JP2018070646A - 放射線照射または化学物質による傷害を治療するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】接着間質細胞を含む、電離放射線又は化学療法に曝露された対象における赤血球又は血小板レベルの低下を軽減するための組成物であって、外因性造血幹細胞が前記対象に投与されておらず、前記接着間質細胞が、三次元培養条件下で培養されたものである、組成物。治療有効量の接着間質細胞を対象に投与する工程を含む、方法。好ましくは、胎盤、脂肪組織、または骨髄から入手した接着間質細胞を、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養し、対象に投与する工程を含む、方法。
【選択図】図17
Description
本願は、2011年3月22日に出願された米国特許出願第13/069,130号、2011年6月15日に出願された米国特許出願第13/161,334号、2011年6月15日に出願された米国仮出願第61/497,400号、および2012年2月6日に出願された米国仮出願第61/595,485号の利益を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
1999;68:1362−8;Fan et al.,Stem Cells 2001;19:144−50)。ヒト−羊移植モデルにおけるヒト間葉系幹細胞の共移植が
、これらの動物におけるヒトHSCキメラ骨髄の長期生着の向上を引き起こすことも実証された(Almeida−Porada et al.,Blood 2000;95:3620−7)。HSCおよび間葉系幹細胞の同時注入は、造血を加速することができる(Zhang et al.,Stem Cells 2004;22:1256−62;Liu et al.,Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.2005;26:385−8)。間葉系幹細胞は、ヒト対象におけるHSCの生着を促進するために使用されてきた(Koc ON,J Clin Oncol.2000;18:307−316;Lazarus HM,Biol Blood Marrow Transplant.2005;11:389−98)。おそらく、間葉系幹細胞は、移植されたHSCのホーミング、自己再生およびコミットメントの潜在能力(commitment potential)を媒介し、バランスを保つのに役立つ支援サイトカインを生産することによって、HSCのホーミングおよび増殖に必要な損傷を受けた造血微小環境を再構築することによって、かつ移植片対宿主病(GvHD)を引き起こす可能性があるドナー由来のT細胞を阻害することによって造血の生着に寄与する(Charbord&Moore,Ann.N.Y.Acad.Sci 2005;1044:159−67;米国特許第6,010,696号;同第6,555,374号)。
含んでもよい。一実施形態において、内因性造血細胞の再増殖は、CD45を発現する造血細胞数の増加を含んでもよい。
内因性造血細胞数の減少を軽減するために、無菌パッケージ内に治療有効量の接着間質細胞と、治療有効量の投与のための取扱説明書と、を含むキットを提供する。
内に第1の治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、曝露の次のマッチング期間後に、外因性造血幹細胞と共に第2の治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、この造血幹細胞は、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である。いくつかの実施形態において、この治療法は、この対象において内因性造血細胞の再増殖を誘導する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞数の減少を軽減する。いくつかの実施形態において、この化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。
施形態において、放射線は電離放射線である。いくつかの実施形態において、この曝露は、治療されないままであると、一般に、約1〜2日以内(例えば、30Gyを上回る電離放射線(IR)の曝露)、2日〜2週間以内(例えば、約8〜30GyのIRの曝露)、または約2〜4週間以内(例えば、約2〜8GyのIRの曝露)に、この対象にとって致死的であるような曝露である。
増殖させた細胞は、接着アッセイおよび再増殖アッセイ(実施例1参照)から明らかなように、低温保存後に生存能力があることが見出された。胎盤由来の接着細胞のフローサイトメトリー分析により、異なるマーカーの発現パターンが明らかになった(図3a〜3b参照)。最も重要なことに、2Dまたは3Dの設定で増殖させた脂肪および胎盤由来の接着細胞は、HSC生着を支援することができ(実施例2参照)、このことが、クリニックにおける本発明の細胞の使用を示した。
施形態において、母方および胎児の胎盤接着間質細胞は、遺伝子型および/または核型(例えば、FISH)分析に基づいて同定される。例えば、雄胚の胎盤由来の接着間質細胞は、核型分析に基づいて胎児および母方の細胞に分離することができる(すなわち、XX細胞は母方であるが、XY細胞は胎児である)。いくつかの実施形態において、(例えば、絨毛膜絨毛から成るまたは絨毛膜絨毛を含む)胎盤の胎児部分由来の接着間質細胞は、CD200を発現する。すなわち、負の発現を明確にするためのアイソタイプ対照を用いてフローサイトメトリーにより測定した場合に、これらの細胞の少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%は、CD200を発現する。いくつかの実施形態において、負の発現を明確にするためのアイソタイプ対照を用いてフローサイトメトリーにより測定した場合に、母方部分由来の接着間質細胞の3.5%以下、3%以下、2%以下、または1%以下がCD200を発現する。
とができる。
salt base)を添加したBME)、ダルベッコ改変イーグル培地(血清を含まないDMEM)、Yamane、IMEM−20、グラスゴー変更イーグル培地(GMEM)、リーボビッツL−15培地(Leibovitz L−15 Medium)、マッコイ5A培地、培地M199(アール塩の塩基を含むM199E)、培地M199(ハンクス塩の塩基を含むM199H)、最小必須培地イーグル(アール塩の塩基を含むMEM−E)、最小必須培地イーグル(ハンクス塩の塩基を含むMEM−H)および最小必須培地イーグル(非必須アミノ酸を含むMEM−NAA)、数ある中でもとりわけ、培地199、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、MAB8713、DM145、ウィリアムズ’G、ニューマン&タイテル(Neuman&Tytell)、Higuchi、MCDB301、MCDB202、MCDB501、MCDB401、MCDB411、MDBC153が挙げられる。本発明の使用に好ましい培地は、DMEMである。これらおよび他の有用な培地は、とりわけ、ギブコ社((GIBCO)、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)およびBiological Industries社(Bet HaEmek、イスラエル)から入手可能である。多数のこれらの培地は、William B.JakobyおよびIra
H.Pastanによって編集され、アカデミックプレス社から出版された酵素学の方法(Methods in Enzymology)、第58版「細胞培養(Cell Culture)」のページ62〜72にまとめられている。
因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子、および骨形成タンパク質などを、pg/mlからmg/mlの間のレベルの濃度で補充してもよい。
ている)は、接着間質細胞の成長および長期維持を支援することができる。このバイオリアクターでは、接着間質細胞を、ポリエステルの不織布マトリックスから作られた多孔性担体(porrosive carrier)上に播種し、ガラスカラムに充填することによって、比較的少量からの大型細胞数の増加を可能にする。
et al.,Cytotherapy 8(4):315−17(2006))。したがって、本発明の様々な態様および実施形態のいくつかにおいて、「接着間質細胞」または「ASC」という用語は、間葉系幹(間質)細胞を除外する。
での培養によって生産される胎盤接着間質細胞の単離集団は、免疫蛍光によって検出される場合に、アイソタイプ対照と比較して、マーカーOCT−4については、約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、または60%未満が陽性である。
はHSCの増殖に必要な、損傷を受けた造血微小環境を再構築するこれらの細胞の能力に起因し得る。
C移植なしで投与される。いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、内因性造血系の再構築または再増殖のための主要な治療として投与される。
び/もしくは汗腺の損傷、萎縮、線維症、皮膚の色素沈着の低下もしくは増加、または壊死が含まれるが、これらに限定されない。
に治療されるであろう。これらの治療には、レシピエントの免疫系を抑制する工程または移植前に免疫単離用半透膜中にこれらの非自己細胞をカプセル化する工程のいずれかが含まれ得る。
cell encapsulation.Adv Drug Deliv Rev.2000;42:29−64)。
poly(allylamine).Biotechnol Bioeng.2000,70:479−83,Chang TM and Prakash S.Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol.2001,17:249−60、ならびにLu MZ,et al.,A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha−cyanocinnamylideneacetate).J
Microencapsul.2000,17:245−51に開示されるものなどを含む。
nanoparticle technology in medical devices.Med Device Technol.1999,10:6−9;Desai,T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002,2:633−46)。
前に、回数の組み合わせ中に、回数の組み合わせ後に投与してもよい。投与が少なくとも2回の投与を含む場合に、各投与は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日間隔でもよい。あるいは、各投与は、約1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、または6ヶ月間隔でもよい。
を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を対象に投与する工程を含む方法にも関する。
質細胞およびマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞(CB/BM)の投与。
in Molecular Biology」,John Wiley&Sons社、ボルティモア、メリーランド州(1989);Perbal,「A Practical
Guide to Molecular Cloning」,John Wiley&Sons社、ニューヨーク州(1988);Watsonら「Recombinant DNA」,Scientific American Books社、ニューヨーク州;Birrenら(編)「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」、1−4巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、ニューヨーク州(1998);米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、および同第5,272,057号に記載の方法;「Cell Biology:A Laboratory Handbook」,I−III巻、Cellis,J.E.編(1994);「Current Protocols in Immunolgy」I−III巻、Coligan J.E.編(1994);Stitesら(編),「Basic and Clinical Immunology」(第8版),Appleton&Lange、ノーウォーク、コネティカット州(1994);MishellおよびShiigi(編)、「Selected Methods in Cellular Immunology」、W.H.Freemanら、ニューヨーク州(1980)を参照されたい;利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で広範に説明されており、例えば、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号、同第5,011
,771号および同第5,281,521号;「Oligonucleotide Synthesis」 Gait, M.J.編(1984);「Nucleic Acid
Hybridization」Hames,B.D.,およびHiggins S.J.編(1985);「Transcription and Translation」Hames,B.D.,およびHiggins S.J.編(1984);「Animal Cell Culture」Freshney,R.L,編(1986);「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press社,(1986);「A Practical Guide to Molecular Cloning」Perbal,B.,(1984)および「Methods in Enzymology」1−317巻,Academic Press社;「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」,Academic Press社、サンディエゴ、カリフォルニア州(1990);Marshakら「Strategies for Protein Purification andCharacterization−A Laboratory Course Manual」CSHL Press社(1996)を参照されたい。これらの全ては、本明細書で十分に記載されるように、参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この文書全体の中に提供される。その中の手順は、当技術分野において公知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。その中に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
骨髄、胎盤および脂肪組織由来の接着間質細胞(ASC)の生産および培養
特定の細胞マーカー発現プロファイルによって特徴付けられる3D−ASC細胞を生産するために、3D担体を含むバイオリアクターシステムで接着間質細胞を培養した。成長効率を、細胞数を介して試験した。これらの細胞の分化能を、分化培地で培養することにより試験した。
骨髄接着間質細胞
骨髄(BM)の接着間質細胞を、開胸手術またはBM生検を受ける血液学的に健常なドナーの吸引された胸骨の骨髄から得た。骨髄吸引物を、ハンクス平衡塩溶液(HBSS;GIBCO BRL/Invitrogen社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州)で3倍希釈し、フィコール−ハイパック(Robbins Scientific社、サニーベール、カリフォルニア州)密度勾配遠心分離を行った。その後、骨髄単核細胞(<1.077gm/cm3)を収集し、HBSSで3回洗浄し、10%FCS(GIBCO BRL社)、10−4Mのメルカプトエタノール(Merck社、ホワイトハウスステーション、ニュージャージー州)、Pen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml、Beit Ha’Emek社)、2mMのL−グルタミン(Beit Ha’Emek)を補充した成長培地(DMEM(Biological Industries社、Beit Ha’Emek、イスラエル))に再懸濁した。個々のドナーからの細胞を、37℃(5%CO2)で組織培養フラスコ(Corning社、アクトン、マサチューセッツ州)に別々にインキュベートし、培地を1週間ごとに交換した。細胞を、0.25%トリプシン−EDTA(Beit Ha’Emek)を用いて、3〜4日ごとに分けた。2〜40回継代した後、60〜80%コンフルエンスに達した時に、細胞を分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
満期分娩の胎盤の内部の部分(Bnei Zion医療センター、ハイファ、イスラエル)を、無菌条件下で切り、ハンクス緩衝液で3回洗浄し、0.1%コラゲナーゼ(1m
g/mlの組織、Sigma−Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)と37℃で3時間インキュベートした。その後、穏やかにピペッティングし、懸濁細胞を、10%FCS、Pen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)および2mMのL−グルタミンを補充したDMEMで洗浄し、75cm2フラスコに播種し、37℃で、5%CO2を含む加湿条件下の組織培養インキュベーター内でインキュベートした。その後、細胞を、72時間プラスチック表面に接着させ、その後、培地を3〜4日ごとに交換した。60〜80%コンフルエンスに達した時(通常、10〜12日)、0.25%トリプシン−EDTAを用いて、細胞を成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。その後、培養細胞は、分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
接着間質細胞を、脂肪吸引手順(Rambam ハイファ、イスラエル)のヒト脂肪組織から得た。脂肪組織を、等量のPBSで十分に洗浄し、37℃で30分間、コラゲナーゼ(20mg/ml)で消化した。その後、細胞を、10%FCS、Pen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)およびL−グルタミンを含むDMEMで洗浄し、室温で10分間、1200rpmで遠心分離し、溶解液(1:10;Biological Industries社、Beit Ha’emek、イスラエル、赤血球を廃棄するため)に再懸濁し、遠心分離して、10%FCS、Pen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)およびL−グルタミンを含むDMEMに再懸濁した。その後、洗浄細胞を、3〜10×107細胞/フラスコで、無菌の組織培養培地のフラスコに播種した。翌日、細胞をPBSで洗浄し、残留RBCおよび死細胞を除去した。これらの細胞を、5%CO2を含む加湿条件下で組織培養インキュベーター中37℃に保持した。培地を3〜4日ごとに交換した。60〜80%コンフルエンスの時点で、これらの細胞を0.25%トリプシン−EDTAを用いて成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。2〜40回の継代後に、細胞が60〜80%コンフルエンスに達した時、細胞を分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
PluriX(商標)栓流バイオリアクター(Pluristem社、ハイファ、イスラエル;図1gに示す、米国特許第6,911,201号も参照されたい)に、ポリエステルの不織布マトリックスから作られた1〜100ml充填用の3D多孔性担体(porrosive carrier)(直径4mm)を充填した。これらの担体は、比較的少量で大細胞数の増殖を可能にする。ガラス製品は、Pluristem社が設計し、製造した。このバイオリアクターは、37℃のインキュベーター内で維持され、流速は、バルブ(図1gの6a)、および蠕動ポンプ(図1gの9)によって調節され、監視された。このバイオリアクターは、サンプリングポイントおよび注入ポイント(図1gの4)を含み、細胞の連続播種を可能にする。培地を、貯蔵所(図1gの1)から、pH6.7〜7.4で供給した。この貯蔵所には、バイオリアクター中の細胞密度に応じて、異なる比率で空気/CO2/O2を含む濾過したガス混合物(図1gの2、3)が供給された。O2の割合は、モニター(図1gの6)によって測定される、バイオリアクターの出口における溶存O2のレベルに適していた。このガス混合物は、シリコンチューブまたは拡散器(Degania Bet社、Emek Hayarden、イスラエル)を経て貯蔵所に供給された。培地を、循環している非接着細胞の収集を可能にする分離容器(図1gの7)に通過させた。培地の循環は、蠕動ポンプ(図1gの9)が行った。このバイオリアクターは、さらに、追加のサンプリングポイント(図1gの10)および連続培地交換用の容器を備えていた。
上記のように成長させたコンフルエントでない初代ヒト接着間質細胞の2D培養物を、トリプシン処理し、洗浄し、10%FBS、Pen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)および2mMのL−グルタミンを補充したDMEMに再懸濁し、注入ポイントを介して、無菌の栓流バイオリアクター(図1g参照)内の3D担体上に播種した(103〜105細胞/ml)。接種前に、バイオリアクターに、PBS−Ca−Mg(Biological Industries社、Beit Ha’emek、イスラエル)を充填し、これをオートクレーブ処理(120℃、30分間)し、10%熱不活性化ウシ胎児血清およびPen−Strep−ナイスタチン混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)を含むダルベッコ成長培地で洗浄した。流れを、0.1〜5ml/分の速度で維持した。播種プロセスには、2〜48時間の循環の中断が含まれ、それによって、細胞がこれらの担体上で定着するのを可能にした。バイオリアクターを、必要に応じて、無菌の空気およびCO2が供給されるインキュベーターを用いて、制御された温度(37℃)およびpH条件(pH=6.7〜7.4)下で維持した。成長培地を週に2〜3回交換した。循環培地を、4時間〜7日ごとに新鮮なDMEM培地と交換した。1×106〜1×107細胞/mlの密度(成長の12〜40日後)で、培地の全量をこのバイオリアクターから除去し、担体をPBSで3〜5回洗浄した。その後、3D−ASC細胞を、トリプシン−EDTA(Biological Industries社、Beit Ha’emek、イスラエル;3〜15分穏やかに攪拌しながら、1〜5回)を用いてこれらの担体から脱離させ、その後、DMEMに再懸濁して、凍結保存した。
凍結保存した3D−ASC細胞を解凍し、数を数えた。細胞生存率の評価のために、2×105細胞を150cm2組織培養フラスコに播種し、それらの接着力および再増殖を、播種後の7日以内に評価した。その後、3D−ASCの膜マーカーの表現型を、蛍光モノクローナル抗体のフローサイトメーター(Beckman Coulter社、フラートン、カリフォルニア州)を用いて分析した。
2D培養物および3Dフロー方式培養物の100,000〜200,000個の接着間質細胞を、5mlチューブ中の培地0.1mlに懸濁し、飽和濃度の以下のMAbのそれぞれとインキュベートした(4℃、30分、暗い条件):FITC結合抗ヒトCD90(Chemicon International社、テメキュラ、カリフォルニア州)、PE結合抗ヒトCD73(Bactlab Diagnostic社、Ceasarea、イスラエル)、PE結合抗ヒトCD105(eBioscience社、サンディエゴ、カリフォルニア州)、FITC結合抗ヒトCD29(eBioscience社、サンディエゴ、カリフォルニア州)、Cy7−PE結合抗ヒトCD45(eBiosience社)、PE結合抗ヒトCD19(IQProducts社、グローニンゲン、オランダ)、PE結合抗ヒトCD14MAb(IQProducts社)、FITC結合抗ヒトCD11b(IQProducts社)およびPE結合抗ヒトCD34(IQProducts社)またはFITC結合抗ヒトHLA−DRのMAb(IQProducts社)。インキュベーション後、これらの細胞を、1%熱不活性化FCSを含む氷冷PBSで2回洗浄し、0.5%ホルムアルデヒド500μlに再懸濁し、FC−500フローサイトメーター(Beckman Coulter社、フラートン、カリフォルニア州)を用いて分析した。
2Dおよび3Dの培養手順によるASCを、上述したとおり胎盤から生産した。簡単に
説明すると、これらの2D培養物は、60〜80%コンフルエンスに達するまで37℃の加湿5%CO2雰囲気下で4日間、175cm2フラスコ内で0.3〜0.75×106細胞を培養することによって生産した。これらの3D培養物は、2000担体を含むバイオリアクター中で2〜10×106細胞/gを播種し、18日間培養することによって生産した。収集後、細胞を洗浄し(×3)、全ての血清を除去し、ペレット化して、凍結させた。タンパク質を、(Tri試薬キット(Sigma社、セントルイス、米国)を用いて)ペレットから単離し、トリプシンで消化し、メーカーのプロトコールに従ってiTRAQ試薬(Applied Biosciences社、フォスターシティ、カリフォルニア州)で標識した。簡単に説明すると、iTRAQ試薬は、非ポリマー性の等圧タグ付き試薬である。各試料中のペプチドを、それらのN−末端および/またはリジン側鎖を介して4つの等圧の同位体コード化タグのうちの1つで標識した。これらの4つ標識試料を混合し、ペプチドを、質量分析で分析した。ペプチド断片化の際、各タグは異なる質量のレポーターイオンを放出するので、4つのレポーターの比率は、試料中の特定のペプチドの相対存在量を与える(情報元:http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf)。
2Dおよび3Dの培養手順によって胎盤から生産させるASCを、上述したとおり、24日間、3D培養で生産した。その後、馴化培地を収集し、3つの独立した実験で、ELISA(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)を用いて、Flt−3リガンド、IL−6、トロンボポエチン(TPO)および幹細胞因子(SCF)について分析した。結果を、1×106細胞/mlに対して規準化した。
PluriX(商標)バイオリアクターシステムは、生理的環境のような微小環境を作り出す
接着間質細胞にとって効率的な培養条件にさせるために、生理的環境のような環境(図
1aに示す)を、PluriXバイオリアクター(Pluristem社、ハイファ、イスラエル;担体を図1gに示し、図1bに播種前の状態を示す)を用いて人工的に作り出した。図1c〜図1fに示すとおり、骨髄生産3D−ASC細胞を十分に培養し、播種後20日間(図1b〜図1c、それぞれ150倍および250倍に拡大)ならびに40日間(図1c〜図1d、それぞれ350倍および500倍に拡大)、3Dマトリックス上で増殖させた。
異なる生産ロットの胎盤由来の3D−ASC細胞を、PluriXバイオリアクターシステム内で成長させた。播種密度は、13,300細胞/担体(全部で2×106細胞)であった。播種後14日目に、細胞密度は15倍増し、約200,000細胞/担体(図2)、または150担体のバイオリアクター中30×106個に達した。別の実験では、細胞を、1.5×104細胞/mlの密度でバイオリアクターに播種し、播種後30日目に、これらの担体は、50倍を超える高い細胞数、すなわち、約0.5×106細胞/担体、または0.5×107細胞/mlを含んでいた。様々なレベルの成長カラムの担体上の細胞密度は一貫しており、細胞への酸素および栄養素の移送が均質であることが示された。したがって、この3D培養系は、生着および移植の成功を支援する目的のために十分な量まで効率よく成長させることができる、高密度の間葉系細胞培養物の成長および長期維持のための支援条件を提供することが証明された。
3D培養法を模倣する骨環境によって与えられる可溶性分子の分泌プロファイルおよびタンパク質生産の違いを定義するために、FACS分析を行った。図3aに示すとおり、細胞マーカーのFACS分析は、3D−ASCが2D条件で成長させた接着間質細胞とは異なるマーカー発現パターンを示すことを表す。2D培養細胞は、3D培養細胞と比較して、著しく高いレベルの陽性膜マーカーCD90、CD105、CD73およびCD29を発現した。例えば、CD105は、3D培養細胞中では56%の発現を示し、それに対して、2D培養細胞中では87%の発現を示した。2D胎盤培養物と3D胎盤培養物の両方のASCは、造血膜マーカーを発現しなかった(図3b)。
造血のニッチには、豊富なサイトカイン、ケモカインおよび成長因子を生産する支援細胞が含まれる。2D培養ASCと3D培養ASCの違いをさらに定義するために、2D ASC培養物および3D ASC培養物の馴化培地中の4つの主要な造血分泌タンパク質のプロファイルをELISAにより調べた。図4a〜図4cは、3D条件で成長させた細胞が、高レベルのFlt−3リガンド(図4a)、IL−6(図4b)、およびSCF(図4c)を有する馴化培地を生成するが、2D培養物の馴化培地では、低レベルのIL−6、ならびに0に近いレベルのFlt−3リガンドおよびSCFが検出されたことを示す。トロンボポエチン(TPO)の生産は、非常に低く、両方の培養物で等しかった。
2D培養ASCと3D培養ASCの違いをさらに定義するために、これらの細胞のタンパク質プロファイルを、質量分析によって分析した。図4dは、2D培養ASCおよび3D培養ASCが、非常に異なるタンパク質発現プロファイルを示すことを示す。以下の表1に示すとおり、3D培養細胞は、非常に高い発現レベル(それぞれ、9倍および12倍を上回る高さ)のH2AFおよびALDH X、ならびに高レベルのタンパク質EEEF2、RCN2およびCNN1を示す(それぞれ、約3倍、約2.5倍および約2倍)。さらに、3D培養細胞は、タンパク質HnrphlおよびCD44抗原アイソフォーム2前駆体が約半分の発現レベルであり、Papss2およびrpL7aが約3分の1の発現レベルであることを示す。
2D培養ASCおよび3D培養ASCによるリンパ球反応の抑制
接着間質細胞、特に、3D−ASCは、MLRアッセイにおいてヒト臍帯血単核細胞の免疫反応を抑制することが見出された。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ
胎盤から生産される2Dおよび3D培養手順によるASCの免疫抑制ならびに免疫特権の特性は、反応(増殖)細胞および刺激(非増殖)細胞の混合培養における不適合リンパ球の増殖率によって影響されるように、HLA遺伝子座で組織適合性を測定するMLRアッセイによって影響を受けた。ヒト臍帯血(CB)単核細胞(2×105)を反応細胞として使用し、放射線照射(3000Rad)した等量(105)のヒト末梢血由来の単球(PBMC)と共培養するか、胎盤から生産された2Dもしくは3D培養の接着間質細胞と共培養するか、または接着間質細胞とPBMCの組み合わせで共培養することによって刺激した。各アッセイを3回繰り返した。細胞を、96ウェルプレート中の(37℃の加湿5%CO2雰囲気下で、20%FBSを含む)RPMI 1640培地で4日間共培養した。プレートを、培養の最後の18時間中に、1μCの3H−チミジンでパルスした。その後、細胞を、グラスファイバーフィルター上で収集し、チミジン取り込みを、シンチレーションカウンターを用いて定量した。
図7は、PBMCで刺激した時に、CB細胞の増殖が上昇することによって示されるCB細胞の免疫反応を示し、これは、理論によって縛られることなく、おそらく、HLA不適合性に反応するT細胞増殖に関連付けられる。しかし、本発明の接着間質細胞とインキュベートした時に、かなり低いレベルの免疫反応がこれらの細胞によって示された。さらに、PBMCに対するCB免疫反応は、これらの接着細胞と共培養したときに、実質的に低下した。したがって、ASCは、GvHDに特有の、ドナー細胞のT細胞増殖を低下させる潜在能力を有することが見出された。2Dおよび3Dの両方の培養物は、リンパ球の免疫反応を低下させるが、上記の3D−ASCの他の利点と一致して、これらの3D−ASCはより強い免疫抑制を示した。
胎盤由来の3D−ASCのHSC生着を改善する能力の評価
HSC生着の3D−ASC支援を、亜致死線量の放射線照射または化学療法で前処理した免疫欠損NOD−SCIDマウスで検出されるヒト造血細胞(hCD45+)のレベルにより評価した。
CD34+細胞の単離
臍帯血試料を、分娩中無菌条件下で取得し(Bnei Zion医療センター、ハイファ、イスラエル)、単核細胞を、Lymphoprep(Axis−Shield PoC As、オスロ、ノルウェー)密度勾配遠心分離を用いて分画し、凍結保存した。解凍した単核細胞を洗浄し、抗CD34抗体とインキュベートし、midi MACS(Miltenyl Biotech社、Bergish Gladbach、ドイツ)を用いて単離した。2種類以上の試料からの細胞を、所望の量(50,000〜100,000細胞)に達するまでプールした。
7週齢の雄および雌のNOD−SCIDマウス(NOD−CB 17−Prkdcscid/J;Harlan/Weizmann Inst.,Rehovot、イスラエル)を、無菌のオープンシステムケージ内で維持し、無菌の食事およびオートクレーブした酸性水を与えた。これらのマウスに亜致死線量(350cGy)の放射線を照射し、その後(放射線照射後48時間)、胎盤または脂肪組織由来の追加のASC(0.5×106〜1×106)を含む場合と含まない場合とで(各群3〜7匹のマウス)、外側尾静脈への静脈注射によって50,000〜100,000個のhCD34+細胞を移植した。移植後4〜6週間目に、これらのマウスを脱臼により屠殺し、BMを、FACS緩衝液(PBS50ml、FBS5ml、5%アジ化ナトリウム0.5ml)で大腿骨と脛骨の両方を洗い流すことによって収集した。マウスBMにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出し、治療したNOD−SCIDマウスにおけるヒトおよびマウスのCD45造血細胞マーカー発現細胞の割合を、抗ヒトCD45−FITC(IQ Products、Groningen、オランダ)と細胞をインキュベートすることによって測定した。明確なヒト生着についての最低の閾値は0.5%であった。
6.5週齢の雄のNOD−SCIDマウス(NOD.CB17/JhkiHsd−scid;Harlan、Rehovot、イスラエル)を、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに維持し、ブスルファンを腹腔内に注射した(2日連続−25mg/kg)。第2のブスルファン注射後2日目に、マウスに、CD34+細胞を単独で、または胎盤から生産された0.5×106個のASCと共に注射した。移植後3.5週目に、マウスを屠殺し、放射線照射マウスについて記載したとおりに、ヒト造血細胞の存在を決定した。
放射線照射マウスにおける3D−ASCによって改善されたHSCの生着
ヒトCD34+造血細胞および胎盤または脂肪に由来する3D−ASCを、放射線照射NOD−SCIDマウスに共移植した。生着率を共移植後4週目に評価し、HSCを単独で移植したマウスと比較した。表2および図5に示すとおり、3D−ASCおよびUCB
CD34+細胞の共移植は、UCB CD34+細胞単独で治療したマウスと比較して、レシピエントマウスのBMにおいてかなり高い生着率およびより高レベルのヒト細胞を与えた。
ヒトCD34+造血細胞を、化学療法で前処理したNOD−SCIDマウスに、胎盤由来の500,000個の2D−ASCまたは3D−ASCと共移植した。共移植後3.5週目に、生着効率を評価し、HSCを単独で移植したマウスと比較した。表3に示すとおり、ASCおよびUCB CD34+細胞の共移植は、UCB CD34+細胞単独と比較して、レシピエントマウスのBMにおいてより高レベルの生着が得られた。さらに、表3に示すとおり、生着の平均レベルは、従来の静的な2D培養条件(フラスコ)で成長させた同じドナー由来の細胞を共移植したマウスよりも、PluriXバイオリアクターシステムで成長させた胎盤由来の接着間質細胞(3D−ASC)と共移植したマウスにおいてより高かった。
放射線照射および化学損傷後にHSC回復を改善する胎盤由来の3D−接着間質細胞の能力の評価
レシピエントの内因性HSC回復の3D−接着間質細胞による支援を、亜致死線量の放射線照射または化学療法で前処理した免疫欠損NOD−SCIDマウスにおいて検出されるマウスの造血細胞(mCD45+)のレベルによって評価した。
放射線照射マウスにおける回復した細胞の検出
7週齢の雄および雌のNOD−SCIDマウス(NOD−CB17−Prkdcscid/J;Harlan/Weizmann Inst.,Rehovot、イスラエル)を、無菌のオープンシステムケージ内で維持し、無菌の食事およびオートクレーブした酸性水を与えた。これらのマウスに亜致死線量(350cGy)の放射線を照射し、その後(放射線照射後48時間)、2Dまたは3D条件下で成長させた胎盤由来の接着間質細胞(0.5×106〜1×106)を含む場合と含まない場合とで(各群3〜7匹のマウス)、50,000〜100,000個のhCD34+細胞を移植した。細胞を、外側尾静脈への静脈注射によって投与した。移植後4〜6週間目に、これらのマウスを脱臼により屠殺し、BMを、FACS緩衝液(PBS50ml、FBS5ml、5%アジ化ナトリウム0.5ml)で大腿骨と脛骨の両方を洗い流すことによって収集した。マウス造血系の回復を表す、治療したNOD−SCIDマウスにおけるマウスCD45造血細胞マーカー発現細胞の測定を、抗マウスCD45−FITC(IQ Products、Groningen、オランダ)と細胞をインキュベートすることによって行った。
6.5週齢の雄のNOD−SCIDマウス(NOD.CB17/JhkiHsd−scid;Harlan、Rehovot、イスラエル)を、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに維持し、ブスルファンを腹腔内に注射した(2日連続−25mg/kg)。第2のブスルファン注射後2日目に、マウスに、ヒトCD34+細胞を単独で注射するか、または胎盤から生産された0.5×106個の接着間質細胞と共に注射した。移植後3.5週目に、マウスを屠殺し、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに、ヒト造血細胞の回復を測定した。
放射線照射マウスにおける3D−接着間質細胞によって改善されたHSCの生着
ヒトCD34+造血細胞および胎盤または脂肪組織に由来する3D−接着間質細胞を、放射線照射NOD−SCIDマウスに共移植した。マウス造血系の回復効率を共移植後4週目に評価し、胎盤接着間質細胞を含めないで、hHSCを移植したマウスの自己回復と比較した。表4に示すとおり、2D−接着間質細胞とUCB CD34+細胞および3D−接着間質細胞とUCB CD34+細胞の両方の共移植は、UCB CD34+細胞単独で治療したマウスと比較して、mCD45の発現レベルによって示されるように、かなり高い回復率を与えた。改善は、3D増殖細胞においてより高かったことに留意されたい。
ヒトCD34+造血細胞を、化学療法で前処理したNOD−SCIDマウスに、胎盤由来の接着間質細胞と共移植した。レシピエントマウスの造血系の回復効率を、共移植後3.5週目に評価し、HSCを単独で移植したマウスと比較した。表5に示すとおり、接着間質細胞およびUCB CD34+細胞の共移植が、UCB CD34+細胞単独と比較
して、レシピエントマウスの造血系のより高い回復率を与えた。さらに、表5に示すとおり、回復の平均レベルは、投与した接着間質細胞の数に対して用量依存的であった。
放射線照射マウスの生存に対する3D−ASC(PLX)細胞の効果を、放射線照射(850cGy)後24時間に、C3Hマウスに3D増殖ASCを静脈内投与した後に検討した。
調製
マウス(C3H雄、20g、約8週齢)を、Harlan社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにSPF施設で1週間飼育した。30匹のC3H雄マウスに全身放射線照射(850cGy)した。放射線照射後24時間に、15匹のマウスに、外側尾静脈の1つへのゆっくりとした静脈注射(約1分)によって、マウス1匹あたりplasmaLyte A250μl中の3D−ASC細胞(1×106個)を注射した。凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。15匹のマウスの残りの対照群に、等量(250μ1)のplasmaLyte A(ビヒクル)を注射した。
図9は、BALB/cおよびC3Hマウスにおける2種類の放射線量の電離放射線照射
後のマウス(3D−ASC治療なし)の生存率の追跡調査を示す。
放射線照射マウスの生存に対する胎盤由来の3D−増殖接着間質細胞(PLX)の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間に、C3Hマウスに静脈内投与した後に検討した。
調製
マウス(C3H雄、20g、約6週齢)を、Harlan社から購入した。動物を、実験開始前の馴化のためにSPF施設で2週間飼育した。30匹のC3H雄マウスに全身放射線照射(770cGy)した。放射線照射後24時間に、15匹のマウスに、外側尾静脈の1つへのゆっくりとした静脈注射(約1分)によって、マウス1匹あたりplasmaLyte A250μl中の3D−ASC細胞(1×106個)を注射した。凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。15匹のマウスの残りの対照群に、同量(250μ1)のplasmaLyte A(ビヒクル)を注射した。
マウスを、CO2吸入により屠殺した。屠殺前に、CBCのために、後眼窩洞(retro−orbital sinus)から血液を収集した。その後、骨髄を収集した。1脚(脛骨および大腿骨)からの有核BM細胞の全細胞数を直接数え、スメアを他の脚(脛骨および大腿骨)から調製した。肝臓、肺、および腸を、組織学的検査のために取得した。
PLX細胞で治療したマウス(●)およびPLX治療を受けていないマウス(○)についての、770cGyの放射線量での放射線照射後の生存率を図17に示す。図18は、規準化した体重変化(図18A)または平均体重変化(図18B)のいずれかの18日間の体重変化を経時的に示す。
これらの結果は、使用する放射線照射線量が使用するマウス系統に致死的であったことを示す。770cGyにおいて、ビヒクル治療群の12匹のマウスのうち1匹だけが18日目まで生存した(生存率8%)。PLX細胞の静脈注射は、同じ線量の放射線照射後に、生存マウスの割合を75%(9/12)まで増加させる。追跡調査期間中、PLX治療マウスは、ビヒクル治療マウスよりもよく食べた。18日目に、PLXマウスは平均体重まで増えたが、たった1匹生き残ったビヒクル治療マウスは、さらに体重を失っていた。IV PLX注射によって治療した群も、8日目および18日目の両方において、より高
い骨髄細胞数を有していた。18日目の血液パラメータ、特に、RBCおよび血小板も、一般に、PLX治療マウスで良好であった。これらの効果は、生存率が低下する時期の開始前である8日目においては明らかでなかった。
放射線照射マウスの血清サイトカインプロファイルに対する胎盤由来の3D−増殖接着間質細胞(PLX)の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間に、C3HマウスにPLXを静脈内投与した後1日目および4日目に検討した。
調製
マウス(C3H雄、20g、約6週齢)を、Harlan社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにSPF施設で2週間飼育した。4匹のマウスを未治療対照マウスとする一方で、26匹に770cGyの放射線を照射した。放射線照射後24時間に、8匹のマウスにPLXをIV注射し、8匹のマウスにPlasmalyteを注射した。IV注射後の予期せぬ死亡の場合のために、6匹を予備として飼育した。PLX注射後1日目および4日目に、2匹の非放射線照射対照マウス、2匹の放射線照射した対照マウス、4匹のビヒクル注射マウス、および4匹のPLX注射マウスから動脈血を収集した。血清をこの血液から分離し、次いで、650μlの十分な量を得るために、各2匹のマウスからの血清を一緒にプールした。以下のサイトカイン/成長因子IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、IL10、IL12、IL17A、IFNγ、TNFα、G−CSF、およびGM−CSFについて「マウスの炎症性サイトカイン多検体ELISAアレイキット(Mouse Inflammatory Cytokines Multi−Analyte ELISArray Kit」(SABiosciences社;カタログ番号MEM−004A)を用いた解析まで、収集した血清を−20℃で保管した。
図26A〜図26Bは、PLX細胞またはビヒクルでの注射後1日目(図26A)および4日目(図26B)におけるサイトカインプロファイルを示す。最も顕著な変化は、放射線処理した全マウスにおいてG−CSFレベルが増加したことであった。
放射線照射マウスの生存に対する3D−ASC(PLX)細胞の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間に、C3Hマウスに3D増殖ASCを筋肉内投与した後に検討した。
調製
マウス(C3H雄、約24g、7週齢)を、Harlan社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにSPF施設で2週間飼育した。C3H雄マウスに全身放射線照射(770cGy)した。放射線照射後約24時間に、12匹のマウス(「放射線照射+PLX」群)に、インスリン注射器および25g針を使用して、それぞれの尾筋肉に、2×106細胞/マウスの総量に対して3D−ASC細胞50μl(バッチPD061210 153B04、plasmaLyte A中20×106細胞/mL)を注射した。第2群(「放射線照射+PLX−2X」)には、最初に同じ量の注射をしたが、さらに、4日の間隔で、第2の2×106個の3D−ASCをそれぞれの尾筋肉に筋肉注射した。全ての注射について、凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。放射線照射マウスの対照群は、plasmaLyte A(ビヒクル)を同量(全部で100μl、尾筋肉あたり50μ1)、同じ方法で筋肉注射した。
図27は、770cGy電離放射線を与えたC3Hマウスの生存率(図27A)および体重変化(図27B)を示す。放射線照射後1日目および5日目(丸)に、2×106細胞/用量の2回の筋肉注射を与えたマウスは、放射線照射後1日目に1回の筋肉注射を与えたマウスまたはPLX細胞を一切与えなかった対照の放射線照射マウスと比較して、生存率が改善した。
放射線照射マウスの生存率に対する胎盤由来の3D−増殖接着間質細胞(PLX)の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間および/または5日目に、C3Hマウスに2種類の異なる用量(1万細胞または2万細胞/注射)の3D増殖ASCを筋肉内投与した後に検討した。
44匹のC3Hマウスに、ハダサヘブライ大学医療センターの腫瘍学のシャレット研究所(Sharett Institute of Oncology at Hadassah Hebrew University Medical Center)で全身放射線照射(770cGy)した。放射線照射マウスを4群に分け(11匹/群)、以下のように治療した:
1.1×106PLX細胞を2回注射した:放射線照射後24時間および放射線照射後5日目(注射した全細胞数2×106個)。
2.2×106PLX細胞を2回注射した:放射線照射後24時間および放射線照射後5日目(注射した全細胞数4×106個)。
3.放射線照射後5日目に2×106PLX細胞を1回注射した。
4.対照群として、PlasmaLyte A(ビヒクル)のみを注射した。
図28A〜図28Bは、770cGyの放射線量での放射線照射後の生存率(図28A)および平均体重変化(図28B)を示す。ビヒクルで治療した11匹のマウスのうちの3匹(△)が、監視期間生存した。5日目に2×106PLX細胞単独で治療した11匹のマウスのうちの5匹(○)が生存した。1日目および5日目に1×106PLX細胞で治療した11匹のマウスのうちの9匹(●)が生存した。1日目および5日目に2×106PLX細胞を投与した場合(上部の黒丸のセット)、11匹のうち10匹が生存した。
3D−増殖させ、混合した母方/胎児PLX細胞と比較した、放射線照射マウスの生存率に対する3D−増殖させた胎盤由来の母方接着間質細胞(PLX)の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間および5日目に、C3Hマウスに2百万細胞/注射の3D増殖ASCを筋肉内投与した後に検討した。
1.2×106細胞/マウスでPLX−1(混合)を2回注射した:放射線照射後24時間および5日目(注射した全細胞数4×106個)。
2.2×106細胞/マウスでPLX−2(母方)を2回注射した:放射線照射後24時間および5日目(注射した全細胞数4×106個)。
3.PlasmaLyte Aを2回注射した:放射線照射後24時間および5日目。
図33A〜図33Bは、770cGyの放射線量での放射線照射後の生存率(図33A)および平均体重変化(図33B)を示す。混合PLX細胞(□;9/9生存)は、母方PLX(△;7/9生存)よりも23日の生存率は良好であったが、両群とも、ビヒクル治療マウスと比較して生存率が改善した(◇;3/9生存)。図33Bに示すとおり、混合PLX細胞で治療したマウスは、高い割合の初期体重も保持していた。
IM投与した母方PLX細胞とPLX細胞の混合バッチの両方は、生存率を改善した。この混合PLXバッチは、生存率をより効果的に改善した。混合PLXも、BM有核細胞および末梢血白血球百分率(differential count)のパラメータによって示されるとおり、BM再増殖を引き起こすのにより効果的であった。
3D−増殖させ、混合した胎盤由来の母方/胎児接着間質細胞と比較した、放射線照射マウスの血清サイトカインに対する3D−増殖させた胎盤由来の母方接着間質細胞(PLX)の効果を、放射線照射(770cGy)後24時間および5日目に、C3Hマウスに2百万細胞/注射の3D増殖ASCを筋肉内投与した後に検討した。
図36は、PLX細胞またはビヒクルの注射後8日目のサイトカインプロファイルを示す。G−CSFレベルは、放射線処理した全マウスにおいて増加した。この増加は、母方
PLX細胞で治療したマウスで最大であった。
全身的な炎症の急性発症は、放射線照射後8日目のマウスでは検出されなかった。顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)レベルにのみ顕著な変化があった。G−CSFは骨髄を刺激し、顆粒球および幹細胞を生産し、その後、骨髄を刺激して、それらを血液中に放出する。G−CSFは、放射線照射マウスの血清、特に、母方PLX注射群において上昇した。
3D−混合(PLX)細胞と比較した、放射線照射マウスの生存率、血液学的パラメータ、および血清サイトカインに対する3D−母方(PLX)細胞の効果を、放射線照射(770cGy)後48時間および5日目に、C3Hマウスに2百万細胞/注射の3D増殖ASCを筋肉内投与した後に検討した。
1.2×106個の混合PLX細胞を2回注射した:放射線照射後48時間および5日目(注射した全細胞数4×106個)。
2.2×106個の母方PLX細胞を2回注射した:放射線照射後48時間および5日目(注射した全細胞数4×106個)。
3.PlasmaLyte Aを2回注射した:放射線照射後48時間および5日目。
図40A〜図40Bは、770cGyの放射線量で放射線照射し、放射線照射後48時間および5日目に治療した後の生存率(図40A)および平均体重変化(図40B)を示す。第1の注射を、放射線照射後24時間に行った場合のように、混合PLX細胞(□)は、母方PLX(△)よりも良好な日数の生存を与えたが、本例においても、両群とも、
ビヒクル治療マウス(◇)と比較して生存率が改善した。図40Bに示すとおり、混合PLX細胞で治療したマウスは、対照の生存マウスと比較して、より高い割合の初期体重も保持していた。母方の細胞の性質または混合細胞の性質に関わらず、24時間および5日目における治療と比較して、第1の治療を48時間まで遅らせると、全体的な生存率がわずかに減少した。
第1の治療が24時間〜48時間遅れたとしても、I.M.投与した母方PLX細胞とPLX細胞の混合バッチの両方は生存率を改善した。しかし、本例においても、混合PLX細胞が、良好な生存率を与えた。混合PLXは、本例においても、BM有核細胞および末梢血白血球百分率のパラメータによって示されるとおり、BM再増殖を引き起こすのにより効果的でもあった。
Claims (126)
- 放射線被曝後に対象を治療するための方法であって、前記放射線被曝の1つ以上の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
- 前記放射線が電離放射線である、請求項1に記載の方法。
- 前記電離放射線の被曝が放射線治療によるものである、請求項2に記載の方法。
- 前記曝露が電離放射線への偶発的な曝露である、請求項1に記載の方法。
- 放射線被曝の影響が、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの1つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経症状が、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である、請求項5に記載の方法。
- 前記放射線被曝が進行中である、請求項1に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項1に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項8に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項1に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項1に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項1に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項1に記載の方法。
- 前記投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものでる、請求項1に記載の方法。
- 前記投与が、筋肉注射または静脈注射によるものである、請求項15に記載の方法。
- 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項1に記載の方法。
- 第1の投与後約2日〜約21日目に少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細
胞を投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の治療有効量の投与および少なくとも1つの追加的な治療有効量の投与が、筋肉注射によるものである、請求項18に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量が曝露後約0日目〜約3日目に投与され、前記少なくとも1つの追加的な治療有効量が、約2日〜約5日後に投与される、請求項18に記載の方法。
- 化学療法を受けている対象を治療するための方法であって、化学療法の1つ以上の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
- 化学療法の影響が、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの1つ以上である、請求項21に記載の方法。
- 前記神経症状が、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である、請求項22に記載の方法。
- 前記化学療法が進行中である、請求項21に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項21に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項25に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項21に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項21に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項21に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項21に記載の方法。
- 前記投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものでる、請求項21に記載の方法。
- 前記投与が、筋肉注射または静脈注射によるものである、請求項32に記載の方法。
- 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項21に記載の方法。
- 第1の投与後約2日〜約21日目に少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細
胞を投与する工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。 - 前記第1の治療有効量の投与および前記少なくとも1つの追加的な治療有効量の投与が、筋肉注射によるものである、請求項35に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量が曝露後約0日目〜約3日目に投与され、前記少なくとも1つの追加的な治療有効量が、約2日〜約5日後に投与される、請求項35に記載の方法。
- 内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
- 内因性造血細胞の再増殖が、内因性造血細胞の数の増加を含む、請求項38に記載の方法。
- 内因性造血細胞の再増殖が、CD45を発現する造血細胞の数の増加を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記内因性造血系が放射線被曝より損なわれる、請求項38に記載の方法。
- 前記放射線被曝が進行中である、請求項41に記載の方法。
- 前記内因性造血系が化学療法により損なわれる、請求項38に記載の方法。
- 前記化学療法が進行中である、請求項43に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項38に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項45に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項38に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項47に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項38に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項38に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項38に記載の方法。
- 前記投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものでる、請求項38に記載の方法。
- 前記投与が、筋肉注射または静脈注射によるものである、請求項52に記載の方法。
- 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項38に記載の方法。
- 前記第1の投与後約2日〜約21日目に少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を投与する工程をさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量の投与および前記少なくとも1つの追加的な治療有効量の投与が、筋肉注射によるものである、請求項55に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量が曝露後約0日目〜約3日目に投与され、前記少なくとも1つの追加的な治療有効量が、約2日〜約5日後に投与される、請求項56に記載の方法。
- 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療する方法であって、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導するために、少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
を含む方法。 - 前記放射線被曝または化学療法が進行中である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が0〜10日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が7〜10日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が5〜6日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が2〜4日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が1〜2日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記指定期間が約1日以内である、請求項58に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第2の治療有効量の投与が、前記第1の治療有効量の投与後約2日〜約21日目である、請求項58に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第2の治療有効量の投与が、前記第1の治療有効量の投与後約2日〜約10日目である、請求項66に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第2の治療有効量の投与が、前記第1の治療有効量の投与後約2日〜約5日目である、請求項67に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量の投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものである、請求項58に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加的な治療有効量の投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものである、請求項58に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量の投与および前記少なくとも1つの第2の治療有効量の投与が、筋肉注射によるものである、請求項58に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項58に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項72に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項58に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項74に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項58に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項58に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項58に記載の方法。
- 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項58に記載の方法。
- 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導するために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に第2の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
を含む方法。 - 前記放射線被曝または化学療法が進行中である、請求項80に記載の方法。
- 前記指定期間が0〜10日以内である、請求項80に記載の方法。
- 前記指定期間が7〜10日以内である、請求項80に記載の方法。
- 前記指定期間が5〜6日以内である、請求項80に記載の方法。
- 前記指定期間が2〜4日以内である、請求項80に記載の方法。
- 前記指定期間が1〜2日以内である、請求項80に記載の方法。
- 前記外因性造血幹細胞を前記対象とマッチさせる工程をさらに含む、請求項80に記載の方法。
- 前記外因性造血幹細胞が、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である、請求項80に記載の方法。
- 前記外因性造血幹細胞は前記対象とマッチするが、前記接着間質細胞とはマッチしない、請求項80に記載の方法。
- 前記第1の治療有効量の投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものである、請求項80に記載の方法。
- 前記第2の治療有効量の投与が、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものである、請求項80に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項80に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項92に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項80に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項94に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項80に記載の方法。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項80に記載の方法。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項80に記載の方法。
- 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項80に記載の方法。
- 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するためのキットであって、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、無菌パッケージ内に治療有効量の接着間質細胞と、
治療有効量の投与のための取扱説明書と、
を含むキット。 - 前記無菌パッケージが、血管内注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、皮下注射用、または吸入用に構成される、請求項100に記載のキット。
- 内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、第2の無菌パッケージに第2の治療有効量の接着間質細胞をさらに含む、請求項100に記載のキット。
- 前記第2の治療有効量の接着間質細胞が、前記第2の無菌パッケージ内に外因性造血幹細胞と共に包装される、請求項102に記載のキット。
- 前記外因性造血幹細胞が、同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である、請求項103に記載のキット。
- 前記第1および第2の無菌パッケージが、血管内注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、皮下注射用、または吸入用に構成される、請求項102に記載のキット。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項100に記載のキット。
- 前記接着間質細胞が、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項106に記載のキット。
- 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された、請求項100に記載のキット。
- 前記接着間質細胞が、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項108に記載のキット。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーCD200が陽性である、請求項100に記載のキット。
- 前記接着間質細胞の約60%未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーOCT−4が陽性である、請求項100に記載のキット。
- 前記接着間質細胞が、Flt−3リガンド、IL−6、およびSCFを分泌する、請求項100に記載のキット。
- 有害なレベルの放射線の被曝後に、前記放射線被曝の影響を軽減するために対象を治療するための接着間質細胞。
- 化学療法の影響を軽減するために、化学療法を受けている対象を治療するための接着間質細胞。
- 内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための接着間質細胞。
- 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための接着間質細胞であって、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導するために、少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と
を含む接着間質細胞。 - 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための
接着間質細胞であって、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に第2の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
を含む接着間質細胞。 - 請求項113〜117のいずれか一項に記載の治療有効量の接着間質細胞を含む医薬組成物。
- 請求項118に係る無菌パッケージ中の医薬組成物と、前記医薬組成物を投与するための取扱説明書と、を含むキット。
- 請求項1〜99に記載の方法のいずれかの実施のための薬剤調製における接着間質細胞の使用。
- 有害なレベルの放射線の被曝後に対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、前記治療が、放射線被曝の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用。
- 化学療法を受けている対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、前記治療が、化学療法の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用。
- 内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、前記治療が、内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用。
- 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、前記治療が、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導するために、少なくとも1つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
を含む接着間質細胞の使用。 - 放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、前記治療が、
内因性造血細胞の再増殖を誘導するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第1の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に第2の治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程と、
を含む接着間質細胞の使用。 - 化学療法および放射線照射を受けている対象を治療するための方法であって、化学療法および放射線照射の1つ以上の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
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