CN104768559A - 用于预防和治疗先兆子痫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了通过施用贴壁基质细胞治疗或预防先兆子痫或子痫的方法。所述贴壁基质细胞可以源自骨髓、胎盘或脂肪组织。本发明还描述了使用贴壁基质细胞制备药物的用途，及包括包装材料的制品，所述包装材料包括用于治疗或预防先兆子痫或子痫的标签。

Description

用于预防和治疗先兆子痫的方法
先兆子痫疾病
先兆子痫(妊娠期蛋白尿高血压；PE)在所有妊娠的3％至5％中出现。[1]在美国，其是妊娠相关孕产妇死亡的第二最常见原因，并且在发展中国家，其是孕产妇死亡率的主要原因。PE占全世界所有孕产妇死亡的约15％，折算为每年估计60,000名孕产妇死亡，即每十分钟就有一名妇女由于先兆子痫的并发症死亡[1，2]。
PE是一种在妊娠期间临床上存在高血压、水肿和蛋白尿的全身综合征。其通过联合检测两种因素进行诊断：新发型高血压(保持的静坐血压[BP]≥140/90mm Hg)和蛋白尿(≥300mg/24h)。目前对于PE唯一有效的治疗就是分娩。PE的并发症包括惊厥、高凝状态、急性肾功能衰竭和肺水肿[1，3]。
在正常人妊娠期间，向子宫的血流增加，在晚期妊娠达到心输出量的约25％。在第一孕期期间螺旋动脉的调节和扩张降低了子宫胎盘的血管阻力且增加了子宫胎盘的血流量。在发展先兆子痫的妇女中，子宫胎盘的血流量减少了50％至70％[3，4]。
母亲的健康主要取决于先兆子痫的类型(轻度或重度)、并发症(比如癫痫发作)的预防及适时分娩。
围产期结果取决于病症的严重程度，因此取决于使妊娠达到足月的能力。在严重先兆子痫的情况下，导致胎死的早产是许多情况下的结果。
尽管正常妊娠本身就是全身性炎症的状态，先兆子痫的特征为广泛全身性孕产妇炎症性反应[8]。正常妊娠中的全身性炎症性反应与先兆子痫的全身性炎症性反应并非本质上不同，但只不过是更轻度的。该发现导致提出当全身性炎性过程达到妊娠本身引起的孕产妇全身性炎症反应范围的极端时，出现先兆子痫，引起一个或另一个孕产妇系统代谢失调[8]。依据这理论，炎症性反应产生氧化应激，相反，氧化应激可以刺激炎症性反应，形成正反馈系统的基础。由胎盘的合胞体表面释放到孕产妇的循环中的一种或多种促炎症因子可能参与了该情况。
先兆子痫是一种对于人类妊娠特定的多系统病症；其发展的基础在妊娠早期已确定。病理学特点似乎是从妊娠的16周到20周的异常滋养层着床，和因此足够的胎盘床灌流所需要的孕产妇血管中异常生理学改变。随着妊娠进展，胎儿胎盘单位的代谢性要求增加，并且由于胎盘的异常浅侵入，螺旋小动脉没有扩张到足以适应所需的血流量增加。这引起胎盘功能障碍和导致血管痉挛和内皮损伤的来自缺血性胎盘的因子的异常释放。最新研究表明孕产妇、胎儿和胎盘循环中促血管生成因子(例如，VEGF和胎盘生长因子[PlGF])和抗血管生成因子(例如sFlt1[可溶性VEGF受体]和内皮因子[可溶性TGF-β受体])的不平衡参与了PE的发展。循环的促血管生成和抗血管生成因子之间不平衡进一步导致胎盘血管系统发育异常和循环因子减少，循环因子对于血管健康和血管舒张很重要，比如NO和PGI2。
虽然对先兆子痫中的分子机制的理解很少，但是研究已经提示对胎儿-父亲抗原的胎儿耐受性不足在受孕和着床期间之间有联系[1，3，5-7]。有趣地是，已经建立了微嵌合体(microchimerisms)(母体的循环细胞，其是来自孕产妇的祖母或之前妊娠的残留物)的水平和PE发生之间的联系，其中较高的微嵌合体水平降低了PE的概率。这表明来自胎儿胎盘接触面的细胞，其与来自骨髓、胎盘和脂肪组织的贴壁细胞具有类似的来源(参见，例如，在国际专利公开号WO2007/108003和WO 2009/037690中描述的细胞，将其全文并入本文作为参考)，可以减少PE的发生[8]。
在多数情况下，先兆子痫和子痫在分娩的一周至两周之内消失，但是20％的妇女在七年之内发展为高血压和微白蛋白尿(microalbuminuria)，心脏和脑的血管病的长期风险增加两倍[1，3]。
目前治疗选择的限制
尽管PE研究有所进展，但是除了胎儿分娩之外，仍然没有用于先兆子痫的治疗。使用抗高血压药物通常没有减轻PE症状。先兆子痫的控制取决于胎龄和该疾病的严重程度。然而，在所有情况下，分娩是唯一的治疗选择。患有轻度PE的患者可以预期得到控制。在某些情况下，可以通过静脉内递送硫酸镁以预先阻止癫痫发作而暂时性稳定PE，同时考虑到分娩，施用类固醇注射剂以促进胎儿肺发育成熟。在这些情况下，需要住院停留，并密切监测胎儿状态。然而，在更严重的PE或子痫的情况下，存在器官功能障碍、胎儿不良(fetalcompromise)或HELLP综合征(肝酶升高、血小板计数减少和溶血)，建议立即分娩而不考虑胎龄[1，3，9，10]。
PE动物模型
人类先兆子痫的可用模型包括：
●在几种物种中，夹紧腹主动脉或闭塞和/或捆扎向子宫供给的动脉，导致子宫胎盘的灌流压力显著(约50％)减少，从而模拟先兆子痫[11]。
●近亲繁殖的BPH-5小鼠，来源于临界高血压BPH/2小鼠的兄弟-姐妹交配，显示出妊娠后期的血压升高(从130到160mmHg，与之相比，对照C57BL-6为105mmHg)，其在分娩2天之内消除，并且伴随有蛋白尿增加。外源性VEGF和抗氧化剂降低了血压，且提高了胎儿存活率[7，12]。
●SHHF/Mcc-fa(cp)(自发性高血压和心力衰竭)大鼠显示出自发性妊娠相关高血压，小于胎龄的后代(small-for-gestational-age offspring)和胎盘基因表达改变[13]。
●用于PE的遗传修饰的小鼠模型，包括：具有p57Kip2基因敲除的小鼠，p57Kip2是几个细胞周期蛋白/细胞周期蛋白-依赖性激酶复合物的一种有效抑制剂；eNOS-缺陷型小鼠；和缺乏儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的小鼠，儿茶酚-O-甲基转移酶是一种雌激素分解的限速酶[14]。
细胞疗法作用机制
PE的病因学包括血管系统调节异常以及血管生成相关细胞因子的全身谱异常，主要是抗血管生成蛋白升高。
来自骨髓、胎盘和脂肪组织的三维-贴壁细胞(参见，例如国际专利公开号WO 2007/108003和WO 2009/037690[Plurix的3D-贴壁细胞；PLX细胞])分泌高水平的促血管生成因子，包括例如VEGF、血管生成素、PDGF和IL-8，以及组织调节因子，比如TIMP和MMP。在体外，由贴壁胎盘或脂肪组织细胞产生的条件培养基能够同时增加内皮细胞和平滑肌细胞增殖，其是对血管生成和血管调节重要的两个过程。另外，所述贴壁细胞显示出显著的免疫调节性质。
动物模型中的试验以及临床试验表明在后肢局部缺血模型中和在患有外周动脉疾病(PAD)的患者中施用(IM)贴壁胎盘或脂肪组织细胞引起灌流和血管生成的增加，其表现为从头形成毛细管，和很可能重塑现有的血管系统以增加血流量(血管发生)。
因此，本发明的方面涉及贴壁胎盘或脂肪组织细胞疗法预防或治疗先兆子痫的能力。
一个实施方案涉及一种治疗或预防有此需要的受试者中先兆子痫或子痫的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的贴壁基质细胞，从而治疗或预防先兆子痫或子痫。在某些实施方案中，所述细胞是从骨髓、胎盘或脂肪组织获得的。
另一个实施方案涉及贴壁基质细胞在制备用于治疗或预防先兆子痫或子痫的药物中的用途。在某些实施方案中，所述细胞是从骨髓、胎盘或脂肪组织获得的。
某些实施方案涉及用于治疗或预防先兆子痫或子痫的贴壁基质细胞。在一个实施方案中，细胞是从骨髓、胎盘或脂肪组织获得。
另一个实施方案涉及包括包装材料的制品，所述包装材料包括用于治疗或预防先兆子痫或子痫的标签，所述包装材料包装药用有效量的贴壁基质细胞。在一个实施方案中，所述细胞是从骨髓、胎盘或脂肪组织获得的。
在所述方法、用途、贴壁基质细胞或制品的某些实施方案中，受试者患有早发型(early-onset)先兆子痫。在其它实施方案中，受试者处于约20周至约34周的妊娠期。在仍然其它实施方案中，受试者患有后发型(late-onset)先兆子痫。在另外的实施方案中，受试者处于约34周至约38周或以上的妊娠期。
在一些实施方案中，受试者具有增加的对妊娠的炎症性反应。在其它实施方案中，受试者具有一种或多种选自下述的先兆子痫的危险因素：一级亲属中的先兆子痫、之前妊娠的先兆子痫史、胎盘生长因子(PlGF)的血清浓度降低、可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的血清浓度增加、可溶性内皮因子的血清浓度增加、心血管疾病的危险因素、预先存在的亚临床内皮功能障碍、慢性高血压、糖尿病、高脂血症、母体肥胖、胰岛素抗性、早期妊娠的高血压、肾病、代谢综合征、高度凝血状态、低龄孕产妇、高龄孕产妇、胎盘形成差、胎盘质量增加、多胞妊娠、葡萄胎和带给之前的伴侣之前先兆子痫妊娠的男性的产前亲子关系(prenatal paternity by a man who fathered a prior preclamptic pregnancywith a prior partner)。
在其它实施方案中，通过在妊娠之前施用贴壁基质细胞预防先兆子痫或子痫。在仍然更进一步的实施方案中，通过在妊娠期间的任何时间施用贴壁基质细胞预防先兆子痫或子痫。在其它实施方案中，在约16周至约20周的妊娠期间，通过施用基质细胞预防先兆子痫或子痫。
在某些实施方案中，全身施用贴壁基质细胞，而在其它实施方案中，局部施用贴壁细胞。在其它实施方案中，肌内注射施用贴壁细胞。在某些实施方案中，皮下施用贴壁细胞。
在一些实施方案中，贴壁细胞包括选自CD73、CD90、CD29和CD105的阳性标记物表达。在其它实施方案中，贴壁细胞包括选自CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34和CD79的阴性标记物表达。
在一些实施方案中，贴壁基质细胞是由三维(3D)培养获得的。在特定实施方案中，三维(3D)培养包括3D生物反应器。在仍然其它实施方案中，在3D培养中培养贴壁细胞是在灌流下进行的。在另外的实施方案中，培养贴壁细胞进行至少3天。在某些实施方案中，培养贴壁细胞进行直到至少10％的贴壁细胞在增殖。
在一些实施方案中，贴壁细胞包括在2维(2D)培养条件下由胎盘或脂肪组织培养的细胞。
在一些实施方案中，贴壁基质细胞是母亲或胎儿自体固有的。在其它实施方案中，贴壁基质细胞与母亲和/或胎儿是异基因的(allogeneic)。
本发明的进一步的目的和优点将在随后的说明书中部分地阐述，并且部分将由说明书中显而易见，或可以通过实施本发明获得。
附图简述
图1.在妊娠期第14天，在测量收缩压(“SBP”)之后，通过在右腿i.m.注射施用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P(妊娠)、PPIC(妊娠+聚I：C(TLR3激动剂))和PR(妊娠+R837(TLR7激动剂))小鼠。在妊娠期间逐渐降低的SBP在第17天恢复基准水平。N提供在括号中。数据表示为平均值+/-SEM。＊p＜0.05vs.P+PLA。
图2.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。使用第18天安乐死期间收集的尿液测定蛋白质和肌酸酐含量。对于P+PLA和P+PLX，N＝4，对于其它4组，N＝6。数据表示为平均值+SEM。＊p＜0.05vs.P+PLA。
图3A和3B.妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死期间，收集主动脉，并固定在DMT 210肌动描记器的销(pins)上，所述肌动描记器包含加热至37℃且鼓泡通入95％O2/5％CO2的生理盐水溶液。PPIC和PR小鼠显示出内皮功能障碍(乙酰胆碱-诱导的松弛降低(图3A)，硝普钠诱导的松弛正常(图3B))，其通过PLX细胞治疗得到改善。N提供在括号中。数据表示为平均值+SEM.＊p＜0.05vs.P+PLA。
图4.妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死期间，由2名研究者评价每窝幼仔数和每窝胎儿死亡数。每窝幼仔数或胎儿死亡数没有任何显著性差异。对于P+PLA和P+PLX，N＝4，对于其它4组，N＝6。数据表示为平均值+SEM。
图5.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死期间，测量脾重和体重。PLX细胞改善PR小鼠的脾肿大，但没有改善PPIC小鼠的脾肿大。对于其它4组，N＝6。数据表示为平均值+SEM。＊p＜0.05vs.P+PLA。
图6A和6B.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死之后，通过流式细胞仪测量免疫细胞子集。PLX细胞改善PPIC小鼠中调节性T细胞的降低，但没有改善PR小鼠中调节性T细胞的降低(图6A)，同时降低PR小鼠中的γδT细胞，但没有降低PPIC小鼠中的γδT细胞(图6B)。对于所有组，N＝2-4。数据表示为平均值+SEM.
图7A和7B.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死期间收集全血，分离血浆，并通过ELISA测定IL-4和IL-6。PPIC和PR小鼠都显示显著降低的IL-4水平(图7A)和升高的IL-6水平(图7B)，其都通过PLX细胞处理标准化。数据表示为平均值+SEM。用单向ANOVA，＊p＜0.05vs.P+PLA。
图8.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。通过对在第18天安乐死之后获得的胎盘进行免疫印迹测量HIF1_蛋白含量，并针对肌动蛋白含量进行标准化。PLX细胞降低PPIC和PR小鼠中HIF1_蛋白含量。数据表示为P+PLA的％的平均值+SEM。用单向ANOVA，＊p＜0.05vs.P+PLA。
图9.在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射，用PLA载体或PLX细胞(总共106个细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。对在第18天安乐死之后获得的胎盘进行H&E染色。提供的图像是10x放大倍率。在PPIC和PR小鼠中，PLX细胞减少胎盘血管周围的纤维蛋白沉积(黑色箭头)。P＝妊娠，PPIC＝妊娠(TLR3激动剂)和PR＝妊娠+R837(TLR7激动剂)。
某些实施方案的描述
参照附图和所附的说明书，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明没有将其应用限于其在下述说明书中列出的或实施例示例的详细内容。本发明能够以多种方式实施或进行其它实施方案。而且，应当理解本文使用的措词和术语是用于描述的目的，而不应当被认为是限制。
本发明的实施方案涉及治疗或预防有此需要的受试者中先兆子痫或妊娠诱发的高血压或子痫的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的贴壁基质细胞。“贴壁基质细胞”为可以通过在标准培养条件下粘附至贴壁材料(例如塑料)而被分离和/或保持的基质细胞。即，“贴壁基质细胞”指其在体外是锚定依赖性的均质或异质细胞群，即其需要附着于表面或其它细胞以便在体外生长。贴壁基质细胞可以包括至少一种“基质细胞表型”。如本文使用的“基质细胞表型”是指骨骼髓来源的基质(即，间质)细胞特有的结构或功能表型。因此，例如，细胞可以具有梭形。可选地或另外，细胞可以表达基质细胞特有的标记物或标记物(例如表面标记物)的集合。
贴壁基质细胞可以源自胎盘或脂肪或骨髓组织或贴壁基质细胞的任何其它来源。实施方案进一步涉及用于治疗或预防先兆子痫或妊娠诱发的高血压或子痫的制品，所述制品包括包含标签的包装材料，其中所述包装材料包装药用有效量的来自胎盘或脂肪组织的贴壁基质细胞。在一些实施方案中，贴壁基质细胞为来自描述在国际专利公开号WO2007/108003和WO 2009/037690(Plurix的3D-贴壁细胞；PLX细胞)中的胎盘或脂肪组织的贴壁基质细胞，将其中每篇的全文并入本文作为本文参考。
本发明的方面进一步涉及使用贴壁基质细胞(比如来自胎盘或脂肪组织的包括例如PLX细胞)进行先兆子痫或妊娠诱发的高血压或子痫的治疗或预防的多种作用方式。在一些实施方案中，通过在妊娠之前施用贴壁基质细胞预防先兆子痫。在其它实施方案中，通过在妊娠期间的任何时间施用贴壁基质细胞预防先兆子痫。在一些实施方案中，贴壁基质细胞疗法引起循环血管生成细胞因子从抗血管生成谱向促血管生成谱的变化，从而在子宫胎盘的接触面诱导内分泌的血管生成作用。在一些实施方案中，该细胞疗法诱导调节子宫胎盘接触面的螺旋小动脉，引起血管调节和血管舒张及血流量增加。在某些实施方案中，该细胞疗法诱导可能涉及PE的炎症和免疫过程的全身抑制。
在一些实施方案中，在其中胎儿存活率低且孕产妇健康受损的早发型重度先兆子痫(包括处于约20至约24周之间的妊娠期的受试者)的情况下，肌内施用贴壁基质细胞逆转或减轻PE症状和改善母亲和儿童的预后。
胎盘或脂肪组织来源的贴壁细胞可以使用二维或三维培养条件增殖。如本文使用的短语“三维培养”是指其中将细胞设置于适合细胞生长同时允许细胞以多于一层生长的条件下的培养。很好理解的是，活生物体(或组织)中细胞的原位环境是在三维架构中。细胞被其它细胞围绕。它们被约束在胞外基质纳米级纤维的复杂网络中，所述复杂网络允许建立各种局部微环境。它们的细胞外配体不仅介导与基底膜的附着，而且还进入(access to)各种血管和淋巴管。氧、激素和营养素被运送给细胞，并且废物被带走。在本发明的三维培养中的条件被设计为模拟如下文进一步示例的这样的环境。
应当理解，三维培养的条件是使得能够扩增贴壁细胞。如本文使用的术语“扩增(expanding)”和“扩增(expansion)”是指基本上无分化的细胞维持，和最终细胞生长，即细胞群的增加(例如，至少2倍)，而这种增加没有伴随分化。
如本文使用的术语“维持(maintaining)”和“维持(maintenance)”是指基本上无分化的细胞更新，即，基本上稳态的的细胞群，该稳态没有伴随分化。
如所述的，本发明的该特定方面的贴壁细胞获取自脂肪或胎盘组织。
胎盘细胞可以从足月的或足月前(pre-term)胎盘获得。一旦胎盘已经出血(exblooded)，优选地收集胎盘。优选地，将胎盘灌流足够的时间以除去残余细胞。本文使用的术语“灌注(perfuse)”或“灌流(perfusion)”是指将流体倾倒在器官或组织上或使流体流经器官或组织的行为。胎盘组织可以来自任何哺乳动物；例如，胎盘组织为人胎盘组织。胎盘组织的方便的来源是产后胎盘(例如，1-6小时)，然而，胎盘组织或细胞的来源或胎盘组织的分离方法对于本发明不是关键的。
源自胎盘的贴壁细胞可以从胎盘的胎儿部分(即，胎盘的羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛或内部部分)和胎盘的母体部分(即，基蜕膜和壁蜕膜)获得。将组织样品在生理缓冲液[例如，磷酸缓冲盐水(PBS)或Hank’s缓冲液]中洗涤。通过用消化酶(参见下文)处理组织或/和通过切碎并经由尼龙过滤器冲洗组织部分或通过用洗涤介质轻轻吹打(pipetting)(Falcon，Becton，Dickinson，San Jose，CA)来制备单细胞悬浮液。
源自脂肪组织的贴壁细胞可以通过本领域技术人员已知的多种方法分离。例如，这类方法描述在美国专利号6,153,432中。脂肪组织可以源自网膜/内脏、乳腺、性腺、或其它脂肪组织部位。脂肪组织的一个来源是网膜的脂肪。在人类中，通常通过脂肪抽吸术分离脂肪。
从脂肪组织分离的贴壁细胞可以通过如下获得：用消化酶比如胶原酶、胰蛋白酶和/或分散酶；和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶；和乙二胺四乙酸(EDTA)；在25-50℃的温度下，处理组织10分钟至3小时的时间。然后，可以使细胞通过20微米至1mm的尼龙或粗棉布筛网过滤器。之后，使细胞直接在培养基中或在Ficoll或Percoll或其它颗粒梯度上进行差速离心。在4-50℃下的温度下，以100至3000×g的速度将细胞离心1分钟至1小时(参见美国专利号7,078,230)。
不考虑来源(例如，胎盘或脂肪组织)，优选地在无菌条件下进行细胞获取。一旦获得分离的细胞，允许其粘附至贴壁材料(例如，被配置为表面)，从而分离贴壁细胞。可以在2D条件下进行培养，并且可以将细胞进一步转移到3D条件。
如本文使用的“贴壁材料”是指合成的、天然存在的无细胞毒性(即，生物相容的)材料或其组合，该材料具有可以将细胞保持在表面上的化学结构(例如，带电的表面暴露的基团)。根据本发明可使用的贴壁材料的实例包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、乙酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、细胞外基质成分(例如，纤连蛋白、软骨粘连蛋白、层粘连蛋白)、胶原、聚L乳酸和惰性金属纤维。
纯化或富集贴壁基质细胞的其它步骤可以通过使用本领域熟知的方法进行(比如，如本文下文进一步描述的，使用贴壁基质细胞标记物表达通过FACS进行)。
根据本发明用于培养的基础培养基的非限制性实例包括最小必需培养基Eagle、ADC-I、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(经过和不经过Fitton-Jackson改良)、基础培养基Earle(添加Eagle’s盐基(salt base)的BME)、Dulbecco改良的Eagle培养基(无血清的DMEM)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良的Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy的5A培养基、培养基M 199(具有Earle’s盐基的M199E)、培养基M199(具有Hank’s盐基的M199H)、最小必需培养基Eagle(具有Earle’s盐基的MEM-E)、最小必需培养基Eagle(具有Hank’s盐基的MEM-H)和最小必需Eagle培养基(具有非必需氨基酸的MEM-NAA)等等，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams的G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153的大量其它培养基。用于本发明的优选培养基是DMEM。这些和其它有用的培养基可以从GIBCO，Grand Island，N.Y.，USA和Biological Industries，BetHaEmek，Israel等获得。许多这些培养基概述在Methods in Enzymology，Volume LVIH，“Cell Culture”，第62-72页中，William B.Jakoby和Ira H.Pastan编著，Academic Press，Inc出版。
培养基可以补充比如血清(比如牛或人或其它物种的胎儿血清)以及任选或可选地，补充生长因子、维生素(例如抗坏血酸)、细胞因子、盐类(例如B-甘磷酸甘油)、甾类(例如地塞米松)和激素，例如生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护蛋白配体抗体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生的生长因子和骨形态发生蛋白，它们的浓度为pg/ml至mg/ml的水平。
进一步认识到，可以向培养基中加入另外的成分。这类成分可以是抗生素、抗真菌剂(antimycotic)、白蛋白、氨基酸和本领域已知用于细胞培养的其它成分。另外，当需要时，可以加入增强分化过程的成分(进一步参见下文)。
应当理解，在将本发明的贴壁基质细胞施用至人类受试者的情况下，细胞和培养基(例如，含有上述培养基添加剂)应当基本上是无外来物，即无任何动物污染物例如支原体。例如，培养基可以补充有血清替代品、人血清和/或合成或重组产生的因子，使得细胞可以在无血清条件下生长。
如所述的，一旦获得了贴壁细胞，可以使其传代至二维或三维环境。但是应当理解，虽然可以在分离之后立即将细胞转移至3D配置的基质，但可替代地也可以在二维条件之后将其传代至三维环境。
对于高规模生产，培养可以在3D生物反应器中进行。针对3D培养来配置贴壁物质，从而提供生长基质，所述生长基质实质上增加用于细胞粘附的可利用的附着表面，从而模拟组织(例如胎盘)的基础结构。
这类生物反应器的实例包括但不限于活塞式流动(plug flow)生物反应器、连续搅拌罐生物反应器、固定床生物反应器、CelliGen生物反应器系统(New Brunswick Scientific(NBS)或BIOFLO 310生物反应器系统(NewBrunswick Scientific(NBS)。例如，Celligen生物反应器能够在受控条件(例如pH、温度和氧水平)下并且以恒定的细胞培养基灌注进行贴壁细胞的3D扩增。此外，可以直接监测细胞培养物的葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐和铵的浓度水平。贴壁细胞的葡萄糖消耗速率和乳酸盐形成速率使得能够测定细胞生长速率并确定收获时间。
可以用于本发明的其它3D生物反应器包括但不限于连续搅拌罐生物反应器，其中培养基被连续加入生物反应器并且产物被连续抽出，以在生物反应器内维持时间恒定稳态。带有纤维床篮的搅拌罐生物反应器是从例如NewBrunswick Scientific Co.，Edison，NJ可获得、固定床生物反应器、气升式生物反应器(其中空气通常被供入中央导管的底部，向上流动同时形成气泡，并且在柱顶释放废气)、具有多聚活性泡沫的细胞接种灌注式生物反应器[如Wendt，D.等，Biotechnol Bioeng 84：205-214，(2003)中所述]、径向流灌注生物反应器中的管状聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架[如Kitagawa等，Biotechnology andBioengineering 93(5)：947-954(2006)中所述]。可以根据本发明使用的其它生物反应器被描述在美国专利号6,277,151、6,197,575、6,139,578、6,132,463、5,902,741和5,629,186中。
细胞接种优选在接种时达到100,000-1,500,000个细胞/mm。在示例性的实施方案中，接种总共150±30×106个细胞，接种3-5×106个细胞/gr载体，或0.015-0.1×106个细胞/ml。
当至少约10％的细胞在增殖时，可以收获细胞，同时避免不受控制的分化和衰老。
培养进行至少约2天、3天、4天、5天、10天、20天、1个月或甚至更长。应当理解，在生物反应器中培养可延长这一时间段。在3D培养中培养贴壁细胞可以在培养基的连续流动下进行。也可以进行传代以增加细胞数。应当理解，可以改变培养基以延长和改进培养条件。
本发明的某些实施方案的贴壁细胞包括至少约10％、28％、30％、50％、80％或更多的增殖细胞(如可以通过监测S和G2/M期的FACS测定)。可选地或另外，细胞可以表达贴壁基质细胞典型的标记物或标记物(例如表面标记物)的集合。这种细胞表面标记物(阳性和阴性)的实例包括但不限于：CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD3-、CD4-、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其它贴壁基质细胞标记物包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。
根据本发明教导产生的细胞群的特征为独特的蛋白质表达谱。因此，例如，胎盘或脂肪组织的贴壁基质细胞能够表达和/或分泌高水平的所选择因子。例如，这样的细胞或分泌SCF、Flt-3、H2A组蛋白家族(H2AF)或醛脱氢酶X(ALDHX)是在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织的贴壁细胞表达或分泌的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或甚至12倍高。另外或可选地，本发明的细胞群分泌或表达IL-6、真核翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙结合蛋白3、EF-手型钙结合结构域(RCN2)或钙调蛋白(calponin)1碱性平滑肌(CNN1)的水平是在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织的贴壁细胞表达或分泌的至少2、3或5倍高。另外或可选地，本发明的细胞群的特征为与2D培养细胞相比各种其它蛋白表达水平较低。因此，例如，分泌或表达在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织的贴壁细胞表达或分泌的异源核核糖核蛋白Hl(Hnrphl)、CD44抗原同工型2前体、3磷酸腺苷5磷酸硫酸合酶2同工型a(Papss2)或核糖体蛋白L7a(rpL7a)的表达水平的少于0.6、0.5、0.25或0.125。
接受治疗的受试者可以是需要治疗或预防先兆子痫或子痫的任何妊娠哺乳动物，包括例如人类或驯养动物，包括但不限于马(即马类动物)、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、骆驼、羊驼、美洲驼和牦牛。
施用方式
在一些实施方案中，局部施用贴壁基质细胞。在进一步的实施方案中，全身施用所述细胞。
在一些实施方案中，经由肌内或皮下注射局部施用所述细胞。肌内(IM)施用被证实在严重肢体缺血(CLI)的临床试验中是安全的。当IM注射距离损伤(未结扎的腿)远时，局部施用也促进后肢局部缺血(HLI)症状的改善。
IM施用也允许在全身可检测水平分泌细胞因子，并且提供递送的容易性和速度。
在一些实施方案中，贴壁基质细胞是母亲或胎儿自体的。在其它实施方案中，贴壁基质细胞与母亲和/或胎儿是异基因的。
在本文描述的任一种方法中，细胞可以本身施用，或者优选地作为进一步包含可药用载体的药物组合物的一部分施用。如本文使用的“药物组合物”是指本发明的贴壁细胞(即，选自胎盘和脂肪组织的组织的贴壁细胞，其是从三维培养获得的)与其它化学成分(比如药用合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是为了便于向受试者的施用细胞。
在下文中，术语“可药用载体”是指对于受试者不引起显著刺激并且不破坏所施用的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。载体的非限制性实例为丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物。
本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
根据本发明优选的实施方案，药物载体为盐水溶液。
配制和施用药物的技术可以在“Remington′s PharmaceuticalSciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，将其并入本文作为参考。
可以以全身方式施用药物组合物。可选地，可以局部施用药物组合物，例如直接将药物组合物注射到患者的组织区中。
可以通过本领域熟知的方法制备本发明的药物组合物，例如借助于常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学可接受的载体以常规方式进行配制，所述载体包括促进活性成分加工成可被药用使用的制备物的赋形剂和助剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中进行配制，优选在生理学相容的缓冲液(比如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、生理盐缓冲液或包含冷冻保护剂的冷冻介质)中进行配制。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于在本发明的方法中使用的任何制备物而言，治疗有效量或剂量可以从体外和细胞培养测定初步估计。优选地，在动物模型中配制剂量以获得想要的浓度或滴度。这样的信息可用于更精确地确定在人类中有用的剂量。可以通过体外标准药物方法在细胞培养或实验动物中确定本文所述的活性成分的毒性和治疗效果。
从这些体外和细胞培养测定和动物研究中得到的数据可用于配制供人类使用的剂量范围。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的施用途径而变化。可以由个人医师考虑患者的状况选择确切的制剂、施用途径和剂量(参见，例如Fingl等，1975“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章第1页)。例如，可以对帕金森患者就指示对治疗具有积极反应的改善的运动功能进行对症监测。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中配制，优选在生理学相容的缓冲液(比如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐缓冲液)中配制。
可以单独调整剂量和间隔至足以通过植入的细胞有效地调节神经递质合成的活性成分水平。获得预期效果所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。检测测定可用于确定血浆浓度。
根据待治疗的病症的严重程度和反应性，配量(dosing)可以单次施用或多次施用，疗程持续若干天至若干周，或达到疾病状态的减轻。当然，待施用的组合物的量将取决于正被治疗的个体、病痛的严重程度、施用方式、开处方医师的判断等。施用剂量和时机(timing)将对个体变化的病症的仔细和连续的监测做出反应。
治疗/预防的模式
在一些实施方案中，接受贴壁基质细胞治疗的受试者患有早发型PE(妊娠约20至约34周)。在早发型PE的情况下，预后包括快速进展、多种并发症和差的围产期结果。而且，对于妊娠少于24周的胎龄，对症治疗与高孕产妇发病率和最小的围产期益处有关[15，16]。在一些实施方案中，受试者在诊断之后立即接受细胞治疗。
在进一步的实施方案中，接受贴壁基质细胞治疗的受试者患有后发型PE。在后发型PE(妊娠约34至38周或以上)的情况下，预后通常良好，并且预期的控制是可能的。用本文所述的细胞疗法治疗可以减轻症状，从而潜在地减少并发症以及减少昂贵的住院停留时间和长期并发症。
在一些实施方案中，在预防性治疗的方法中使用贴壁基质细胞，比如来自胎盘或脂肪组织的贴壁基质细胞。在妊娠的任何点或在妊娠之前，可以给予受试者预防性治疗。例如，在孕早期、孕中期或孕晚期可以给予受试者预防性治疗。在一些实施方案中，受试者在妊娠约12至约28周，或在妊娠约6至约38或更多周，或在妊娠的任何周(包括从妊娠的第一周直到分娩)接受预防性治疗。在预防性治疗的一些实施方案中，受试者在妊娠约16至约20周接受治疗。在一些实施方案中，受试者遗传上易患PE。在进一步的实施方案中，受试者在以往妊娠中患有PE病史。在一些实施方案中，使用生物标记物在受试者中检测到PE的潜在情形，所述生物标记物包括胎盘生长因子(PIGF)和可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)。PE的病因学与胎盘发育的早期发育过程有关，其实际上是血管生成/组织调整。因此，在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法(例如PLX疗法)可以预防PE的首次出现。PLX疗法显示孕产妇和胎儿安全性，因此，实施方案涵盖用于处于危险的人群的预防性PLX疗法。
在一些实施方案中，将贴壁基质细胞施用至具有PE的一种或多种危险因素的受试者。结论是将增加对妊娠的孕产妇全身性炎症性反应的任何因素都将使母亲易患先兆子痫，而与其来源无关。PE的危险因素包括下述的：母体肥胖和相关炎症、心血管疾病的危险因素比如慢性高血压、预先存在的糖尿病、高脂血症和高龄产妇[19]。与进入血压正常妊娠的妇女相比，这些妇女很可能是超重的、具有较高脂质水平、较高血压、胰岛素抗性，并且很可能具有血栓形成倾向[20]。
在早期妊娠中具有较高血压的妇女似乎对循环抗血管生成因子sFlt-1和sEng更敏感，因此，在较低浓度的这些因子下她们就发展为先兆子痫[21]。尽管当独立使用这些危险因素没有高度预测性，但是它们有助于鉴定处于风险中的妇女，并且可以改善孕产妇结果，以及可能改善围产期结果[22]。
综上，这些观察结果支持观点：如通过慢性高血压识别的，预先存在的孕产妇亚临床内皮功能障碍使得妇女更易受胎盘形成不良的损害，并且对胎盘功能障碍的结果更敏感。因此，妇女的妊娠前代谢和内皮健康状况使她易患先兆子痫，其进而是她将来在以后的生活中代谢性疾病和心血管疾病风险的临床表现。
其它危险因素包括在之前妊娠中的先兆子痫，特别是在早发型PE的情况下；一级亲属中的先兆子痫(增加妇女患严重先兆子痫的风险两倍至四倍)；特定医学病症，包括糖尿病、肾病、代谢综合征和高度凝血状态；非常低龄孕产妇；高龄孕产妇；胎盘质量增加；多胎妊娠；葡萄胎；带给之前的伴侣之前先兆子痫妊娠的男性的产前亲子关系；胎盘生长因子(PlGF)的血清浓度降低；可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的血清浓度增加；sFlt-1：PlGF的比例增加；可溶性内皮因子的血清浓度增加。
在一些实施方案中，向受试者施用剂量为约1.5亿至约3亿细胞的贴壁基质细胞。在一些实施方案中，后续剂量的细胞数较低。剂量可以在多个时间点和/或以可变间隔施用。在一些实施方案中，施用和/或服药时间表是与妇科医生会诊确定的。
实施例
实施例1：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX、脂肪贴壁基质细胞和骨髓贴 壁基质细胞治疗降低了血压
dsRNA或ssRNA形式的RNA都在PE的发展中起主要作用，因为在大鼠、小鼠和人中，妊娠期间的RNA受体活化引起炎症、内皮和胎盘功能障碍及高血压[23-25]。病毒表达的以及由受损的/垂死细胞释放的dsRNA和ssRNA活化高度保守的、特异性的RNA受体(对于dsRNA是Toll-样受体3[TLR3]；对于ssRNA是Toll-样受体7[TLR7])和引起促炎性免疫反应。Toll-样受体(如同其它固有免疫系统的受体)是高度保守的，并且通过引发促炎性信号通路和活化适应性免疫系统，而响应病原体-相关分子模式(PAMP)和由垂死细胞或受损细胞释放的内源性配体。大鼠和小鼠中由激动剂聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I：C))活化TLR3在妊娠和非妊娠动物中都引起全身性炎症，并且其在妊娠动物中引起高血压、蛋白尿和内皮功能障碍[23-25]。小鼠妊娠期间TLR7活化也引起妊娠-依赖性高血压、内皮功能障碍、脾肿大和胎儿死亡的发病率增加[25]。假定该症状与人类的PE类似，则这些结果表明在人类中过度的TLR3和TLR7活化引发PE症状[25]，并且表明小鼠中TLR3和TLR7活化是人类中PE研究的有用模型。
在妊娠的第13、15和17天，给妊娠的C57B1/6J小鼠腹膜内注射Toll-样受体3(TLR3)激动剂聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I：C))(PPIC小鼠)、Toll-样受体7(TLR7)激动剂R837(咪喹莫特)(PR小鼠)或盐水载体(P小鼠)。在妊娠期第14天，制备PLX细胞，并加工到含有50万PLX细胞的25□l的plasmaLyteA(PLA)中。在尾套(tail-cuff)收缩压测量之后，两只P、两只PPIC和两只PR小鼠接受PLA载体注射剂或PLX细胞注射剂。在短暂麻醉(异氟烷)下，各自给予一只P、一只PPIC和一只PR小鼠在右腿肌肉中两支单独的25□lPLA注射剂。在短暂麻醉(异氟烷)下，剩余P、PPIC和PR小鼠在右腿肌肉中接受两支单独的25□l PLX细胞注射剂(总共106个细胞)。小鼠很快痊愈，显示出麻醉或注射没有有害作用。将以两组饲养的六只小鼠放回它们的标准饲养条件中，随意进食和进水。由不知道每只小鼠的身份(PLA vs.PLX)的两名研究者在妊娠期第15、16和17天的下午测量收缩压，并且在第15天和第17天注射TLR之前进行测量。
PPIC和PR小鼠显示出在妊娠期第14天收缩压显著升高，其保持升高直至第17天(图1；P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837；n显示在括号中；数据表示为平均值+/-SEM；星号指示p-值＜0.05vs.P+PLA)。接受肌肉注射PLA载体的所有小鼠的血压没有任何变化(图1中的实心黑色符号)。然而，接受PLX细胞的PPIC和PR小鼠具有逐渐的、显著的血压下降，其在第17天恢复至P的水平(图1中的空心黑色符号)。另外，PLX细胞治疗对于P小鼠的血压没有任何影响。
使用源自骨髓或脂肪组织的贴壁基质细胞进行类似的实验。如上所述进行实验，在第14天通过i.m.注射向PPIC小鼠施用106个细胞。结果显示在表1中，其显示在施用后第14-17天SBP值降低。对于施用的每个细胞类型(即，骨髓或脂肪)，结果证实在细胞施用之后从妊娠的第14天至第17天升高的SBF出现降低。
表1
实施例2：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX、脂肪贴壁基质细胞和骨髓 贴壁基质细胞治疗减少蛋白尿
TLR-诱发的PE小鼠显示蛋白尿，蛋白尿是一种人类临床上PE的决定因素。如实施例1所述，在妊娠的C57B1/6J小鼠中诱导PE，并且用PLX细胞或PLA载体治疗小鼠。在妊娠期第18天，将小鼠处以安乐死，此时收集尿液，并测量尿蛋白。将测量的蛋白质值标准化为尿肌酸酐水平。在PPIC和PR小鼠中，在第14天的PLX细胞治疗使尿蛋白/肌酸酐比正常化，而它在P小鼠中没有作用(图2；P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837；对于P+PLA和P+PLX，n＝4，对于其他4组，n＝6；数据表示为平均值+SEM；星号指示p-值＜0.05vs.P+PLA)。因此，PLX细胞治疗改善PPIC和PR小鼠的蛋白尿。
使用源自骨髓或脂肪组织的贴壁基质细胞进行类似的实验。如上所述进行实验，在第14天通过i.m.注射向PPIC小鼠施用106个细胞。结果显示在表2中，其显示在第14天BM和脂肪来源的贴壁细胞治疗降低了PPIC小鼠中的尿蛋白/肌酸酐比。因此，骨髓贴壁基质细胞和脂肪贴壁基质细胞治疗改善PPIC小鼠的蛋白尿。
表2
PPIC+PLA PPIC+脂肪 PPIC+BM
平均值 5.68 3.73 2.42
sem 0.17 N/A 0.29
实施例3：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX细胞治疗减轻内皮功能障碍
患有PE的人特征性地显示内皮功能障碍，或血管响应于血管扩张刺激物而松弛的能力降低。TLR-诱导的PE小鼠也显示内皮功能障碍，其得到对内皮依赖性扩张药乙酰胆碱的松弛反应的显著降低但对内皮依赖性扩张药硝普钠的松弛反应正常的证实。如实施例1所述，在妊娠的C57B1/6J小鼠中诱导PE，并且用PLX细胞或PLA载体处理小鼠。在妊娠期第18天，在安乐死之后收集主动脉，并固定在DMT 210肌动描记器的销上，所述肌动描记器包含加热至37℃且鼓泡通入95％O2/5％CO2的生理盐水溶液。PLX细胞治疗恢复了PPIC和PR小鼠对于乙酰胆碱的主动脉内皮依赖性松弛反应(图3A)，而对硝普钠的内皮非依赖性松弛反应没有作用((图3B；对于图3：P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837；n提供在括号中；数据表示为平均值+SEM：星号指示p-值＜0.05vs.P+PLA)。因此，PPIC和PR小鼠的PLX细胞治疗增加了乙酰胆碱介导的主动脉松弛反应，指示改善了PE小鼠的内皮功能障碍。
实施例4：PLX细胞治疗对于妊娠PE小鼠中的胎儿是无害的
通过确定来自PLX-治疗的PE小鼠的每窝幼仔的数量和每窝胎儿死亡的发病率来评价PLX细胞治疗对于胎儿发育的作用。如实施例1所述，在妊娠的C57B1/6J小鼠中诱导PE，并且用PLX细胞或PLA载体治疗小鼠。由不知道每只小鼠的身份的两名研究者在第18天安乐死期间评估每窝幼仔数量和每窝胎儿死亡的发病率。在六组小鼠的任一组中，每窝幼仔的数量和胎儿死亡的发病率显然没有显著性差异(图4；P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837；对于P+PLA和P+PLX，n＝4；对于其他四组，n＝6；数据表示为平均值+SEM)。这表明PLX细胞治疗没有伤害胎儿。
实施例5：PLX细胞在妊娠的小鼠中是非免疫原性的
患有PE的妇女通常经历脾肿大(或脾脏的肿大)，其代表主动免疫反应。为了评价PLX细胞治疗的PE小鼠妊娠期间免疫系统的状态，如实施例1所述，在妊娠的C57B1/6J小鼠中诱导PE，并且用PLX细胞或PLA载体治疗小鼠。在妊娠期第18天，将小鼠为处以安乐死，并测量脾重量并针对体重进行标准化。PLX细胞治疗不会增加P小鼠的脾大小，证实PLX细胞缺乏免疫原性(图5)。PPIC和PR小鼠显示脾肿大(图5)。PLX细胞治疗使注射R837的PE小鼠(PR小鼠)的脾重与体重比正常化，但是该治疗不会显著地降低聚(I：C)-注射的(PPIC)小鼠中脾重与体重比(图5；P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837，对于P+PLA和P+PLX，n＝4，对于其他四组，n＝6，数据表示为平均值+SEM；星号指示p-值＜0.05vs.P+PLA)。
实施例6：PE发展和PLX细胞治疗的免疫细胞水平的变化
我们还检查了免疫细胞亚群的变化是否与PE的发展和PLX细胞治疗介导的PE症状减少有关。如实施例1所述，在妊娠的C57B1/6J小鼠中诱导PE，并且用PLX细胞或PLA载体治疗小鼠。在妊娠第18天，将小鼠处以安乐死，并且通过流式细胞仪确定抗炎的致耐受性免疫细胞调节性T细胞(Tregs；CD4+/FoxP3+)和促炎性免疫细胞γδT细胞(CD3+/γδ+)的水平。如图6A证实的，相对于P小鼠，PPIC和PR小鼠的Tregs的脾水平降低。PLX细胞治疗恢复了PPIC小鼠的Tregs水平，但没有恢复PR小鼠的Tregs水平(图6A)。另外，当相对于脾重进行标准化时，PPIC和PR小鼠的γδT细胞的脾水平升高(图6B)。在PR小鼠中，PLX细胞治疗使γδT细胞水平降至正常，但在PPIC小鼠中没有降至正常(图6B)(对于图6：P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚(I：C)，和PR＝妊娠+R837；对于所有组，n＝2-4；数据表示为平均值+SEM.)
实施例7：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX恢复IL-4的血浆水平
与PLX细胞诱导的脾肿大和γδT细胞的减少一致，我们观察到抗炎细胞因子IL-4的血浆水平恢复(其对于正常妊娠很重要)，和PPIC和PR小鼠的促炎细胞因子IL-6的血浆水平正常化(图7)。在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射用PLA载体或PLX细胞(总共106个细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死期间收集全血，分离血浆，并通过ELISA测定IL-4和IL-6。PPIC和PR小鼠显示显著降低的IL-4水平和增加的IL-6水平，这两者通过PLX细胞治疗都正常化了。P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚I：C(TLR3激动剂)，和PR＝妊娠+R837(TLR7激动剂)。数据表示为平均值+SEM。用单向ANOVA，＊p＜0.05vs.P+PLA。
这些数据一起表明PLX细胞治疗减少了炎症，其可以介导减轻PPIC和PR小鼠的PE症状。
实施例8：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX细胞减少HIF1α蛋白质
接着，我们通过免疫印迹检查缺氧标记物HIF1α的胎盘水平，以确定在PPIC和PR小鼠中是否出现胎盘损伤和PLX细胞治疗是否具有任何作用。在来自PPIC和PR小鼠的胎盘中，HIF1α的蛋白水平显著地增加，这可通过PLX细胞治疗来预防(图8)。
在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射用PLA载体或PLX细胞(总共106个细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。通过对第18天安乐死之后获得的胎盘进行免疫印迹测量HIF1α的蛋白水平，并针对肌动蛋白水平进行标准化。在PPIC和PR小鼠中，PLX细胞降低了HIF1α的蛋白质水平。P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚I：C(TLR3激动剂)，和PR＝妊娠+R837(TLR7激动剂)。数据表示为P+PLA的％的平均值+SEM。用单向ANOVA，＊p＜0.05vs.P+PLA。
实施例9：在先兆子痫小鼠的妊娠期间，PLX细胞减少胎盘血管周围的纤 维蛋白沉积
我们还使用H&E染色和光学显微镜通过组织学检查了胎盘损伤。我们在PPIC和PR小鼠的胎盘脉管系统周围的细胞中观察到描绘纤维蛋白沉积的伊红-阳性细胞，而这在来自PLX-治疗的小鼠的胎盘中没有观察到(图9)。
在妊娠期第14天，通过在右腿i.m.注射用PLA载体或PLX细胞(总共106个细胞)处理P、PPIC和PR小鼠。在第18天安乐死之后获得的胎盘上进行H&E染色。提供的图像是10x放大倍率。在PPIC和PR小鼠中，PLX细胞减少胎盘血管周围的纤维蛋白沉积(黑色箭头)。P＝妊娠，PPIC＝妊娠+聚I：C(TLR3激动剂)，和PR＝妊娠+R837(TLR7激动剂)。
总之，这些数据证实在妊娠期第14天PLX细胞治疗能够使小鼠的收缩压、蛋白尿和内皮功能正常化，而不具有有害的胎儿影响。虽然机制仍需准确地确定，但是这些初步数据表明PLX细胞治疗通过减少炎症、胎盘缺氧和胎盘损伤发挥有益的作用，并且证实PLX细胞可能是用于治疗PE的潜在新治疗剂。
应当理解，前述说明书仅仅是示例性的和解释性的，而不限制所要求保护的发明。考虑本文所公开的本发明的说明书和实施，本发明的其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。这意味着说明书和实施例仅仅被认为是示例性的。
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Claims (28)

1.一种治疗或预防有此需要的受试者中先兆子痫或子痫的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的贴壁基质细胞，从而治疗或预防先兆子痫或子痫。
2.贴壁基质细胞在制备用于治疗或预防先兆子痫或子痫的药物中的用途。
3.用于治疗或预防先兆子痫或子痫的贴壁基质细胞。
4.包括包装材料的制品，其包括用于治疗或预防先兆子痫或子痫的标签，所述包装材料包装药用有效量的贴壁基质细胞。
5.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者患有早发型先兆子痫。
6.权利要求5的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者处于约20周至约34周的妊娠期。
7.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者患有后发型先兆子痫。
8.权利要求7的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者处于约34周至约38周或以上的妊娠期。
9.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者具有增加的对妊娠的炎症性反应。
10.权利要求1、2、3、4或9的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述受试者具有选自下述的先兆子痫的一种或多种危险因素：一级亲属中的先兆子痫、之前妊娠的先兆子痫史、胎盘生长因子(PlGF)的血清浓度降低、可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的血清浓度增加、可溶性内皮因子的血清浓度增加、心血管疾病的危险因素、预先存在的亚临床内皮功能障碍、慢性高血压、糖尿病、高脂血症、母体肥胖、胰岛素抗性、早期妊娠的高血压、肾病、代谢综合征、高度凝血状态、低龄孕产妇、高龄孕产妇、胎盘形成差、胎盘质量增加、多胎妊娠、葡萄胎和带给之前的伴侣之前先兆子痫妊娠的男性的产前亲子关系。
11.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中通过在妊娠之前施用所述贴壁基质细胞预防先兆子痫或子痫。
12.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中通过在妊娠期间的任何时间施用所述贴壁基质细胞预防先兆子痫或子痫。
13.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中通过在约16周至约20周的妊娠期间施用所述基质细胞预防先兆子痫或子痫。
14.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中全身施用所述贴壁细胞。
15.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中局部施用所述贴壁细胞。
16.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中肌内施用所述贴壁细胞。
17.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中皮下施用所述贴壁细胞。
18.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁基质细胞是从骨髓、胎盘或脂肪组织获得的。
19.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞包含选自CD73、CD90、CD29和CD105的阳性标记物表达。
20.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞包含选自CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34和CD79的阴性标记物表达。
21.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁基质细胞是由三维(3D)培养获得的。
22.权利要求21的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述三维(3D)培养包括3D生物反应器。
23.权利要求21的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞在所述3D培养中的培养是在灌流下进行的。
24.权利要求21的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞的培养进行至少3天。
25.权利要求21的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞的培养进行直到至少10％的贴壁细胞在增殖。
26.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁细胞包括在2维(2D)培养条件下由胎盘或脂肪组织培养的细胞。
27.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞或制品，其中所述贴壁基质细胞是母亲或胎儿自体固有的。
28.权利要求1、2、3或4的方法、用途、贴壁基质细胞和/或制品，其中所述贴壁基质细胞与母亲和/或胎儿是异基因的。
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