별된 마커 발현 양상을 밝혀주었다(도 3a 및 3b를 참고). 가장 중요하게도, 2D 또는 3D 세팅들 상에서 증식된 지방 및 태반 유래된 유착성 세포는 HSC 접목을 지지할 수 있었고(실시예 2를 참고), 본 발명의 세포의 병원에서 사용을 실체화한다.

따라서 본 발명의 한 가지 양태에 따르면, 세포 확장의 방법으로서 세포 확장을 지지하는 삼차원의(3D) 배양 조건하에서 태반, 지방 조직, 또는 골수로부터 얻은 유착성 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "확장하는(expanding)" 및 "확장(expansion)"은 실질적으로 분화 없는 세포의 유지 및 궁극적으로 세포 성장, 즉 이러한 증가를 동반하는 분화 없는 세포 군집의 증가(예로, 적어도 2배)를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유지하는" 및 "유지"는 실질적으로 분화 없는 새포 재생, 즉 이러한 정지성(stationarity)을 동반하는 분화 없이 실질적으로 정지된 세포 군집을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유착성 세포"은 고정(anchorage) 의존적인, 예로 시험관내에서 성장하기 위하여 표면에 부착을 요구하는 세포의 균질한 또는 불균질한 군집을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방 조직(adipose tissue)"은 지방 세포(fat cell)(adipocytes)을 포함하는 연결 조직을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "태반 조직"은 자궁벽을 피복하고 임신 동안 제대에 의해 부착된 태아를 감싸는 포유동물 암컷 기관의 임의의 일부를 말한다. 출산에 이어서, 태반은 배출된다(산후 태반이라고도 언급된다).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삼차원의 배양 조건"은 세포를 세포 성장에 적합한 조건에 배치하는 한편 세포를 한 층 이상으로 성장하도록 허용하는 것을 말한다. 살아있는 유기체(또는 조직)에서 세포의 제자리(in situ) 환경은 삼차원의 구조물로서 잘 이해된다. 세포는 다른 세포에 의해 둘러싸인다. 그들은 다양한 국소적 미세환경들의 확립을 허용하는 세포외 기질의 나노규모의 섬유들의 복잡한 연결망에 놓여있다. 그들의 세포외 리간드들은 기저막과 부착뿐만 아니라 다양한 혈관 및 림프관들과의 접근을 매개한다. 산소, 호르몬들 및 영양분은 세포로 운반되고 폐기물은 배출된다. 본 발명의 삼차원의 배양 조건은 하기에 더 예시된 바와 같은 환경을 모방하도록 설계된다.

태반 유래된 유착성 간질세포는 태반의 태아(즉, 양막 또는 태반의 내부 부분) 및 모성(즉, 기저 탈락막 및 벽측 탈락막)의 부분 둘 다로부터 획득될 수 있다. 따라서, 태반으로부터 얻은 "모성의" 유착성 간질세포는 태반의 모성 부분의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 세포를 포함한다. 유사하게, 태반으로부터 얻은 "태아의" 유착성 간질세포는 태반의 태아 부분의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 유착성 세포를 포함한다.

모성-유래 및 태아-유래된 유착성 간질세포를 제조하고 분석하는 방법은 국제특허출원 제WO 2011/064669호에 기술되어 있고, 이는 참고문헌으로 통합된다. 일정 구현예에서, 모성 및 태아 태반의 유착성 간질세포는 유전자형 및/또는 핵형(예로, FISH) 분석법을 기초로 하여 확인된다. 예를 들면, 수컷 배아의 태반으로 얻은 유착성 간질세포가 핵형 분석법을 기초로 하여 태아 및 모성의 세포로 분리될 수 있다(즉, XX 세포는 모성인 한편 XY 세포는 태아이다). 일정 구현예에서, 태반의 태아 일부분으로부터 유래된 (예로, 융모막 융모로 구성되거나 이를 포함하는) 유착성 간질세포는 CD200을 발현한다. 다시 말하면, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 세포가 음성 발현을 정의하는 이소형 대조군을 사용한 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 CD200를 발현한다. 일정 구현예에서, 모성의 일부분으로부터 얻은 유착성 간질세포의 3.5% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하가 음성 발현을 정의하는 이소형 대조군을 사용한 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 CD200를 발현한다.

모성, 태아, 또는 혼합된 모성 및 태아-유래된 태반의 유착성 간질세포가 제조되고 있는지 여부와는 상관없이, 조직 표본들은 생리학적 완충액(예로, 포스페이트-완충된 식염수(PBS) 또는 행크 완충액(Hank's buffer))으로 세척된다. 단일-세포 현탁액은 조직을 소화 효소로 처리하고/하거나(하기를 참조) 조직 부분을 나일론 필터를 통해 또는 세척 배지로 부드러운 피펫팅(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)하여 분쇄하고 세척하는 것에 의해 만들어진다.

지방 조직 유래된 유착성 간질세포는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 미국 특허 제6,153,432호에 기술되어 있다. 지방 조직은 그물막/내장, 유방, 생식기, 또는 기타 지방 조직 부위들로부터 유래될 수 있다. 지방 조직의 바람직한 출처는 그물막 지방이다. 인간들에서, 지방은 전형적으로 지방흡입에 의해 분리된다.

지방 조직으로부터 얻은 분리된 유착성 간질세포는 콜라겐분해효소, 트립신 및/또는 디스파제와 같은 소화 효소; 및/또는 유효 농도들의 하이알루로니다제 또는 DNAse; 및 에틸렌디아민테트라-아세트산(EDTA)으로; 25 내지 50℃ 사이의 온도들에서 10분 내지 3시간 사이의 기간들 동안 조직을 처리하여 유래될 수 있다. 다음으로 세포는 나일론 또는 치즈천의 20 마이크론 내지 800 마이크론들 사이의 메쉬 필터를 통해 통과될 수 있다. 다음으로 세포는 배지에서 직접적으로 또는 피콜 또는 퍼콜 또는 기타 입자 구배 상에서 분별 원심분리된다. 세포는 100 내지 3,000× g 사이의 속도들로 1분 내지 1시간 사이의 기간들 동안 4 내지 50℃ 사이의 온도에서 원심분리된다(미국 특허 제7,078,230호를 참조).

태반 또는 지방 조직 유래된 유착성 간질세포에 추가하여, 본 발명은 다른 세포 출처들로부터 얻은 유착성 간질세포의 용도도 역시 착상하고 있다. 예를 들면, 소정의 구현예에서, 유착성 간질세포는 골수로부터 획득된다. 유착성 간질세포가 회수될 수 있는 다른 조직 출처들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 제대혈, 모낭들(예로, 미국 특허출원 제20060172304호에 기술된 바와 같음), 고환들(예로, GuanK., et al., Nature. 2006 Apr 27; 440(7088): 1199-203에 기술된 바와 같음), 인간 청각 점막(예로, Marshall, CT., et al., Histol. Histopathol. 2006 Jun;21(6):633-43에 기술된 바와 같음), 배아 난황낭(예로, Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427(6970): 148-54에 기술된 바와 같음) 및 양수(Pieternella et al.(2004) Stem Cells 22: 1338-1345)를 포함한다. 이들 조직 출처들로부터 얻은 유착성 간질세포는 부착성 표면 상에서 세포를 배양하여 분리될 수 있고, 따라서 초기 군집에서 다른 세포로부터 유착성 간질세포를 분리한다.

기원(예로, 태반, 지방 조직, 또는 골수)과는 상관없이, 세포 회수는 일반적으로 무균의 조건하에서 효과를 내었다. 일단 분리된 세포가 획득되면, 그들은 부착성 물질(예로, 표면으로서 제작됨)과 부착하도록 허용되고 이에 의해 유착성 간질세포를 분리한다. 이것은 3D 배양 조건에서 배양 이전에(실시예 1 참조) 또는 배양과 동시에 효과를 낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "부착성 물질"은 표면 상에 세포를 보유할 수 있는 화학적 구조(예로, 전하를 가진 표면 노출된 그룹)를 가진 비-세포독성(즉, 생물학적으로 적합한) 물질의 합성적, 자연적으로 생기는 물질 또는 이들의 조합을 말한다.

본 발명의 본 양태에 따라 사용될 수 있는 부착성 물질들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리에스테르, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 폴리스티렌, 폴리설폰, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유, 세라믹 입자, 매트리겔, 세포외 기질 성분(예로, 피브로넥틴, 콘드로넥틴, 라미닌), 콜라겐, 폴리 L 락트산 및 불활성 금속 섬유를 포함한다.

특정한 마커를 발현하는 세포를 위한 정제 또는 농축강화의 심화 단계들이 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법(본 명세서에서 하기에 더 기술된 바와 같이, 유착성 간질세포 마커 발현을 사용한 FACS에 의해서와 같음)을 사용하여 효과를 낼 수 있다.

본 발명에 따른 배양에 유용한 기본 배지의 비제한적인 예들로는 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, 윌리암의 G, 뉴만 & 타이텔, 히쿠치, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153를 포함하는 수많은 다른 배지 중에서, 최소 필수 배지 이글, ADC-I, LPM(무-소혈청 알부민), F1O(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI1640, BGJ 배지(피튼-잭슨(Fitton-Jackson) 변형이 있거나 없음), 기본 배지 이글(BME-얼(Earle)의 염 베이스의 첨가 있음), 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM-혈청 없음), 야만(Yamane), IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지(GMEM), 레이보위츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 M199(M199E-얼의 염 베이스 있음), 배지 M 199(M 199H-행크 염 베이스 있음), 최소 필수 배지 이글(MEM-E-얼의 염 베이스 있음), 최소 필수 배지 이글(MEM-H-행크 염 베이스 있음), 및 최소 필수 배지 이글(MEM-NAA 비필수 아미노산들을 가짐)을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 배지는 DMEM이다. 이들 및 기타 유용한 배지는 무엇보다도 GIBCO사(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드) 및 바이올로지칼 인더스트리사 (이스라엘 벧 하멕)으로부터 입수가능하다. 많은 이들 배지는 윌리암 B. 자코비 및 이라 H. 패스탄에 의해 편집되고, 아카데믹 출판사에 의해 출판된 Methods in Enzymology, Volume LVⅢ, "Cell Culture",pp. 62 - 72에 요약되어 있다.

배지는 소 또는 기타 종들의 태아 혈청과 같은 혈청, 및 선택적으로 또는 대안적으로 성장인자, 사이토카인 및 호르몬들(예로, 성장호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식세포 콜로니 자극인자, c-kit 리간드/줄기세포 인자, 오스티오프로테제린 리간드, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 섬유모세포 성장인자, 신경 성장인자, 섬모성 신경영양인자, 혈소판 유래 성장인자, 및 뼈 형태형성 단백질이 피코그램/mL 내지 밀리그램/mL 사이의 수준의 농도들로 보충될 수 있다.

추가적인 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있는 것으로 또한 인식된다. 이러한 성분은 항생제, 항진균제, 알부민, 아미노산들, 및 세포의 배양을 위한 당해 기술분야에 알려진 기타 성분일 수 있다. 추가적으로, 성분은 필요할 때 분화 과정을 증진하도록 첨가될 수 있다(또한 하기를 참조).

유착성 간질세포는 통상적인 이차원의(2D) 배양 조건에 의해 또는 삼차원의(3D) 배양 조건하에서 시험관내 증식될 수 있다. 용어 "이차원 배양" 또는 "2D"는 세포가 조직 배양 접시에서와 같이 한 단편으로 주로 성장하는 배양을 말한다.

일단 유착성 간질세포가 준비되면 그들은 삼차원의 세팅들로 계대된다(다음의 실시예 섹션의 실시예 1을 참조). 세포는 분리 이후 바로(상기 본 명세서에서 언급된 바와 같이) 3D-제작된 기질로 전달될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

용어 "삼차원 배양" 또는 "3D"는 세포 성장에 적합하고 삼차원들에서 세포 대 세포 접촉들을 허용하는 스캐폴드를 포함하는 조건하에서 세포가 배양되는 배양을 말한다.

따라서, 본 발명의 3D 관점의 부착성 물질은 3D 배양을 위해 제작되고 이에 의해 조직(예로, 태반)의 내부구조를 모방하도록 유착성 간질세포의 부착을 위한 사용가능한 부착 표면을 실질적으로 증가시키는 성장 기질을 제공한다.

예를 들면, 높이 0.5 mm의 성장 기질을 위해, 증가는 성장 기질의 기저선 상의 투사에 의해 계산된 적어도 5배로부터 30배까지의 팩터이다. 약 5배 내지 30배의 팩터로 이러한 증가는 단위 층 당이고, 겹치거나 공간체들 등에 의해 분리된 다수의 이러한 층들이 사용된 경우라면, 5배 내지 30배의 팩터가 이러한 구조당 각각 적용된다. 기질이 판 형태로 사용될 때, 이것은 비직조된 섬유판들 또는 개방-공극 발포 중합체들의 판들일 수 있다. 판의 두께는 약 50 내지 1,000 ㎛ 이상일 수 있고, 세포 출입, 영양분의 출입을 위해 그리고 판으로부터 폐기물의 제거를 위해 적당한 공극도가 제공된다. 한 가지 구현예에 따르면, 공극들은 10 ㎛ 내지 100 ㎛의 유효 직경을 가진다. 이러한 판들은 다양한 두께들의 섬유들로부터 제조될 수 있다. 일정 구현예에서, 섬유 두께 또는 섬유 직경은 0.5 ㎛로부터 20 μm까지의 범위이다. 예를 들면, 섬유들은 직경 10 ㎛ 내지 15 ㎛의 범위일 수 있다.

본 발명의 구조들은 차원적 안정성 및 물리적 강도를 제공하는 공극성 지지 판 또는 스크린에 의해 지지되거나 이와 결합될 수 있다. 이러한 기질 판들은 또한 동일한 크기의 두께(약 50 내지 1,000 ㎛)로 약 0.2 mm² 내지 약 10 mm²의 크기의 투사된 면적을 가진 입자을 제공하도록 잘리거나, 뚫리거나, 찢어질 수도 있다.

부착성 표면은 사각형, 원형, 디스크형, 및 십자가형로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모양을 가질 수 있다. 일정 구현예에서, 배양은 3D 생물배양기에서 효과를 낸다.

이러한 생물반응기들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 플러그 유동 생물반응기, 연속 교반된 탱크 생물반응기 및 정지-베드 생물반응기를 포함한다. 실시예 섹션의 실시예 1에서 나타난 바와 같이, 삼차원의(3D) 플러그 유동 생물반응기(미국 특허 제6,911,201호에서 기술된 바와 같음)는 유착성 간질세포의 성장 및 연장된 유지를 지지할 수 있다. 이러한 생물배양기에서, 유착성 간질세포는 유리 컬럼에 충전된, 비직조된 섬유 기질의 폴리에스테르로 만들어진 공극성 담체 상에 접종되고, 이에 의해 상대적으로 작은 부피에 많은 세포 수의 증식을 가능하게 한다.

다른 3D 생물반응기들이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적 예는 연속 교반된 탱크 생물반응기이고, 여기에서 배양 배지는 생물반응기 내로 연속적으로 주입되고 산물은 연속적으로 배출되어, 생물반응기 내에서 시간-연속적인 안정 상태를 유지한다. 섬유성 베드 용기를 가진 교반된 탱크 생물반응기는 예를 들면 뉴브룬스윅 사이언티픽사(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 입수가능하다. 다른 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 정지-베드 생물반응기, 공기-리프트 생물반응기,(여기에서 공기는 전형적으로 상승하는 중앙 통풍 튜브의 바닥 내에 주입되고, 컬럼의 상부에서는 거품을 형성에 이어 배출 기체를 방출한다), 중합활성 발포체를 가진 세포 접종 관류 생물반응기(Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, 2003에 기술된 바와 같음), 및 방사-유동 관류 생물반응기에 있는 튜브형 폴리-L 락트산(PLLA) 공극성 스캐폴드들(Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954, 2006에서 기술된 바와 같음) 을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 생물반응기들은 미국 특허 제6,277,151호, 제6,197,575호, 제6,139,578호, 제6,132,463호, 제5,902,741호 및 제5,629,186호에 기술된다.

생물반응기에서 사용된 기질은, 예를 들면 판의 형태일 수 있다. 이러한 판은 비직조된 섬유판, 또는 개방-공극 중합체들의 판일 수 있다. 판의 두께는, 일정 구현예에서 약 50부터 1,000 ㎛ 이상까지 일 수 있고, 세포 출입, 영양분의 출입을 위해 그리고 판으로부터 폐기물의 제거를 위해 적당한 공극도가 제공된다.

일정 구현예에서, 세포 접종은 접종 시 100,000 내지 1,500,000개 세포/mm이 효과를 낸다.

일정 구현예에서, 세포는 일단 미조절된 분화 및 노화를 피하면서 일단 적어도 약 40% 충만도, 60% 충만도 또는 80% 충만도에 도달하면 수확된다.

일정 구현예에서, 배양은 적어도 약 2일, 3일, 5일, 10일, 20일, 1개월 또는 심지어 그 이상 동안 효과를 낸다. 생물반응기에서는 배양이 이러한 기간을 연장시킬 수 있는 점이 이해될 것이다. 계대도 역시 세포수를 증가시키도록 효과를 낼 수 있다.

본 발명의 세포는 유착성 간질세포(ASC)이다. 따라서 예를 들면, 세포는 방추형 모양을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로 세포는 유착성 간질세포에 전형적인 마커 또는 마커의 집합(예로, 표면 마커)을 발현할 수 있다. 유착성 간질세포 표면 마커(양성 및 음성)의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CDllB-, CDl4-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, 및 FMC7-을 포함한다. 기타 유착성 간질세포 마커는 이에 제한되는 것은 아니지만 타이로신 하이드록실라제, 네스틴 및 H-NF을 포함한다.

유착성 간질세포의 전형적인 기능적 표현형의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 T 세포 억제 활성(T 세포를 자극하지 않고 반대로 이를 억제함) 및 조혈 줄기세포 지지 활성을 포함한다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포는 분화하지 않는다. 대안의 구현예에서, 세포는 하나 이상의 지방형성, 간형성, 뼈형성 및 신경형성 분화 잠재력을 소유하지만 세포가 이들 잠재력 모두를 소유하지는 않는다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 뼈형성 분화 잠재력을 소유하지 않는다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 신경형성 분화 잠재력을 소유하지 않는다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 세 가지 생식층들 모두의 세포로 분화하지는 않는다. 임의의 이들 구조적 또는 기능적 특징은 본 발명의 세포를 정성분석하는 데 사용될 수 있다(다음의 실시예 섹션의 실시예 1 및 2를 참조).

본 발명의 유착성 간질세포과는 대조적으로, 중간엽 줄기(간질) 세포는 골모, 지방형성, 및 연골형성 분화를 모두 할 수 있는 유착성 세포가다(Dominici et al., Cytotherapy 8(4): 315-17, 2006). 이에 따라, 본 발명의 일정의 다양한 양태 및 구현예에서, 용어 "유착성 간질세포" 또는 "ASC"는 중간엽 줄기(간질) 세포를 배제한다.

다른 곳에서 주목된 바와 같이, ASC는 이에 제한되는 것은 아니지만 태반, 지방 조직, 및 골수를 포함하는 다양한 조직 출처들로부터 제조될 수 있다. 세포가 3D 배양으로 성장될 때, 그들은 "3D-ASC"라고 언급된다. 세포가 3D 배양으로 생산된 태반의 ASC일 때, 그들은 "PLX" 세포라고도 역시 언급될 수 있다.

일정 구현예에서, 본 교시에 따른 세포의 군집들은 실시예 섹션의 실시예 1에서 나타낸 바와 같은 독특한 단백질 발현 프로파일을 특징으로 한다. 따라서 예를 들면, 본 교시에 따라 생성된 태반, 지방 조직, 또는 골수의 유착성 간질세포는 선택된 인자의 높은 수준을 발현하고/하거나 분비할 수 있다. 예를 들면, 이러한 세포는 SCF, Flt-3, H2AF 또는 ALDH X를 2D 배양에서 성장된 태반, 지방 조직, 또는 골수의 유착성 간질세포에 의해 발현되거나 분비되는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 심지어 12배로 높게 발현하거나 분비한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 세포의 군집은 IL-6, EEEF2, RCN2 또는 CNN1을 2D 배양에서 성장된 태반, 지방 조직, 또는 골수의 유착성 간질세포에 의해 발현되거나 분비되는 것보다 적어도 2, 3, 또는 5배 높은 수준으로 분비하거나 발현한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 세포의 군집은 2D 배양된 세포과 비교 시 다양한 기타 단백질의 더 낮은 발현을 특징으로 한다. 따라서 예를 들면, 2D 배양에서 성장된 태반, 지방 조직, 또는 골수의 유착성 간질세포에 의해 발현되거나 분비된 Hnrphl, CD44 항원 이소형2 전구체, Papss2 또는 rpL 7a의 발현 수준의 0.6, 0.5, 0.25, 또는 0.125배 미만으로 분비하거나 발현한다.

일정 구현예에서, 3D 조건하의 배양에 의해 생산된 태반의 유착성 간질세포의 분리된 군집은 이소형 대조군과 대비하여 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 미만으로 마커 CD200에 대해 양성이다. 일정 구현예에서, 3D 조건하의 배양에 의해 생산된 유착성 간질세포의 분리된 군집은 이소형 대조군과 대비하여 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 미만으로 마커 HLA-G에 대해 양성이다. 일정 구현예에서, 3D 조건하의 배양에 의해 생산된 태반의 유착성 간질세포의 분리된 군집은 이소형 대조군과 대비하여 면역형광법에 의해 검출된 바와 같이 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 미만으로 마커 OCT-4에 대해 양성이다.

본 발명을 실행하면서, 본 발명자은 유착성 간질세포, 상세하게는 3D 배양된 유착성 간질세포(3D-ASC)이 면역억제 활성을 보여주었던 점을 밝혔다. 다음의 실시예 섹션의 실시예 2에서 나타낸 바와 같이, 유착성 간질세포, 상세하게는 3D-ASC가 MLR 검정법에서 인간 제대혈 단핵세포의 면역 반응을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 세포는 병원에서 선호적으로 사용될 수 있는 생물학적 활성들을 포함할 수 있다(예로, T 세포 억제 활성, 조혈 줄기세포 지지체 활성).

세포의 조정된 배지도 역시 병원에서 선호적으로 사용될 수 있는 생물학적 활성들을 포함할 수 있다(예로, T 세포 억제 활성, 조혈 줄기세포 지지체 활성).

따라서, 본 발명은 또한 조정된 배지의 수집 및 그의 용도 또는 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용한 농축, 강화 또는 분획화의 후속 심화 단계들을 착상한다. 일정 구현예에서, 본 발명의 조정된 배지는 높은 생존도의 세포의 중간-로그 배양으로부터 획득된다.

상기 본 명세서에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 세포 및 조정된 배지는 적어도 하나의 유착성 간질세포 표현형을 특징으로 하고, 이와 같이 이러한 세포의 사용으로부터 유익이 될 수 있는 임의의 연구 및 임상적 적용에 사용될 수 있다. 하나의 이러한 예시적인 적용의 하나는 조혈 줄기세포(HSC) 지지체를 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "줄기세포"는 자가-재생할 수 있고 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는(즉, 중복성의(multipotent)) 세포를 말한다. "조혈 줄기세포"(HSC)는, 예를 들면 제대혈(CB) 또는 골수(BM)로부터 유래될 수 있는 줄기세포이다. HSC는 복수의 혈액 세포 유형로 분화할 수 있다. 향후, 배아 줄기세포로부터와 같은 다른 출처들로부터 HSC를 유래하는 것이 가능할 수 있다.

이식된 HSC에 의한 접목 및 조혈작용의 개시는 내피세포 장벽을 가로지르는 케모카인의 구배에 이어서 골수로의 귀소 그리고 이식된 세포, ECM 및 소와들의 중간엽 세포 간의 물리적 접촉들을 확립하면서, 적당한 소와들에 정착을 포함하는 복잡한 과정들에 의존한다. 이들 과정들 모두는 사이토카인, 호르몬들, 스테로이드들, 세포외 기질 단백질, 성장인자, 세포-대-세포 상호작용 및 부착 단백질 및 기질 단백질과 같은 분자의 복잡한 배열이 관여한다.

수혈된 HSC의 1 내지 5%만이 이식 이후 2 내지 3일째 수여자의 BM에서 검출되는 것으로 알려져 있다(Kerre et al, J. Immunol. 167:3692-8, 2001); Jetmore et al., Blood 99: 1585-93, 2002). 조혈성 접목에 중간엽 줄기세포(MSC)의 기여는 부분적으로 이식편 대 숙주병을 유발하는 공여자 유래된 T 세포 생산의 저해에 의하고(GvHD, Charbord P., and Moore, K., Ann. KY. Acad. ScL 1044: 159-167, 2005; Maitra B, et al., Bone Marrow Transplant. 33(6): 597-604, 2004; 미국 특허 제6,010,696호; 제6555374호); 그리고 부분적으로는 조혈 줄기세포(HSC) 지지체를 제공하는 것(즉, 조혈 줄기세포의 증식, 성숙 및/또는 귀소를 유지하고 돕는 것)에 의한다. 이론에 얽매이지 않더라도, 본 발명의 유착성 간질세포가 손상된 내인성 조혈 체계를 가진 환자에서 적어도 부분적으로 MSC의 기작과 유사한 기작들에 의해 그들의 유익한 효과를 매개하는 것이 가능하다.

다음의 실시예 섹션에서 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 태반 및 지방 조직-유래된 유착성 간질세포는 화학요법 또는 방사선 조사 이후에도 HSC 접목을 지지하는 것으로 확인되었다. 따라서 골수와 같은 다른 출처들로부터 얻은 유착성 간질세포도 역시 HSC 접목을 잠재적으로 지지한다.

이들 결과가 주어졌기 때문에, 본 발명의 세포 또는 배지는 줄기세포 이식이 사용되는 임의의 임상적 적용에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면 이의 필요가 있는 개체에서 유착성 간질세포 이식으로부터 유익이 될 수 있는 의학적 병태(예로, 병리학, 질환, 증후군)를 치료하는 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 병리학의 발생을 저해하거나 정지시키고/시키거나 병리학의 감소, 소강 또는 퇴행을 유도하는 것을 말한다. 당업자이라면 다양한 방법론들 및 검정법이 병리학의 발생을 접근하는 데 사용될 수 있고, 유사하게 다양한 방법론들 및 검정법이 병리학의 감소, 소강 또는 퇴행을 접근하는 데 사용될 수 있는 점을 이해할 것이다. 용어 "치료하는"은 암성 질환과 연관된 증상을 완화하거나 감소시키는 것을 말한다. 한 가지 구현예에서, 치료하는 것은 의학적 병태와 연관된 증상을 치유하고, 예로 실질적으로 제거한다. 치유가 의도된 최종 결과라고 특정되지 않은 경우라면, "치료하는"는 개체를 "치유하는" 것을 요구하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "유착성 간질세포 이식으로부터 유익이 될 수 있는 의학적 병태"는 본 발명의 세포/배지의 투여에 의해 완화될 수 있는 임의의 의학적 병태를 말한다.

용어 또는 어구 "이식"은 개체에게 세포의 도입을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체"는 임의의 개체(예로, 포유동물), 예를 들면 인간 개체를 말한다.

본 발명의 본 양태의 방법은 개체에게 (본 명세서에 기술된 바와 같은)본 발명의 세포 또는 배지의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 개체의 유착성 간질세포 이식으로부터 유익이 될 수 있는 의학적 병태를 치료한다.

본 발명의 본 양태에 따라 투여될 수 있는 세포는 이차원 또는 삼차원적 세팅들 둘 중 하나로 배양될 수 있는 상기-기술된 유착성 간질세포를 포함한다.

대안의 구현예에서, 줄기세포의 중간엽 및 비중간엽의 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 유도체들은 유착성 간질세포과 조합하여 사용될 수 있다. 줄기세포로부터 특이적 세포 계열을 유도하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,486,359호, 제5,942,225호, 제5,736,396호, 제5,908,784호 및 제5,902,741호를 참조한다. 세포는 고유적이거나 관심 있는 계열을 유도하도록 유전적으로 변형될 수 있다(미국 특허출원 제20030219423호를 참조한다).

본 발명의 세포 및 배지는 신선하거나 냉동된(예로, 동결건조-보존된) 제조물의 자가유래 또는 비-자가유래(예로, 동종이형 또는 이종의) 출처일 수 있다.

의학적 병태에 의존하여, 개체는 추가적인 화학적 약물(예로, 면역조정, 화학요법 등) 또는 세포를 투여받을 수 있다.

따라서, 예를 들면 줄기세포 접목을 개선하기 위해(예로, 수여자 BM에서 생존가능한 HSC의 수를 증가시키고 선택적으로 정상적인 백혈구 계수를 개선하는 것) 본 발명의 세포/배지는 HSC 이식 이전에, 이와 동시에 또는 이를 이어서 투여될 수 있다.

일정 구현예에서, HSC 및 유착성 간질세포는 공통적인 HLA 항원들을 공유하지 않는다. 다른 구현예에서, HSC 및 유착성 간질세포는 공통적인 HLA 항원들을 공유한다.

일정 구현예에서, HSC 및 유착성 간질세포는 단일한 개인으로부터 나온다. 대안적으로, HSC 및 유착성 간질세포는 서로 다른 개인로부터 나온다.

일정 구현예에서, 수여자 BM에서 생존가능한 HSC의 수는 유착성 간질세포/배지가 내인성 HSC의 사망을 경감하기 때문에 적어도 부분적으로 증가된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수여자 BM에서 생존가능한 HSC의 수는 본 발명의 세포/배지의 투여에 이어서 수여자의 내인성 세포의 확장 때문에 적어도 부분적으로 증가된다.

놀랍게도 본 명세서에서 기술된 유착성 간질세포, 예를 들면 3D-유착성 간질세포가 소정의 경우들에서 필요가 있는 수여자의 내인성 조혈 체계의 재군집을 증진하고 지지하는 데 중요한 자극성 역할을 할 수 있는 점이 확인되어 왔다. 유착성 간질세포의 면역결핍 또는 면역 손상된 개체에게 투여는 증가된 내인성 조혈작용을 유도하였다. 따라서, 하기 결과 및 연구들은 유착성 간질세포를 내인성 조혈 체계를 재건하는 것을 포함하는 지금 확인된 그들의 면역학적 성질들을 위해 사용하는 것의 추가적인 임상적 유익들을 제공한다.

개시된 3D 유착성 간질세포(3D-ASC)의 두 가지 속성들은 그들을 특히 핵 시설의 사고 또는 테러주의자 공격과 같은 큰 재해에 의해 초래될 수 있는 집단에서 방사선 노출의 대량 치료에 적당하도록 만든다. 먼저, 개시된 방법 및 3D 생물반응기로 생산된 3D-ASC 세포의 낮은 면역원성은 노출 직후의 기간 동안 투여된 세포를 특이적으로 환자과 개별적으로 매칭 없이, 모든 환자을 위해 동일한 유형의 세포를 사용하는 것을 허용한다. 둘째, 3D 생물반응기는 3D-ASC 세포의 대량 생산을 허용하고, 이에 의해 대규모 치료를 가능하게 하는 충분한 양의 세포를 제공한다.

실시예에서 나타낸 바와 같이, 내인성 조혈작용은 3D-ASC 및 PLX 세포를 포함하는 ASC의 투여에 의해 유도된다. 실시예에서, 내인성 CD45의 발현은 내인성 조혈세포 증식 및/또는 재군집의 상승조절을 가리키는 급격한 증가를 보여준다.

수여자에게 미치는 이러는 조혈작용-촉진 효과는, 제대혈 또는 HSC와의 공동-이식 없이도 일어나는 3D-ASC 및 PLX를 포함하는 이들 ASC의 미인식된 기능이다.

따라서, 다른 곳에서 더 자세하게 기술된 바와 같이, 3D-ASC 및 PLX를 포함하는 유착성 간질세포는, 예를 들면 급성 방사선병을 경감하도록 면역 결핍 개체들 또는 수여자을 치료하는 데 사용될 수 있다. 상세하게, 개체들(또는 수여자)은 치사 또는 치사-이하 방사선 조사에 노출되었던 개체들일 수 있다. 게다가, 개체들(또는 수여자)은 화학요법으로 미리 치료된 개체들일 수 있다.

3D-ASC 및 PLX를 포함하는 유착성 간질세포의 투여는 방사선 및 화학요법에 이어서 조혈 회복을 개선하도록 지지적 치료로서 작용할 수 있다. 3D-유착성 간질세포의 조혈 줄기 및/또는 전구체 회복을 증진하는 능력은 조혈세포의 자가-재생 및 증식 능력을 개선할 수 있는 HSC 지지성 사이토카인을 분비하는 3D-유착성 간질세포 능력으로부터 또는 이들 세포의 HSC의 증식을 위해 필요한 손상된 조혈 미세환경을 재건하는 능력으로부터 유도될 수 있다.

유착성 간질세포의 내인성 조혈 체계를 재-군집화하는 치료로서의 사용은 골수(BM) 세포 및 인간 제대혈(HUCB) 세포를 이식하는 데 유망한 장점들을 보여준다. 일반적으로, 유착성 간질세포는 조직형 분석 및 수여자와의 매칭을 요구하지 않는다. 대조적으로, BM 및 HUCB는 그들의 사용가능성을 실질적으로 제한하는 조직 매칭을 요구한다. 게다가, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 유착성 간질세포는 대량 생산되고 세포의 지속가능한 출처를 제공할 수 있다.

보다 자세하게 하기 기술되는 바와 같이, 본 발명의 세포/배지도 역시 HSC 이식 없이 투여되고 수여자 BM에서 생존가능한 HSC의 수의 증가에 보다 효과를 줄 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 세포/배지는 외인성 조혈 줄기세포가 개체에게 투여되지 않더라도, 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체에게 투여될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 세포/배지는 외인성 조혈 줄기세포가 개체에게 투여되지 않더라도, 화학요법의 효과를 경감하도록 화학요법을 받은 개체에게 투여될 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 한 가지 양태에서 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 본 양태의 일정 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 개체에게 투여되지 않는다.

보다 또 다른 양태에서, 본 발명은 화학요법의 효과를 경감하도록 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법을 받은 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 본 양태의 일정 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 개체에게 투여되지 않는다.

보다 또 다른 양태에서, 본 발명은 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하기 위해/위하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 개체에게 유착성 세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 양태의 일정 구현예에서, 외인성 조혈 줄기세포는 개체에게 투여되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어들 "내인성", "내인성 조혈세포(들)" 또는 "내인성 조혈 체계"는 자연적으로 발견되거나 수여자 포유동물, 인간(즉, 치료된 개체); 유착성 간질세포로 치료되고 있는 수여자 내에서 기원하는 조혈세포를 말한다. 이들 조혈세포는 수여자 포유동물 신체 내에서 자연적으로 발견되거나 기원하고 수여자 신체에 의해 생산되고, 즉 그들은 외인성 조혈세포가 아니다.

일정 구현예에서, 이들 유착성 간질세포는 본 명세서에서 개시된 임의의 유착성 간질세포일 수 있다. 예를 들면, 유착성 간질세포는 태반, 지방 조직, 또는 골수로부터 얻을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성", "외인성 출처" 또는 "외인성 공여자"는 수여자 또는 달리 치료된 개체의 측면에서 외부 출처로부터 기원하는 세포를 말한다. 다시 말하면, 외인성 세포는 수여자 개체가 아닌 공여자로부터 유래된 세포이다.

일정 구현예에서, 외인성 유착성 간질세포는 동종이형 또는 이종의 공여자(들)로부터 획득된다. 일정 구현예에서, 유착성 간질세포는 동종이형 또는 이종의 HSC 이식 없이 투여된다. 일정 구현예에서, 유착성 간질세포는 내인성 조혈 체계의 재건 또는 재군집을 위한 일차적인 치료로서 투여된다.

일반적으로 세포/조직이 수여자에 대해 내인성인지 외인성인지 여부는 세포/조직의 초기 출처가 수여자(내인성)인지 또는 또 다른 출처(외인성)인지 여부가 알려질 것이기 때문에 바로 명확해질 것이다. 그럼에도 불구하고, 세포 또는 조직이 수여자의 측면에서 내인성인지 또는 외인성인지 여부도 역시 유전자형 분석에 의해 결정될 수 있다. 용어 "유전자형"은 개인 또는 세포에서 한 쌍의 자가유래 염색체들 상의 좌위에 있는 한 벌의 하나 이상의 다형성 부위들에서 확인되는 뉴클레오타이드 쌍들의 5' 내지 3' 서열을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 유전자형은 전체 유전자형을 포함한다. 비-제한적인 설명을 하자면, 전체 유전자형이라는 용어는 수여자 개인에서 한 쌍의 자가유래 염색체들의 다수의 다형성 부위들에서 확인되는 뉴클레오타이드 쌍들의 서열을 포함한다.

용어 "방사선 조사"는 수여자 포유동물, 인간, 또는 치료된 개체의 방사선에 대한 노출의 상황 또는 병태를 말한다. 일정 구현예에서, 방사선은 이온화 방사선이다. 다른 구현예에서, 방사선은 비-이온화 방사선이다. 방사선은 전자기 방사선을 포함하고, 이는 X-선들 및/또는 감마선들을 포함한다. 용어 방사선은 방사성 방사선도 역시 포괄한다. 본 용어는 방사성 요소들의 붕괴로부터 유발된 방사선을 포괄한다.

일정 구현예에서, 방사선은 이온화 방사선이다. 일정 구현예에서, 이온화 방사선은 임상적 이온화 방사선이고; 다시 말하면, 암 또는 종양의 치료와 같은 적어도 하나의 치료적 목적을 위해 병원 또는 의원에서 생산된 이온화 방사선이다. 또 다른 구현예에서, 이온화 방사선은 방사성 동위원소로부터 나온다. 또 다른 구현예에서, 방사선은 핵 분열 또는 융합으로부터 나온다.

한 가지 구현예에서, 방사선은 태양 방사선이 아니다.

용어 "방사선 조사된" 수여자 포유동물, 인간, 또는 개체를 방사선에 대해 노출되었던 수여자, 포유동물, 인간, 또는 개체를 말한다. 방사선 조사의 효과은 하기에 기술된 것들과 같은 여러 방식 중 임의로 나타날 수 있다. 일정 구현예에서, 방사선 조사는 내인성 조혈 체계를 손상시키는 방사선에 대한 노출을 의미한다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 감소된 조혈세포 계수 또는 수에 의해 나타난다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 CD45+를 발현하는 내인성 조혈세포의 감소된 수에 의해 나타난다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 혈소판의 감소된 수에 의해 나타난다. 이들 구현예에서, 개체는 출혈을 나타낼 수 있다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 적혈구 세포의 감소된 수에 의해 나타난다. 이들 구현예에서, 개체는 빈혈을 나타낼 수 있다.

일정 구현예에서, 방사선 조사는 위창자 증상을 생산하는 방사선에 대한 노출을 의미한다. 이들 구현예에서, 위창자 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 멀미, 구토, 식욕 감소, 또는 복통의 하나 이상을 포함한다.

일정 구현예에서, 방사선 조사는 신경학적 증상을 생산하는 방사선에 대한 노출을 의미한다. 이들 구현예에서, 신경학적 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 현기증, 두통, 또는 의식 수준의 감소의 하나 이상을 포함한다.

일정 구현예에서, 방사선 조사는 피부 증상을 생산하는 방사선에 대한 노출을 의미한다. 이들 구현예에서, 피부 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 발적, 수포형성, 궤양, 탈모, 손상된 피지샘 및/또는 땀샘, 위측증, 섬유종, 감소된 또는 증가된 피부 색소침착, 또는 괴사를 포함한다.

방사선은 개체에서 방사선이 또한 의도되거나 심지어 유익한 효과도 생산하는지를 막론하고, 하나 이상의 손상된 조혈 체계, 위창자 증상, 또는 신경학적 증상과 같은 원치않는 하나 이상의 효과를 유발할 때 "해로운" 것이다. 이에 따라, 해로운 방사선 조사는 암 치료법에서 사용되는 바와 같은 치료적 방사선 조사를 포괄한다.

용어 "화학적 노출"은 수여자 포유동물, 인간, 또는 개체의 내인성 조혈 체계를 손상시키는 임의의 세포독성 물질에 대한 노출을 포괄한다. 화학적 노출의 한 가지 예는 "화학요법"이다. 일정 구현예에서, 화학요법은 수여자 포유동물, 인간, 또는 치료된 개체의 세포독성 치료 요법을 포괄한다. 따라서 한 가지 구현예에서, 화학요법은 암을 치료하는 데 사용되는 항-종양성 약물 또는 화합물, 또는 이들 약물의 조합을 말한다. 일정 구현예에서, 수여자 포유동물, 인간, 또는 개체는 방사선 요법에 추가하여 화학요법을 받는다. 다른 구현예에서, 수여자 포유동물, 인간, 또는 개체는 테러주의자 공격에서, 화학 시설 또는 연구 실험실에서의 사고, 화학물질의 운반에서의 사고, 또는 기타 우연한 노출에서 일어날 수 있는 바와 같이, 임상적 설정의 외부의 해로운 화학물질에 노출된다. 일정 구현예에서, 수여자 포유동물, 인간, 또는 치료된 개체의 내인성 조혈 체계에 대한 손상은 그들의 독성 성질들에 대한 화학적 전쟁으로서 사용된 화학적 물질(들)인 세포독성 물질에 대한 노출에 의해 유발된다.

화학적 노출 또는 화학요법의 효과은 여러 방식들 중 임의로 나타날 수 있다. 일정 구현예에서, 조혈 체계에 대한 손상은 감소된 조혈세포 계수 또는 수에 의해 나타난다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 CD45+를 발현하는 내인성 조혈세포의 감소된 수에 의해 나타난다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 혈소판의 감소된 수에 의해 나타난다. 이들 구현예에서, 개체는 출혈을 나타낼 수 있다. 일정 구현예에서, 손상된 조혈 체계는 적혈구 세포의 감소된 수에 의해 나타난다. 이들 구현예에서, 개체는 빈혈을 나타낼 수 있다.

일정 구현예에서, 화학요법은 위창자 증상을 생산한다. 이들 구현예에서, 위창자 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 멀미, 구토, 식욕 감소, 또는 복통의 하나 이상을 포함한다.

일정 구현예에서, 화학요법은 신경학적 증상을 생산한다. 이들 구현예에서, 신경학적 증상은 이에 제한되는 것은 아니지만 현기증, 두통, 또는 의식 수준의 감소의 하나 이상을 포함한다.

용어 "손상된 내인성 조혈 체계"는 유착성 간질세포 투여(또는 치료)로부터 유익을 얻을 수 있는 병태를 의미한다. 비-제한적인 예로서, 병태는 내인성 조혈 체계의 재군집 및/또는 촉진을 요구한다. 또 다른 비-제한적인 예로는 치료된 개체의 BM에서 적은 수의 조혈세포(CD45를 발현하는 세포)을 포함하는 병태를 포함한다. 숙련된 의사라면 조혈세포의 감소된 수를 조혈세포의 정상적인 수준과 대비하여 결정하는 것을 알고 있을 것이다.

용어 또는 어구 "이식"은 개체에게 세포의 도입을 말한다. 세포는 수여자로부터 또는 동종이형 또는 이종의 공여자로부터 유래될 수 있다.

일정 구현예에서, 개체는 비-자가유래 세포의 거부를 피하도록 더 치료될 것이다. 이들 치료들은 이식 이전에 수여자 면역 체계를 억제하는 단계 또는 면역분리하는 반투과성 막들로 비-자가유래 세포를 피막화하는 단계 둘 중 하나를 포함할 수 있다.

피막화 기법은 일반적으로 작은 구형 소포들이 관여하는 미세피막화 및 더 큰 편평-판 및 빈-섬유 막들이 관여하는 거대피막화로서 분류될 수 있다(Uludag, H. et al., Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv. Rev. 2000, 42: 29-64).

미세캡슐을 제조하는 방법이 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면 LuMZ, et al., 알기네이트 및 알파-페녹시시나밀리덴-아세틸화된 폴리(알릴아민)로의 세포 피막화, Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM. and Prakash S. 효소들, 세포 및 유전적으로 조작된 미생물의 미세피막화를 위한 절차, Mol. Biotechnol., 2001, 17: 249-60, 그리고 LuMZ, et al., 광민감성 폴리(알릴아민 알파-시아노시나밀리덴아세테이트)를 사용한 새로운 세포 피막화 방법, J. Microencapsul. 2000, 17: 245-51에 개시된 것들을 포함한다.

예를 들면, 미세캡슐은 2-하이드록시에틸 메틸아크릴레이트(HEMA), 메타아크릴산(MAA) 및 메틸 메타크릴레이트(MMA)의 터르-중합체 껍질과 변형된 콜라겐을 복합화하고 2 내지 5 ㎛의 캡슐 두께를 유도하여 제조된다. 이러한 미세캡슐은 음성 전하를 가진 민무늬 표면을 부여하고 혈장 단백질 흡수를 최소화하기 위하여 추가적인 2 내지 5 ㎛ 터르-중합체 껍질들로 더 피막화될 수 있다(Chia, S.M. et al. Multi-layeredmicrocapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

기타 미세캡슐은 해양 다당류인 알기네이트 또는 그의 유도체들을 기초로 한다(Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8). 예를 들면, 미세캡슐은 염화칼슘의 존재 시 다중양이온 폴리(메틸렌-co-구아니딘) 염산과 다중음이온들인 소듐 알기네이트 및 소듐 셀룰로스 설페이트 간의 다중전해질 복합화에 의해 제조될 수 있다.

세포 피막화는 더 작은 캡슐들이 사용될 때 개선되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 피막화된 세포의 정성적 관리, 기계적 안정성, 확산 성질들, 및 시험관내 활성들은 캡슐 크기가 1 mm로부터 400 ㎛까지 감소되었을 때 개선되었다(Canaple L. et al, Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002, 13: 783-96). 게다가, 7 nm 정도의 잘-조절된 공극 크기, 맞춤 표면 화학들 및 정확한 미세구조들을 가진 나노공극성 바이오캡슐들이 세포를 위한 미세환경들을 성공적으로 면역분리하는 것으로 확인되었다(Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin BioI Ther. 2002, 2: 633-46).

면역억제성 제제의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 메토트렉세이트, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 사이클로스포린 A, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진(설파살라조피린), 골드 염들, D-페니실라민, 레플루노마이드, 아자티오프린, 아나킨라(anakinra), 인플릭시마브(REMICADE), 에타너셉트(etanercept), TNF 알파 차단제, 염증성 사이토카인을 표적하는 생물학적 제제, 및 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)을 포함한다. NSAID의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 아세틸 살리실산, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 디풀루니살(diflunisal), 마그네슘 살리실레이트, 살살레이트(salsalate), 소듐 살리실레이트, 디클로페낙(diclofenac), 에토도락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토로락(ketorolac), 메크로페나메이트(meclofenamate), 나프록센(naproxen), 나부메톤(nabumetone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 아세타미노펜(acetaminophen), 이부프로펜(ibuprofen), Cox-2 저해제 및 트라마돌(tramadol)을 포함한다.

본 명세서에서 기술된 일정 방법에서, 세포 또는 배지는 그 자체로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 약제학적 조성물의 일부 둘 중 하나로서 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적 조성물"은 약제학적으로 적합한 담체 및 부형제과 같은 기타 화학적 성분을 가진 본 명세서에서 기술된 화학적 결합체들의 하나 이상의 제조물을 말한다. 약제학적 조성물의 목적은 개체에게 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

이하 본 명세서에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 개체에게 유의한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 성질들을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 담체의 예들로는, 제한되지 않지만 프로필렌 글리콜, 식염수, 에멀전들 및 물과 유기용매들의 혼합물이 있다.

본 명세서에서 용어 "부형제"는 화합물의 투여를 더 용이하게 하도록 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예들로는, 제한되지 않지만 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당들 및 전분의 유형, 셀룰로스 유도체들, 젤라틴, 식물성 오일들 및 폴리에틸렌 글리콜들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 약제학적 담체는 식염수의 수용성 용액이다.

약물의 제형화 및 투여를 위한 기법은 "레밍턴의 약제학적 과학들" Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 확인될 수 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

약제학적 조성물은 전신적 방식으로 투여할 수 있다(본 명세서에서 상술된 바와 같음). 대안적으로, 약제학적 조성물을 국소적으로, 예를 들면 환자의 조직 부위 내로 직접적으로 약제학적 조성물의 주사를 통해 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 기술분야에서 잘 알려진 공정들에 의해, 예로 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀전화, 피막화, 포획화 또는 동결건조 공정들에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 용도를 위한 약제학적 조성물은 따라서, 활성 성분의 약제학적으로 사용될 수 있는 제조물 내로 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.

주사를 위해, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용성 용액들로, 예를 들면 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액들로 제형화될 수 있다. 경점막 투여를 위해, 투과될 장벽에 적당한 침투제가 제형물에 사용될 수 있다. 이러한 침투제은 당분야에 일반적으로 알려져 있다.

본 발명의 방법을 사용한 임의의 제조물에 대한, 치료적 유효량 또는 용량은 처음에 시험관내 및 세포 배양 검정법로부터 추정될 수 있다. 용량은 일반적으로 원하는 농도 또는 역가를 달성하도록 동물 모델에서 제형화된다. 이러한 정보는 인간들에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 기술된 활성 성분의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 시험적 동물에서 시험관내 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다.

이들 시험관내 및 세포 배양 검정법로부터 획득된 데이타 및 동물 연구들은 인간에서의 사용을 위한 용량의 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 용량은 채용된 용량 형태 및 사용된 투여의 경로에 의존하여 다양화할 수 있다. 정확한 제형, 투여의 경로 및 용량은 환자의 병태의 견지에서 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예로, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l을 참조한다). 예를 들면, 화학요법 환자는 치료에 대한 양성 반응을 가리키는 개선된 위창자 증상을 위해 증상적으로 감시될 수 있다.

주사를 위해, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용성 용액들로, 예를 들면 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액들로 제형화될 수 있다.

투여 용량 및 간격은 이식된 세포에 의한 신경전달물질 합성을 효과적으로 조절하기에 충분한 활성 성분의 수준으로 개별적으로 조절될 수 있다. 원하는 효과를 달성하는 데 필요한 용량은 개인적 특징 및 투여의 경로에 의존할 것이다. 검출 검정법이 혈장 농도들을 결정하는 데 사용될 수 있다.

치료될 병태의 중증도 및 반응성에 의존하여, 용량 투여(dosing)는 수일로부터 수주까지 또는 질환 상태의 축소가 달성될 때까지 지속되는 치료의 과정으로 단일 또는 다수의 투여일 수 있다.

일정 구현예에서, 본 발명의 세포 또는 배지는 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 경막내, 또는 흡입에 투여될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 근육내 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 세포 또는 배지는 단 한 번 투여될 수 있거나, 그들은 적어도 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 또는 열 번 이상까지 투여될 수 있다. 복수의 투여의 경우에, 개별적 투여는 모두 동일한 경로를 통할 수 있거나, 투여의 서로 다른 경로들이 치료법의 과정 동안 서로 다른 투여를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 세포 또는 배지는 방사선 또는 화학물질에 대한 노출의 측면에서 시점들의 이전에, 동안, 이후에 또는 조합으로 투여될 수 있다. 투여가 적어도 두 번의 투여를 포함할 때, 각각의 투여는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 간격일 수 있다. 대안적으로, 각각의 투여는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 간격일 수 있다.

용량 투여는 방사선 또는 화학물질에 대한 노출일에 개시될 수 있다. 용량 투여는 노출에 이어서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일째 시작할 수 있다. 용량 투여는 방사선 또는 화학물질에 대한 노출이 진행 중일 때 계속될 수 있다. 일정 구현예에서, 용량 투여는 노출 이전 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일째에, 예를 들면 방사선요법 또는 화학요법 스케줄 이전에 시작할 수 있다. 용량 투여가 노출 이전에 시작할 때, 이것은 위에서 주목된 바와 같이 노출일에 또는 노출에 이어서 시작할 수 있다.

한 가지 예시적인 용량 투여 요법에서, 유착성 간질세포는 적어도 두 번 근육내로 투여되고 1, 2, 3, 4, 또는 5일 간격으로 투여된다. 다른 예시적인 용량 투여 요법은 실시예에서 제공된다.

투여될 조성물의 양은 치료될 개인, 고통의 중증도, 투여의 방식, 처방 의사의 판단 등에 당연히 의존할 것이다. 투여의 용량 및 시기는 개인의 변화하는 병태의 신중하고 계속적인 감시에 반응할 것이다. 예를 들면, 치료된 화학요법 환자는 감시하는 지시인자를 기초로 하여, 화학요법의 증상을 완화하기에 충분한 양으로 세포를 투여받을 것이다.

한 가지 구현예에서, 이식에 이어서 본 발명의 세포는 치료 효과가 관찰되는 기간 동안 환자에서 생존한다.

적합한 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제조물을 포함하는 조성물은 또한 지시된 병태의 치료를 위해 제조되고, 적당한 용기에 담기고, 라벨될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 원하는 경우라면 FDA 승인된 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 기기 내에 제시될 수 있고, 이는 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 용량 형태들을 함유할 수 있다. 팩은, 예를 들면 발포 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 기기에는 투여를 위한 지침들이 동봉될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 처방된 형태의 용기와 연관된 공고를 동봉할 수 있고, 공고는 기관에 의한 조성물의 형태 또는 인간 또는 수의적 투여의 승인을 반영한다. 이러한 공고는, 예를 들면 처방 약물을 위한 미국 식품의약품안전청에 의해 승인된 라벨 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다.

본 발명의 일정 관점들은 키트를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 키트는 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록, 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하기 위한 것이다. 한 가지 구현예에서, 키트는 화학요법의 효과를 경감하도록 화학요법을 받은 개체를 치료하기 위한 것이다. 한 가지 구현예에서, 키트는 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하기 위한 것이다.

일정 이들 구현예에서, 키트는 적어도 한 번의 무균의 포장으로 유착성 간질세포의 치료적 유효량, 및 세포의 치료적 유효량의 투여를 위한 지침들을 포함할 수 있다. 키트는 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 특정된 기간 이내의 투여를 위한 지침들을 더 포함할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 키트는 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후 특정된 기간 이내의 투여를 위한 첫 번째 무균의 포장 내의 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량; 내인성 조혈 체계에서 내인 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해, 노출에 이어지는 매칭 기간 이후의 투여를 위한 선택적으로 조혈 줄기세포과 함께 제공되는 유착성 간질세포의 두 번째 무균의 포장 내의 두 번째 치료적 유효량, 그리고 첫 번째 및 두 번째 치료적 유효량들의 투여를 위한 지침들을 포함한다.

일정 구현예에서, 치료적 유효량은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도, 또는 더 유도한다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서, 방사선은 이온화 방사선이다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 3D 조건하에서 배양되었던 태반, 지방 조직, 또는 골수이다.

무균의 포장들은 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경막내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의한 투여를 가능하게 하도록 서로와 독립적으로, 가능하게는 개체에게 적응가능하도록 제작될 수 있다. 서로 다른 포장들을 가진 서로 다른 키트들은 투여 방법에 따라 사용될 수 있다.

본 발명의 일정 구현예은 방사선 또는 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계의 특정된 투여 요법에서의 치료에 사용하는 약제의 제조를 위한 유착성 간질세포의 용도를 포함한다. 예를 들면, 특정된 투여 요법은 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 10일 이내에 투여된 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 특정된 투여 요법은 방사선 또는 화학물질에 대한 노출 이후 10일 이내의 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량 및 두 번째 특정된 기간 이후에 적어도 한 번의 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 치료적 유효량은 개체에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도, 또는 더 유도한다. 일정 구현예에서, 화학적 노출은 화학요법이다. 일정 구현예에서, 방사선은 이온화 방사선이다. 한 가지 구현예에서, 유착성 간질세포는 3D 조건하에서 배양되었던 태반, 지방 조직, 또는 골수 유래의 유착성 간질세포가다.

적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량이 관여하는 이들 구현예에서, 두 번째 치료량은 선택적으로 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포를 포함할 수 있다. 이들 구현예은 선택적으로 개체와 세포를 매칭하는 매칭 기간일 수 있는 (두 번째) 특정된 기간을 포함할 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 치료적 유효량은 노출 이후 2일 이내에 투여될 수 있고 매칭 기간은 적어도 4일일 수 있다.

적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량은, 예를 들면 노출에 이어서 매주, 매월, 1개월 내지 4개월마다, 또는 4개월 내지 6개월마다 투여될 수 있다.

첫 번째 및 선택적인 적어도 한 번의 두 번째 치료적 유효량들은 혈관 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 손상된 내인성 조혈 체계를 유발하는 조혈성 질환, 장애, 결핍 또는 증후군으로 고생하는 개체를 치료하는 방법으로서, 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 지향한다.

본 발명은 또한 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법으로서, 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

보다 또 다른 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 한 가지 구현예에서, 약제학적 조성물은 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하기 위해 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 화학요법의 효과를 경감하도록 화학요법을 받은 개체를 치료하기 위한 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 약제학적 조성물은 손상된 조혈 체계로 고생하는 개체의 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함한다.

한 가지 구현예에서, 약제학적 조성물은 외인성 조혈 줄기세포를 더 포함하지는 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 제조에서 치료적 유효량의 유착성 간질세포의 용도에 관한 것이다. 한 가지 구현예에서, 약제학적 조성물은 방사선에 대한 노출의 효과를 경감하도록 해로운 수준의 방사선에 대한 노출에 이어서 개체를 치료하는 데 사용하기 위한 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 화학요법의 효과를 경감하도록 화학요법을 받은 개체를 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 손상된 조혈 체계로 고생하는 개체의 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 유착성 간질세포를 포함한다.

일정 구현예에서, 내인성 조혈세포는 개체의 조혈 체계에 의해 생산된다. 따라서 일정 구현예에서, 내인성 조혈세포(들)은 수여자 포유동물, 예를 들면 인간(즉, 치료된 개체)의 것일 수 있다. 내인성 조혈세포(들)은 수여자 포유동물, 예를 들면 인간(즉, 치료된 개체)의 전체 유전자형을 가질 수 있다. 일정 구현예에서, 이식된 유착성 간질세포의 유전자형은 수여자의 내인성 조혈세포(들)의 유전자형과 다르거나 일치하지 않는다.

일정 구현예에서 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집은 개체의 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함한다.

일정 구현예에서 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집은 CD45 마커를 발현하는 내인성 조혈세포의 수를 증가시키는 것을 포함한다.

일정 구현예에서, 개체는 방사선에 노출된 적이 있었다.

일정 구현예에서, 개체는 화학요법으로 인한 면역 결핍이다. 일정 구현예에서, 개체는 내인성 조혈 체계를 손상시키는 세포독성 물질에 노출된 적이 있었다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포는 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다. 일정 구현예에서, 배양된 유착성 간질세포는 배양 배지 내로 Flt-3 리간드, IL-6, 및 SCF를 분비한다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이고, 유착성 간질세포는 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다.

일정 구현예에서, 유착성 간질세포의 기원은 태반, 지방 조직, 또는 골수이고, 유착성 간질세포는 분화의 부재 시 세포 확장을 지지하는 삼차원의 배양 조건하에서 배양되었다.

유착성 간질세포는 치료된 개체로부터 또는 동종이형 또는 이종의 공여자로부터 유래될 수 있다.

비-제한적인 예로서, 본 발명의 임의의 방법은 외인성 HSC 이식 없이 사용될 수 있다. 이에 따라, 일정의 다양한 양태에서, 본 방법은 외인성 HSC를 환자 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 않는 조건이 제공된다.

일정 구현예에서, 손상된 내인성 조혈 체계는 감소된 조혈세포 계수 또는 수에 의해 나타난다. 일정 구현예에서, 손상된 내인성 조혈 체계는 CD45+를 발현하는 내인성 조혈세포의 감소된 수에 의해 나타난다.

이론에 얽매이지 않더라도, 유착성 간질세포는 일반적으로 조혈 체계의 재군집을 지지하는 것에 의해/의하거나 치료된 개체의 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하는 것에 의해 작용하는 것으로 믿어진다. 따라서 기술된 바와 같이, 일정 구현예에서, 유착성 간질세포는 내인성 조혈세포 발현, 증식 및/또는 분화를 이를 필요로 하는 개체에서 증가시키는 것에 의해 작용한다. 다른 구현예에서, 유착성 간질세포는 개체에서 외인성 조혈 줄기세포의 접목을 지지하는 것에 의해 작용한다. 다른 구현예에서, 투여된 유착성 간질세포의 치료적 효과는 방사선 또는 화학적 제제에 대해 노출된 개체를 치료하는 것 또는 노출된 개체에서 방사선 또는 화학적 제제에 대한 노출의 증상 하나 이상을 개선하는 것이다.

이에 따라, 또 다른 양태에서 본 발명은 또한 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 노출된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방사선 또는 화학물질에 노출된 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, 치료는 개체 예를 들면 치사 용량의 방사선에 노출된 개체의 생존을 연장시킨다. 치사 용량은 약 2 내지 8 Gy 이온화 방사선(IR)(일반적으로 약 2 내지 4주 이내에 치사), 8 내지 30 Gy IR(일반적으로 약 2일 내지 2주 이내에 치사), 또는 약 30 Gy 초과의 IR(일반적으로 약 1 내지 2일 이내에 치사)의 노출을 의미한다. 본 발명은 또한 추가적인 양태에서, 방사선 예를 들면 이온화 방사선에 대한 노출과 연관된 증상, 또는 이어지는 화학요법과 같은 독성 화학물질에 대한 노출과 연관된 증상을 감소시키는 방법로서, 노출된 개체에게 유착성 간질세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이들 구현예에서, 증상로는 이에 제한되는 것은 아니지만 멀미, 구토, 설사, 두통, 열, 무게 감소, 신경학적 증상(예로, 인지 손상, 발작, 떨림, 운동실조, 기면증), 백혈구 감소증, 빈혈, 혈소판 감소증, 피로, 쇠약, 자색반병, 출혈, 탈모, 또는 및 충격을 포함한다. 증상은 이전에 주목된 바와 같이 호흡계, 신경계, 위창자계, 심혈관계, 피부, 또는 신장계의 하나 이상에 대한 손상으로서도 역시 나타날 수 있다.

본 발명의 이들 양태의 일정의 다양한 구현예에서, 투여의 시기, 용량의 횟수, 및 투여의 경로(들)은 조혈 체계의 재군집이 관여하고/하거나 내인성 조혈세포의 수에서 감소의 경감이 관여하는 다양한 양태에 관하여 기술된 내용을 포함한다.

도 15는 방사선 또는 화학요법과 같은 독성 화학물질에 대한 노출로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법(200)을 도시하는 높은 수준의 흐름도를 나타낸다.

방법(200)은 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 유도하고/하거나 내인성 조혈세포의 수의 감소를 경감하기 위해, 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량을 개체에게 방사선에 대한 노출 또는 화학요법(단계 210) 이후 특정된 기간 이내(예로, 10일 이내, 예를 들면 7 내지 10일 이내, 5 내지 6일 이내, 3 내지 4일 이내, 1 내지 2일 이내, 또는 약 1일 이내)에 투여하는 단계(단계 212), 및 내인성 조혈 체계에서 내인성 조혈세포의 재군집을 더 증진하기 위해(단계 222), 유착성 간질세포의 두 번째 치료적 유효량을 노출에 이어지는 매칭 기간(예로, 4 내지 21일) 이후에 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포과 함께 개체에게 투여하는 단계(단계 220)를 포함한다.

방법(200)은 또한 유착성 간질세포 단독(단계 214) 또는 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포(단계 224)과 함께 유착성 간질세포 반복 투여하는 것 둘 중 하나를 포함할 수 있다.

구현예에서, 방법(200)은 유착성 간질세포 단독(단계 214)의 반복 투여(예로, 매주, 매월, 1 내지 4개월마다, 또는 4 내지 6개월마다)만을, 또는 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포과 함께 유착성 간질세포의 반복 투여(예로, 매주, 매월, 1 내지 4개월마다, 또는 4 내지 6개월마다)(단계 224)만을 포함할 수 있다.

방법(200)은 또한 개체와 동종이형의 제대혈 또는 골수세포를 매칭하는 단계를 더 포함할 수 있다(단계 215).

투여(210, 220)은 혈관내, 근육내, 복강내, 피하 주사, 또는 흡입 투여에 의해 수행될 수 있다. 투여 방법은 개체에게 적응될 수 있고 투여(210, 220) 간에 서로 다를 수 있다.

도 16은 본 발명의 일정 구현예에 따른 일정의 투여 요법을 도시하고 있다. 유착성 간질세포(ASC)의 투여, 및 조혈 줄기세포 예를 들면 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포(CB/BM)과 함께 ASC의 투여는 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후의 시간의 측면에서 도시된다. 공여자 확인의 기간(즉, "매칭 기간")은 전형적으로 2 내지 5일이지만, 더 길거나 짧아질 수 있고, 조혈작용을 지지하도록 동종이형의 제대혈 또는 골수세포를 투여하는 것의 가능성을 결정한다. 일반적으로 말하자면, ASC의 첫 번째 즉시 투여(선택적으로 CB/BM을 포함함)는 급성 독성에 대해 보호작용하는 한편, ASC 또는 CB/BM과 함께 ASC의 후속 투여의 둘 중 하나는 조혈작용을 지지하고 개체의 회복에 따라 수행될 수 있다.

다음의 리스트는 개시된 용도 및 방법에 적용가능한 다양한 용량 요법을 도시한다.

1 - 예를 들면 노출 이후 7 내지 10일 이내, 5 내지 6일 이내, 3 내지 4일 이내, 1 내지 2일 이내, 또는 약 1일 이내와 같이 약 10일 이내에 유착성 간질세포(ASC)만의 투여.

2 - 1에 이어서 - 예를 들면 매주, 매월, 1 내지 4개월마다, 또는 4 내지 6개월마다 유착성 간질세포만의 추가적인 투여.

3 - 제대혈 또는 골수 공여자를 찾은 경우라면 - 노출 이후 7 내지 10일 이내, 5 내지 6일 이내, 3 내지 4일 이내, 1 내지 2일 이내, 또는 약 1일 이내와 같이 약 10일 이내에 유착성 간질세포 및 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포(CB/BM)의 투여.

4 - 3에 이어서 - 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포가 있거나 없이 유착성 간질세포의, 예를 들면 매주, 매월, 1 내지 4개월마다, 또는 4 내지 6개월마다 추가적인 투여.

5 - 노출 이후 1일 및 5일째와 같이 노출 이후 약 0 내지 5일 이내에 적어도 두 번 근육내 경로를 통한 유착성 간질세포만의 투여.

6 - 제대혈 또는 골수 공여자를 찾은 경우라면 - 노출 이후 2일 이내 유착성 간질세포 및 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포의 투여.

7 - 5 또는 6에 이어서 - 노출 이후 (제대혈 또는 골수 공여자를 찾기 위해 필요한 시간인) 4 내지 21일째 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포의 투여.

8 - 7 이후에 - 필요로 하는 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포가 있거나 없이 유착성 간질세포의 추가적인 투여.

본원에 기술된 발명은 본 명세서에서 첨부한 도면을 단지 예로서 참조하여 기술된다. 지금 자세한 도면들에 대한 구체적인 참조를 가지고, 도시된 특정 사항은 본 발명의 바람직한 구현예의 단지 예로서 및 설명적 논의의 목적을 위한 것이라고 강조되며, 또한 가장 유용하게 여겨지는 점 및 본 발명의 원리와 개념적 관점의 잘 이해되는 설명을 제공할 이유로 제시된다. 본 관점에서, 본 발명의 구조적인 세부사항을 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 이상으로 자세하게 보여주려고 전혀 시도되지 않고, 도면들과 함께 기술된 설명은 당업자에게 본 발명의 여러 형태들이 실제적으로 구현될 수 있는 방식을 명확하게 한다.
도면에서:
도 1a 내지 1g는 3-D 담체를 함유하는 생물반응기 시스템으로 제작된 뼈-유사 미세환경을 나타낸 것이다. 도 1a 내지 도 1b는 천연 뼈(도 la) 및 뼈 미세환경을 모방하는 유착성 간질세포(3D-ASC)을 접종한 7일 이후에 PluriX(TM) 3D 담체의 구조(도 1b)의 비교를 도시하는 전자현미경 사진들이다. 도 1c 내지 도 1f는 3D-ASC와 함께 접종되고, 접종 이후 20일(도 1c 내지 도 1d, 각각 150배 및 250배로 확대됨) 및 40일째(도 1e 내지 도 1f, 각각 350배 및 500배로 확대됨) 골수로부터 생산된 PluriX(TM) 3D 기질을 도시하는 전자현미경 사진들이다. 도 1g는 번호들에 의해 정의된 분리된 부분을 가진 Plurix 3D 플러그 유동 생물반응기의 모식도이다: 배양 배지 저장조(1), 기체 혼합물 공급조(2), 필터(3), 주입점(4), 3D 담체가 놓이는 컬럼(5), 유동 모니터(6), 유동 밸브(6a), 분리 용기(7), 세포 성장 분석기들(8); 연동 펌프(9), 시료 수집점(10), 용해된 O₂ 측정 전극(11), pH 측정 전극(12), 조절 시스템(13), 신선한 성장 배지(14), 사용된 성장 배지(15).
도 2는 태반으로부터 기원하고, 생물반응기 시스템 내의 3D 성장 조건에서 성장된 유착성 간질세포(3D-ASC; 로트들 5 내지 8번)의 서로 다른 생산 로트들을 도시하는 그래프를 나타낸 것이다. ASC(2 × 10⁶개)가 10,000 내지 15,000개 세포/담체의 밀도로 생물반응기에 접종되었다. 12일 배양에 이어서, 3D-ASCs는 150,000 내지 250,000개 세포/담체 또는 150개 담체를 포함하는 생물반응기에서 22.5 내지 37.5 × 10⁶개 사이의 밀도에 도달하였다.
도 3a 내지 3b는 통상적인 2D 배양 조건에서 배양된 태반 세포에서 막 마커(옅은 보라색)과 비교 시 태반 유래된 3D-ASC에서 발현된 막 마커(짙은 보라색)의 발현 수준에서 차이를 도시하는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 유착성 세포는 플라스크들(2D)에서 4 내지 6주 동안 또는 폴리스티렌 담체 상의(3D) 생물반응기 시스템에서 2 내지 3주 동안 성장되었다. 플라스크들 또는 담체 둘 중 하나로부터 수확에 이어서, 세포는 배양되었고, 중간엽 세포(도 3a), 또는 조혈세포(도 3b)의 특징적인 막 마커를 인식하는 단일클론 항체들(MAb)의 패널에 결합되었다. CD90, CD105, CD73 및 CD29 막 마커의 경우에 관찰된 바와 같이, 2D 배양된 세포에서 막 마커의 유의하게 더 높은 발현을, 3D-배양된 유착성 세포에서 발현된 막 마커과 비교하여, 특히 3D 배양된 세포에서 56% 발현 대비 2D 배양된 세포에서 87%를 보여주었던 CD105를 주목한다(도 3a). 2D 및 3D 배양 둘 다의 ASC는 임의의 조혈성 막 마커를 발현하지 않았다(도 3b).
도 4a 내지 4d는 2D 및 3D 조건 또는 그의 조정된 배지 하에서 배양된 태반으로부터 생산된 ASC에서 단백질 수준의 비교를 도시하는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 도 4a 내지 4c는 엘라이자(ELISA)에 의해 분석된 바와 같이 2D 및 3D 배양된 ASC의 조정된 배지에서 1 × 10⁶ 세포/mL로 정규화된 Flt-3 리간드(도 4a), IL-6(도 4b) 및 SCF(도 4c)의 수준을 pg/mL으로 도시한다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 하나를 나타낸다. 도 4d는 서로 비교된 iTRAQ 시약 표지된 단백질 시료로 질량 분광분석법에 의해 분석된 바와 같이, 서로 다른 세포성 단백질의 발현 수준을 보여준다. 단백질 시료는 2D(흰색 막대) 및 3D(회색 막대) 조건하에서 성장된 ASC로부터 채취되었다. 도면은 두 번의 반복 실험의 하나를 나타낸다. 2D 및 3D 배양 조건의 세포 및 조정된 배지에서 일정 단백질의 발현 수준에서 차이를 주목한다.
도 5는 이식에 이어서 3.5주째 화학요법(연속 2주 동안 25 mg/mL의 부설판(busulfan) 복강내 주사들)으로 처리된 NOD-SCID 마우스의 골수(BM)에서 검출된 인간 CD45+ 세포의 백분율을 도시하는 그래프를 나타낸 것이다. 제대혈 유래된 단핵 세포로부터 정제된 CD34+ 세포(100,000개) 단독으로 이식되거나(5마리 마우스, a), 2D 조건에서 배양된 0.5 × 10⁶개의 태반 유래된 유착성 세포(2D-ASC; 2마리 마우스, b), 또는 PluriX™ 생물반응기로 3D 조건에서 배양된 태반 유래된 유착성 세포(3D-ASC)(5마리 마우스, c)과 공동-이식되었다. 다음으로 골수(BM)가 마우스 대퇴골 및 경골로부터 수집되었다. BM에서 인간 세포는 유동 세포측정법에 의해 검출되었다. CD45를 발현하는 인간 세포의 백분율은 항-인간 CD45-FITC와 세포를 인큐베이션하여 결정되었다. HSC 단독으로(a) 처리된 마우스에서 인간 세포의 백분율과 비교하여, 2D-ASC(b) 뿐만 아니라 3D-ASC(c)로 공동-이식된 마우스의 골수에서 인간 세포(hCD45+)의 더 높은 백분율을 주목한다. 2D-ASC 배양된 세포로 처리된 마우스와 비교하여 3D-ASC 배양된 세포로 처리된 마우스에서 관찰된 더 높은 접목은 3D 배양된 ASC에 독특한 더 높은 치료적 장점을 가리킨다.
도 6a 및 6b는 지방 조직 유래된 ASC와 함께 CD34+ 세포(도 6b)을 비교하여 CD34+ 세포만으로 이식된 마우스에서 인간 이식편 CD45+ 세포(도 6a)의 FACS 분석을 나타낸 것이다. 인간 CD34+ 단독으로 처리된 마우스와 비교하여(도 6b - 12%) 지방 조직 유래된 ASC와 공동-이식된 마우스에서 인간 조혈 군집(hCD45+)의 유의하게 더 높은 백분율(도 6a - 29%)을 주목한다.
도 7은 인간 제대혈 단핵세포(CB), 및 동등한 양의 방사선 조사된(3,000 Rad) 제대혈 세포(iCB), 인간 말초혈액 유래된 단핵구(PBMC), 2D 배양된(2D) 또는 3D 배양된(3D) 태반 ASC, 또는 PBMC 및 2D와 3D 배양된 태반 ASC의 조합(PBMC + 2D 및 PBMC + 3D) 간에 시행된 혼합된 림프구 반응을 도시하는 막대 그래프를 나타낸 것이다. CB 세포 군집의 크기는 마지막 18시간의 배양 동안 측정된 ³H-티미딘 흡수(CPM으로 측정됨)에 의해 나타난다. 자극된 CB 세포 증식의 증가는 더 높은 수준의 면역 반응을 가리킨다. 유착성 세포과 인큐베이션된 세포에 의해 나타난 면역 반응의 더 낮은 수준, 상세하게는 유착성 세포과 공동-인큐베이션될 때 PBMC에 대한 CB 면역 반응의 감소를 주목한다. 각각의 반응의 세 번 반복들이 시행되었다.
도 8a 및 8b는 지방 조직 유래된 유착성 간질세포과 함께 인간 CD34+ 세포로 이식된 마우스(도 8b)와 인간 CD34+ 세포만으로 이식된 마우스(도 9a)를 비교하여 마우스 CD45+ 세포의 FACS 분석을 나타낸 것이다. 인간 CD34+ 단독으로 처리된 마우스와 비교하여(도 8a - 5.57%) 지방 조직 유래된 유착성 세포과 공동-이식된 마우스에서 마우스 조혈 군집(mCD45+)의 유의하게 더 높은 백분율(도 8b - 9.42%)을 주목한다.
도 9는 BALB/c 및 C3H 마우스에서 두 번 용량의 이온화 방사선 이후(3D-ASC 처리 없이) 마우스 생존의 추적을 나타낸 것이다.
도 10은 0.5 및 1 × 10⁶개 세포 용량의 정맥내 주사의 안전성을 도시하는, 방사선 미조사된 C3H 및 BALB/c 마우스의 무게 변화에 미치는 서로 다른 용량의 3D-ASC(PLX) 세포의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 방사선에 대한 노출에 이어지는 C3H 마우스 생존(패널 A) 및 정규화된 무게 변화(패널 B)을 나타낸 것이다. "PLX"는 3D-ASC 세포로의 처리를 표시한다. "운반체"는 PLX 세포를 수여받지 않았던 대조군 마우스를 표시한다.
도 12는 PLX 세포로 미처리(왼쪽) 또는 처리된(오른쪽) 방사선 조사된 마우스에서 비장 무게를 나타내고, 또한 마우스의 해당하는 그룹으로부터 제조된 예시적인 비장들을 도면으로 나타낸 것이다. 준비는 C3H 마우스가 치사-이하의 방사선 조사에 노출된 이후 9일째 수행되었고, 3D-ASC(PLX) 주사로 이어졌다. BM 세포 재생은 비장 콜로니 형성 검정법에 의해 테스트되었다. 전구체 세포로부터 기원된 콜로니들은 BM으로 재현탁되었다.
도 13은 골수 전구체 세포 재군집을 나타낸 것이다. 핵형성된 BM 세포는 마우스의 양 뒷다리의 대퇴골 및 경골로부터 PBS로 세척하고 이어서 용출 용액을 사용한 RBC 용출을 시행하여 수집되었고 다음으로 직접적 계수에 의해 측정되었다. 방사선 미조사된 마우스에서 정상적 BM 세포 계수는 약 30 × 10⁶개의 범위이다. 3D-ASC(PLX)로 처리된 마우스는 방사선에 대한 노출에 이어서 9일 및 23일 이후에 훨씬 더 높은 수준의 총 핵형성된 골수세포를 가졌다.
도 14는 3D-ASC로의 처리 및 동종이형의 골수 이식(PLX-BMT)의 조합된 효과, 즉 인간 제대혈(hUCB)의 접목의 증진을 도시하는 결과를 나타낸 것이다. 결과는 주사 이후 5주째 일어난 접목을 가진 350 rad 방사선 조사된 NOD 마우스로 획득되었다. 유사한 접목 결과가 방사선 조사 대신에 부설판이 사용되었을 때 획득되었고, 방사선 조사 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계를 치료하기 위해 조합된 처리의 효능 및 상승작용도 역시 도시한다.
도 15는 방사선에 대한 노출 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계로 고생하는 개체를 치료하는 방법(200)을 도시하는 높은 수준의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일정 구현예에 따른 일정의 투여 요법을 나타낸 것이다. 유착성 간질세포(ASC), 및 매칭된 동종이형의 제대혈 또는 골수세포(CB/BM)과 함께 ASC의 투여는 방사선에 대한 노출 또는 화학요법 이후의 시간의 측면에서 도시된다.
도 17은 방사선 조사에 이어서 24시간째 PLX 세포로 정맥내 처리된 마우스(채워진 원들) 및 PLX 처리를 받지 않은 마우스(비어있는 원들)를 위한 생존 데이타를 나타낸 것이다.
도 18은 18일에 걸친 시간의 무게 변화를 정규화된 무게 변화(도 18a) 또는 평균 무게 변화(도 18b) 둘 중 하나로서 나타낸 것이다.
도 19는 대조군, 운반체 처리된, 및 PLX 처리된 마우스의 경우에 8일째(도 19a; 모든 그룹 n = 3) 및 18일째(도 19b; 대조군 n = 2, PLX n= 9, 및 운반체 n = 1) 전체 골수세포 계수를 나타낸 것이다.
도 20은 8일(도 20a) 및 18일(도 20b)에 적혈구(RBC) 수을 나타낸 것이다.
도 21은 8일(a) 및 18일(b)에 백혈구(WBC) 계수를 나타낸 것이다.
도 22는 8일(a, c) 및 18일(b, d)에 핵형성된 RBC를 위한 데이타를 나타낸 것이다. 상부 그래프(a, b)은 핵형성 RBC의 백분율을 제시하고, 저부 그래프(c, d)은 마이크로리터 당 핵형성 RBC × 10³개의 절대적 수를 제시한다.
도 23은 8일(a) 및 18일(b)에 헤모글로빈 수준을 나타낸 것이다.
도 24는 8일(a) 및 18일(b)에 혈소판 수을 나타낸 것이다.
도 25는 8일(a) 및 18일(b)에 적혈구 용적율을 나타낸 것이다.
도 26은 PLX 세포 또는 운반체로의 주사에 이어서 1일(a) 및 4일(b)에 사이토카인 프로파일들을 나타낸 것이다.
도 27은 마우스의 방사선에 대한 노출에 이어서 생존(패널 A) 및 정규화된 무게 변화(패널 B)를 나타낸 것이다. 유착성 간질세포(ASC)의 한 번(네모) 또는 두 번(원들) 용량로 근육내(IM) 처리된 방사선 조사된 마우스는 ASC로 처리되지 않은 대조군 마우스와 대비하여 보여진다.
도 28은 770c Gy의 용량으로 방사선 조사 그리고 방사선 조사에 이어서 1일 또는 1일 및 5일에 표시된 세포 용량로 근육내(IM) 처리에 이어서 생존(a) 및 평균 무게 변화(b)를 나타낸 것이다.
도 29는 골수세포의 경우 23일에 평균 세포 계수를 나타낸 것이다.
도 30은 23일에 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC) 계수를 나타낸 것이다. 각각의 마우스를 위한 개별 계수는 패널 A(WBC) 및 패널 B(RBC)에 제시된다. 패널 C(WBC) 및 패널 D(RBC)는 각각의 그룹을 위한 데이타 풀을 제시한다.
도 31은 개별 마우스(a) 및 평균 그룹(b)을 위한 23일 혈소판 계수를 나타낸 것이다.
도 32는 개별 마우스(a, b) 및 그룹에 의해 평균된 수치들(c, d)을 위한 헤모글로빈(a, c) 및 적혈구 용적율(b, d)의 23일 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 770c Gy의 용량으로 방사선 조사에 이어서 생존(a) 및 평균 무게 변화(b)를 나타낸 것이다. 마우스는 모성 유래된 세포 또는 모성/태아 혼합된 세포로 방사선 조사에 이어서 24시간 및 5일에 주사 당 2 × 10⁶개 세포의 용량으로 근육내 주사되었다.
도 34는 23일 혈액학 결과를 나타낸 것이다. 도 34a는 전체 골수 계수를 제시한다. 도 34b는 백혈구 세포 계수를 제시한다. 도 34c는 적혈구 세포 계수를 제시한다. 도 34d는 혈소판 계수를 제시한다.
도 35는 23일에 헤모글로빈(a) 및 적혈구 용적율(b)을 나타낸 것이다.
도 36은 PLX 세포 또는 운반체로의 주사에 이어서 8일에 사이토카인 프로파일들을 나타낸 것이다.
도 37은 8일에 전체 골수 계수(a), 백혈구 세포 계수(b), 적혈구 세포 계수(c), 및 혈소판 계수(d)의 견지에서 마우스 그룹 간의 차이들을 나타낸 것이다.
도 38은 적혈구 용적율(a) 및 헤모글로빈(b)을 나타낸 것이다.
도 39는 탈석회화된 대퇴골에 대한 조직학을 나타낸 것이다.
도 40은 770c Gy의 용량으로 방사선 조사에 이어서 생존(a) 및 평균 무게 변화(b)를 나타낸 것이다. 마우스는 모성 유래된 세포 또는 모성/태아 혼합된 세포로 방사선 조사에 이어서 48시간 및 5일에 주사 당 2 × 10⁶개 세포의 용량으로 근육내 주사되었다.
도 41a 내지 41d는 모성의 또는 혼합된 PLX 세포로 48시간 및 5일에 처리된 마우스에서 23일 혈액학 결과를 나타낸 것이다. 도 41a는 전체 골수 계수를 제시한다. 도 41b는 백혈구 세포 계수를 제시한다. 도 41c는 적혈구 세포 계수를 제시한다. 도 41d는 혈소판 계수를 제시한다.
도 42는 23일에 헤모글로빈(도 42a) 및 적혈구 용적율(도 42b)를 나타낸 것이다.

실시예

다음의 실시예에 관한 참고문헌이 지금 언급되고, 이는 상기 상세한 설명들과 함께 비-제한적인 방식으로 본 발명을 설명한다.

일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 사용된 실험실 절차은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 이러한 기법은 문헌에서 상세히 설명된다. 예를 들면 "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al.,(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Vols. I-Ⅲ Ausubel,R. M., ed.(1994); Ausubelet al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guideto Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York(1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al.(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호; 및 제5,272,057호에 개시된 바와 같은 방법론들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Vols I-Ⅲ Cellis, J. E., ed.(1994); "Current Protocols in Immunology" Vols I-Ⅲ Coligan J. E., ed.(1994); Stites et al.(eds), "Basic and Clinical Immunology"(제 8판), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell and Shiigi(eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York(1980); 입수가능한 면역검정법이 특허 및 과학적 문헌에 광범위하게 기술되고, 예를 들면 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호를 참조한다; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed.(1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds.(1984); "Animal Cell Culture"Freshney, R. L, ed.(1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986); "A Practical Guideto Molecular Cloning" Perbal, B.,(1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1317, Academic Press; "PCR Protocols: A GuideTo Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purificationand Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996)을 참고한다; 이들 모두는 본 명세서에서 전부 개시된 것처럼 참고문헌으로 통합되어 있다. 다른 일반적인 참고문헌은 본 문서의 전체를 통하여 제공된다. 본 참고문헌에서 절차은 당해 기술분야에서 잘 알려진 것으로 여겨지며 독자의 편의를 위해 제공된다. 이에 따라 본 참고문헌에 포함된 정보는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

실시예 1

골수, 태반 및 지방 조직으로부터 유착성 간질세포( ASC )의 생산 및 배양

유착성 간질세포는 특이적 세포 마커 발현 프로파일을 특징으로 하는 3D-ASC 세포를 생산하도록 3D 담체를 함유하는 생물반응기 시스템에서 배양되었다. 성장 효율은 세포 계수를 통하여 테스트되었다. 이들 세포의 분화 능력은 분화 배지에서 배양에 의해 테스트되었다.

재료 및 실험적 절차

골수 유착성 간질세포 - 골수(BM) 유착성 간질세포는 심장-개방 수술 또는 BM 생검을 거친 혈액학적으로 건강한 공여자의 흡인된 흉골수로부터 획득되었다. 골수 흡인물은 행크 균형잡힌 염 용액(HBSS; GIBCO BRL/lnvitrogen, Gaithersburg MD)으로 3배 희석되었고 피콜-하이파크(Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA) 밀도 구배 원심분리가 시행되었다. 이후에, 골수 단핵세포(< 1.077 gm/cm³)가 수집되었고 HBSS로 3번 세척되었고 성장 배지 [10 % FCS(GIBCO BRL), 10.4 M 머캅토에탄올(Merck, White House Station, NJ), 펜-스트렙나이스타틴(Pen-StrepNystatin) 혼합물(100 U/ml: 100 ug/ml: 1.25 un/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM L-글루타민(Beit Ha'Emek)이 보충된 DMEM(Biological Industries, Beit Ha'emek, 이스라엘)]로 재현탁되었다. 개별 공여자로부터 얻은 세포는 배양 배지의 매주 교환과 함께 조직 배양 플라스크들(Corning, Acton, MA)로 37℃(5% C0₂)에서 별도로 인큐베이션되었다. 세포는 0.25% 트립신-EDTA(Beit Ha'Emek)를 사용하여 3 내지 4일마다 나누어졌다. 2 내지 40번의 계대에 이어서 60 내지 80%의 충만도에 도달할 때, 세포는 분석을 위해 또는 생물반응기들에서 배양을 위해 수집되었다.

태반 유래된 유착성 간질세포 - 만삭 분만의 태반의 내부 부분(Bnei Zion medical center, Haifa, 이스라엘)이 무균의 조건하에서 절단되었고 행크 완충액으로 3번 세척되었으며 0.1% 콜라겐분해효소(1 mg/ml 조직; Sigma Aldrich, St. Lewis, MO)와 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션되었다. 다음으로 조심스런 피펫팅을 사용하여 현탁된 세포는 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물(100 U/ml: 1OO ug/ml: 1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM으로 세척되었고, 75 cm² 플라스크들에 접종되었으며 37℃로 5% CO₂를 가진 습한 조건하에서 조직 배양기에서 인큐베이션되었다. 이들 이후에, 세포는 플라스틱 표면에 72시간 동안 부착되도록 허용되었고 이후 배지가 3 내지 4일마다 교환되었다. 60 내지 80% 충만도에 도달할 때(보통 10 내지 12일), 세포는 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 성장 플라스크로부터 탈착되었고 새로운 플라스크들 내로 접종되었다. 배양된 세포는 이후에 분석을 위해 또는 생물반응기들에서 배양을 위해 수집되었다.

지방 유래된 유착성 간질세포 - 유착성 간질세포는 지방흡입 절차(Rambam Haifa, 이스라엘)의 인간 지방 조직으로부터 획득되었다. 지방 조직은 동등한 부피들의 PBS로 잘 세척되었고, 37℃에서 30분 동안 콜라겐분해효소(20 mg/ml)로 소화되었다. 다음으로 세포는 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물(100 U/ml: 1OO ug/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM으로 세척되었으며 RT에서 10분 동안 1,200 rpm으로 원심분리되었고, 용해 용액(1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, 이스라엘, 적혈구 세포를 제거하기 위함)으로 재현탁되었으며 원심분리되었고 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물(100 U/ml: 1OO ug/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM으로 재현탁되었다. 다음으로 세척된 세포는 무균의 조직 배양 배지 플라스크에 3 내지 10 × 10⁷개 세포/플라스크로 접종되었다. 다음날 세포는 남아있는 RBC 및 죽은 세포를 제거하도록 PBS로 세척되었다. 세포는 5% CO₂를 가진 습한 조건하에서 조직 배양기로 37℃로 유지되었다. 배지는 3 내지 4일마다 교환되었다. 60 내지 80% 충만도에서, 세포는 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 성장 플라스크로부터 탈착되었고 새로운 플라스크들 내로 접종되었다. 2 내지 40번의 계대에 이어서 세포가 60 내지 80% 충만도에 도달했을 때, 세포는 분석을 위해 또는 생물반응기들에서 배양을 위해 수집되었다.

PluriX ™ 플러그 유동 생물반응기 - PluriX™ 플러그 유동 생물반응기가 (Puristem, Haifa, 이스라엘; 도 1g에 도시된 바와 같음, 미국 특허 제6,911,201호도 역시 참조), 폴리에스테르의 비-직조된 섬유 기질로 만들어진 1 내지 100 mL의 충전된 3D 공극성 담체(직경 4 mm)로 로딩되었다. 이들 담체는 비교적인 적은 부피로 많은 세포 수의 증식을 가능하게 한다. 유리 용기가 플루리스템사에 의해 설계되었고 제조되었다. 생물반응기는 37℃의 배양기에서 밸브(도 1g의 6a) 및 연동 펌프(도 1g의 9)에 의해 조절되고 감시되는 유동 속도로 유지되었다. 생물반응기는 시료수집 및 주입점을 함유하고(도 1g의 4), 세포의 연속적 접종을 허용한다. 세포 배지는 저장조(도 1g의 1)로부터 pH 6.7 내지 7.4로 공급되었다. 저장조는 생물반응기에서 세포 밀도에 의존하여, 서로 다른 비율들로, 공기/C0₂/0₂를 함유하는 여과된 기체 혼합물(도 1g의 2, 3)이 공급되었다. O₂ 비율은 모니터(도 1g의 6)에 의해 결정된, 생물반응기 출구에서 용해된 O₂의 수준에 의해 적절하다. 기체 혼합물은 실리콘 튜브들 또는 확산기(Degania Bet, Emek Hayarden, 이스라엘)를 통해 저장조로 공급되었다. 배양 배지는 순환하는 비유착성 세포의 수집을 가능하게 하는 분리 용기들(도 1g의 7)을 통해 통과되었다. 배지의 순환은 유동 펌프(도 1g의 9)에 의해 획득되었다. 생물반응기는 연속적인 배지 교환을 위해 추가적인 시료 수집점(도 1g의 10) 및 용기들이 더 장착되었다.

3D- 유착성 간질세포(3D- ASC )의 생산 - 상기에서 기술된 바와 같이 성장된 미충만된 일차 인간 유착성 간질세포 2D 배양물은 트립신 처리되었고, 세척되었으며, 10% FBS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물(100 U/ml: 1OO ug/ml: 1.25 un/ml) 및 2 mM의 L-글루타민이 보충된 DMEM으로 재현탁되었고, 무균의 플러그 유동 생물반응기(도 1g를 참조)에 넣은 3D 담체 상에 주입점을 통해 접종되었다(10³ 내지 10⁵개 세포/mL). 접종 이전에, 생물반응기는 PBS-Ca-Mg(Biological Industries, Beit Ha'emek, 이스라엘)로 충전되었고, 고온가압멸균(autoclave)되었으며(120℃, 30분), 10% 열-불활성화된 우태아혈청 및 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물(100 U/ml: 1.00 ug/ml: 1.25 un/ml)을 함유하는 둘베코 성장 배지로 세척되었다. 유동은 0.1 내지 5 mL/분의 속도로 유지되었다. 접종 공정은 2 내지 48시간 동안 순환의 정지가 관여하였고, 이에 의해 세포가 담체 상에 정착하도록 허용된다. 생물반응기는 조절된 온도(37℃) 및 pH 조건(pH = 6.7 내지 7.4) 하에서; 필요한 바와 같은 무균의 공기 및 CO₂가 공급된 배양기를 사용하여 유지되었다. 성장 배지는 매주 2 내지 3번 교체되었다. 순환 배지는 신선한 DMEM 배지로 4시간 내지 7일마다 교체되었다. 1 × 10⁶내지 1 × 10⁶개 세포/mL의 밀도로(12 내지 40일의 성장에 이어서), 전체 배지 부피가 생물반응기로부터 제거되었고 생물반응기 및 담체는 PBS로 3 내지 5번 세척되었다. 다음으로 3D-ASC 세포는 트립신-EDTA(Biological Industries, Beit Ha'emek, 이스라엘; 조심스러운 교반으로 3 내지 15분, 1 내지 5번)으로 담체로부터 탈착되었고, 이후에 DMEM에 재현탁되었으며 동결보관되었다.

3D- ASC 정성적 생물학적 검정법 - 동결보관된 3D-ASC 세포는 해동되었고 계수되었다. 세포 생존도 평가를 위해, 2 × 10⁵개 세포가 150 cm² 조직 배양 플라스크에 접종되었고 그들의 부착 능력 및 재군집이 접종에 이어서 7일 이내에 평가되었다. 이후에, 3D-ASC 막 마커 표현형이 형광 단일클론 항체들 유동-세포측정기(Beckman Coulter, Fullerton,CA)를 사용하여 분석되었다.

유동 세포측정 검정법을 사용한 3D 및 2D 배양된 유착성 간질세포의 세포막 마커 프로파일 간의 비교 - 2D 배양물 및 3D 유동 시스템 배양물로부터 얻은 100,000 내지 200,000개의 유착성 간질세포는 5 mL 튜브에 넣은 0.1 mL의 배양 배지에서 재현탁되었고 포화 농도들의 다음의 각각의 Mab: FITC-결합된 항-인간 CD90(Chemicon International Inc. 25 Temecula, CA), PE 결합된 항-인간 CD73(Bactlab Diagnostic, Ceasarea, 이스라엘), PE 결합된 항-인간 CD lO5(eBioscience, San Diego, CA), FITC 결합된 항-인간 CD29(eBioscience, San Diego, CA), Cy7-PE 결합된 항-인간 CD45(eBiosience), PE 결합된 항-인간 CDI9(IQProducts, Groningen, 네덜란드), PE 결합된 항-인간 CDl4 MAb(IQProducts), FITC 결합된 항-인간 CD11b(IQProducts) 및 PE 결합된 항-인간 CD34(IQProducts) 또는 FITC 결합된 항-인간 HLA-DR MAb(IQProducts)과 인큐베이션되었다(4℃, 30분, 암조건). 배양에 이어서, 세포는 1% 열-불활성화된 FCS를 함유하는 차가운 PBS로 두 번 세척되었고, 500 μL 포름알데하이드 0.5%로 재현탁되었고 FC-5OO 유동-세포측정기(Beckman Coulter, Fullerton,CA)를 사용하여 분석되었다.

질량 분광분석법을 사용한 3D 및 2D 배양된 유착성 간질세포의 단백질 프로파일 간의 비교 - 2D 및 3D 유래된 배양 절차 ASC는 상기에 기술된 바와 같이 태반으로부터 생산되었다. 간략하게, 2D 배양물은 0.3 내지 0.75 × 10⁶개 세포를 175 cm² 플라스크들에서 4일 동안 습한 5% CO₂대기 하에서 37℃로, 60 내지 80%의 충만도에 도달할 때까지 배양하여 생산되었다. 3D 배양물은 2,000개의 담체를 함유하는 생물반응기에 2 내지 10 × 10⁶개 세포/그램(g)을 접종하고 18일 동안 배양하여 생산되었다. 수확에 이어서, 세포는 혈청 모두를 제거하도록 세척되었고(3번), 펠렛화 되었으며 냉동되었다. 단백질은 펠렛들로부터 제조사들의 프로토콜에 따라 분리되었다 [Tri 시약 키트(Sigma, Saint Louis, USA)를 사용하고 트립신으로 소화되었으며 iTRAQ 시약(Applied Biosciences, Foster City, CA)으로 표지되었다]. 간략하게, iTRAQ 시약은 비중합성 등비중 태그화 시약이다. 각각의 시료 내의 펩타이드는 그들의 N-말단 및/또는 라이신 측쇄을 통해 등비중 동위원소 코드된 태그들의 네 개 중 하나로 표지되었다. 네 가지의 표지된 시료는 혼합되었고 펩타이드는 질량 분광분석법으로 분석되었다. 펩타이드 단편화 시, 각각의 태그는 구별되는 질량 리포터 이온을 방출하고; 따라서 네 가지의 리포터들의 비율은 시료에서 주어진 펩타이드의 상대적 양을 알려준다(http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf에서의 정보).

태반 유래된 ASC의 2D 배양물 대비 3D 배양물의 단백질학 분석이 QTOF-프리미어(Waters, San Francisco, CA) 상의 LC-MS/MS를 사용하여 스몰러 단백질학 센터(Smoler proteomic center, department of Biology, Technion, Haifa, 이스라엘)에서 nr 데이타베이스의 인간 부분에 대한 펩-마이너 소프트웨어(Beer, I., et al., Proteomics, 4, 950-60, 2004)에 의해 시행된 확인 및 분석과 함께 수행되었다. 분석된 단백질은: 불균질한 핵 리보핵산단백질 H1(Hnrphl 진뱅크 기탁번호 NP_005511), H2A 히스톤 패밀리(H2AF, 진뱅크 기탁번호 NP_034566.l), 진핵성 번역 연장인자 2(EEEF2, 진뱅크 기탁번호 NP_031933.l), 리티쿨로칼빈 3(reticulocalbin 3), EF-핸드 칼슘 결합 도메인(RCN2, 진뱅크 기탁번호 NP 065701), CD44 항원 이소형2 전구체(진뱅크 기탁번호 NP⌒OO 1001389, 칼포닌 1 염기성 민무늬 근육(CNNI, 진뱅크 기탁번호 NP_001290), 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 합성효소2 이소형a(Papss2, 진뱅크 기탁번호 NP 004661), 리보좀 단백질L7a(rpL7a, 진뱅크 기탁번호 NP_000963) 및 알데하이드 탈수소효소 X(ALDH X, 진뱅크 기탁번호 P47738)이었다. 모든 실험은 두 번 시행되었다. 분석의 특성 때문에, 모든 단백질은 시료에 출현하였던 펩타이드의 수에 따라 분석되었다(각각의 분석에서 단백질의 2 내지 20번 출현들).

엘라이자를 사용한 3D 및 2D 배양된 유착성 간질세포의 분비된 단백질 간의 비교 - 2D 및 3D 유래된 배양 절차 ASC는 상기에 기술된 바와 같이 태반으로부터 생산되었고 24일의 지속기간 동안 3D 배양로 생산되었다. 조정된 배지는 이후에 수집되었고 Flt-3 리간드, IL-6, 트롬보포이에틴(TPO) 및 줄기세포 인자(SCF)를 위해 3번의 독립적인 실험로 엘라이자(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석되었다. 결과는 1 X 10⁶ 세포/㎖로 정규화되었다.

결과

PluriX ( TM ) 생물반응기 시스템은 생리학적-유사 미세환경을 제작한다.

유착성 간질세포를 위한 효율적인 배양 조건을 만들기 위하여, 생리학적-유사 환경(도 1a에 도시됨)이 PluriX 생물반응기(Pluristem, Haifa, 이스라엘; 담체는 도 1g에 도시되고 도 1b에 접종 이전을 나타냄)를 사용하여 인위적으로 제작되었다. 도 1c 내지 1f에서 나타낸 바와 같이, 골수 생산된 3D-ASC 세포가 성공적으로 배양되었고 3D 기질 상에서 접종에 이어서 20일(도 1b 내지 1c, 각각 150배 및 250배로 확대됨) 및 40일(도 lc 내지 1d, 각각 350배 및 500배 확대됨) 증식되었다.

PluriX 생물반응기 시스템에서 성장된 세포는 유의하게 증식되었다 - 태반 유래된 3D-ASC 세포의 서로 다른 생산 로트가 PluriX 생물반응기 시스템에서 성장되었다. 접종 밀도는 13,300개 세포/담체(총 2 × 10⁶개 세포)이었다. 접종에 이어서 14일째, 세포 밀도는 15배로 증식되었고, 150개 담체의 생물반응기에서 대략 200,000개 세포/담체(도 2), 또는 30 × 10⁶개에 도달하였다. 서로 다른 실험에서, 세포는 생물반응기 내로 1.5 × 10⁴개 세포/mL의 밀도로 접종되었고 접종에 이어서 30일째 담체는 50배 초과의 더 많은 세포수, 즉, 약 0.5 × 10^6세포/담체 또는 1.5 × 10⁷개 세포/mL를 함유하였다. 성장 컬럼의 다양한 수준에서 담체 상의 세포 밀도는 일정하였고, 산소 및 영양분의 세포로의 균질한 전달을 가리켰다. 따라서 3D 배양 시스템은 성장을 위한 지지 조건을 제공하고 접목 및 성공적인 이식을 지원하려는 목적에 충분한 양으로 효율적으로 성장될 수 있는 고밀도 중간엽 세포 배양물의 유지를 연장하는 것으로 입증되었다.

3D- ASC는 독특한 막 마커 특징을 나타낸다 - 3D 배양 절차를 모방하는 뼈 환경에 의해 영향을 받는 용해성 분자 및 단백질 생산의 분비 프로파일에서 차이를 정의하기 위하여, FACs 분석이 효과를 내었다. 도 3a에서 나타낸 바와 같이, 세포 마커의 FACS 분석은 3D-ASC가 2D 조건에서 성장된 유착성 간질세포과는 서로 다른 마커 발현 양상을 전시하는 점을 도시한다. 2D 배양된 세포는 3D 배양된 세포과 비교 시 양성의 막 마커인 CD90, CD105, CD73 및 CD29 막 마커의 유의하게 더 높은 수준을 발현하였다. 예를 들면, CD105는 3D 배양된 세포에서 56% 발현 대비 2D 배양된 세포에서 87%를 보여주었다. 2D 및 3D 태반 배양물 둘 다의 ASC는 어떠한 조혈 막 마커도 발현하지 않았다(도 3b).

3D- ASC는 용해성 인자의 독특한 프로파일을 나타낸다 - 조혈성 소와는 풍부한 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 생산하는 지지 세포를 포함한다. 2D 및 3D 배양된 ASC 간의 차이를 좀 더 정의하기 위하여, 2D 및 3D ASC 배양액물의 조정된 배지에서 네 가지의 주요한 조혈 분비 단백질의 프로파일이 엘라이자에 의해 효과를 내었다. 도 4a 내지 4c는 3D 조건에서 성장된 세포가 Flt-3 리간드(도 4a), IL-6(도 4b), 및 SCF(도 4c)의 더 높은 수준을 가진 조정 배지를 생산하였던 반면, IL-6의 낮은 수준, 및 Flt-3 리간드 및 SCF의 거의 제로 수준이 2D 배양물의 조정 배지에서 검출되었던 점을 보여준다. 트롬보포이에틴(TPO)의 생산은 매우 낮았고 배양물 둘 다에서 동등하였다.

3D- ASC는 질량 분광분석법에서 독특한 단백질 프로파일을 나타낸다 - 2D 및 3D 배양된 ASC 간의 차이를 좀 더 정의하기 위하여, 이들 세포의 단백질 프로파일이 질량 분광분석법에 의해 분석되었다. 도 4d는 2D 및 3D 배양된 ASC가 현저하게 서로 다른 단백질 발현 프로파일을 보여주는 점을 도시한다. 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 3D 배양된 세포는 H2AF 및 ALDH X의 훨씬 더 높은 발현 수준(각각 9배 및 12배 이상 높음) 및 단백질 EEEF2, RCN2 및 CNN1의(각각 3배, 2.5배 및 2배) 더 높은 수준은 보여준다. 또한, 3D 배양된 세포는 각각의 단백질 Hnrphl 및 CD44 항원 이소형2 전구체의 절반 발현 수준 그리고 각각 Papss2 및 rpL7a의 삼분의 일의 발현 수준을 보여준다.

실시예 2

2D 및 3D 배양된 ASC에 의한 림프구 반응의 억제

유착성 간질세포, 및 상세하게는 3D-ASC는 MLR 검정법에서 인간 제대혈 단핵세포의 면역 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

재료 및 실험적 절차

혼합된 림프구 반응( MLR ) 검정법 - 태반으로부터 생산된 2D 및 3D 유래된 배양 절차 ASC의 면역억제 및 면역특권 성질들은 HLA 좌위에서 조직적합성을 측정하는 MLR 검정법에 의해, 반응성(증식하는) 및 자극하는(비증식성) 세포의 혼합 배양에서 비적합한 림프구들의 증식 속도에 의해 효과를 내는 바와 같은 영향을 받는다. 인간 제대혈(CB) 단핵세포(2 × 10⁵개)은 반응성 세포로서 사용되었고, 방사선 조사된(3,000 Rad) 인간 말초혈액 유래된 단핵구(PBMC)의 동등한 양(10⁵개)과 또는 태반으로부터 생산된 2D 또는 3D 배양된 유착성 간질세포, 또는 유착성 간질세포 및 PBMC의 조합과 공동-배양하여 자극되었다. 각 검정법은 세 번 반복되었다. 세포는 96-웰 플레이트에서 RPMI 1640 배지(20% FBS를 함유하며 습한 5% CO₂ 대기 하에서 37℃로)로 4일 동안 공동-배양되었다. 플레이트는 배양의 마지막 18시간 동안 1 μC의 ³H-티미딘으로 펄스 표지되었다. 다음으로 세포는 섬유유리 필터 위에서 수확되었고 티미딘 흡수는 섬광계수기로 정량되었다.

결과

도 7은 PBMCs로 자극될 때 이들 세포의 증가된 증식에 의해 재연되는 바와 같은 CB 세포의 면역 반응을 보여주고, 이는 이론에 얽매이지 않더라도 아마도 HLA 비적합성에 반응한 T 세포 증식과 연관된다. 그러나, 상당하게 더 낮은 수준의 면역 반응이 본 발명의 유착성 간질세포과 인큐베이션될 때 이들 세포에 의해 나타났다. 게다가, PBMC에 대한 CB 면역 반응은 이들 유착성 세포과 공동-인큐베이션될 때 실질적으로 감소되었다. 따라서, ASC는 GvHD에 전형적인 공여자 세포의 T 세포 증식을 감소시키는 잠재적인 능력을 가지는 것으로 확인되었다. 2D 및 3D 배양물 둘 다가 림프구들의 면역 반응을 감소시켰고 본 명세서에서 기술된 3D-ASC의 다른 장점들과 일치하였지만, 3D ASC는 더욱 면역억제적이었다.

실시예 3

태반 유래된 3D- ASC의 HSC 접목을 개선하는 능력의 평가

HSC 접목의 3D-ASC 지지는 치사 이하로 방사선 조사되거나 화학요법이 미리 처리된 면역 결핍 NOD-SCID 마우스에서 검출된 인간 조혈세포(hCD45+)의 수준에 의해 평가되었다.

재료 및 실험적 절차

CD34+ 세포의 분리 - 제대혈 혈액 시료가 분만 시 무균의 조건하에서 채취되었고(Bnei Zion Medical Center, Haifa, 이스라엘) 단핵세포가 림포프렙(Lymphoprep, Axis-Shield PoC As, Oslo, 노르웨이) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분획화되었으며 동결보존되었다. 해동된 단핵세포는 세척되었고 항-CD34 항체들과 인큐베이션되었으며 미디 MACS(Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, 독일)을 사용하여 분리되었다. 하나 이상의 시료로부터 세포가 원하는 양(50,000 내지 100,000개 세포)을 달성하기 위해 풀 형성되었다.

방사선 조사된 마우스에서 이식된 세포의 검출 - 7주령 수컷 및 암컷 NOD-SClD 마우스(NOD-CB 17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot 이스라엘)이 무균의 개방 시스템 사육상자에서 무균의 식사들 및 멸균된 산성 물을 주어 유지되었다. 마우스는 치사 이하로 방사선(350 cGy) 조사되었고, 이후 (방사선 조사-후 48시간째) 50,000 내지 100,000개 hCD34+ 세포로, 태반 또는 지방 조직으로부터 (각각의 그룹에서 3 내지 7마리 마우스) 유래된 추가적인 ASC(0.5 × 10⁶ 내지 1 × 10⁶개)가 있거나 없이 측면 꼬리 정맥으로 정맥내 주사에 의해 이식되었다. 이식에 이어서 4 내지 6주째, 마우스는 탈골에 의해 희생되었으며 BM은 대퇴골 및 경골 둘 다를 FACS 완충액(50 ml PBS, 5 ml FBS, 0.5 ml 소듐 아자이드 5%)으로 세척하여 수집되었다. 마우스 BM에서 인간 세포는 유동 세포측정법에 의해 검출되었고, 처리된 NOD-SCID 마우스에서 인간 및 마우스 CD45 조혈세포 마커를 발현하는 세포의 백분율은 세포를 인간 CD45-FITC(IQ Products, Groningen, 네덜란드)과 인큐베이션하여 측정되었다. 명백한 인간 접목을 위한 가장 낮은 역치는 0.5%로 지정되었다.

화학요법으로 처리된 마우스에서 이식된 세포의 검출 - 상기 본 명세서에서 방사선 조사된 마우스의 경우에 기술된 바와 같이 유지된 6.5주령 수컷 NOD-SClD 마우스(NOD.CBI7/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot 이스라엘)는 부설판(25 mg/kg - 연속 2일 동안)으로 복강내 주사되었다. 두 번째 부설판 주사에 이어서 2일째, 마우스는 CD34+ 세포 단독, 또는 태반으로부터 생산된 0.5 × 10⁶개 ASC와 함께 주사되었다. 이식에 이어서 3.5주째, 마우스는 희생되었고, 인간 조혈세포의 존재가 방사선 조사된 마우스의 경우에 기술된 바와 같이 결정되었다.

결과

3D- ASC는 방사선 조사된 마우스에서 HSC의 접목을 개선하였다 - 인간 CD34+ 조혈세포 및 태반 또는 지방세포로부터 유래된 3D-ASC가 방사선 조사된 NOD-SCID 마우스에 공동-이식되었다. 접목 효율은 공동-이식에 이어서 4주째 평가되었고, HSC 단독으로 이식된 마우스와 비교되었다. 표 2 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 3D-ASC 및 UCB CD34+ 세포의 공동-이식은 UCB CD34+ 세포 단독으로 처리된 마우스와 비교 시 수여자 마우스의 BM에서 상당하게 더 높은 접목율 및 인간 세포의 더 높은 수준을 가져왔다.

도 14는 3D-ASC의 서로 다른 회분 및 용량의 경우에 hCD45+ 세포의 백분율을 보여주는 접목 결과를 나타낸다. 유사한 접목 결과가 방사선 조사 대신에 부설판이 사용되었을 때 획득되었고, 방사선 조사 또는 화학요법으로 인해 손상된 내인성 조혈 체계를 치료하기 위해 조합된 처리의 효능 및 상승작용도 역시 도시한다.

3D- ASC는 화학요법으로 처리된 마우스에서 HSC의 접목을 개선하였다 - 인간 CD34+ 조혈세포가 태반으로부터 유래된 500,000개의 2D-ASC 또는 3D-ASC와 함께 화학요법으로 미리 처리된 NOD-SCID 마우스 내로 공동-이식되었다. 접목 효율은 공동-이식에 이어서 3.5주째 평가되었고, HSC 단독으로 이식된 마우스와 비교되었다. 표 3에서 나타낸 바와 같이, ASC 및 UCB C034+ 세포의 공동-이식은 UCB CD34+ 세포 단독과 비교 시 수여자 마우스의 BM에서 더 높은 접목 수준을 가져왔다.

게다가 표 3에서 나타낸 바와 같이, 접목의 평균 수준은 통상적인 정지 2D 배양 조건(플라스크)에서 성장된 동일한 공여자로부터 얻은 세포로의 마우스 공동-이식보다 PluriX 생물반응기 시스템에서 성장된 태반 유래된 유착성 간질세포(3D-ASC)들로 공동-이식된 마우스에서 더 높았다.

도 6a 및 6b에 나타낸 FACS 분석 결과는 ASC의 hHSC과의 공동-이식의 장점(도 6b), 및 HSC 이식에 이어서 조혈 체계의 회복을 개선하는 ASC의 능력을 보여준다.

종합하면, 이들 결과는 ASC가 HSC 이식(자가유래 또는 동종이형)에 이어서 조혈 체계를 개선하도록 지지적 세포로서 작용할 수 있는 점을 보여준다. HSC 이식에 이어서 조혈 줄기 및/또는 전구체 세포 접목을 증진하는 3D-ASC의 능력은 이식된 세포의 귀소, 자가-재생 및 증식 능력을 개선할 수 있는 HSC 지지 사이토카인을 분비하는 3D-ASC 능력으로부터, 또는 이식가능한 HSC의 귀소 및 증식을 위해 필요한 손상된 조혈 미세환경을 재건하는 이들 세포의 능력으로부터 기인할 수 있다.

실시예 4

방사선 조사 및 화학적 손상에 이어서 HSC 회복을 개선하는 태반 유래된 3D- 유착성 간질세포의 능력의 평가

수여자의 내인성 HSC 회복의 3D-유착성 간질세포의 지지는 치사 이하로 방사선 조사되거나 화학요법으로 미리 처리된 면역 결핍 NOD-SCID 마우스에서 검출된 마우스 조혈세포(mCD45+)의 수준에 의해 평가되었다.

재료 및 실험적 절차

방사선 조사된 마우스에서 회복된 세포의 검출 - 7주령 수컷 및 암컷 NOD-SClD 마우스(NOD-CB 17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot 이스라엘)가 무균의 개방 시스템 사육 상자에서 무균의 식사들 및 멸균된 산성 물을 주어 유지되었다. 마우스는 치사 이하로 방사선(350 cGy) 조사되었고, 이후 (방사선 조사-후 48시간째) 50,000-100,000개 hCD34+ 세포로, 2D 또는 3D 조건하에서 성장된 태반으로부터 유래된 (각각의 그룹에서 3 내지 7마리 마우스) 유착성 간질세포(0.5 × 10⁶ 내지 1 × 10⁶개)이 있거나 없이 이식되었다. 세포는 측면 꼬리 정맥으로 정맥내 주사에 의해 투여되었다. 이식에 이어서 4 내지 6주째, 마우스는 탈골에 의해 희생되었으며 BM은 대퇴골 및 경골 둘 다를 FACS 완충액(50 ml PBS, 5 ml FBS, 0.5 ml 소듐 아자이드 5%)으로 세척하여 수집되었다. 처리된 NOD-SCID 마우스에서 마우스 CD45 조혈세포 마커를 발현하는 세포의 측정은 마우스 조혈 체계의 회복을 나타내는 항-마우스 CD45-FITC(IQ Products, Groningen, 네덜란드)와 인큐베이션하여 효과를 내었다.

화학요법으로 처리된 마우스에서 회복된 세포의 검출 - 본 명세서에서 방사선 조사된 마우스의 경우에 기술된 바와 같이 유지된 6.5주령 수컷 NOD-SClD 마우스(NOD.CBI7/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot 이스라엘)는 부설판(25 mg/kg - 연속 2일 동안)으로 복강내 주사되었다. 두 번째 부설판 주사에 이어서 2일째, 마우스는 CD34+ 세포 단독, 또는 태반으로부터 생산된 0.5 × 10⁶개의 유착성 간질세포로 주사되었다. 이식에 이어서 3.5주째, 마우스는 희생되었고, 인간 조혈세포의 회복이 본 명세서에서 방사선 조사된 마우스의 경우에 기술된 바와 같이 결정되었다.

결과

3D- 유착성 간질세포는 방사선 조사된 마우스에서 HSC의 접목을 개선하였다 - 인간 CD34+ 조혈세포 및 태반 또는 지방조직으로부터 유래된 3D-유착성 간질세포가 방사선 조사된 NOD-SCID 마우스에 공동-이식되었다. 마우스 조혈 체계의 회복 효율은 공동-이식에 이어서 4주째 평가되었고, 태반 유착성 간질세포 없이 hHSC으로 이식된 마우스에서 자가 회복과 비교되었다. 표 4에서 나타낸 바와 같이, 2D 및 3D-유착성 간질세포 그리고 UCB CD34+ 세포의 공동-이식은 mCD45의 발현 수준에 의해 반영된 바와 같이 UCB CD34+ 세포 단독으로 처리된 마우스와 비교 시 상당하게 더 높은 회복 속도들을 가져왔다. 개선은 3D 확장된 세포에서 더 높았던 점을 주목한다.

3D- 유착성 간질세포는 화학요법으로 처리된 마우스에서 HSC의 접목을 개선하였다 - 인간 CD34+ 조혈세포가 태반 유래된 유착성 간질세포과 함께 화학요법으로 미리 처리된 NOD-SCID 마우스 내로 공동-이식되었다. 수여자 마우스 조혈 체계의 회복 효율은 공동-이식에 이어서 3.5주째 평가되었고, HSC 단독으로 이식된 마우스와 비교되었다. 표 5에서 나타낸 바와 같이, 유착성 간질세포 및 UCB CD34+ 세포의 공동-이식은 UCB CD34+ 세포 단독과 비교 시 수여자 마우스의 조혈 체계의 더 높은 회복 수준을 가져왔다. 게다가 표 5에서 나타낸 바와 같이, 회복의 평균 수준은 투여된 유착성 간질세포의 수에 용량 의존적이었다.

도 8a 및 8b에 나타낸 FACS 분석 결과는 hHSC 단독(도 8a)과 비교 시 지방세포 유래된 유착성 간질세포과 hHSC의 공동-이식의 장점(도 8b), 및 수여자 조혈 체계의 회복을 개선하는 유착성 간질세포의 능력을 보여준다.

도 8a 및 8b는 또한 본 발명의 유착성 간질세포의 이식 또는 투여에 이어서, 수여자의 내인성 조혈 체계가 실질적으로 회복되었던 점을 보여준다. 이것은 내인성 조혈세포의 계수가 증가하면서 결과로 얻어졌다. 본 발명의 유착성 간질세포는 무엇보다도 특히 수여자의 내인성 조혈 체계 및/또는 성분의 회복을 개선하거나 유도하였다. 아마도 회복은 조절된 조혈세포 분화 및 증식을 위해 필요한 용해성 또는 정착성 사이토카인을 제공하여 용이하게 된다.

실시예 5

방사선 조사된 마우스의 생존에 미치는 3D-ASC(PLX) 세포의 효과는 방사선 조사(850 cGy) 이후 24시간째 C3H 마우스 내로 3D 확장된 ASC의 정맥내 투여에 이어서 조사되었다.

재료 및 실험적 절차

준비. 마우스(C3H 수컷, 20 그램, 약 8주령)는 하란사로부터 구입되었다. 동물은 실험 이전에 순화를 위해 SPF 시설에 1주 동안 가두었다. 30마리의 C3H 수컷 마우스는 전신 방사선 조사(850 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사 이후 24시간째, 15마리의 마우스는 250 μL 플라스마라이트 A/마우스에 넣은 3D-ASC 세포(1 × 10⁶개)로 측면의 꼬리 정맥들의 하나로 느린 정맥내 주사(약 1분)에 의해 주사되었다. 세포는 응집을 방지하도록 주사 단계를 따라 모두 부드럽게 혼합되었다. 남아있는 15마리 마우스의 대조군 그룹은 동일한 부피(250 μL)의 플라스마라이트 A(운반체)로 주사되었다.

9일째, 각각의 그룹으로 나온 3마리의 동물이 추가적인 3마리의 대조군 마우스(방사선 조사되지 않거나 3D-ASC 세포로 주사됨)와 함께 희생되었다. 비장들 및 골수가 수확되었다. BM에서 전체 핵형성된 세포수가 계수되었고 비장들에는 콜로니 형성 검정법이 시행되었다.

남아있는 마우스의 생존에 대한 추적이 23일 동안 수행되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건하에서 감시되었다. 동물은 조사되었고 매주 2 내지 3번 무게 측정되었다. 최종 시간대까지 생존한 마우스는 CO₂ 흡입에 의해 희생되었으며 그들의 BM은 핵형성된 BM 세포수 측정을 위해 수확되었다.

결과

도 9는 BALB/c 및 C3H 마우스에서 두 번 용량의 이온화 방사선 이후 (3D-ASC 처리 없이) 마우스 생존의 추적을 나타낸다.

도 10은 방사선 미조사된 C3H 및 BALB/c 마우스의 무게 변화에 미치는 서로 다른 용량의 3D-ASC(PLX) 세포의 효과를 나타내고, 0.5 및 1 × 10⁶개 세포 용량의 정맥내 주사의 안전성을 도시한다.

도 11은 방사선에 대한 노출에 이어지는 C3H 마우스 생존(패널 A) 및 정규화된 무게 변화(패널 B)을 나타낸다. "PLX"는 3D-ASC 세포로의 처리를 표시한다. "운반체"는 PLX 세포 없이 플라스마라이트 A를 수여받은 대조군 마우스를 표시한다.

도 12는 PLX 세포로 미처리(왼쪽) 또는 처리된(오른쪽) 방사선 조사된 마우스에서 고정된 비장 무게를 나타내고, 또한 마우스의 해당하는 그룹으로부터 제조된 예시적인 비장들을 도면으로 나타낸다. 제조는 C3H 마우스가 치사-이하의 방사선 조사에 노출된 이후 9일째 수행되었고, 3D-ASC(PLX) 주사로 이어졌다. BM 세포 재생은 비장 콜로니 형성 검정법에 의해 테스트되었다. 전구체 세포로부터 기원된 콜로니들은 BM으로 재현탁되었다.

도 13은 골수 전구체 세포 재군집을 나타낸다. 핵형성된 BM 세포는 마우스의 양 뒷다리의 대퇴골 및 경골로부터 PBS로 세척하고 이어서 용출 용액을 사용한 RBC 용출을 시행하여 수집되었고 다음으로 직접적 계수에 의해 측정되었다. 방사선 미조사된 마우스에서 정상적 BM 세포 계수는 약 30 × 10⁶개의 범위이다. 3D-ASC(PLX)로 처리된 마우스는 방사선에 대한 노출에 이어서 9일 및 23일 이후에 훨씬 더 높은 수준의 총 핵형성된 골수세포를 가졌다.

요약하면, 치사 이하로 방사선 조사된 마우스에 미치는 3D-ASC 처리의 효과의 다음의 관점들이 기술되었다: 조직 조직학(폐들, 비장, 장들, 간, 피부), BM 세포의 전체 수의 함수로서 BM 재구성, 비장 콜로니들 및 생존.

실시예 6

방사선 조사된 마우스의 생존에 미치는 3D-확장된 태반으로부터 얻은 유착성 간질세포(PLX)의 효과는 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간째 C3H 마우스 내로 정맥내 투여에 이어서 조사되었다.

재료 및 실험적 절차

준비. 마우스(C3H 수컷, 20 그램, 약 6주령)는 하란사로부터 구입되었다. 동물은 실험 시작 이전에 순화를 위해 SPF 시설에 2주 동안 가두었다. 30마리의 C3H 수컷 마우스는 전신 방사선(770 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사 이후 24시간째, 15마리의 마우스는 250 μL 플라스마라이트 A/마우스에 넣은 3D-ASC 세포(1 × 10⁶개)로 측면의 꼬리 정맥들의 하나로 느린 정맥내 주사(약 1분)에 의해 주사되었다. 세포는 응집을 방지하도록 주사 단계를 따라 모두 부드럽게 혼합되었다. 남아있는 15마리 마우스의 대조군 그룹은 동일한 부피(250 μL)의 플라스마라이트 A(운반체)로 주사되었다.

8일째, 각각의 그룹으로 나온 3마리의 동물이 추가적인 3마리의 대조군 마우스(방사선 조사되지 않거나 3D-ASC 세포로 주사됨)와 함께 희생되었다. 완전한 혈액화학(CBC)를 위한 혈액이 희생 이전에 수집되었다. 골수(BM)가 수확되었고 BM에서 전체 핵형성된 세포수가 계수에 의해 결정되었다. 간, 폐, 및 장은 조직학을 위해 고정되었다.

남아있는 마우스의 생존에 대한 추적이 18일 동안 수행되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건하에서 감시되었다. 동물은 조사되었고 매주 2 내지 3번 무게 측정되었다. 최종 시간대까지 생존한 마우스는 CO₂ 흡입에 의해 희생되었다. 희생 이전에, 안와후방 굴(retro-orbital sinus)로부터 혈액이 CBC를 위해 수집되었다. 그 후, 골수가 수확되었다. 1개의 다리(경골 및 대퇴골)로부터 전체 세포 핵형성된 BM 세포 양이 직접적인 계수에 의해 측정되었고, 도말들이 다른 다리(경골 및 대퇴골)로부터 준비되었다. 간, 폐, 및 장이 조직학을 위해 수집되었다.

결과

PLX 세포로 처리된 마우스(채워진 원들) 및 PLX 처리를 받지 않은 마우스(비어있는 원들)에 대한 770 cGy의 용량으로 방사선 조사에 이어지는 생존이 도 17에 나타나 있다. 도 18은 18일에 걸친 시간으로 무게 변화를 정규화된 무게 변화(도 18a) 또는 평균 무게 변화(도 18b) 둘 중 하나로서 나타낸다.

도 19는 대조군, 운반체 처리된, 및 PLX 처리된 마우스의 경우에 8일째(도 19a; 모든 그룹 n = 3) 및 18일째(도 19b; 대조군 n = 2, PLX n= 9, 및 운반체 n = 1) 전체 골수세포 계수(한쪽 면의 경골 및 대퇴골)를 나타낸다. 8일에, PLX 그룹의 BM 세포의 수는 대조군들의 수와 유사하였던 반면, 운반체 그룹에서 BM 세포의 수는 훨씬 더 낮았다. 18일에 골수세포의 수는 더 낮았지만, 그룹이 운반체 처리된 것과 대비하여 PLX 그룹에서 더 높은 세포 수의 동일한 경향을 보여주었다.

도 20은 8일(도 20a) 및 18일(도 20b)에 서로 다른 그룹에서 적혈구(RBC) 수을 나타낸 것이다. 18일에 방사선 조사된 그룹에서 RBC 수은 대조군 마우스와 대비하여 매우 낮았다. 그러나, 대부분의 PLX 처리된 마우스에서 RBC 수는 운반체 처리된 마우스에서보다 더 높았다.

도 21a 및 21b에서 8일(도 21a) 및 18일(도 21b)에 백혈구(WBC) 계수가 비교되었다. WBC는 8일에 방사선 조사된 마우스 그룹 둘 다에서 급하게 감소되었다. 계수는 18일에 여전히 낮았다.

도 22a 내지 22d는 8일(도 22a 및 22c) 및 18일(도 22b 및 22d)에 핵형성된 RBC를 위한 데이타를 나타낸다. 상부 그래프(도 22a 및 22b)은 핵형성 RBC, 미성숙한 세포 유형의 백분율을 제시하고, 저부 그래프(도 22c 및 22d)은 마이크로리터 당 핵형성 RBC × 10³개의 절대적 수을 제시한다. 핵형성된 RBC의 백분율 및 전체 수 둘 다는 대조군 마우스와 대비하여 증가되었다. 18일에, 단독 생존한 운반체 대조군 마우스는 적은 세포를 가져서 계수는 부정확하였고 보고되지 않았다.

측정된 다른 혈액 매개변수은 헤모글로빈(도 23), 혈소판 수(도 24), 및 적혈구 용적율(도 25)을 포함하였다. 각각의 도면에서 패널 A는 8일의 결과를 제시하는 한편, 패널 B는 18일의 결과를 제시한다. RBC 계수로서, 헤모글로빈은 PLX 세포로 처리된 마우스와 대비하여 운반체 대조군의 경우 둘 다의 시간대들에서 감소되었다. 혈소판 수도 역시 운반체 대조군들과 대비하여 PLX 처리된 마우스에서 증가되었다. 적혈구 용적율도 역시 운반체 대조군들과 대비하여 PLX 마우스에서 가능하게 증가되었다. 방사선 미조사된 대조군 마우스도 역시 각 해당일 및 검정법에 대해 비교로서 경우에 제시된다.

결론

이들 결과는 사용된 방사선 조사의 용량이 사용된 마우스 품종에서 치사량이라는 점을 보여준다. 770 cGy에서, 12마리 마우스 중 1마리만이 운반체 처리된 그룹에서 18일까지 생존하였다(8%의 생존율). PLX 세포의 정맥내 주사는 동일한 용량의 방사선 조사에 이어서 생존 마우스의 분획을 75%(9/12)까지 증가시킨다. 추적 기간 전체를 통하여, PLX 처리된 마우스는 운반체 처리된 마우스보다 더 잘 먹었다. 18일째 PLX 마우스는 평균 체중 증가가 있었던 반면, 단일 생존한 운반체 처리된 마우스는 여전히 무게가 감소되었다. IV PLX 주사로 처리된 그룹도 역시 8일 및 18일째 둘 다에서 더 높은 골수세포 계수를 가졌다. 혈액 매개변수도 역시 일반적으로 PLX 처리된 마우스, 특히 18일에 RBC 및 혈소판에서 더 좋았다. 이들 효과은 감소된 생존 단계의 개시 이전인 8일째 덜 분명하였다.

실시예 7

방사선 조사된 마우스의 혈청 사이토카인 프로파일에 미치는 태반으로부터 얻은 3D-확장된 유착성 간질세포(PLX)의 효과는 C3H 마우스 내로 정맥내 투여에 이어서 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간, PLX 투여에 이어서 1일 및 4일째 조사되었다.

재료 및 실험적 절차

준비. 마우스(C3H 수컷, 20 그램, 약 6주령)는 하란사로부터 구입되었다. 동물은 실험 이전에 순화를 위해 SPF 시설에 2주 동안 가두었다. 4마리의 마우스는 미처리된 대조군 마우스로서 작용하였던 한편, 26마리의 마우스는 770 cGy로 방사선 조사되었다. 방사선 조사 이후 24시간째, 8마리 마우스는 PLX로 IV 주사되었고 8마리 마우스는 플라스마라이트로 주사되었다. 6마리 마우스는 IV 주사 이후에 예기치 않은 치사의 경우에 예비로 보관되었다. PLX 주사 이후 1일 및 4일째, 동맥 혈액이 2마리의 대조군 방사선 미조사된 마우스, 2마리의 대조군-방사선 조사된, 4마리의 운반체-주사된 마우스, 및 4마리의 PLX-주사된 마우스로부터 수집되었다. 혈청이 혈액으로부터 분리되었고, 다음으로 650 μL의 충분한 부피를 수득하도록 각각 2마리의 마우스로부터 얻은 것을 함께 풀을 형성하였다. 수집된 혈청들은 다음의 사이토카인/성장인자 IL1A, IL1B, IL2, IL4, IL6, ILlO, ILl2, IL17A, IFNγ, TNFα, G-CSF, 및 GM-CSF에 대해 "마우스 염증성 사이토카인 다중-분석물 ELISArray 키트"(SABiosciences; cat# MEM-004A)로 분석될 때까지 -20℃에서 보관되었다.

결과

도 26a 및 26b는 PLX 세포 또는 운반체로의 주사에 이어서 1일(도 26a) 및 4일(도 26b)에 사이토카인 프로파일들을 나타낸다. 가장 현저한 변화는 방사선 조사로 처리된 모든 마우스에서 G-CSF 수준의 증가이었다.

실시예 8

방사선 조사된 마우스의 생존에 미치는 3D-ASC(PLX) 세포의 효과가 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간째 C3H 마우스 내로 3D 확장된 ASC의 근육내 투여에 이어서 조사되었다.

재료 및 실험적 절차

준비. 마우스(C3H 수컷, 약 24 그램, 7주령)는 하란사로부터 구입되었다. 동물은 실험 이전에 순화를 위해 SPF 시설에 2주 동안 가두었다. C3H 수컷 마우스는 전신 방사선(770 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사 이후 대략 24시간째, 12마리 마우스("방사선 조사 + PLX" 그룹)는 인슐린 주사기 및 25 g 바늘을 사용하여 50 μL의 3D-ASC 세포(플라스마라이트 A에 넣은 20 × 10⁶개 세포/mL로 회분 PD061210 153B04)이 2 × 10⁶개 세포/마우스의 전체 용량으로 각각의 꼬리 근육 내로 주사되었다. 두 번째 그룹("방사선 조사 + PLX-2X")은 동일한 초기 주사를 수여받았지만, 추가적으로 4일 간격 이후 각각의 꼬리 근육 내로 근육내 주사에 의해 두 번째 2 × 10⁶개 3D-ASC를 수여받았다. 모든 주사들을 위해, 세포는 응집을 방지하도록 주사 단계를 따라 부드럽게 혼합되었다. 방사선 조사된 마우스의 대조군 그룹은 동일한 부피(전체 100 μL, 꼬리 근육 당 50 μL)의 플라스마라이트 A(운반체)로 동일한 방식으로 근육내 주사되었다.

마우스는 21일 동안 추적되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건하에서 감시되었다. 동물은 조사되었고 생존한 마우스는 매주 세 번 무게 측정되었다. 최종 시간대까지 생존하였던 마우스는 희생되었고 그들의 BM은 핵형성된 BM 세포 측정을 위해 수확되었다.

결과

도 27은 770 cGy 이온화 방사선이 주어진 C3H 마우스에서 마우스 생존(도 27a) 및 무게 변화(도 27b)를 나타낸다. 방사선 조사에 이어서 1일 및 5일에(원들) 2 × 10⁶개 세포/용량의 두 번의 근육내 주사들을 수여받은 마우스는 방사선 조사 이후 1일째 단일 근육내 주사를 수여받은 마우스 또는 PLX 세포를 수여받지 않은 방사선 조사된 대조군 마우스와 대비하여 개선된 생존을 가졌다.

실시예 9

방사선 조사된 마우스의 생존에 미치는 태반으로부터 유래된 3D-확장된 유착성 간질세포의 효과가 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간 및/또는 5일째 C3H 마우스 내로 3D-확장된 ASC의 두 가지 다른 용량(1 또는 2백만 개 세포/주사)의 근육내 투여에 이어서 조사되었다.

재료 및 실험적 절차

44마리의 C3H 마우스가 하다사 헤브류 대학 의학센터의 슈레트 종양학 연구소에서 전신 방사선(770 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사된 마우스는 4가지 그룹(11마리 마우스/그룹)로 분할되었고 다음과 같이 처리되었다:

1. 1 × 10⁶개 PLX 세포로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 24시간 및 방사선 조사 이후 5일(주사된 전체 세포수 2 × 10⁶개).

2. 2 × 10⁶개 PLX 세포로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 24시간 및 방사선 조사 이후 5일(주사된 전체 세포수 4 × 10⁶개).

3. 2 × 10⁶개 PLX 세포로 방사선 조사 이후 5일에 한 번 주사되었다.

4. 대조군 그룹으로서 플라스마라이트 A(운반체)만으로 주사되었다.

모든 주사들은 100 마이크로리터 플라스마라이트 A/마우스로 근육내로(IM) 수행되었다(각각의 다리의 2개 근육 부위들 내로 25 마이크로리터 × 2로서 각각의 다리의 근육들로 50 마이크로리터 주사).

마우스의 생존을 위한 추적은 23일 동안 감시되었다. 동물은 매일 조사되었고 매주 3번 무게 측정되었다. 결정적인 시간대들에서 동물은 매일 두 번 테스트되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건에서 감시되었다.

23일에 생존한 마우스는 2마리의 추가적인 방사선 미조사된 마우스와 함께 안와후방 굴(retro-orbital sinus)로부터 얻은 혈액을 사용하여 완전한 혈액화학(CBC)에 대해 조사되었다. 다음으로 마우스는 희생되었고 골수는 수확되었다. 각각의 생존한 동물의 대퇴골 및 경골 둘 다에서 골수세포의 전체 수도 역시 계수되었다.

결과

도 28a 및 28b는 770c Gy의 용량으로 방사선 조사에 이어서 생존(도 28a) 및 평균 무게 변화(도 28b)를 나타낸다. 운반체(세모)로 처리된 11마리 마우스 중 3마리는 감시하는 기간에 생존하였다. 2 × 10⁶개 PLX 세포로 처리된 11마리 마우스 중 5마리가 단지 5일에(비어있는 원들) 생존하였다. 1 × 10⁶개 PLX 세포로 처리된 11마리 마우스 중 9마리가 1일 및 5일에(채워진 원들) 생존하였다. 2 × 10⁶개 PLX 세포가 1일 및 5일에 투여되었을 때(채워진 원들의 첨단 집단), 11마리 마우스 중 10마리가 생존하였다.

각각의 그룹의 골수세포의 경우 23일에 평균 세포 계수는 도 29에 제시된다. 생존 데이타와 일치하여, 1일 및 5일에 2 × 10⁶개 PLX 세포로 처리된 마우스는 가장 높은 골수 계수를 가졌다.

도 30a 내지 30d에서는 실험의 종결 시(23일) 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC) 계수가 나타나 있다. 각각의 마우스를 위한 개별 계수는 패널들 A(WBC) 및 B(RBC)에 제시된다. 패널들 C(WBC) 및 D(RBC)는 각각의 그룹을 위한 데이타 풀을 제시한다. 다시 한 번, 1일 및 5일에 2 × 10⁶개 PLX 세포로 처리된 마우스는 마우스 간의 다양성이 존재하더라도 WBC 및 RBC 둘 다의 경우에 가장 높은 평균 계수를 가졌다. 운반체 처리된 마우스에 대한 평균 세포 계수과 대비하여, 1일 및 5일에 2 × 10⁶개 PLX 세포 그룹을 위한 WBC 및 RBC 계수는 유의하게 증가되었다(p < 0.0001). RBC의 평균 수도 역시 1일 및 5일에 1 × 10⁶개 PLX 세포 그룹에서(p < 0.001) 및 5일에만 2 × 10⁶개 PLX 세포 그룹(p < 0.05)에서 운반체 처리된 마우스와 대비하여 유의하게 증가되었다.

도 31a 및 31b은 개별 마우스(도 31a) 및 평균된 그룹(도 31b)을 위한 23일 혈소판 계수를 나타낸다. 혈소판 계수에서 증가는 1일 및 5일에 2 × 10⁶개 PLX 세포 그룹에서 가장 컸다. 이러한 증가는 운반체 처리된 마우스와 통계학적으로 유의하게 대비되었다(p < 0.005).

도 32a 내지 32d는 개별 마우스(도 32a, 32b) 및 그룹에 의해 평균된 수치들(도 32c, 32d)을 위한 헤모글로빈(도 32a, 32c) 및 적혈구 용적율(도 32b, 32d)의 23일 결과를 나타낸 것이다. 이들 매개변수을 위해, 모든 그룹은 운반체 처리된 마우스와 대비하여 유의한 증가를 보여주었지만, 다시 한 번 증가는 1일 및 5일에 2 × 10⁶개 PLX 세포 그룹에서 가장 컸다.

실시예 10

방사선 조사된 마우스의 생존에 미치는 태반으로부터 유래된 3D-확장된 모성의 유착성 간질세포의 3D-확장된 혼합된 모성/태아 PLX 세포과 대비한 효과가 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간 및 5일째 C3H 마우스 내로 3D 확장된 ASC의 2백만 개 세포/주사의 근육내 투여에 이어서 조사되었다.

적어도 약 90%의 모성-유래된 세포가 존재하는 (유전자형 또는 핵형을 기초로 함) 태반-유래된 유착성 간질세포가 "모성" PLX 세포로서 사용되었다. "혼합된" PLX 세포는 약 70%의 모성-유래된 세포 및 약 30%의 태아 유래된 세포를 포함하였다.

27마리의 9주령 C3H 마우스가 하다사 헤브류 대학 의학센터의 슈레트 종양학 연구소에서 전신 방사선(770 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사된 마우스는 3가지 그룹(9마리 마우스/그룹)로 분할되었고 다음과 같이 처리되었다:

1. 2 × 10⁶개 세포/마우스로 PLX-1(혼합)로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 24시간 및 5일(주사된 전체 세포수 - 4 × 10⁶개).

2. 2 × 10⁶개 세포/마우스에서 PLX-2(모성)로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 24시간 및 5일(주사된 전체 세포수 - 4 × 10⁶개).

3. 플라스마라이트 A(운반체)로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 24시간 및 5일.

모든 주사들은 100 마이크로리터 플라스마라이트 A/마우스로 근육내로(IM) 수행되었다(2개 근육 부위들 내로 25 마이크로리터로서 각각의 다리의 근육들로 50 마이크로리터 주사).

생존은 23일 동안 감시되었다. 동물은 매일 조사되었고 매주 3번 무게 측정되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건에서 감시되었다.

23일에 생존한 마우스는 2마리의 추가적인 방사선 미조사된 마우스와 함께 안와후방굴(retro-orbital sinus)로부터 얻은 혈액을 사용하여 완전한 혈액화학(CBC)에 대해 조사되었다. 마우스는 희생되었고 골수는 수확되었다. 각각의 생존한 동물의 대퇴골 및 경골 둘 다에서 골수세포의 전체 수도 역시 계수되었다.

결과

도 33a 및 33b는 770cGy의 용량으로 방사선 조사에 이어서 생존(도 33a) 및 평균 무게 변화(도 33b)를 나타낸다. 혼합된 PLX 세포(네모; 9/9마리 생존함)은 둘 다의 그룹이 운반체 처리된 마우스(다이아몬드; 3/9마리 생존함)와 대비하여 개선된 생존을 가졌더라도, 모성의 PLX(세모; 7/9마리 생존함)보다 더 나은 23일 생존을 유도하였다. 도 33b에서 나타난 바와 같이, 혼합된 PLX 세포로 처리된 마우스는 그들의 초기 무게의 더 높은 백분율도 역시 보유하였다.

도 34a 내지 34d에서는 23일 혈액학 결과를 나타낸다. 도 34a는 전체 골수 계수를 제시하고, 도 34b는 백혈구 세포 계수를 제시하며, 도 34c는 적혈구 세포 계수를 제시하고, 도 34d는 혈소판 계수를 제시한다. 도 35는 23일에서의 헤모글로빈(도 35a) 및 적혈구 용적율(도 35b)을 나타낸 것이다. 각각의 매개변수을 위해, 혼합된 PLX 세포는 운반체 또는 모성의 PLX-처리된 마우스와 대비하여 더 나은 회복 수치들을 유도하였다.

결론

I.M. 투여된 PLX 세포의 모성 및 혼합된 회분 둘 다는 생존을 개선하였다. 혼합된 PLX 회분은 더욱 효율적으로 생존율을 개선하였다. 혼합된 PLX는 BM 핵형성된 세포 및 말초혈액 차별적 계수 매개변수에 의해 나타난 바와 같이 BM 재군집의 효과를 내는 데도 역시 더욱 효율적이었다.

실시예 11

방사선 조사된 마우스의 혈청 사이토카인에 미치는 태반으로부터 얻은 3D-확장된 모성의 유착성 간질세포(PLX)들의, 태반으로부터 얻은 3D-확장된 혼합된 모성/태아 유착성 간질세포과 대비한 효과가 방사선 조사(770 cGy) 이후 24시간 및 5일째 C3H 마우스 내로 3D-확장된 ASC의 2백만 개 세포/주사의 근육내 투여에 이어서 조사되었다.

15마리의 C3H 수컷(약 27 그램 무게, 9주령)은 전형적으로 8 MeV X-선(광자) 방사선 조사에 의해 전신의 770 cGy 용량에 노출되었다. 설정 및 정확한 용량 산정은 슈레트 연구소의 물리학자에 의해 계산되었다. 실험 동안 마우스는 SPF 조건하에서 유지되었고 감시되었다.

8일에, 1마리의 추가적인 대조군(세포 및 방사선 조사 전혀 없음) 마우스와 함께 마우스는 안와후방굴(retro-orbital sinus)로부터 얻은 혈액을 사용하여 CBC에 대해 분석되었다. 혈청들은 분리되었고 다음의 사이토카인/성장인자 IL1A, IL1B, IL2, IL4, IL6, IL1O, IL12, IL17A, IFNγ, TNFα, G-CSF, 및 GM-CSF에 대해 "마우스 염증성 사이토카인 다중-분석물 ELISArray 키트"(SABiosciences; cat# MEM-004A)를 사용하여 테스트되었다.

1개 다리(경골 및 대퇴골)로부터 얻은 골수는 골수 계수 평가를 위해 수확되었다. 또한, 두 번째 뒷다리 대퇴골은 탈석회화 및 조직병리학을 위해 보내졌다.

결과

도 36은 PLX 세포 또는 운반체로의 주사에 이어서 8일에 사이토카인 프로파일들을 나타낸다. G-CSF 수준은 방사선 조사로 처리된 모든 마우스에서 증가되었다. 이러한 증가는 모성의 PLX 세포로 처리된 마우스에서 가장 컸다.

도 37a 및 37d에서 나타난 바와 같이, 전체 골수 계수(도 37a), 백혈구 세포 계수(도 37b), 적혈구 세포 계수(도 37c), 및 혈소판 계수(도 37d)의 견지에서 방사선 조사된 그룹 간의 차이들이 23일의 정도로 8일에 명확하지 않았다. 그러나 혼합된 PLX 세포로 처리된 마우스는 가장 높은 골수 계수를 가졌다(도 37a).

도 38a 및 38b는 유사하게 적혈구 용적율(도 38a) 또는 헤모글로빈(도 38b)의 측면에서 8일에 방사선 조사된 그룹 중에서도 역시 거의 차이가 없는 점을 보여준다.

탈석회화된 대퇴골에 대한 조직학은 도 39에서 나타나 있다. 낮은 확대 복합 도면들의 왼쪽 상의 내부 네모는 각각의 시료의 오른쪽 상에 확대된다.

결론

전신적 염증성 발작이 방사선 조사 이후 8일에 마우스 혈청에서 검출되지 않았다. 주목가능한 변화는 단지 과립구 콜로니-자극인자(G-CSF) 수준에서 있었다. G-CSF는 과립구들 및 줄기세포를 생산하도록 골수를 자극하고 다음으로 그들을 혈액 내로 방출하도록 골수를 자극한다. G-CSF는 방사선 조사된 마우스에서, 특히 모성-PLX 주사된 그룹에서 증가되었다.

실시예 12

방사선 조사된 마우스의 생존, 혈액학적 매개변수, 및 혈청 사이토카인 미치는 3D-혼합된 (PLX) 세포과 대비한 3D-모성 (PLX) 세포의 효과가 방사선 조사(770 cGy) 이후 48시간 및 5일째 C3H 마우스 내로 3D 확장된 ASC의 2백만 개 세포/주사의 근육내 투여에 이어서 조사되었다.

36마리의 C3H 마우스가 하다사 헤브류 대학 의학센터의 슈레트 종양학 연구소에서 전신 방사선(770 cGy)에 노출되었다. 방사선 조사된 마우스는 3가지 그룹(12마리 마우스/그룹)로 다음과 같이 분할되었다:

1. 혼합된 2 × 10⁶개의 PLX 세포로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 48시간 및 5일(주사된 전체 세포수 - 4 × 10⁶개).

2. 모성의 2 × 10⁶개 PLX 세포로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 48시간 및 5일(주사된 전체 세포수 - 4 × 10⁶개).

3. 플라스마라이트 A로 두 번 주사되었다: 방사선 조사 이후 48시간 및 5일.

모든 주사들은 100 마이크로리터 플라스마라이트 A/마우스로 근육내로 수행되었다(각각의 다리의 2개 근육 부위들 내로 25 마이크로리터 × 2로서 각각의 다리의 근육들로 50 마이크로리터 주사).

23일에 생존한 마우스는 2마리의 추가적인 방사선 미조사된 마우스와 함께 안와후방굴(retro-orbital sinus)로부터 얻은 혈액을 사용하여 완전한 혈액화학(CBC)에 대해 조사되었다. 마우스는 희생되었고 골수가 수확되었다. 각각의 생존한 동물의 대퇴골 및 경골 둘 다에서 골수세포의 전체 수도 역시 계수되었다.

결과

도 40a 및 40b는 770cGy의 용량으로 방사선 조사 및 방사선 조사에 이어서 48시간 및 5일째 처리에 이어서 생존(도 40a) 및 평균 무게 변화(도 40b)를 나타낸다. 첫 번째 주사가 방사선 조사에 이어서 24시간째 주어지는 경우에서와 같이, 혼합된 PLX 세포(네모)은 둘 다의 그룹이 운반체 처리된 마우스(다이아몬드)과 대비하여 개선된 생존들을 역시 가졌더라도 모성의 PLX(세모)보다 더 나은 일 생존을 유도하였다. 도 40b에서 나타난 바와 같이, 혼합된 PLX 세포로 처리된 마우스도 역시 대조군 생존 마우스와 대비하여 그들의 초기 무게의 더 높은 백분율을 보유하였다. 24시간 및 5일째 처리와 대비하여, 첫 번째 처리를 48시간으로 지연시킨 것은 모성 대비 혼합된 세포의 특성과는 상관없이 전반적인 생존을 약간 감소시켰다.

도 41a 내지 도 41d에서는 23일의 경우에 혈액학 결과가 나타나 있다. 도 41a는 전체 골수 계수를 제시하고, 도 41b는 백혈구 세포 계수를 제시하고, 도 41c는 적혈구 세포 계수를 제시하고, 도 41d는 혈소판 계수를 제시한다. 도 42는 23일에 헤모글로빈(도 41a) 및 적혈구 용적율(도 41b)를 나타낸다. 각각의 매개변수를 위해, 혼합된 PLX 세포는 운반체 또는 모성의 PLX-처리된 마우스와 대비하여 더 나은 회복 수치들을 유도하였다.

결론

첫 번째 주사가 24시간으로부터 48시간까지 연기되었을 때라도, I.M. 투여된 PLX 세포의 모성 및 혼합된 회분 둘 다는 생존을 다시 개선하였다. 다시 한 번, 그러나 혼합된 PLX 세포는 더 나은 생존율을 유도하였다. 혼합된 PLX는 다시 한 번 BM 핵형성된 세포 및 말초혈액 차별적 계수 매개변수에 의해 나타난 바와 같이 BM 재군집의 효과를 내는 데도 역시 더욱 효율적이었다.

본 발명의 소정의 특징이, 명확하게 별도의 구현예의 내용으로 기술되지만, 단일한 구현예로 조합하여 제공될 수도 역시 있는 것으로 이해된다. 반대로, 본 발명의 다양한 특징은, 간략하게 단일한 구현예의 내용으로 기술되지만, 분리하여 또는 임의의 적합한 하부 조합으로도 역시 제공될 수 있다.

본 발명은 그의 특정한 구현예과 결합하여 기술되었더라도, 많은 대안, 변형, 및 변화가 당업자에게는 자명할 것이라는 점은 명백하다. 이에 따라, 첨부된 청구항들의 사상 및 광범위한 범주 내에 속하는 이러한 대안, 변형 및 변화 모두를 포용하도록 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 그들의 전부가 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합되어 있다. 참고문헌으로 통합된 재료가 본 명세서에서의 개시와 모순되는 경우에, 본 발명의 본 명세서가 우선한다. 또한, 본 출원에서 임의의 참고문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 입수가능한 점의 승인으로서 참작되지는 않는다.

Claims

방사선 또는 화학요법에 노출된 개체에서 조혈 줄기세포(HSC)의 회복 또는 접목(engraftment)을 개선하기 위한 유착성 간질세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 유착성 간질세포가 세포 확장을 지지하는 삼차원 배양 조건하에서 배양되었고, 유착성 간질세포의 기원이 태반인 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
a) 방사선이 이온화 방사선이고,
b) i) 이온화 방사선에 대한 노출이 방사선요법에 기인하거나, 또는
ii) 방사선에 대한 노출이 이온화 방사선에 대한 우연한 노출인 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유착성 간질세포가 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원 배양 조건하에서 배양되었던 것인, 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 유착성 간질세포가 분화 없이 세포 확장을 지지하는 삼차원 배양 조건하에서 생물반응기로 배양되었던 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 외인성 조혈 줄기세포가 개체에 투여되지 않는 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유착성 간질세포의 60% 미만이 이소형 대조군과 대비하여 면역형광법에 의해 검출된 바와 같이 마커 OCT-4에 대해 양성인 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유착성 간질세포의 투여가 혈관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 또는 흡입에 의한 것인, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 투여가 근육내 주사에 의한 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 첫 번째 치료적 유효량의 투여에 이어서 2 내지 21일째에 투여되는 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 첫 번째 치료적 유효량 및 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 투여가 근육내 주사에 의한 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유착성 간질세포의 첫 번째 치료적 유효량이 방사선 또는 화학요법에 대한 노출 후 특정된 기간 이내에 개체에게 투여되고,
유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량이 개체에게 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 첫 번째 치료적 유효량 및 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량의 투여가 근육내 주사에 의한 것인, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 유착성 간질세포의 적어도 한 번의 추가적인 치료적 유효량이 방사선 또는 화학요법에 대한 노출에 이어서 매칭(matching) 기간 이후에 외인성 조혈 줄기세포와 함께 개체에게 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 외인성 조혈 줄기세포를 개체와 매칭하는 것을 더 포함하고, 상기 외인성 조혈 줄기세포가 동종이형의 제대혈 또는 골수세포와 매칭되고 개체와 매칭되지만, 유착성 간질세포와 반드시 매칭되는 것은 아닌, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유착성 간질세포가 Flt-3 리간드, IL-6, 및 SCF를 분비하는 것인, 약제학적 조성물.