JP6371286B2 - 子癇前症の予防及び治療方法 - Google Patents

Description

子癇前症疾患
子癇前症（妊娠性タンパク尿高血圧（gestational proteinuric hypertension）；PE）は、妊娠全体の3〜5％で現れる［1］。これは、米国では、妊娠と関連する妊産婦死亡原因の第2位であり、発展途上国では、妊産婦死亡の主因である。PEは、世界中の妊産婦死亡全体のおよそ15％を占め、これは年間推定60,000例の妊産婦死亡と変換され、すなわち、子癇前症の合併症が原因で10分毎に一人の女性が死亡している［1, 2］。

PEは、妊娠の間に高血圧、浮腫及びタンパク尿を臨床的に示す全身性症候群である。これは、以下の二因子の検出を組み合わせて診断される：新規発症高血圧（座位血圧［BP］≧140/90 mm Hgの持続）及びタンパク尿（≧300 mg/24時間）。PEに対して現在有効な唯一の治療は出産である。PEの合併症には、痙攣、凝固性亢進、急性腎不全及び肺水腫が含まれる［1, 3］。

正常なヒト妊娠の間、子宮への血流は増加し、妊娠後期には心拍出量のおよそ25％まで達する。妊娠初期の間、ラセン動脈の調節（modulation）及び拡張により、子宮胎盤の血管抵抗性が低下し、子宮胎盤の血流が増加する。子癇前症を発症した女性では、子宮胎盤の血流が50％〜70％低下する［3, 4］。

母体の健康は、主として、子癇前症のタイプ（軽度又は重度）、合併症（例えば、発作）の予防、及び適時な出産によって決まる。

周産期の転帰は、病態の重症度、ひいては妊娠を出産まで持って行く能力によって決まる。重度の子癇前症の場合には、多くの症例において、胎児の死亡をもたらす早産がその転帰である。

子癇前症は、一般的な全身性母体炎症反応により特徴付けられるが［8］、とはいえ、正常妊娠それ自体も全身性炎症の状態である。正常妊娠における全身性炎症反応は、子癇前症のものと本質的に異ならず、単に軽度なだけである。この発見により、子癇前症は、全身性炎症プロセスが、妊娠自体により引き起こされる母体全身性炎症反応の範囲の極限まで達した場合に発症し、1つ又は別の母体システムを非代償性のものにする、との提案が導かれた［8］。この理論によれば、炎症性反応により酸化的ストレスが生成され、また逆に、酸化的ストレスにより炎症性反応が刺激され得、ポジティブフィードバックシステムのための基礎が形成される。胎盤の合胞体表面から母体循環系へと放出される1つ以上の炎症促進性因子がこのシナリオに関与するのかもしれない。

子癇前症はヒト妊娠に特異的な多系統疾患である；その発症の基礎は、妊娠初期に確立される。その病理学的特徴は、妊娠16〜20週におけるトロホブラストの着床の異常、ひいては胎盤床の適切な灌流のために必要である母体血管における生理的変化の異常であるように見える。妊娠が進むにつれ、胎児胎盤ユニットの代謝要求が増加するが、異常に浅い胎盤の侵入に起因して、ラセン細動脈が、必要な血流の増加を収容するのに十分に拡張しない。これにより、胎盤機能不全や、虚血性胎盤からの因子の異常な放出がもたらされ、血管痙攣及び内皮損傷が導かれる。最近の研究により、母体、胎児及び胎盤の循環系における、血管新生促進因子（例えば、VEGF及び胎盤成長因子［PlGF］）と抗血管新生因子（例えば、sFlt1［可溶性VEGF受容体］及びエンドグリン［可溶性TGF-β受容体］）のインバランスが、PE発症と関与することが示唆される。循環血管新生促進因子と循環抗血管新生因子のインバランスにより、更なる異常な胎盤血管系の発生、並びに血管の健康及び血管の拡張に重要な循環因子（例えばNO及びPGI₂）の減少がもたらされる。

子癇前症の根底にある分子メカニズムは十分に理解されていないとはいえ、研究により、受胎及び着床の間、胎児-父親抗原に対する不適切な胎児の耐性との関連が示唆されている［1, 3, 5-7］。興味深いことに、マイクロキメリズム（母方の祖母又は以前の妊娠由来の残留物である、母体における循環細胞）のレベルとPEの発生との関連が確立されており、ここでは、マイクロキメリズムのレベルが高いとPEの可能性が低下する。これは、骨髄、胎盤及び脂肪組織由来の接着性細胞と起源が類似する胎児胎盤インターフェース由来の細胞（例えば、国際特許公開公報番号WO 2007/108003及びWO 2009/037690（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載の細胞を参照）が、PEの発生を低下させ得ることを示唆する［8］。

多くの場合、子癇前症及び子癇は、出産から1〜2週間以内に消失するとはいえ、20％の女性は7年以内に高血圧及び微量アルブミン尿を発症し、心臓及び脳の血管系の病気の長期的なリスクは2倍増加する［1, 3］。

現在の治療オプションの制限
PE研究は進んでいるにも関わらず、子癇前症に対する治療は、胎児の出産以外に依然として存在しない。抗高血圧薬を使用しても、通常、PEの症状は緩和されない。子癇前症の管理は、在胎期間及び病気の重症度に依存する。しかしながら、全ての場合において、出産が、選択される唯一の治療である。軽度のPEを有する患者は、待機的（expectantly）に管理され得る。いくつかの場合では、出産を考慮して、胎児肺成熟を促進するためにステロイド注射を投与しながら、発作の発生を防ぐために硫酸マグネシウムを静脈内デリバリーすることによりPEを一時的に安定化できる。これらのケースでは、入院が必要とされ、胎児の状態が厳密にモニタリングされる。しかしながら、臓器機能不全、胎児の危険、又はHELLP症候群（肝酵素の上昇、血小板数の減少、及び溶血）を示す、より重度のPE、又は子癇の場合には、在胎期間に関わらず、即時の出産が示唆される［1, 3, 9, 10］。

PE動物モデル
ヒト子癇前症に利用可能なモデルには以下が含まれる：
・複数の種において子宮胎盤灌流圧の有意（およそ50％）な低下をもたらし、それにより子癇前症を模倣する子宮を提供する、腹部大動脈のクランピング、又は動脈の閉塞及び／若しくは結束（banding）［11］。
・境界域高血圧BPH/2マウスの同胞交配に由来する近交系BPH-5マウスは、出産から2日以内に消失し、タンパク尿の増加を伴う、妊娠後期の血圧上昇（コントロールC57BL-6における105 mmHgと比較して、130〜160 mmHg）を示す。外因性VEGF及び抗酸化剤は血圧を低下させ、胎児の生存を増加させる［7, 12］。
・SHHF/Mcc-fa（cp）（自然発生高血圧及び心不全）ラットは、妊娠と関連する自然発生高血圧、胎内発育遅延の子孫及び改変された胎盤遺伝子発現を示す［13］。
・PEに関する遺伝子組み換えマウスモデルは以下を含む：複数のサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体の強力な阻害剤であるp57Kip2の遺伝子ノックアウトを有するマウス；eNOS欠損マウス；及びエストロゲン異化の律速酵素であるカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ（COMT）欠損マウス［14］。

作用の細胞療法メカニズム
PEの病因は、血管系の異常な調節、及び血管新生と関連するサイトカインの異常な全身性プロファイル、主として、抗血管新生タンパク質の上昇を含む。

骨髄、胎盤及び脂肪組織由来の三次元的接着性細胞（例えば、国際特許公開公報番号WO 2007/108003及びWO 2009/037690［Plurixによる3D-接着性細胞；PLX細胞］を参照）は、高レベルの血管新生促進因子（例えば、VEGF、アンギオジェニン、PDGF及びIL-8を含む）、及び組織調節因子（例えば、TIMPs及びMMPs）を分泌する。In vitroにおいて、接着性の胎盤又は脂肪組織細胞によりコンディショニングされた培地は、血管新生及び血管調節の中心となる2つのプロセスである、内皮細胞増殖と平滑筋細胞増殖の両方を増加させることができる。さらに、接着性細胞は、有意な免疫調節特性を示す。

動物モデル及び臨床試験での実験によって、後肢虚血モデル、及び末梢動脈疾患（PAD）の罹患者において、接着性の胎盤又は脂肪組織細胞を投与（IM）することにより、灌流及び血管新生の増加がもたらされる（毛細血管がde-novo形成され、大概、既存の血管系がリモデリングされて血流が増加する（脈管形成）ことにより明らかにされる）ことが示される。

従って、本発明の側面は、子癇前症を予防又は治療する、接着性の胎盤又は脂肪組織細胞療法の能力に関する。

一実施態様は、子癇前症又は子癇の治療又は予防を必要とする対象において子癇前症又は子癇を治療又は予防する方法であって、治療上又は予防上有効量の接着性間質細胞を該対象に投与することを含み、それにより子癇前症又は子癇を治療又は予防する、方法を対象とする。特定の実施態様において、該細胞は、骨髄、胎盤又は脂肪組織から得られる。

別の実施態様は、子癇前症又は子癇を治療又は予防するための医薬を製造するための接着性間質細胞の使用を対象とする。特定の実施態様において、該細胞は、骨髄、胎盤又は脂肪組織から得られる。

特定の実施態様は、子癇前症又は子癇の治療又は予防に使用するための接着性間質細胞を対象とする。一実施態様において、該細胞は、骨髄、胎盤又は脂肪組織から得られる。

別の実施態様は、子癇前症又は子癇の治療又は予防に使用するためのラベルを含む包装材料を含む製造品であって、該包装材料が医薬上有効量の接着性間質細胞を包装する、製造品を対象とする。一実施態様において、該細胞は、骨髄、胎盤又は脂肪組織から得られる。

前記方法、使用、接着性間質細胞又は製造品の特定の実施態様において、対象は、早発型子癇前症を有する。他の実施態様において、対象は、妊娠約20週〜約34週の期間にある。さらに他の実施態様において、対象は、遅発型子癇前症を有する。更なる実施態様において、対象は、妊娠約34週〜約38週又はそれ以上の期間にある。

いくつかの実施態様において、対象は、妊娠に対する炎症反応が増加している。他の実施態様において、対象は、以下から選択される子癇前症に対する危険因子を1以上有する：一等親血縁者における子癇前症、以前の妊娠時の子癇前症歴、胎盤成長因子（PlGF）の血清濃度の低下、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1（sFlt-1）の血清濃度の増加、可溶性エンドグリンの血清濃度の増加、心血管疾患に対する危険因子、既存の無症状（sub-clinical）の内皮機能障害、慢性高血圧、糖尿病、脂質異常症、母体肥満、インスリン抵抗性、妊娠早期の高血圧、腎疾患、メタボリックシンドローム、凝固能亢進状態、若い母体年齢、高齢の母体年齢、不十分な胎盤形成、胎盤質量の増加、多胎妊娠、胞状奇胎、及び以前のパートナーとの以前の子癇前症の妊娠（preclamptic pregnancy）で父親であった人による出生前の父親。

他の実施態様において、子癇前症又は子癇は、妊娠前に接着性間質細胞を投与することにより予防される。なお更なる実施態様において、子癇前症又は子癇は、妊娠期間の任意の時期に接着性間質細胞を投与することにより予防される。他の実施態様において、子癇前症又は子癇は、妊娠約16週〜約20週の期間に該間質細胞を投与することにより予防される。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は全身投与され、一方、他の場合には、接着性細胞は局所投与される。他の実施態様において、接着性細胞は筋肉内投与される。特定の実施態様において、接着性細胞は皮下投与される。

いくつかの実施態様において、接着性細胞は、CD73、CD90、CD29及びCD105からなる群から選択されるポジティブマーカーの発現を含む。他の実施態様において、接着性細胞は、CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34及びCD79からなる群から選択されるネガティブマーカーの発現を含む。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は、三次元（3D）培養から得られる。特定の実施態様において、三次元（3D）培養は、3Dバイオリアクターを含む。さらに他の実施態様において、3D培養における接着性細胞の培養は、灌流下でなされる。更なる実施態様において、接着性細胞の培養は少なくとも3日間なされる。さらに、いくつかの実施態様において、接着性細胞の培養は、少なくとも10％の接着性細胞が増殖するまでなされる。

いくつかの実施態様において、接着性細胞は、二次元（2D）培養条件下、胎盤又は脂肪組織から培養された細胞を含む。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は、母親又は胎児に対して自家性（autologous）である。他の実施態様において、接着性間質細胞は、母親及び／又は胎児に対して同種異系（allogeneic）である。

本発明の更なる目的及び利点は、以下の説明にその一部が記載され、一部は、当該説明から明白であるか、或いは本発明の実施により学び得る。

図1。P（妊娠）、PPIC（妊娠＋polyI:C（TLR3アゴニスト））及びPR（妊娠＋R837（TLR7アゴニスト））マウスを、収縮期血圧（「SBP」）の測定後、妊娠14日目に、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射により投与して処置（treated）した。SBPは、妊娠の間、徐々に低下し、17日目までに基底レベルまで戻った。Nを括弧内に示す。データは平均±SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA。 図2。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に集めた尿を用いて、タンパク質及びクレアチニンレベルを分析した。P+PLA及びP+PLXについてはN＝4、他の4グループについてはN＝6。データは平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA。 図3A及び3B。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に大動脈を集め、37℃まで加熱し95％O2/5％CO2でバブリングした生理食塩水を含むDMT 210ミオグラフにおいてピン上にマウントした。PPIC及びPRマウスは内皮機能障害（アセチルコリン誘発性弛緩の低下（図3A）、正常なニトロプルシドナトリウム誘発性弛緩（図3B））を示し、これは、PLX細胞で処置することにより改善された。Nを括弧内に示す。データは平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA。 図4。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に2人の調査員により、一腹当たり（per litter）の産仔数（pup number）及び一腹当たりの胎児死亡を評価した。一腹当たりの産仔数又は胎児死亡に有意な差はなかった。P+PLA及びP+PLXについてはN＝4、他の4グループについてはN＝6。データは平均+SEMとして示す。 図5。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に脾臓重量及び体重を測定した。PLX細胞は、PRマウスにおいては脾腫を改善したが、PPICマウスにおいてはしなかった。他の4グループについてはN＝6。データは平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA。 図6A及び6B。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死後、18日目に、フローサイトメトリーにより免疫細胞サブセットを測定した。PLX細胞は、PPICマウスにおいては制御性T細胞の減少を改善したが、PRマウスにおいてはこれをせず（図6A）、一方で、PRマウスにおいてはγδ T細胞を減少させたが、PPICマウスにおいてはこれをしなかった（図6B）。全グループについてN＝2〜4。データは平均+SEMとして示す。 図7A及び7B。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に全血を集め、血漿を単離し、ELISAによりIL-4及びIL-6について分析した。PPIC及びPRマウスは、有意なIL-4レベルの低下（図7A）及びIL-6レベルの増加（図7B）を示し、これらはいずれもPLX細胞での処置により平常値へと戻った。データは平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA（one-way ANOVAによる）。 図8。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死後、18日目に得た胎盤においてイムノブロットによりHIF1_タンパク質レベルを測定し、アクチンレベルに対して正規化した。PLX細胞は、PPIC及びPRマウスにおいて、HIF1_タンパク質レベルを低下させた。データは、P+PLAの％として、平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA（one-way ANOVAによる）。 図9。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で106細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死後、18日目に得た胎盤に対してH&E染色を実施した。画像は、10×の倍率で示す。PLX細胞は、PPIC及びPRマウスにおいて、胎盤の血管周辺のフィブリン沈着（黒矢印）を低下させた。P＝妊娠、PPIC＝妊娠（TLR3アゴニスト）及びPR＝妊娠＋R837（TLR7アゴニスト）。

特定の実施態様の説明
本発明の原理及び実施は、図面及び以下の説明を参照してより理解されるだろう。

本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるか又は実施例により例証されるその詳細に、その適用を限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施態様が可能であり、或いは様々な方法で実施又は実行できる。また、本明細書で用いる表現及び専門用語は、説明目的であり、限定するものとみなすべきでないことが理解されるべきである。
本発明の実施態様は、子癇前症又は妊娠誘発高血圧又は子癇の治療又は予防を必要とする対象において、子癇前症又は妊娠誘発高血圧又は子癇を治療又は予防する方法であって、治療上又は予防上有効量の接着性間質細胞を該対象に投与することを含む、方法に関する。「接着性間質細胞」は、標準培養条件において、接着性材料（例えばプラスチック）への接着により単離及び／又は維持され得る間質細胞である。すなわち、「接着性間質細胞」とは、in vitroにて足場依存的である細胞、すなわち、in vitroにて増殖するために表面又は他の細胞への接着を必要とする細胞の均一又は不均一な集団をいう。接着性間質細胞は、少なくとも1つの「間質細胞表現型」を含んでよい。本明細書で使用する場合、「間質細胞表現型」とは、骨髄由来の間質（すなわち、間葉）細胞に典型的な構造的又は機能的な表現型をいう。従って、例えば、該細胞は、紡錘形を有してよい。或いは又は加えて、該細胞は、間質細胞に典型的なマーカー又はマーカー群（例えば表面マーカー）を発現してよい。

接着性間質細胞は、胎盤若しくは脂肪若しくは骨髄の組織に由来してよく、又は接着性間質細胞の任意の他の供給源に由来してよい。実施態様は更に、子癇前症又は妊娠誘発高血圧又は子癇の治療又は予防に使用するためのラベルを含む包装材料を含む製造品であって、該包装材料が、胎盤又は脂肪組織に由来する、医薬上有効量の接着性間質細胞を包装する、製造品に関する。いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は、国際特許公開公報番号WO 2007/108003及びWO 2009/037690（Plurixによる3D-接着性細胞；PLX細胞）（これらは各々、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載する、胎盤又は脂肪組織由来の接着性間質細胞である。

本発明の側面は更に、例えばPLX細胞などを含む胎盤又は脂肪組織由来などの接着性間質細胞を用いて子癇前症又は妊娠誘発高血圧又は子癇を治療又は予防するための多種多様な作用機序に関する。いくつかの実施態様において、子癇前症は、妊娠前に接着性間質細胞を投与することにより予防される。他の実施態様において、子癇前症は、妊娠の間の任意の時期に接着性間質細胞を投与することにより予防される。いくつかの実施態様において、接着性間質細胞療法は、抗血管新生プロファイルから血管新生促進プロファイルへと循環血管新生サイトカインの変化を引き起こし、それにより、子宮胎盤インターフェースにおいて内分泌腺の血管新生効果を誘起する。いくつかの実施態様において、この細胞療法は、子宮胎盤インターフェースにおいてラセン細動脈の調節を誘起し、それにより、血管調節及び血管拡張、並びに血流の増加がもたらされる。特定の実施態様において、該細胞療法は、PEに関与し得る炎症性及び免疫性プロセスの全身的な抑制を誘起する。

いくつかの実施態様において、胎児生存率が低く、母体の健康が危険にさらされている早期及び重度に発症する子癇前症（妊娠約20週〜約24週の期間にある対象を含む）の場合、接着性間質細胞の筋肉内投与により、PE症状が改善（reverse）又は緩和され、母親及び子供の両方の予後が改善される。

胎盤又は脂肪組織に由来する接着性細胞は、二次元又は三次元培養条件を用いて増殖させ得る。本明細書で使用する場合、フレーズ「三次元培養」とは、細胞を1より多い層中で増殖させながら、細胞増殖に適合する条件に細胞を置く培養をいう。生体（又は組織）中での細胞のin situ環境が、三次元的な構造であることが十分理解される。細胞は、他の細胞で囲まれている。それらは、様々な局所微小環境の樹立を可能にする、細胞外マトリックスナノスケール線維の複雑なネットワーク中に保持される。それらの細胞外リガンドは、基底膜への接着を媒介するだけでなく、様々な血管及びリンパ管へのアクセスも媒介する。酸素、ホルモン及び栄養素が細胞に運ばれ、老廃物が運び出される。本発明の三次元培養における条件は、以下にてさらに例証するように、かかる環境を模倣するよう設計される。

三次元培養の条件は、接着性細胞の拡大を可能にするようなものであることが理解されるだろう。本明細書で使用する場合、用語「拡大する（expanding）」及び「拡大（expansion）」とは、細胞が実質的にほとんど分化せずに維持され、最終的には細胞が増殖すること、すなわち、細胞集団の増加（例えば、少なくとも2倍）であって、かかる増加に伴い分化しないことをいう。

本明細書で使用する場合、用語「維持する（maintaining）」及び「維持（maintenance）」とは、細胞が実質的にほとんど分化せずに再生すること、すなわち、実質的に定常的な細胞集団であって、かかる定常性に伴い分化しないことをいう。

述べたように、本発明のこの具体的な側面の接着性細胞は、脂肪又は胎盤組織から回収される。

胎盤細胞は、臨月の又は出産予定日より早い胎盤から得られてよい。胎盤は、好ましくは、それが完全に放血（ex blooded）されている際に集められる。胎盤は、好ましくは、残留細胞を除去するのに十分な期間灌流される。本明細書で使用する場合、用語「灌流する」又は「灌流」とは、臓器又は組織に流体を注ぐ又は通過させる行為をいう。胎盤組織は、任意の哺乳動物由来であってよい；例えば、胎盤組織はヒトである。胎盤組織の簡便な供給源は、分娩後の胎盤（例えば、1〜6時間）由来のものであるが、胎盤組織若しくは細胞の供給源、又は胎盤組織の単離方法は、本発明にとって重要ではない。

胎盤由来の接着性細胞は、胎盤の胎児部分（すなわち、羊膜、絨毛膜、絨毛膜絨毛又は胎盤の内部部分）、並びに胎盤の母体部分（すなわち、基底脱落膜及び壁側脱落膜）の両方から得られてよい。組織試料は、生理学的バッファー［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）又はハンクスバッファー］で洗浄される。単細胞懸濁液は、組織を消化酵素で処理すること（下記参照）、又は／及び組織部分を細かく刻み、ナイロンフィルターを通す（flushing）ことによって、又は洗浄メディウムとともに穏やかにピペッティング（Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA）することによって、作製される。

脂肪組織由来の接着性細胞は、当業者に公知の様々な方法により単離されてよい。例えば、かかる方法は、米国特許第6,153,432号に記載される。脂肪組織は、大網／内臓の、乳房の、生殖腺の、又は他の脂肪組織の部位に由来してよい。脂肪組織の供給源の一つは、大網脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は、典型的には、脂肪吸引により単離される。
脂肪組織からの単離接着性細胞は、該組織を消化酵素、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン及び／又はディスパーゼ；及び／又は有効濃度のヒアルロニダーゼ若しくはDNAse；及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で、10分間〜3時間の期間、25〜50℃の温度で処理することにより得られてよい。次いで、該細胞を、20ミクロン〜1 mmのナイロン又はチーズクロスメッシュフィルターに通過させてよい。次いで、該細胞を、培地中直接的な分画遠心法、又はFicoll若しくはPercoll若しくは他の微粒子勾配にわたる分画遠心法に供する。細胞を、1分間〜1時間の期間、4〜50℃の温度で100〜3000×gの速度で遠心分離する（米国特許第7,078,230号を参照）。

その起源（例えば、胎盤又は脂肪組織）に関わらず、細胞の回収は、好ましくは、滅菌条件下でなされる。単離細胞が得られたら、それらを接着性材料（例えば、表面として構成される）に接着させ、それにより接着性細胞を単離する。培養は、2D条件下で進めてよく、細胞をさらに3D条件に移動させてよい。

本明細書で使用する場合、「接着性材料」とは、表面に細胞を保持し得る化学的構造（例えば、荷電表面露出基）を有する非細胞毒性（すなわち、生物学的に適合する）材料の合成物、天然物又はそれらの組み合わせをいう。本発明に従って使用されてよい接着性材料の例として、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン）、コラーゲン、ポリL乳酸及び不活性金属ファイバーが挙げられるが、これらに限定されない。

接着性間質細胞について精製又は濃縮（enrichment）の更なる工程を、当分野で周知の方法（例えば、以下にさらに記載するように、接着性間質細胞マーカーの発現を用いたFACSによる）を用いて行ってよい。

本発明に従った培養に有用な基本培地の非限定的な例として、199培地、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams' G、Neuman & Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153を含めて、多数ある中で、イーグル最小必須培地（Minimum Essential Medium Eagle）、ADC-I、LPM（ウシ血清アルブミン不含）、F 10（HAM）、F 12（HAM）、DCCM 1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培地（Fitton-Jackson Modificationを有するか、有さない）、基本イーグル培地（Earleの塩ベース（salt base）を添加したBME）、ダルベッコ改変イーグル培地（血清不含DMEM）、Yamane、IMEM-20、Glasgow改変イーグル培地(GMEM)、Leibovitz L-15培地、McCoyの5A培地、M199培地(Earleの塩ベースを含むM199E)、M199培地(Hank’sの塩ベースを含むM199H)、イーグル最小必須培地(Earleの塩ベースを含むMEM-E)、イーグル最小必須培地(Hank’sの塩ベースを含むMEM-H)、及びイーグル最小必須培地(非必須アミノ酸を含むMEM-NAA)が挙げられる。本発明における使用に好ましい培地はDMEMである。これらの培地及び他の有用な培地は、特に、GIBCO、Grand Island, N.Y., USA、及びBiological Industries, Bet HaEmek, Israelから入手可能である。これらの培地のいくつかは、Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72、William B. Jakoby及びIra H. Pastan（編）、Academic Press, Inc（発行）にまとめられている。

培地には、例えば、血清（例えば、ウシ又は他の種の胎児血清）が補充されてよく、且つ任意選択で又は代替的に、成長因子、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）、サイトカイン、塩（例えば、B-グリセロホスフェート）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、及びホルモン、例えば、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン3、インターロイキン6、インターロイキン7、マクロファージコロニー刺激因子、c-kitリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子、及び骨形成タンパク質がピコグラム/ml〜ミリグラム/mlレベルの濃度で補充されてもよい。

追加成分が培養培地に添加されてよいことが更に理解される。かかる成分は、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、及び細胞の培養のために当分野で公知の他の成分であってよい。さらに、必要に応じて分化プロセスを増強するために成分を添加してよい（さらに下記参照）。

本発明の接着性間質細胞がヒト対象に投与される場合には、細胞及び培養培地（例えば、上記培地添加物を有するもの）は、実質的にゼノフリーでなければならず、すなわち、マイコプラズマなどの何らかの動物性汚染物質がないものでなければならないことが理解されるだろう。例えば、培養培地には、血清代替物、ヒト血清、及び／又は合成若しくは組換え産生された因子（細胞が血清不含条件下で増殖し得るように）を補充できる。

述べたように、接着性細胞が手元にあれば、それらを二次元又は三次元的な環境に継代してよい。とはいえ、細胞は、単離後すぐに3D構成マトリックスに移動されてよく、或いはまた二次元的な条件の後、三次元的な環境に継代されてもよいことが理解されるだろう。

大規模生産のために、培養を3Dバイオリアクター中で行うことができる。3D培養のために接着性基質を構成し、それにより、組織（例えば、胎盤）の基礎構造を模倣するように細胞接着のために利用可能な接着表面を実質的に増加させる増殖マトリックスを提供する。
かかるバイオリアクターの例として、プラグフローバイオリアクター、連続撹拌槽型バイオリアクター、定常床（stationary-bed）バイオリアクター、CelliGen Plus（登録商標）バイオリアクターシステム（New Brunswick Scientific（NBS））又はBIOFLO 310バイオリアクターシステム（New Brunswick Scientific（NBS））が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Celligenバイオリアクターは、制御された条件（例えば、pH、温度及び酸素レベル）下、コンスタントに細胞増殖培地を灌流して、接着性細胞を3D拡大することが可能である。さらに細胞培養は、グルコース、ラクテート、グルタミン、グルタメート及びアンモニウムの濃度レベルについて直接モニタリングすることができる。接着性細胞のグルコース消費速度及びラクテート生成速度により、細胞増殖速度を測定すること、及び回収時期を決定することが可能である。

本発明とともに使用できる他の3Dバイオリアクターとして、以下が挙げられるが、これに限定されない：連続撹拌槽型バイオリアクターであって、培養培地がバイオリアクターに連続的に供給され、生産物が連続的に引き出されて、リアクター内の時定数定常状態（time-constant steady state）が維持されるもの。繊維状床バスケットを有する撹拌槽型バイオリアクターは、例えば、New Brunswick Scientific Co., Edison, NJにて入手可能である。定常床バイオリアクター、エアーリフトバイオリアクター（このバイオリアクターでは、空気が、典型的には、中央通気管の底部に供給され、気泡を形成しながら上に流れ、排気ガスをカラムの上部から放出（disengaging）する）、ポリアクティブ発泡体を有する細胞播種灌流バイオリアクター［Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84：205-214,（2003）に記載されるようなもの］、ラジアルフロー灌流バイオリアクターにおける管状のポリL-乳酸（PLLA）の多孔性足場［Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93（5）：947-954（2006）に記載されるようなもの］。本発明に従って使用することができる他のバイオリアクターは、米国特許第6,277,151号、同第6,197,575号、同第6,139,578号、同第6,132,463号、同第5,902,741号及び同第5,629,186号に記載されている。

細胞播種は、好ましくは、播種時において100,000〜1,500,000細胞／mmでなされる。例示的な実施態様において、合計で150±30×10⁶細胞が播種され、3〜5×10⁶細胞／gr担体が播種されるか、又は0.015〜0.1×10⁶細胞／mlが播種される。
細胞は、制御されない分化及び老化を避けながら、細胞の少なくとも約10％が増殖中であるときに回収することができる。

培養は、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、10日間、20日間、1ヶ月間又はさらにそれ以上の期間にわたってなされる。バイオリアクターにおける培養はこの期間を延ばし得ることが理解されるだろう。3D培養における接着性細胞の培養は、培養培地の連続流下でなされ得る。継代もまた、細胞数を増加させるためになされてよい。培養培地は、培養条件を延ばし、かつ改善するために交換されてよいことが理解されるだろう。

本発明のいくつかの実施態様の接着性細胞は、少なくとも約10％、28％、30％、50％、80％又はそれ以上の増殖性細胞を含む（S期及びG2／M期をFACSモニタリングすることによってアッセイされ得るように）。或いは又は加えて、細胞は、接着性間質細胞に典型的なマーカー又はマーカー群（例えば、表面マーカー）を発現し得る。かかる細胞表面マーカー（ポジティブ及びネガティブ）の例として、CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD3-、CD4-、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-及びFMC7-が挙げられるが、これらに限定されない。他の接着性間質細胞マーカーには、チロシンヒドロキシナーゼ、ネスチン及びH-NFが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の教示に従って作製された細胞集団は、独特のタンパク質発現プロフィルを特徴とする。従って、例えば、胎盤又は脂肪組織の接着性間質細胞は、選択された因子を高いレベルで発現及び／又は分泌することができる。例えば、かかる細胞は、SCF、Flt-3、H2Aヒストンファミリー（H2AF）又はアルデヒドデヒドロゲナーゼX（ALDH X）を、2D培養で増殖させた胎盤又は脂肪組織の接着性細胞によって発現又は分泌されるものよりも、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍又はさらには12倍高く発現又は分泌する。加えて又は或いは、本発明の細胞集団は、IL-6、真核生物翻訳伸長因子2（eukaryotic translation elongation factor 2）（EEEF2）、レチクロカルビン3、EF-ハンドカルシウム結合ドメイン（RCN2）又はカルポニン1塩基性平滑筋（calponin 1 basic smooth muscle）（CNN1）を、2D培養で増殖させた胎盤又は脂肪組織の接着性細胞によって発現又は分泌されるレベルよりも、少なくとも2倍、3倍又は5倍高いレベルで分泌又は発現する。加えて又は或いは、本発明の細胞集団は、2D培養させた細胞と比較して、様々な他のタンパク質の発現レベルがより低いことを特徴とする。従って、例えば、2D培養で増殖させた胎盤又は脂肪組織の接着性細胞によって発現又は分泌されるヘテロ核リボヌクレオタンパク質H1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1）（Hnrph1）、CD44抗原アイソフォーム2前駆体、3 ホスホアデノシン 5 ホスホスルフェートシンターゼ2アイソフォームa（3 phosphoadenosine 5 phosphosulfate synthase 2 isoform a）（Papss2）又はリボソームタンパク質L7a（rpL7a）の発現レベルの0.6、0.5、0.25又は0.125未満を分泌又は発現する。

治療を受ける対象は、子癇前症又は子癇に対する治療又は予防を必要とする任意の妊娠哺乳動物であってよく、これには、例えば、ヒト又は家畜（ウマ（すなわち、ウマ科動物）、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラクダ、アルパカ、ラマ及びヤクを含むが、これらに限定されない）が含まれる。

投与様式
いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は局所投与される。更なる実施態様において、該細胞は全身投与される。

いくつかの実施態様において、細胞は、筋肉内又は皮下注射を介して局所投与される。筋肉内（IM）投与は、重症虚血肢（CLI）に対する臨床試験において安全性が証明されている。局所投与はまた、IM注射が損傷に対して離れている場合（結紮されていない肢）、後肢虚血（HLI）の症状の改善を容易にする。IM投与はまた、全身的に検出可能なレベルでのサイトカインの分泌を可能にし、デリバリーの容易性及びスピードを提供する。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は、母親又は胎児に対して自家性である。他の実施態様において、接着性間質細胞は、母親及び／又は胎児に対して同種異系である。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、細胞はそれ自体で投与することができ、又は好ましくは、医薬上許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与することができる。本明細書で使用する場合、「医薬組成物」とは、本発明の接着性細胞（すなわち、三次元培養から得られる、胎盤及び脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞）と、他の化学的成分（例えば、医薬上適した担体及び賦形剤）との調製物をいう。医薬組成物の目的は、対象に対する細胞の投与を容易にすることである。

以下、用語「医薬上許容される担体」とは、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ投与された化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤をいう。担体の非限定的な例は、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョン、及び有機溶媒と水の混合物である。

本明細書において、用語「賦形剤」とは、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが含まれる。

本発明の好ましい実施態様によれば、医薬用担体は塩類（saline）の水溶液である

薬物の配合及び投与のための技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co., Easton, PA、最新版）（参照により本明細書に援用される）に見出され得る。

医薬組成物を全身的な様式で投与してよい。或いは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物を注射することによって、局所的に医薬組成物を投与してよい。

本発明の医薬組成物は、当分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和（levigating）、乳化、カプセル化、封入化（entrapping）又は凍結乾燥化プロセスによって製造されてよい。

従って、本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬として使用可能な調製物へと活性成分の加工を容易にする、賦形剤及び補助剤を含む1以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化されてよい。適切な製剤は、選択される投与経路によって決まる。

注射について、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合し得るバッファー（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、生理学的食塩緩衝液、又は凍結保存剤（cryopreservents）を含む凍結培地など）中で配合されてよい。経粘膜投与について、浸透されるバリアに適した浸透剤が、製剤中で使用される。かかる浸透剤は当分野で一般に公知である。

本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療上有効な量又は用量は、in vitro及び細胞培養アッセイから最初に推定することができる。好ましくは、用量は、所望の濃度又は滴定量を得るために動物モデルにおいて製剤化される。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。本明細書に記載の活性成分の毒性及び治療効力は、in vitro、細胞培養又は実験動物において、標準的な薬学的手順により決定され得る。

これらのin vitro及び細胞培養アッセイ並びに動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を策定（formulating）するのに使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に応じて変化してよい。正確な配合、投与経路及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Fingl, et ai, 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l参照）。例えば、パーキンソン病患者は、治療に対してポジティブな反応を示す運動機能の改善について症候的にモニタリングされ得る。

注射について、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合し得るバッファー（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的食塩緩衝液など）中で配合されてよい。

投薬量及び投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に制御するのに十分である活性成分のレベルまで個々に調節されてよい。所望の効果を達成するのに必要な投薬量は、個体の特徴及び投与経路によって決まるだろう。検出アッセイを用いて、血漿中濃度を決定できる。
治療される状態の重篤度及び応答性に依存して、投薬は単回投与であることも複数回投与であることも可能であり、治療の経過は、数日から数週間まで、或いは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。投与される組成物の量は、当然のことながら、治療されている個体、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などによって決まるだろう。投薬量及び投与のタイミングは、個体の変化する状態の慎重かつ継続的なモニタリングに対応するだろう。

治療／予防の様式
いくつかの実施態様において、接着性間質細胞治療を受ける対象は早発型PE（妊娠約20〜約34週）を有する。PEを早期に発症する場合、予後は、急速な進行、複数の合併症、及び不良な周産期の転帰を含む。さらに、妊娠24週未満の妊娠期間について、待機治療（expectant treatment）は、高い母体罹患率及び最小の周産期有益性と関連する［15, 16］。いくつかの実施態様において、対象は、診断後すぐに細胞治療を受ける。

更なる実施態様において、接着性間質細胞治療を受ける対象は遅発型PEを有する。遅発型PE（妊娠約34〜38週又はそれ以上）の場合、予後は通常良好であり、待機的管理が可能である。本明細書に記載の細胞療法での治療は症状を緩和でき、それにより、潜在的に合併症を低下させ、かつ費用のかかる入院期間及び長期合併症を低下させ得る。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞、例えば、胎盤又は脂肪組織由来の接着性間質細胞は、予防的治療方法で使用される。予防的治療は、妊娠の任意の時期又は妊娠前に対象に行われてよい。例えば、予防的治療は、妊娠初期、妊娠中期、又は妊娠後期の対象に行われてよい。いくつかの実施態様において、対象は、妊娠約12〜約28週、又は妊娠約6〜約38週若しくはそれ以上、又は妊娠の任意の週（妊娠第1週から出産までを含む）にて、予防的治療を受ける。予防的治療のいくつかの実施態様において、対象は、妊娠約16〜約20週にて治療を受ける。いくつかの実施態様において、対象は、PEに遺伝子的にかかりやすい。更なる実施態様において、対象は、過去の妊娠においてPE歴を有する。いくつかの実施態様において、PEの潜在的ケースは、胎盤成長因子（PIGF）及び可溶性fms様チロシンキナーゼ-1（sFlt-1）を含むバイオマーカーを用いて、対象にて検出される。PEの病因は、血管新生／組織調節的な性質である、胎盤発育の初期発育プロセスと関連する。従って、いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞療法（例えば、PLX療法）は、最初の段階でPEが現れることを予防し得る。PLX療法は、母体及び胎児の安全性を示し、従って、実施態様は、危険にさらされている集団に対する予防的なPLX療法を包含する。

いくつかの実施態様において、接着性間質細胞は、PEに対して1以上の危険因子を有する対象に投与される。妊娠に対する母体全身性炎症反応を増加させ得る任意の因子が、その起源に関わらず、母親を子癇前症にかかりやすくするであろうことは必然的帰結である。PEに対する危険因子は以下を含む：母体肥満及び関連炎症、心血管疾患に対する危険因子、例えば、慢性高血圧、既存の糖尿病、脂質異常症、及び高齢の母体年齢［19］。これらの女性は、正常血圧性妊娠を有し続ける女性と比較して、過体重であり、より高い脂質レベル、より高い血圧、インスリン抵抗性を有する可能性が高く、血栓形成傾向を有する可能性が高い［20］。

妊娠初期により高い血圧を有する女性は、循環抗血管新生因子sFlt-1及びsEngに対する感受性が高いように見え、結果として、これらの因子がより低い濃度でも子癇前症を発症する［21］。これらの危険因子は、それだけで使用される場合、それほど予測性は高くないものの、リスクのある女性の同定を助け、母体の帰結及び場合によっては、さらに周産期の転帰を改善できる［22］。

総合すれば、これらの観察により、慢性高血圧により認識されるような、既存の無症状の母体内皮機能障害は、女性を不十分な胎盤形成になりやすくさせ、胎盤機能不全の影響に対しより敏感にさせるという考えが支持される。従って、女性の妊娠前の代謝の及び内皮の健康は、子癇前症に対する発症可能性に影響を及ぼし、それはまた、その後の人生における将来的な代謝性疾患及び心血管疾患のリスクの臨床症状である。

他の危険因子は以下を含む：以前の妊娠時の子癇前症、特に早発型PEの場合；一等親血縁者における子癇前症（女性の重度の子癇前症のリスクを2〜4倍増加させる）；糖尿病、腎疾患、メタボリックシンドローム及び凝固能亢進状態を含む特定の病状；非常に若い母体年齢；高齢の母体年齢；胎盤質量の増加；多胎妊娠；胞状奇胎；以前のパートナーとの以前の子癇前症の妊娠（preclamptic pregnancy）で父親であった人による出生前の父親；胎盤成長因子（PlGF）の血清濃度の低下；可溶性fms様チロシンキナーゼ-1（sFlt-1）の血清濃度の増加；sFlt-1:PlGFの比率の増加；及び可溶性エンドグリンの血清濃度の増加。

いくつかの実施態様において、対象は、約1億5千〜約3億細胞の投与量で接着性間質細胞を投与される。いくつかの実施態様において、その後の用量は、より低い細胞数である。用量は、複数の時点及び／又は変動時間間隔で投与されてよい。いくつかの実施態様において、投与スケジュール及び／又は投薬は、婦人科医と相談して決定される。

実施例1：PLX、脂肪接着性間質細胞及び骨髄接着性間質細胞処置（treatment）は、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、血圧を低下させる
ラット、マウス及びヒトにおいて、妊娠の間のRNA受容体の活性化は、炎症、内皮機能障害及び胎盤機能不全、並びに高血圧を引き起こすことから、dsRNA又はssRNAのいずれかの形態のRNAは、PEの発症に主要な役割を果たす［23〜25］。ウイルスにより発現され、かつ損傷／死滅細胞から放出されるdsRNA及びssRNAは、高度に保存された特異的RNA受容体（dsRNAに対してはToll様受容体3［TLR3］；ssRNAに対してはToll様受容体7［TLR7］）を活性化し、炎症促進性免疫応答を導く。Toll様受容体は、他の自然免疫系受容体と同様に、高度に保存されており、炎症促進性シグナル伝達経路を引き起こし、適応免疫系を活性化させることにより、死滅又は損傷細胞から放出される病原体関連分子パターン（PAMPs）及び内因性リガンドに応答する。ラット及びマウスにおいて、アゴニストポリイノシン-ポリシチジン酸（poly（I:C））によるTLR3の活性化は、妊娠及び非妊娠動物の両方において全身性炎症を引き起こし、妊娠動物においては、高血圧、タンパク尿及び内皮機能障害を引き起こす［23〜25］。マウスにおいて、妊娠の間のTLR7の活性化はまた、妊娠依存性の高血圧、内皮機能障害、脾腫、及び胎児死亡発生率の増加を引き起こす［25］。ヒトにおけるPEとのこの症状の類似性を考慮すると、これらの結果は、過剰なTLR3及びTLR7活性化が、ヒトにおいてPEの症状を引き起こすことを示唆しており［25］、マウスにおけるTLR3及びTLR7活性化が、ヒトにおけるPE研究に対する有用なモデルであることを示す。

妊娠C57Bl/6Jマウスに対し、以下のいずれかを妊娠13、15及び17日目に腹腔内注射した：Toll様受容体3（TLR3）アゴニストポリイノシン-ポリシチジン酸（poly（I:C））（PPICマウス）、Toll様受容体7（TLR7）アゴニストR837（イミキモド）（PRマウス）、又は生理食塩水（saline）ビヒクル（Pマウス）。妊娠14日目に、PLX細胞を調製し、50万個のPLX細胞を含むplasmaLyte A（PLA）（25□l）へと処理した。tail-cuff収縮期血圧の測定後、2匹のPマウス、2匹のPPICマウス及び2匹のPRマウスに、PLAビヒクル注射又はPLX細胞注射のいずれかを受けさせた。1匹のPマウス、1匹のPPICマウス及び1匹のPRマウスには、簡単な麻酔下（イソフルラン）中にて、右肢筋肉に2の別個のPLA注射（25□l）をそれぞれ与えた。残りのPマウス、PPICマウス及びPRマウスには、簡単な麻酔下（イソフルラン）中にて、右肢筋肉に2の別個のPLX細胞注射（25□l）（全部で10⁶細胞）をそれぞれ受けさせた。マウスはすぐに回復し、麻酔又は注射による悪影響は全く示さなかった。6匹のマウス（2つのグループで飼育される）を、食事及び水を自由摂取させる標準的な飼育条件に戻した。収縮期血圧は、各マウスのアイデンティティ（PLA vs. PLX）を知らない（blinded）2人の調査員により、妊娠15、16及び17日目の午後に測定し、15及び17日目には、TLR注射の前に実施した。

PPIC及びPRマウスは、妊娠14日目までに有意な収縮期血圧の上昇を示し、これは、17日目までにわたって上昇したままであった（図1；P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；nは括弧内に示す；データは平均 +/- SEMとして示す；アスタリスクは、<0.05のp値（vs. P+PLA）を示す）。PLAビヒクルの筋肉内注射を受けたマウスはすべて、いずれの血圧の変化も有さなかった（図1における黒一色の記号）。しかし、PLX細胞を受けたPPIC及びPRマウスは、段階的に有意な血圧の低下を有し、17日目までにPレベルまで戻った（図1における黒色アウトラインの記号）。さらに、PLX細胞での処置は、Pマウスにおいて、血圧に対して何ら影響を及ぼさなかった。

骨髄又は脂肪組織由来の接着性間質細胞を用いて同様の実験を行った。実験は上記のように実施し、14日目にPPICマウスに10⁶細胞をi.m.注射により投与した。結果を表1に示し、これは、投与後、14〜17日目におけるSBP値の低下を示す。この結果は、投与された細胞タイプ（すなわち、骨髄又は脂肪）のそれぞれについて、細胞投与後、妊娠14日目から17日目までにおいて、上昇したSBFが低下することを実証する。

実施例2：PLX、脂肪接着性間質細胞及び骨髄接着性間質細胞処置は、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、タンパク尿を低下させる
TLR誘導性のPEマウスは、タンパク尿を呈し、これはヒトにおけるPEの臨床的決定因子である。実施例1に記載するように、妊娠C57Bl/6JマウスにおいてPEを誘導し、該マウスをPLX細胞又はPLAビヒクルで処置した。妊娠18日目にマウスを安楽死させ、この時点で尿を集め、尿タンパク質を測定した。測定したタンパク質値を尿クレアチニンレベルに対して正規化した。14日目におけるPLX細胞での処置は、PPIC及びPRマウスにおいては、尿タンパク質／クレアチニン比を平常値へと戻したが、Pマウスにおいては何ら影響を及ぼさなかった（図2；P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；P+PLA及びP+PLXについてはn＝4、他の4グループについてはn＝6；データは、平均+SEMとして示す；アスタリスクは、<0.05のp値（vs. P+PLA）を示す）。従って、PLX細胞での処置は、PPIC及びPRマウスにおいてタンパク尿を改善した。

骨髄又は脂肪組織由来の接着性間質細胞を用いて同様の実験を行った。実験は上記のように実施し、14日目にPPICマウスに10⁶細胞をi.m.注射により投与した。結果を表2に示し、これは、14日目におけるBM及び脂肪由来接着性細胞での処置が、PPICマウスにおいて、尿タンパク質／クレアチニン比を低下させたことを示す。従って、骨髄接着性間質細胞及び脂肪接着性間質細胞での処置は、PPICマウスにおいてタンパク尿を改善した。

実施例3：PLX細胞処置は、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、内皮機能障害を緩和する
PEを有するヒトは、内皮機能障害、又は血管拡張刺激に応答して血管が弛緩する能力の低下を特徴的に示す。TLR誘導性のPEマウスもまた内皮機能障害を示し、これは、内皮依存性拡張物質アセチルコリンに対する弛緩反応は有意に低下するが、内皮依存性拡張物質ニトロプルシドナトリウムに対する弛緩反応は正常であることにより証明される。実施例1に記載するように、妊娠C57Bl/6JマウスにおいてPEを誘導し、該マウスをPLX細胞又はPLAビヒクルで処置した。安楽死後、妊娠18日目に大動脈を集め、37℃まで加熱し95％O₂/5％CO₂でバブリングした生理食塩水を含むDMT 210ミオグラフにおいてピン上にマウントした。PLX細胞での処置は、PPIC及びPRマウスにおいて、アセチルコリンに対する大動脈内皮依存性弛緩反応を回復させたが（図3A）、ニトロプルシドナトリウムに対する内皮非依存性弛緩反応に対しては何ら影響を及ぼさなかった（図3B；図3について：P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；nは括弧内に示す；データは、平均+SEMとして示す；アスタリスクは、<0.05のp値（vs. P+PLA）を示す）。従って、PPIC及びPRマウスのPLX細胞処置は、アセチルコリン媒介性の大動脈弛緩反応を増加させ、これにより、PEマウスにおける内皮機能障害の改善が示される。

実施例4：PLX細胞処置は、妊娠PEマウスにおいて、胎児に害を及ぼさない
胎児発達に対するPLX細胞処置の影響を、PLX処置PEマウスからの一腹当たりの産仔数（the number of pups per litter）及び各同腹仔における胎児死亡発生率を決定することにより評価した。実施例1に記載するように、妊娠C57Bl/6JマウスにおいてPEを誘導し、該マウスをPLX細胞又はPLAビヒクルで処置した。一腹当たりの産仔数、及び一腹当たりの胎児死亡発生率は、各マウスのアイデンティティを知らない2人の調査員により、安楽死の間、18日目に評価した。6グループのマウスのいずれにおいても、一腹当たりの産仔数及び胎児死亡発生率にいずれの有意差も明らかとならなかった（図4；P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；P+PLA及びP+PLXについてはn＝4；他の4グループについてはn＝6；データは、平均+SEMとして示す）。これは、PLX細胞での処置が、胎児に害を及ぼさないことを示す。

実施例5：PLX細胞は、妊娠マウスにおいて免疫原性ではない
PEを有する女性は、典型的には、脾腫又は脾臓の肥大を経験し、これは能動的な免疫応答を表す。PLX細胞で処置したPEマウスにおける妊娠の間の免疫系の状態を評価するために、実施例1に記載するように、妊娠C57Bl/6JマウスにおいてPEを誘導し、該マウスをPLX細胞又はPLAビヒクルで処置した。妊娠18日目にマウスを安楽死させ、脾臓重量を測定し、体重に対して正規化した。PLX細胞での処置は、Pマウスにおいて脾臓サイズを増加させず、これにより、PLX細胞の免疫原性の欠如が実証された（図5）。PPIC及びPRマウスは脾腫を呈する（図5）。PLX細胞での処置により、R837を注射したPEマウス（PRマウス）では、体重に対する脾臓重量の比率は平常値へと戻ったが、poly（I:C）を注射した（PPIC）マウスでは、体重に対する脾臓重量の比率はこの処置により劇的には低下しなかった（図5；P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；P+PLA及びP+PLXについてはn＝4、他の4グループについてはn＝6；データは、平均+SEMとして示す；アスタリスクは、<0.05のp値（vs. P+PLA）を示す）。

実施例6：PE発症及びPLX細胞処置での免疫細胞レベルの変化
免疫細胞サブセットの変化が、PEの発症、及びPLX細胞処置により媒介されるPE症状の減少と関連するかどうかについても検証した。実施例1に記載するように、妊娠C57Bl/6JマウスにおいてPEを誘導し、該マウスをPLX細胞又はPLAビヒクルで処置した。妊娠18日目にマウスを安楽死させ、抗炎症性で寛容原性の免疫細胞である制御性T細胞（T_regs；CD4+/FoxP3+）、及び炎症促進性の免疫細胞であるγδ T細胞（CD3+/γδ+）のレベルをフローサイトメトリーにより測定した。図6Aが実証するように、T_regsの脾臓レベルは、Pマウスと比較して、PPIC及びPRマウスでは低下した。PLX細胞での処置は、PPICマウスにおいては、T_regsのレベルを回復させたが、PRマウスではしなかった（図6A）。さらに、γδ T細胞の脾臓レベルは、脾臓重量に対して正規化した場合、PPIC及びPRマウスにおいて上昇した（図6B）。PLX細胞での処置は、PRマウスでは、γδ T細胞レベルを正常値まで低下させたが、PPICマウスではしなかった（図6B）（図6について：P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly（I:C）、及びPR＝妊娠＋R837；全てのグループについてn＝2〜4；データは、平均+SEMとして示す）。

実施例7：PLXは、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、IL-4血漿レベルを回復させる
PLX細胞誘導性の脾腫及びγδ T細胞の減少と一致して、正常な妊娠にとって重要である、抗炎症性サイトカインIL-4の血漿レベルの回復、及び炎症促進性サイトカインIL-6の血漿レベルの正常化が、PPIC及びPRマウスにおいて観察された（図7）。P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死の間、18日目に全血を集め、血漿を単離し、ELISAによりIL-4及びIL-6について分析した。PPIC及びPRマウスは、有意なIL-4レベルの低下及びIL-6レベルの増加を示し、これらはいずれもPLX細胞での処置により平常値へと戻った。P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly I:C（TLR3アゴニスト）、及びPR＝妊娠＋R837（TLR7アゴニスト）。データは、平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA（one-way ANOVAによる）。

これらのデータをまとめると、PPIC及びPRマウスにおいて、PLX細胞での処置は炎症を低下させ、これにより、PE症状の減少が媒介され得ることが示唆される。

実施例8：PLX細胞は、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、HIF1αタンパク質を減少させた
次に、胎盤の損傷がPPIC及びPRマウスにおいて引き起こされるかどうか、PLX細胞での処置が何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために、イムノブロットにより低酸素マーカーHIF1αの胎盤レベルを検証した。HIF1αタンパク質レベルは、PPIC及びPRマウス由来の胎盤で有意に増加し、これはPLX細胞での処置により予防された（図8）。

P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死後、18日目に得た胎盤においてイムノブロットによりHIF1αタンパク質レベルを測定し、アクチンレベルに対して正規化した。PLX細胞は、PPIC及びPRマウスにおいて、HIF1αタンパク質レベルを低下させた。P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly I:C（TLR3アゴニスト）、及びPR＝妊娠＋R837（TLR7アゴニスト）。データは、P+PLAの％として、平均+SEMとして示す。*p<0.05 vs. P+PLA（one-way ANOVAによる）。

実施例9：PLX細胞は、子癇前症マウスにおいて、妊娠の間、胎盤の血管周辺のフィブリン沈着を低下させた
H&E染色及び光学顕微鏡検査法を用いて、組織学により胎盤の損傷についても検証した。PPIC及びPRマウスの胎盤血管系の周辺の細胞において、フィブリン沈着を表すエオシン陽性細胞が観察され、これは、PLXで処置したマウス由来の胎盤では観察されなかった（図9）。

P、PPIC及びPRマウスを、妊娠14日目にて、PLAビヒクル又はPLX細胞（全部で10⁶細胞）のいずれかを右肢にi.m.注射することにより処置した。安楽死後、18日目に得た胎盤に対してH&E染色を実施した。画像は、10×の倍率で示す。PLX細胞は、PPIC及びPRマウスにおいて、胎盤の血管周辺のフィブリン沈着（黒矢印）を低下させた。P＝妊娠、PPIC＝妊娠＋poly I:C（TLR3アゴニスト）、及びPR＝妊娠＋R837（TLR7アゴニスト）。

まとめると、これらのデータは、マウスにおいて、妊娠14日目にPLX細胞で処置することにより、胎児に有害な影響を何ら及ぼすことなく、収縮期血圧、タンパク尿及び内皮機能が正常化され得ることを実証する。そのメカニズムは依然として正確に決定されていないものの、これらの予備データは、PLX細胞での処置が、炎症、胎盤低酸素症及び胎盤損傷を低下させることによって有益な効果を発揮することを示唆し、PLX細胞が、PE治療に対する潜在的な新規治療法であり得ることを実証する。

以上の記述は、単に例示的かつ説明的なものであり、請求されるような本発明の制限ではないことが理解されるべきである。本発明の他の実施態様は、本明細書の考慮、及び本明細書に開示した本発明の実施から当業者には明らかであるだろう。本明細書及び実施例は、単に例示的なものとして考慮されることが意図される。

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Claims (25)

1. 有効量の２以上の層からなる胎盤接着性間質細胞を含む子癇前症又は子癇における高血圧及び／又は内皮機能障害の改善剤。
2. 有効量の、三次元培養から得られた胎盤接着性間質細胞を含む、子癇前症又は子癇における高血圧及び／又は内皮機能障害の改善剤。
3. 対象が早発型子癇前症を有する、請求項１又は２に記載の剤。
4. 対象が、妊娠約20週〜約34週の期間にある、請求項３に記載の剤。
5. 対象が遅発型子癇前症を有する、請求項１又は２に記載の剤。
6. 対象が、妊娠約34週〜約38週又はそれ以上の期間にある、請求項５に記載の剤。
7. 対象が、妊娠に対する炎症反応の増加を有する、請求項１又は２に記載の剤。
8. 対象が、一等親血縁者における子癇前症、以前の妊娠時の子癇前症歴、胎盤成長因子（PlGF）の血清濃度の低下、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1（sFlt-1）の血清濃度の増加、可溶性エンドグリンの血清濃度の増加、心血管疾患に対する危険因子、既存の無症状の内皮機能障害、慢性高血圧、糖尿病、脂質異常症、母体肥満、インスリン抵抗性、妊娠早期の高血圧、腎疾患、メタボリックシンドローム、凝固能亢進状態、若い母体年齢、高齢の母体年齢、不十分な胎盤形成、胎盤質量の増加、多胎妊娠、胞状奇胎、及び以前のパートナーとの以前の子癇前症の妊娠で父親であった人による出生前の父親、から選択される子癇前症に対する危険因子を１以上有する、請求項１、２及び７のいずれか１項に記載の剤。
9. 子癇前症又は子癇が、妊娠前に接着性間質細胞を投与することにより予防される、請求項１又は２に記載の剤。
10. 子癇前症又は子癇が、妊娠の間の任意の時期に接着性間質細胞を投与することにより予防される、請求項１又は２に記載の剤。
11. 子癇前症又は子癇が、妊娠約16週〜約20週の期間に胎盤間質細胞を投与することにより予防される、請求項１又は２に記載の剤。
12. 接着性間質細胞が全身投与される、請求項１又は２に記載の剤。
13. 接着性間質細胞が局所投与される、請求項１又は２に記載の剤。
14. 接着性間質細胞が筋肉内投与される、請求項１又は２に記載の剤。
15. 接着性間質細胞が皮下投与される、請求項１又は２に記載の剤。
16. 接着性間質細胞が、CD73、CD90、CD29及びCD105からなる群から選択されるポジティブマーカーの発現を含む、請求項１又は２に記載の剤。
17. 接着性間質細胞が、CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34及びCD79からなる群から選択されるネガティブマーカーの発現を含む、請求項１又は２に記載の剤。
18. 接着性間質細胞がSCFを分泌する、請求項１又は２に記載の剤。
19. 接着性細胞の少なくとも10％が増殖性細胞である、請求項１又は２に記載の剤。
20. 接着性間質細胞が、母親又は胎児に対して自家性である、請求項１又は２に記載の剤。
21. 接着性間質細胞が、母親及び／又は胎児に対して同種異系である、請求項１又は２に記載の剤。
22. 子癇前症又は子癇における高血圧及び／又は内皮機能障害の改善のために使用する旨を表示したラベルを含む包装材料が、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の剤を包装してなる、子癇前症又は子癇における高血圧及び／又は内皮機能障害の改善用製造品。
23. 子癇前症又は子癇における高血圧及び／又は内皮機能障害の改善剤を製造する方法であって、
    （１）三次元（3D）培養条件下で胎盤接着性間質細胞を培養する工程、及び
    （２）工程（１）によって得られた有効量の胎盤接着性間質細胞を含む製剤を調製する工程、
    を含む、方法。
24. 前記工程（１）が3Dバイオリアクター中で前記接着性間質細胞を培養することを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記工程（１）が灌流下で前記接着性間質細胞を培養することを含む、請求項２３に記載の方法。