KR20110086176A

KR20110086176A - 양막 유래 부착성 세포

Info

Publication number: KR20110086176A
Application number: KR1020117014012A
Authority: KR
Inventors: 스튜어트 애봇; 제임스 더블유. 에딩거; 알렉산다르 프랑키; 알렉산드르 카플루노브스키; 블라디미르 얀코비치; 크리스텐 라바조; 에릭 로우; 니라브 디. 패드리야; 제니퍼 파레데스; 지아-런 왕
Original assignee: 안트로제네시스 코포레이션
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-07-27
Also published as: AU2009316541A1; IL212765A; RU2015130665A; CA2743566C; BRPI0922184A2; WO2010059828A1; US8367409B2; CN102282252B; CN102282252A; NZ592726A; NZ602455A; US9198938B2; US20100124569A1; US20160361366A1; RU2015130665A3; EP2367932A1; CN107201337A; RU2011124524A; RU2562154C2; MX2011005229A

Abstract

양막 유래 부착성 세포로서 칭하는, 양막으로부터의 신규한 혈관신생 세포, 및 상기 세포의 집단 및 상기 세포를 포함하는 조성물을 본원에서 제공한다. 상기 세포를 얻는 방법 및 개체의 치료에서 세포의 사용 방법을 본원에서 추가로 제공한다.

Description

양막 유래 부착성 세포 {AMNION DERIVED ADHERENT CELLS}

본원은 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는, 2009년 11월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/116,248을 기초로 한 우선권을 주장한다.

1. 분야

"양막 유래 부착성 세포" (AMDAC)로서 칭하는, 양막으로부터의 신규한 혈관신생 세포 및 상기 세포의 집단을 본원에서 제공한다. 양막 유래 부착성 세포는 조직 배양 플라스틱 부착성 태반 줄기 세포를 비롯한 이전에 설명된 태반 줄기 세포와 구분된다.

2. 배경

세포 조성물, 예를 들어, 줄기 세포 조성물은 많은 생리학적 결핍증, 예를 들어, 골수 대체를 위한 매력적인 치료법이었다. 혈관신생 가능성 및/또는 특성이 있는 세포, 예를 들어, 줄기 세포 또는 전구 세포의 추가의 집단이 필요하다.

3. 개요

한 측면에서, 본원에서 AMDAC로서도 칭하는 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 30 사이클 동안 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 결정할 때, 예를 들어, 적절한 대조 세포주, 예를 들어 배아 암종 유래 줄기 세포주 (예를 들어, NTERA-2 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC) 번호 CRL-1973로 입수가능함))에 비해 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- (POU5F1 또는 옥타머 (octamer) 결합 단백질 4로도 알려진 OCT-4에 대해 음성)이다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정 (immunolocalization)에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ (혈관 내피 성장 인자 수용체 1) 및/또는 VEGFR2/KDR⁺ (혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (키나제 삽입 도메인 수용체로도 알려짐))이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺ (인테그린-α6⁺)이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺ 또는 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 OCT-4^-이고, 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2를 발현하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD29⁺, CD73⁺, ABC-P⁺ 및 CD38^- 중 하나 이상이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺ (안지오포이에틴 수용체), TEM-7⁺ (종양 내피 마커 7), CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^- (안지오텐신-I-전환 효소, ACE), CD146^- (흑색종 세포 부착 분자), CXCR4^- (케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4) 중 하나 이상이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및 CXCR4^-이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공하는 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고; 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고; 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^- 및/또는 Tie-2^- 중 하나 이상 또는 전부이다. 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 부착성 세포의 집단은 NTERA-2 세포, 또는 동등한 수의 세포를 갖는 NTERA-2 세포의 집단보다 예를 들어, >20 사이클에서 OCT-4에 대해 적어도 2 로그 더 적은 PCR-증폭된 mRNA를 발현한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^- (CD144^-)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD105⁺ 및 CD200⁺에 대해 양성이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF (혈관 내피 성장 인자)에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다.

또 다른 측면에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 및 SOX-2^-이고; 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 구체적인 실시양태에서, OCT-4^-, SOX-2^- 세포는 추가로 유동 세포측정에 의해 결정할 때 HLA-G^- 또는 CD271^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 및 SOX-2^-이고; 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺, CD117^-, CD271^- 및 HLA-G^-이다.

또 다른 측면에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 CD309 (VEGFR2/KDR⁺로도 알려짐)에 대해 양성이다.

또 다른 측면에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 예를 들어, >20 사이클에서 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및 VE-카드헤린^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 OCT-4^-, CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- (흑색종 세포 부착 분자), 또는 CXCR4^- 중 하나 이상이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및 CXCR4^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고; 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^- 및/또는 Tie-2^- 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺, VEGFR2/KDR⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^- 및 Tie-2^-이다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 FGF4, IFNG, CXCL10, ANGPT4, ANGPTL3, FGA, LEP, PRL, PROK1, TNMD, FLT3, XLKD1, CDH5, LECT1, PLG, TERT, SOX2, NANOG, MMP-13, DLX5, 또는 BGLAP에 대한 mRNA를 발현하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 불변 사슬 (invariant chain), HLA-DR-DP-DQ, CD6, CD271 중 하나 이상을 구성적으로 발현하지 않는다.

양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 추가로 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 양막 유래 부착성 세포이다. 하나의 실시양태에서, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고, 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 또 다른 실시양태에서, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 및 HLA-G^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 또는 VEGFR2/KDR⁺인 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 제공하고; 여기서 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및 VEGFR2/KDR⁺이고, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 또는 CXCR4^- 중 하나 이상이거나, 예를 들어, >20 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-이고, 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고, 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않고, 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 예를 들어 마트리겔 (MATRIGEL)™과 같은 기재 상에서 혈관신생 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재 하에 배양될 때 싹 (sprout) 또는 관-유사 구조를 형성한다.

또 다른 실시양태에서, 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, 또는 CD200에 대해 양성인 양막 유래 부착성 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺인 양막 유래 부착성 세포이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 예를 들어, 마트리겔™과 같은 기재 상에서 혈관신생 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성한다.

또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 인간 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1, 또는 VEGFR2/KDR 중 하나 이상 또는 전부에 대한 RNA를 발현하는 양막 유래 부착성 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 CD49d, 콘넥신 (Connexin)-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴 (Galectin)-1, ADAM 17 전구체 (디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 17) (TNF-알파 전환 효소) (TNF-알파 컨버타제), 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A (알파-필라민) (필라민 1) (내피 액틴-결합 단백질) (ABP-280) (비-근육 필라민), 알파-액티닌 1 (알파-액티닌 세포골격 이소형) (비-근육 알파-액티닌 1) (F-액틴 가교연결 단백질), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 2 전구체 (메갈린 (Megalin)) (당단백질 330) (gp330), 대식세포 스캐벤저 (scavenger) 수용체 유형 I 및 II (대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II), 액티빈 (Activin) 수용체 유형 IIB 전구체 (ACTR-IIB), Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포 (GFAP), 미오신-결합 단백질 C, 심장-유형 (심장 MyBP-C) (C-단백질, 심장 근육 이소형), 또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A (세포성 미오신 중쇄, 유형 A) (비-근육 미오신 중쇄-A) (NMMHC-A) 중 하나 이상 또는 전부를 발현하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공한다.

또 다른 측면에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 또는 갈렉틴-1 중 하나 이상 또는 전부를, 예를 들어 세포(들)이 성장하는 배양 배지 내로 분비하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 혈관신생성 마이크로RNA (miRNA)를 발현하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 miRNA는 miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 및/또는 miR-296 중 하나 이상 또는 전부이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 혈관신생성 마이크로RNA (miRNA) 중 하나 이상 또는 전부를 발현하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 miRNA는 miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16 중 하나 이상 또는 전부이다. 특정 실시양태에서, AMDAC, 또는 AMDAC 집단은 혈관신생성 miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b 및/또는 miR-16 중 하나 이상 또는 전부를 발현한다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 정상 산소 조건 (예를 들어, 약 20% 또는 약 21% O₂)에 비해 저산소 조건 (예를 들어, 약 5% O₂ 미만) 하에 증가된 수준의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF를 발현하는 양막 유래 혈관신생 세포, 또는 양막 유래 혈관신생 세포의 집단을 본원에서 제공한다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단은 추가로 제2 유형의 세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 상기 집단 내의 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 98%를 구성한다. 구체적인 실시양태에서, 제2 유형의 세포는 태반 혈액, 제대혈, 조질 골수 또는 다른 조직 내에 함유되거나 그로부터 단리된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 유형의 세포는 배아 줄기 세포, 혈액 세포, 말초 혈액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 혈액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 관류액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 조직으로부터 단리된 줄기 세포, 제대혈로부터 단리된 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 줄기 세포, 중간엽 기질 세포, 조혈 줄기 세포, 신체 줄기 세포, 연골세포, 섬유모세포, 근육 세포, 내피 세포, 내피 전구 세포, 혈관주위세포, 근육세포, 심근세포, 근육모세포, 혈관모세포, 또는 심근모세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 유형의 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포, 예를 들어, CD34⁺ 세포이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 유형의 세포는 상기 집단 내의 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 98%를 구성한다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 임의의 상기 세포는 배양액 내에서 증식되거나 증식되었다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 임의의 상기 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 또는 그 초과로 계대배양된 상기 세포의 배양액으로부터의 것이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 임의의 상기 세포는 배양액 내에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 적어도 50회 또는 그 초과로 배가 (doubling)된 배양액으로부터의 것이다.

또 다른 측면에서, 임의의 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물을 본원에서 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 조성물은 매트릭스 (matrix) 또는 스캐폴드 (scaffold), 예를 들어, 천연 조직 매트릭스 또는 스캐폴드, 예를 들어, 영구 또는 분해성 탈세포화 조직 매트릭스 또는 스캐폴드; 또는 합성 매트릭스 또는 스캐폴드이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드는 관 (tube)의 형태 또는 다른 3차원 형태의 유기관 (organoid)으로 성형된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스는 탈세포화 조직 매트릭스이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 생리학상 허용되는 용액, 예를 들어, 염수 용액, 배양 배지 등 내에 본원에서 제공되는 단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단 중 하나 이상을 포함한다.

또 다른 측면에서, 하나 이상의 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 개체에게 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 검출가능한 개선에 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 치료 방법을 본원에서 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를, 양막 유래 부착성 세포의 투여 전의 개체에 비해 흉부 심박출량 (CO), 심장 지수 (CI), 폐 동맥 쐐기압 (PAWP), 심장 지수 (CI), % 분획 단축 (%FS), 박출률 (EF), 좌심실 박출률 (LVEF); 좌심실 이완기말 직경 (LVEDD), 좌심실 수축기말 직경 (LVESD), 수축성 (dP/dt), 심방 또는 심실 기능의 감소, 펌핑 효율의 증가, 펌핑 효율 손실 속도의 감소, 혈역동학적 기능의 손실 감소, 또는 심근병증과 연관된 합병증의 감소인 심장 기능의 하나 이상의 징후의 검출가능한 개선에 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 치료 방법을 본원에서 제공한다.

구체적인 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 심근경색이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 심근병증이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 동맥류, 협심증, 대동맥 협착증, 대동맥염, 부정맥, 동맥경화증, 동맥염, 비대칭 중격 비대 (ASH), 죽상경화증, 심방세동 및 조동, 세균성 심내막염, 바로우 (Barlow) 증후군 (승모판 탈출증), 서맥, 버거 (Buerger) 병 (폐색성 혈전혈관염), 심비대, 심장염, 경동맥 질병, 대동맥 축착, 선천성 심내 결손 (heart defect), 울혈성 심부전, 관상 동맥 질병, 아이젠멩거 (Eisenmenger) 증후군, 색전증, 심내막염, 홍색사지통증, 세동, 섬유근육 형성이상, 심차단, 심잡음, 고혈압, 저혈압, 특발성 영아 동맥 석회화, 가와사끼 (Kawasaki) 질병 (점막피부성 림프절 증후군, 점막피부성 림프절 질병, 영아 다발성 동맥염), 대사 증후군, 미세혈관 협심증, 심근염, 발작성 심방성 빈맥증 (PAT), 결절성 동맥주위염 (다발동맥염, 결절성 다발동맥염), 심장막염, 말초혈관 질병, 중증 하지 허혈, 정맥염, 폐동맥 협착증, 레이노 (Raynaud) 질병, 신동맥 협착증, 신혈관성 고혈압, 류마티스성 심장 질병, 당뇨병성 혈관병, 중격 결손, 무증상성 허혈, 증후군 X, 빈맥, 다까야스 (Takayasu) 동맥염, 팔로 사징증 (Tetralogy of Fallot), 대혈관 전위증, 삼첨판 폐쇄증, 총동맥간증, 판막성 심장 질병, 정맥류성 궤양, 정맥류성 정맥, 혈관염, 심실 중격 결손, 월프-파킨슨-화이트 (Wolff-Parkinson-White) 증후군, 심내막 융기 결손, 급성 류마티스열, 급성 류마티스성 심장막염, 급성 류마티스성 심내막염, 급성 류마티스성 심근염, 만성 류마티스성 심장 질병, 승모판 질병, 승모판 협착증, 류마티스성 승모판 폐쇄 부전증, 대동맥 판막의 질병, 다른 심내막 구조의 질병, 허혈성 심장 질병 (급성 및 아급성), 협심증, 급성 폐성 심장 질병, 폐 색전증, 만성 폐성 심장 질병, 척추 후측만곡성 심장 질병, 심근염, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 심내막 탄력섬유증, 방실 차단, 심장 부정맥, 심근 변성, 뇌혈관 질병, 동맥, 세동맥 및 모세혈관의 질병, 또는 정맥 및 림프관의 질병이다.

다른 구체적인 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 뇌전 동맥의 폐색 및 협착증, 또는 뇌동맥의 폐색이다. 한 측면에서, 개체에게 치료 유효량의 단리된 AMDAC를 투여하는 것을 포함하는, 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴가 있는 개체, 예를 들어, 개체의 뇌 또는 중추 신경계 (CNS) 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴에 기여하는 증상 또는 신경학적 결손이 있는 개체의 치료 방법을 본원에서 제공한다. 특정 실시양태에서, 혈액 유동의 파괴는 개체의 뇌 또는 CNS에 무산소 손상 또는 저산소 손상을 일으킨다.

다른 구체적인 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 말초 동맥의 폐색 및 협착증이다. 한 측면에서, 개체에게 치료 유효량의 단리된 AMDAC를 투여하는 것을 포함하는, 사지 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴가 있는 개체, 예를 들어, 개체의 말초혈관계 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴에 기여하는 증상 또는 혈관 결손이 있는 대상의 치료 방법을 본원에서 제공한다. 특정 실시양태에서, 혈액 유동의 파괴는 개체의 사지 및/또는 팔다리에 무산소 손상 또는 저산소 손상을 일으킨다.

또 다른 측면에서, 하나 이상의 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 개체에게 상처 또는 외상의 검출가능한 개선에 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 상처 또는 외상으로 고통받는 개체의 치료 방법을 본원에서 제공한다.

치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 주사에 의해 상기 개체에게 투여된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 주사는 개체의 심장의 허혈 영역 내의 주사이다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 정맥내 주입에 의해 상기 개체에게 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포, 또는 상기 세포의 집단, 또는 상기 세포를 포함하는 세포의 집단은 상기한 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 매트릭스 또는 스캐폴드를 상기 개체에 삽입 (implantation)함으로써 상기 개체에게 투여된다.

본원에서 제공되는 단리된 양막 유래 부착성 세포 및 세포 집단은 예를 들어 미국 특허 7,255,879 또는 미국 특허 출원 공개 2007/0275362에 기재된 단리된 태반 줄기 세포 또는 세포 집단이 아니다. 또한, 본원에서 제공되는 단리된 양막 유래 부착성 세포는 내피 전구 세포, 양막 상피 세포, 영양모세포, 세포영양모세포, 배아 생식 세포, 배아 줄기 세포, 배아의 내부 세포 덩어리로부터 얻은 세포, 또는 배아의 생식 융기 (gonadal ridge)로부터 얻은 세포가 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 예를 들어 언급된 수치 또는 값의 10% 이내를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포에 대해 용어 "혈관신생성"은 세포가 혈관 또는 혈관-유사 싹을 형성할 수 있거나, 또는 세포가 또 다른 세포 집단, 예를 들어, 내피 세포에서 혈관신생 (예를 들어, 혈관 또는 혈관-유사 구조의 형성)을 촉진할 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혈관신생"은 내피 세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 (remodeling) 및 세포 안정화를 포함하고 이로 제한되지 않는 혈관 형성 과정을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 반드시 무한적이지는 않지만 광범위하게 증식할 수 있고 배 발생 또는 출산후 조직 대체 및 회복 동안 다수의 조직의 형성에 기여할 수 있는 임의의 제시된 세포 집단의 기능적 특성을 규정한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전구 세포"는 반드시 무한적이지는 않지만 광범위하게 증식할 수 있고 배 발생 또는 출산후 조직 대체 및 회복 동안 줄기 세포에 비해 제한된 세트의 다수의 조직의 형성에 기여할 수 있는 임의의 제시된 세포 집단의 기능적 특성을 규정한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유래된"은 단리되거나 다른 방식으로 정제된 것을 의미한다. 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포는 양막으로부터 단리된다. 용어 "유래된"은 조직, 예를 들어, 양막으로부터 직접 단리된 세포로부터 배양된 세포, 및 1차 단리물로부터 배양되거나 팽창된 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "면역학적 위치 결정"은 예를 들어 유동 세포측정, 형광-활성화 세포 분류, 자기 세포 분류, 계내 (in situ) 혼성화, 면역조직화학 등에서 면역 단백질, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편을 사용한 화합물, 예를 들어, 세포 마커의 검출을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 세포가 그로부터 유래되는 조직, 예를 들어, 양막 또는 태반의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다. 세포는, 줄기 세포가 그와 천연에서 회합하는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 적어도 99%의 세포가 예를 들어 세포의 수집 및/또는 배양 동안 세포로부터 제거될 경우 "단리된" 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 세포 집단"은 세포 집단이 그로부터 유래되는 조직, 예를 들어, 양막 또는 태반의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포 집단을 의미한다. 세포는, 세포 집단 또는 세포 집단이 그로부터 유래되는 세포가 그와 천연에서 회합하는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 적어도 99%의 세포가 예를 들어 양막 유래 부착성 세포의 수집 및/또는 배양 동안 세포로부터 제거될 경우 "단리된" 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 세포는 마커가 예를 들어 면역학적 위치 결정에 의해, 예를 들어, 유동 세포측정에 의해; 또는 RT-PCR에 의해 배경보다 높은 수준으로 검출가능할 때 특정 마커에 대해 "양성"이다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 CD105가 배경보다 검출가능하게 더 큰 양으로 세포에서 검출가능한 경우에 (예를 들어, 이소형 대조군에 비해) CD105에 대해 양성인 것으로 설명된다. 예를 들어, 항체-매개 검출에서, 특정 세포 표면 마커의 표시로서의 "양성"은 마커가 그 마커에 특이적인 항체, 예를 들어 형광-표지된 항체를 사용하여 검출가능함을 의미하고; "양성"은 또한 세포가 예를 들어 세포측정기에서 배경보다 높은 수준으로 검출가능한 신호를 생성하는 양의 마커를 보유함을 의미한다. 예를 들어, 세포는 "CD105⁺"로서, 세포는 CD105에 특이적인 항체로 검출가능하게 표지되고, 항체로부터의 신호는 대조군 (예를 들어, 배경)보다 검출가능하게 더 높다. 이와 반대로, 동일한 맥락에서 "음성"은 세포 표면 마커가 배경에 비해 그 마커에 특이적인 항체를 사용하여 검출가능하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 세포는 "CD34^_"이고, 세포는 CD34에 특이적인 항체로 검출가능하게 표지되지 않는다. 본원에서 달리 나타내지 않으면, 분화 클러스터 ("CD") 마커는 항체를 사용하여 검출된다. 예를 들어, OCT-4에 대한 mRNA가 예를 들어 30 사이클 동안 RT-PCR을 이용하여 검출가능할 경우에 OCT-4는 존재하는 것으로 결정될 수 있고, 세포는 OCT-4⁺이다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1은 양막 유래 부착성 세포 및 NTERA-2 세포에 의한 줄기 세포-관련 유전자의 발현을 보여준다.
도 2는 양막 유래 부착성 세포 (AMDAC)의 세포 표면 상에서 TEM-7의 발현을 보여준다.
도 3은 양막 유래 부착성 세포에 의한 선택된 혈관신생 단백질의 분비를 보여준다.
도 4는 인간 내피 세포 (HUVEC) 관 형성에 대한 양막 유래 부착성 세포-조건화 배지의 혈관신생 효과를 보여준다.
도 5는 인간 내피 세포 이동에 대한 양막 유래 부착성 세포-조건화 배지의 혈관신생 효과를 보여준다.
도 6은 인간 내피 세포 증식에 대한 양막 유래 부착성 세포-조건화 배지의 효과를 보여준다.
도 7은 HUVEC 및 양막 유래 부착성 세포에 의한 아세틸화된 LDL의 흡수를 보여준다.
도 8은 HUVEC 및 양막 유래 부착성 세포의 관 형성을 보여준다.
도 9는 저산소 및 정상 산소 조건 하에 양막 유래 부착성 세포에 의한 VEGF 및 IL-8의 분비를 보여준다.
도 10은 정상 산소 (약 21% O₂) 및 저산소 (약 5% O₂ 미만) 조건 하에 세포 마커 Tie2의 발현을 보여준다. Y 축: 유동 세포측정에 의한 Tie2에 양성인 세포의 백분율.
도 11은 양막 유래 부착성 세포의 심근세포 분화 효능을 보여주고, 여기서 AM은 양막 유래 부착성 세포 (AMDAC)를 나타내고, HD는 비처리 현적 (hanging drop)을 나타내고, HD IND는 유도 조건에 노출된 현적을 나타내고, HD IND + 5-AZA는 5-아자시티딘의 존재 또는 부재 하의 유도를 나타낸다. CTRL은 비처리 현적 대조군을 나타낸다.
도 12는 병아리 융모요막 혈관신생 모델에서 혈관신생에 대한 AMDAC의 양성 효과를 보여준다. 로트 (lot) 1, 로트 2, 로트 3: 3개의 별개의 세포 제제로부터의 AMDAC. bFGF: 염기성 섬유모세포 성장 인자 (양성 대조군). MDAMB231: 혈관신생성 유방암 세포주 (양성 대조군). Y 축: 혈관 형성의 정도.
도 13은 병아리 융모요막 혈관신생 모델에서 혈관신생에 대한 AMDAC-조건화 배지의 양성 효과를 보여준다. 로트 1, 로트 2, 로트 3: 3개의 별개의 세포 제제로부터의 AMDAC. bFGF: 염기성 섬유모세포 성장 인자 (양성 대조군). MDAMB231: 혈관신생성 유방암 세포주 (양성 대조군). Y 축: 혈관 형성의 정도.
도 14a, 14b: 성상세포의 배양액, 성상세포와 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC)의 동시-배양액, 또는 성상세포와 AMDAC의 동시-배양액 내에 존재하는 과산화수소-생성된 반응성 산소종. 도 14a: AMDAC, 로트 1; 도 14b: AMDAC, 로트 2. 조건 HA (인간 성상세포) 단독, 성상세포 + H₂O₂, 및 성상세포 + BM-MSC + H₂O₂는 도 14a 및 14b에 대해 동일하다. RFU ROS 활성: 반응성 산소종에 대한 상대 형광 단위.

5. 상세한 설명

5.1 양막 유래 부착성 세포의 특징

본원에서 "양막 유래 부착성 세포" 또는 AMDAC로 칭하는, 양막으로부터 단리가능한 독특한 부착성 혈관신생 세포 및 상기 세포의 집단을 본원에서 제공한다. 양막 유래 부착성 세포는 전체적으로 섬유아세포형 형상을 갖는, 외관이 피상적으로 중간엽 세포를 닮는다. 세포는 세포 배양 표면, 예를 들어, 조직 배양 플라스틱에 부착한다.

AMDAC는 다른 양막-유래 또는 태반-유래 세포로부터 그들을 구분하는 세포 마커를 보인다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- (옥타머 결합 단백질 4)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, OCT-4^- 양막 유래 부착성 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, OCT-4^- 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ (혈관 내피 성장 인자 수용체 1) 및/또는 VEGFR2/KDR⁺ (혈관 내피 성장 인자 수용체 2)이다. 구체적인 실시양태에서, OCT-4^- 양막 유래 부착성 세포, 또는 OCT-4^- 양막 유래 부착성 세포의 집단은 NTERA-2 세포, 또는 동등한 수의 세포 및 RNA 증폭 사이클을 갖는 NTERA-2 세포의 집단보다, 예를 들어 20 사이클에서 OCT-4에 대해 적어도 2 로그 더 적은 PCR-증폭된 mRNA를 발현한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 CD90⁺, CD105⁺ 또는 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4^- 세포는 CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 세포는 OCT-4^- 또는 HLA-G^-이고, 추가로 CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 세포는 OCT-4^-, HLA-G^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, OCT-4^- 세포는 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2를 발현하지 않는다. 따라서, 구체적인 실시양태에서, 세포는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 OCT-4^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고, 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 예를 들어, OCT-4^- AMDAC는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, TEM-7⁺ (종양 내피 마커 7), CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^- (안지오텐신-I-전환 효소, ACE), CD146^- (흑색종 세포 부착 분자), 또는 CXCR4^- (케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4) 중 하나 이상, 또는 RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및 CXCR4^-이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-이다. 하나의 실시양태에서, 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포는 CD31^-, CD34^-, CD45^- 및/또는 CD133^- 중 하나 이상이다. 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-; 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고; CD31^-, CD34^-, CD45^- 및/또는 CD133^- 중 하나 이상 또는 전부이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD105⁺ 및 CD200⁺에 대해 양성이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 25 내지 75 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안, 또는 50 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다. 훨씬 더 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 또는 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 7 내지 14일, 예를 들어 7일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다.

구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^-, VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺ 및/또는 CD200⁺ 중 하나 이상이다. 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^-, VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 예를 들어, 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 OCT-4^-, CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 또는 CXCR4^- 중 하나 이상이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및 CXCR4^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고; 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^- 및/또는 Tie-2^- 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺, VEGFR2/KDR⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^- 및 Tie-2^-이다.

또 다른 실시양태에서, OCT-4^- 양막 유래 부착성 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD49f⁺, CD54⁺, CD90⁺, CD98⁺, CD105⁺, CD200⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺ (CD309⁺) 중 하나 이상 또는 전부이거나; 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD117^-, CD133^-, CD143^-, CD144^-, CD146^-, CD271^-, CXCR4^-, HLA-G^- 및/또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상 또는 전부이거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다.

특정 실시양태에서, 단리된 조직 배양 플라스틱-부착성 양막 유래 부착성 세포는 CD49f⁺이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 CD49f⁺ 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, CD98⁺, CD105⁺, CD200⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺ (CD309⁺) 중 하나 이상 또는 전부이거나; 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD117^-, CD133^-, CD143^-, CD144^-, CD146^-, CD271^-, CXCR4^-, HLA-G^-, OCT-4^- 및/또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상 또는 전부이거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다.

다른 특정 실시양태에서, 단리된 조직 배양 플라스틱-부착성 양막 유래 부착성 세포는 HLA-G^-, CD90⁺ 및 CD117^-이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 HLA-G^-, CD90⁺ 및 CD117^- 세포는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD49f⁺, CD54⁺, CD98⁺, CD105⁺, CD200⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺ (CD309⁺) 중 하나 이상 또는 전부이거나; 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31^-, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD144^-, CD146^-, CD271^-, CXCR4^-, OCT-4^- 및/또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상 또는 전부이거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 혈관신생 세포의 집단은 표준 배양 조건 하에 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 섬유모세포 성장 인자 4 (FGF4), 인터페론 γ (IFNG), 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10), 안지오포이에틴 4 (ANGPT4), 안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3), 피브리노겐 α 사슬 (FGA), 렙틴 (LEP), 프로락틴 (PRL), 프로키네티신 1 (PROK1), 테노모듈린 (TNMD), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT3), 세포외 연결 (link) 도메인 함유 1 (XLKD1), 카드헤린 5, 유형 2 (CDH5), 백혈구 세포 유래 케모탁신 1 (LECT1), 플라스미노겐 (PLG), 텔로머라제 역전사효소 (TERT), (성 결정 영역 Y)-박스 2 (SOX2), NANOG, 매트릭스 메탈로프로테아제 13 (MMP-13), 디스탈-레스 호메오박스 (distal-less homeobox) 5 (DLX5), 및/또는 뼈 감마-카르복시글루타메이트 (gla) 단백질 (BGLAP)에 대한 mRNA를 구성적으로 발현하지 않는다. 다른 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 혈관신생 세포의 집단은 (ARNT2), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양인자 (BDNF), 아교-유래 신경영양인자 (GDNF), 뉴로트로핀 3 (NT-3), NT-5, 저산소증-유도 인자 1α (HIF1A), 저산소증-유도 단백질 2 (HIG2), 헴 옥시게나제 (디사이클링 (decycling)) 1 (HMOX1), 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타제 [Cu-Zn] (SOD3), 카탈라제 (CAT), 전환 성장 인자 β1 (TGFB1), 전환 성장 인자 β1 수용체 (TGFB1R), 및 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR/c-met)에 대한 mRNA를 발현한다.

또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 제공한다. 세포 집단은 균질한 집단, 예를 들어, 그의 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 99%가 양막 유래 부착성 세포인 세포 집단일 수 있다. 세포 집단은 비균질성, 예를 들어, 집단 내의 세포의 최대 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%가 양막 유래 부착성 세포인 세포 집단일 수 있다. 그러나, 단리된 세포 집단은 조직, 즉, 양막이 아니다.

하나의 실시양태에서, AMDAC를 포함하는 단리된 세포 집단, 예를 들어, AMDAC에 대해 실질적으로 균질한 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 AMDAC는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 AMDAC는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이다. 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어, 면역학적 위치 결정 또는 RT-PCR에 의해 결정할 때 CD49f⁺ 또는 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC 집단은 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고, 여기서 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 보다 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 및/또는 HLA-G^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC는 CD90⁺, CD105⁺ 또는 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC는 CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 OCT-4^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2를 발현하지 않는다. 훨씬 더 구체적인 실시양태에서, 집단은 AMDAC를 포함하고, 여기서 상기 AMDAC는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 OCT-4^-, HLA-G^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고, 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 상기 AMDAC는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺ 또는 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 또는 HLA-G^-이고, 추가로 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 AMDAC는 OCT-4^-, HLA-G^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2를 발현하지 않는다. 따라서, 보다 구체적인 실시양태에서, 세포는 면역학적 위치 결정 또는 유동 세포측정에 의해 결정할 때 OCT-4^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고, 예를 들어, 30 사이클 동안 RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2^-이다. 훨씬 더 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 OCT-4^- 또는 HLA-G^-이고, 추가로 CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다. 보다 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 OCT-4^-, HLA-G^-, CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 양막 유래 부착성 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고, 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 또는 CXCR4^- 중 하나 이상이거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-이고, 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및/또는 VEGFR2/KDR⁺이고, 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않고, 상기 단리된 세포 집단은 양막이 아니다. 임의의 상기 실시양태의 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 적어도 4일 내지 14일까지 동안 예를 들어, 태반 콜라겐 또는 마트리겔™과 같은 기재 내에서 또는 상에서 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 콜라겐 유형 I 및 IV, 또는 혈관신생 인자, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성한다.

양막 유래 부착성 세포, 및 양막 유래 부착성 세포의 집단은 혈관신생-관련 또는 심근생성-관련 유전자에 관련된 단백질의 특징적인 발현을 보인다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포, 및 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 ACTA2 (액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥), ADAMTS1 (트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 1), AMOT (안지오모틴), ANG (안지오제닌), ANGPT1 (안지오포이에틴 1), ANGPT2, ANGPTL1 (안지오포이에틴-유사 1), ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1 (뇌-특이적 혈관신생 억제제 1), CD44, CD200, CEACAM1 (암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1), CHGA (크로모그라닌 A), COL15A1 (콜라겐, 유형 XV, 알파 1), COL18A1 (콜라겐, 유형 XVIII, 알파 1), COL4A1 (콜라겐, 유형 IV, 알파 1), COL4A2 (콜라겐, 유형 IV, 알파 2), COL4A3 (콜라겐, 유형 IV, 알파 3), CSF3 (콜로니 자극 인자 3 (과립구)), CTGF (연결 조직 성장 인자), CXCL12 (케모킨 (CXC 모티프) 리간드 12 (기질 세포-유래 인자 1)), CXCL2, DNMT3B (DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 3 베타), ECGF1 (티미딘 포스포릴라제), EDG1 (내피 세포 분화 유전자 1), EDIL3 (EGF-유사 반복체 및 디스코이딘 I-유사 도메인 3), ENPP2 (엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 2), EPHB2 (EPH 수용체 B2), FBLN5 (피불린 (FIBULIN) 5), F2 (응고 인자 II (트롬빈)), FGF1 (산성 섬유모세포 성장 인자), FGF2 (염기성 섬유모세포 성장 인자), FIGF (c-fos 유도 성장 인자 (혈관 내피 성장 인자 D)), FLT4 (fms-관련 티로신 키나제 4), FN1 (피브로넥틴 1), FST (폴리스타틴), FOXC2 (포크헤드 (forkhead) 박스 C2 (MFH-1, 중간엽 포크헤드 1)), GRN (그라눌린), HGF (간세포 성장 인자), HEY1 (YRPW 모티프와 관련된 헤어리/인핸서-오브-스플리트 (hairy/enhancer-of-split) 1), HSPG2 (헤파란 술페이트 프로테오글리칸 2), IFNB1 (인터페론, 베타 1, 섬유모세포), IL8 (인터류킨 8), IL12A, ITGA4 (인테그린, 알파 4; CD49d), ITGAV (인테그린, 알파 V), ITGB3 (인테그린, 베타 3), MDK (미드킨), MMP2 (매트릭스 메탈로프로테아제 2), MYOZ2 (미오제닌 2), NRP1 (뉴로필린 1), NRP2, PDGFB (혈소판-유래 성장 인자 β), PDGFRA (혈소판-유래 성장 인자 수용체 α), PDGFRB, PECAM1 (혈소판/내피 세포 부착 분자), PF4 (혈소판 인자 4), PGK1 (포스포글리세레이트 키나제 1), PROX1 (프로스페로 (prospero) 호메오박스 1), PTN (플레이오트로핀), SEMA3F (세모포린 3F), SERPINB5 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 B (난알부민), 멤버 5), SERPINC1, SERPINF1, TIMP2 (메탈로프로테이나제의 조직 억제제 2), TIMP3, TGFA (전환 성장 인자, 알파), TGFB1, THBS1 (트롬보스폰딘 1), THBS2, TIE1 (면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인이 존재하는 티로신 키나제 1), TIE2/TEK, TNF (종양 괴사 인자), TNNI1 (트로포닌 I, 유형 1), TNFSF15 (종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 멤버 15), VASH1 (바소히빈 1), VEGF (혈관 내피 성장 인자), VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 (혈관 내피 성장 인자 수용체 1) 및/또는 VEGFR2/KDR 중 하나 이상 또는 전부에 대한 RNA를 발현하는 양막 유래 부착성 세포이다.

인간 세포가 사용될 때, 전체에서 유전자 명칭은 인간 서열을 나타내고, 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 대표적인 서열은 문헌 또는 GenBank에서 찾을 수 있다. 서열에 대한 프로브는 공적으로 이용가능한 서열에 의해 또는 상업적인 공급원을 통해, 예를 들어, 특이적 타크만 (TAQMAN)® 프로브 또는 타크만® 혈관신생 어레이 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 파트 no. 4378710) 결정될 수 있다.

양막 유래 부착성 세포, 및 양막 유래 부착성 세포의 집단은 혈관신생-관련 단백질의 특징적인 발현을 보인다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포, 및 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 CD49d, 콘넥신-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴-1, ADAM 17 전구체 (A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 17) (TNF-알파 전환 효소) (TNF-알파 컨버타제), 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A (알파-필라민) (필라민 1) (내피 액틴-결합 단백질) (ABP-280) (비-근육 필라민), 알파-액티닌 1 (알파-액티닌 세포골격 이소형) (비-근육 알파-액티닌 1) (F-액틴 가교연결 단백질), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 2 전구체 (메갈린) (당단백질 330) (gp330), 대식세포 스캐벤저 수용체 유형 I 및 II (대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II), 액티빈 수용체 유형 IIB 전구체 (ACTR-IIB), Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포 (GFAP), 미오신-결합 단백질 C, 심장-유형 (심장 MyBP-C) (C-단백질, 심장 근육 이소형), 및/또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A (세포성 미오신 중쇄, 유형 A) (비-근육 미오신 중쇄-A) (NMMHC-A)를 발현하는 양막 유래 부착성 세포이다.

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 내피 세포, 내피 전구 세포 등에서 혈관신생을 촉진하는 단백질을 추가로 분비한다. 특정 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하고, 예를 들어, 여기서 상기 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 또는 갈렉틴-1 중 하나 이상 또는 전부를 예를 들어, 세포(들)이 성장하는 배양 배지 내로 분비하는 양막 유래 부착성 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 상기 양막 유래 부착성 세포와 접촉하는 내피 세포의 집단에서 싹 또는 관-유사 구조의 형성을 일으킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 양막-유래 혈관신생 세포는 인간 내피 세포와 동시-배양되어, 예를 들어, 적어도 4일 및/또는 14일까지 동안 태반 콜라겐 또는 마트리겔™과 같은 기재 내에서 또는 상에서 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 콜라겐 유형 I 및 IV, 또는 혈관신생 인자, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성하거나 내피 세포 싹을 지지한다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 혈관신생 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 또는 인터류킨-8 (IL-8)을 분비하고, 그에 의해 인간 내피 세포가 예를 들어, 태반 콜라겐 또는 마트리겔™과 같은 기재 내에서 또는 상에서 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 콜라겐 유형 I 및 IV의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성하도록 유도할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 혈관신생성 마이크로RNA (miRNA)를 발현하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 miRNA는 miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 및/또는 miR-296 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 집단, 또는 단리된 세포 집단 내의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 혈관신생성 마이크로RNA (miRNA) 중 하나 이상 또는 전부를 발현하는 양막 유래 부착성 세포인 세포의 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 miRNA는 miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다. 특정 실시양태에서, AMDAC, 또는 AMDAC의 집단은 혈관신생성 miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, (혈관신생성 miRNA 클러스터 (cluster) 17-92의 멤버), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16 중 하나 이상 또는 전부를 발현한다.

따라서, 하나의 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포를 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고, 상기 세포는 (a) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1, 또는 VEGFR2/KDR (CD309) 중 하나 이상을 발현하고/하거나; (b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G 또는 VE-카드헤린의 발현이 결핍되거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2의 발현이 결핍되고/되거나; (c) ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1, 또는 VEGFR2/KDR에 대한 mRNA를 발현하고/하거나; (d) 단백질 CD49d, 콘넥신-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴-1, ADAM 17, 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A, 알파-액티닌 1, 메갈린, 대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II, 액티빈 수용체 유형 IIB 전구체, Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포, 미오신-결합 단백질 C, 또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A 중 하나 이상을 발현하고/하거나; (e) VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 또는 갈렉틴-1을 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비하고/하거나; (f) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 마이크로RNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 또는 miR-296을 발현하고/하거나; (g) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 마이크로RNA miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 또는 miR-16을 발현하고/하거나; (h) miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, 또는 miR-16을 발현하고/하거나; (i) 21% O₂ 하의 CD202b, IL-8 또는 VEGF의 발현에 비해 약 5% O₂ 미만에서 배양될 때 증가된 수준의 CD202b, IL-8 또는 VEGF를 발현한다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고, (a) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9, CD10, CD44, CD54, CD90, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1, 및/또는 VEGFR2/KDR (CD309)를 발현하고/하거나; (b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G 및/또는 VE-카드헤린의 발현이 결핍되거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2의 발현이 결핍되고/되거나; (c) ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1, 및/또는 VEGFR2/KDR에 대한 mRNA를 발현하고/하거나; (d) CD49d, 콘넥신-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴-1, ADAM 17, 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A, 알파-액티닌 1, 메갈린, 대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II, 액티빈 수용체 유형 IIB 전구체, Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포, 미오신-결합 단백질 C, 및/또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A 중 하나 이상을 발현하고/하거나; (e) VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 및/또는 갈렉틴-1을 예를 들어, 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비하고/하거나; (f) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 마이크로RNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 및/또는 miR-296을 발현하고/하거나; (g) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 마이크로RNA miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16을 발현하고/하거나; (h) miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16을 발현하고/하거나; (i) 21% O₂ 하의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF의 발현에 비해 약 5% O₂ 미만에서 배양될 때 증가된 수준의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF를 발현한다. 상기 언급된 특징 중 하나 이상을 갖는 AMDAC를 포함하는 세포의 집단, 예를 들어 AMDAC의 집단을 본원에서 추가로 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 혈관신생 인자를 분비한다. 구체적인 실시양태에서, 세포 집단은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및/또는 인터류킨-8 (IL-8)을 분비한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 양막-유래 혈관신생 세포를 포함하는 세포 집단은 하나 이상의 혈관신생 인자를 분비하여, 인간 내피 세포가 시험관내 상처 치유 검정에서 이동하도록 유도한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단은 인간 내피 세포, 내피 전구체, 근육세포 또는 근육모세포의 성숙, 분화 또는 증식을 유도한다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 예를 들어, 태반 콜라겐 또는 마트리겔™과 같은 기재 상에서 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 콜라겐 유형 I 또는 IV, 및/또는 하나 이상의 혈관신생 인자, 예를 들어, VEGF, EGF, PDGF, 또는 bFGF의 존재 하에 배양될 때 아세틸화된 저밀도 지단백질 (LDL)을 흡수한다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, 상기 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 또는 VE-카드헤린^-이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 또는 VE-카드헤린^-인 양막 유래 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및 VE-카드헤린^-인 양막 유래 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 또는 VE-카드헤린^-인 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 또한 VE-카드헤린^-이다.

양막 유래 부착성 세포를 포함하는, 본원에서 제공되는 세포 집단은 혈관 또는 혈관구조를 닮은 싹 또는 관-유사 구조를 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단은 혈관신생 모이어티 (moiety), 예를 들어, VEGF, EGF, PDGF 또는 bFGF의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성한다. 보다 구체적인 실시양태에서, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 또는 VE-카드헤린^-인 상기 양막 유래 세포는 상기 세포 집단이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 존재 하에 배양될 때 싹 또는 관-유사 구조를 형성한다.

본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 1차 배양액 내에서 또는 줄기 세포의 배양을 위해 적합한 배지 내의 증식 동안 상기 특징, 예를 들어, 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 프로파일, 및/또는 혈관신생 효능 및 기능의 조합을 보인다. 상기 배지는 예를 들어, 1 내지 100% DMEM-LG (깁코 (Gibco)), 1 내지 100% MCDB-201 (시그마 (Sigma)), 1 내지 10% 우태아 혈청 (FCS) (하이클론 래보러토리즈 (Hyclone Laboratories)), 0.1 내지 5x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS, 시그마), 0.1 내지 5x 리놀렌산-소 혈청 알부민 (LA-BSA, 시그마), 10^-5 내지 10^-15 M 덱사메타손 (시그마), 10^-2 내지 10^-10 M 아스코르브산 2-인산염 (시그마), 1 내지 50 ng/mL 표피 성장 인자 (EGF) (R&D 시스템즈 (R&D Systems)), 1 내지 50 ng/mL 혈소판 유래-성장 인자 (PDGF-BB) (R&D 시스템즈), 및 100U 페니실린/1000U 스트렙토마이신을 포함하는 배지를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 배지는 60% DMEM-LG (깁코), 40% MCDB-201 (시그마), 2% 우태아 혈청 (FCS) (하이클론 래보러토리즈), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS), 1x 리놀렌산-소 혈청 알부민 (LA-BSA), 10^-9 M 덱사메타손 (시그마), 10^-4 M 아스코르브산 2-인산염 (시그마), 표피 성장 인자 (EGF) 10 ng/ml (R&D 시스템즈), 혈소판 유래-성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D 시스템즈), 및 100U 페니실린/1000U 스트렙토마이신을 포함한다. 다른 적합한 배지는 아래에 설명되어 있다.

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단은 예를 들어, 용기 내에 약, 적어도 약, 또는 약 1 x 10⁵, 5 x 10⁵, 1 x 10⁶, 5 x 10⁶, 1 x 10⁷, 5 x 10⁷, 1 x 10⁸, 5 x 10⁸, 1 x 10⁹, 5 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 5 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹개 이하 또는 그 초과의 양막 유래 부착성 세포를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 단리된 세포 집단 내의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 양막 유래 부착성 세포이다. 즉, 단리된 양막 유래 부착성 세포 집단은 예를 들어, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 만큼의 비-줄기 세포를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포는 기재 상에서 배양될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 기재는 그 위에서 양막 유래 부착성 세포의 배양 및/또는 선택이 달성될 수 있는 임의의 표면일 수 있다. 일반적으로, 기재는 플라스틱, 예를 들어, 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 생체분자 또는 합성 모방제, 예를 들어, 셀스타트 (CELLSTART)™, 메센컬트 (MESENCULT)™ ACF-기재, 오르니틴, 또는 폴리라이신, 또는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴 등으로 처리, 코팅 또는 각인 (imprinting)될 수 있다.

양막 유래 세포, 예를 들어, 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포, 및 상기 세포의 집단은 하나 이상의 태반으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 양막 유래 세포의 단리된 집단은 파괴된 양막 조직, 예를 들어, 조직 소화물 (즉, 양막의 효소 소화에 의해 얻어진 세포의 수집물 (collection))으로부터 얻거나 그에 함유된 그러한 세포를 포함하는 태반 세포의 집단일 수 있고, 여기서 상기 세포 집단은 양막 유래 세포에 대해 농축되고, 조직은 단일 태반 또는 2개 이상의 태반으로부터의 것이다. 단리된 양막 유래 세포는 상기 세포의 집단을 생성하기 위해 배양 및 팽창될 수 있다. 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 태반 세포의 집단은 또한 양막 유래 부착성 세포의 집단을 생성하기 위해 배양 및 팽창될 수 있다.

특정 실시양태에서, 임의의 상기 마커 및/또는 유전자 발현 특징을 보이는 AMDAC는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 또는 그 초과로 계대배양되었다. 다른 특정 실시양태에서, 임의의 상기 마커 및/또는 유전자 발현 특징을 보이는 AMDAC는 배양액 내에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49회 또는 적어도 50회 또는 그 초과로 배가되었다.

5.2 다른 세포 종류를 포함하는 양막 유래 부착성 세포의 집단

본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단은 제2 세포 종류, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포가 아닌 태반 세포 또는 예를 들어, 태반 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단은 제2 유형의 세포의 집단을 포함할 수 있고, 예를 들어, 그와 조합될 수 있고, 여기서 상기 제2 유형의 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포, 혈액 세포 (예를 들어, 태반 혈액, 태반 혈액 세포, 제대혈, 제대혈 세포, 말초 혈액, 말초 혈액 세포; 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 유핵 세포 등), 혈액으로부터 단리된 줄기 세포 (예를 들어, 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 단리된 줄기 세포), 태반 줄기 세포 (예를 들어, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 7,468,276 및 미국 특허 출원 공개 2007/0275362에 기재된 태반 줄기 세포), 태반 관류액으로부터의 유핵 세포, 예를 들어, 태반 관류액으로부터의 총 유핵 세포; 탯줄 줄기 세포, 혈액-유래 유핵 세포, 골수-유래 중간엽 기질 세포, 골수-유래 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 조혈 줄기 세포, 조질 골수, 성체 (신체) 줄기 세포의 집단, 조직, 배양된 세포, 예를 들어, 배양된 줄기 세포 내에 함유된 줄기 세포의 집단, 완전 분화된 세포 (예를 들어, 연골세포, 섬유모세포, 양막 세포, 골모세포, 근육 세포, 심장 세포 등), 혈관주위세포의 집단 등이다. 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단은 태반 줄기 세포 또는 탯줄로부터 줄기 세포를 포함한다. 제2 유형의 세포가 혈액 또는 혈액 세포인 특정 실시양태에서, 적혈구는 세포 집단으로부터 제거된다.

구체적인 실시양태에서, 제2 유형의 세포는 조혈 줄기 세포이다. 그러한 조혈 줄기 세포는 예를 들어, 비가공된 태반, 제대혈 또는 말초 혈액 내에; 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 총 유핵 세포 내에; 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 CD34⁺ 세포의 단리된 집단 내에; 비가공된 골수 내에; 골수로부터 총 유핵 세포 내에; 골수로부터 CD34⁺ 세포의 단리된 집단 내에 등에 함유될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단은 혈관계로부터의 많은 성체 또는 전구 세포와 조합된다. 다양한 실시양태에서, 세포는 내피 세포, 내피 전구 세포, 근육세포, 심근세포, 혈관주위세포, 혈관모세포, 근육모세포 또는 심근모세포이다.

또 다른 실시양태에서, 제2 세포 종류는 배아 줄기 세포와 연관된 만능성 (pluripotency) 및 기능의 마커를 발현하도록 배양액 내에서 조작되는 비-배아 세포 종류이다.

양막 유래 부착성 세포의 상기 단리된 집단의 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포 및 제2 유형의 세포 중 하나 또는 둘 모두는 세포의 의도된 수여체에 대해 자가성 또는 동종이형이다.

양막 유래 부착성 세포 및 양막 유래 부착성 세포 이외의 많은 줄기 세포를 포함하는 조성물을 본원에서 추가로 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 조성물은 태반으로부터 얻어진 줄기 세포, 즉, 태반 줄기 세포, 예를 들어 각각 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 7,045,148; 7,255,879; 및 7,311,905, 및 미국 특허 출원 공개 2007/0275362에 기재된 태반 줄기 세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200⁺ 및 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺; CD200⁺ 및 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺; CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단 내에서, 상기 집단이 배아양 (embryoid)-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양될 때 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 OCT-4⁺이고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단 내에서, 상기 집단이 배아양-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양될 때 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 이들의 임의의 조합이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺ 줄기 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^- 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺ 줄기 세포는 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD73⁺ 및 CD105⁺ 줄기 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 OCT-4⁺ 줄기 세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 모체에서 기원한다 (즉, 모체 유전자형을 갖는다). 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태아에서 기원한다 (즉, 태아 유전자형을 갖는다).

또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 양막 유래 부착성 세포 및 배아 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 양막 유래 부착성 세포 및 중간엽 간질 (stromal) 또는 줄기 세포, 예를 들어, 골수-유래 중간엽 간질 또는 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 골수-유래 조혈 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 양막 유래 부착성 세포 및 조혈 전구 세포, 예를 들어, 골수, 태아 혈액, 제대혈, 태반 혈액, 및/또는 말초 혈액으로부터 조혈 전구 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 양막 유래 부착성 세포 및 신체 줄기 세포를 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 신체 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 근육 줄기 세포이다.

다른 구체적인 실시양태에서, 제2 유형의 세포는 상기 집단 내의 세포의 약, 적어도, 또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하를 구성한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 조성물 내의 AMDAC는 상기 조성물 내의 세포의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%를 구성한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 상기 집단 내의 세포의 약, 적어도, 또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45% 이하를 구성한다.

양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단 내의 세포는 또 다른 종류의 많은 세포, 예를 들어 줄기 세포의 집단과, 각각의 집단 내의 총 유핵 세포의 수를 비교하여 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; 또는 약 1:100,000,000의 비로 조합될 수 있다. 양막 유래 부착성 세포의 단리된 집단 내의 세포는 많은 세포 종류의 많은 세포와 또한 조합될 수 있다.

5.3 배양액 내에서 성장

임의의 포유동물 세포에 대해, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포의 성장은 부분적으로 성장을 위해 선택된 특정 배지에 의해 좌우된다. 최적 조건 하에, 양막 유래 부착성 세포는 일반적으로 약 24시간 내에 수가 배가한다. 배양하는 동안, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 배양액 내의 기재, 예를 들어, 조직 배양 용기 (예를 들어, 조직 배양 접시 플라스틱, 피브로넥틴-코팅 플라스틱 등)의 표면에 부착하고 단층 (monolayer)을 형성한다. 일반적으로, 세포는 배양액 내에서 양막의 소화 후 2-7일 이내에 확립된다. 세포는 매일 약 0.4 내지 1.2 집단 배가로 증식하고, 적어도 30 내지 50 집단 배가를 겪을 수 있다. 세포는 합류 미만 (subconfluence) 및 팽창 동안 중간엽/섬유모세포성 세포-유사 표현형을 보이고, 합류 시에 입방체/조약돌-유사 외관을 보이고, 배양액 내의 증식은 강하게 접촉-억제된다. 양막-유래 혈관신생 세포의 집단은 배양액 내에서 팽창 동안 배아양체를 형성할 수 있다.

5.4 양막-유래 혈관신생 세포의 수득 방법

양막 유래 부착성 세포, 및 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포의 집단은은 예를 들어, 양막 조직의 특정 소화 방법을 통해 다른 세포 또는 세포 집단으로부터 생산, 예를 들어, 단리할 수 있고, 임의로 이어서 양막 유래 부착성 세포의 특징적인 마커 또는 마커의 조합의 존재 또는 부재에 대해 생성되는 세포 또는 세포 집단을 평가하거나, 양막 세포를 얻고, 양막 유래 부착성 세포의 특징적인 마커에 기초하여 선택한다.

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포, 및 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단은 예를 들어, 양막 조직의 소화에 이어 부착성 세포에 대한 선택에 의해 생산할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 예를 들어, 단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단은 (1) 제1 효소로 양막 조직을 소화시켜 양막의 중간엽층의 세포로부터 양막의 상피층의 세포를 해리시키고; (2) 후속적으로 제2 효소로 양막의 중간엽층을 소화시켜 단일-세포 현탁액을 형성하고; (3) 상기 단일-세포 현탁액 내의 세포를 조직 배양 표면, 예를 들어, 조직 배양 플라스틱 상에서 배양하고; (4) 배지의 교체 후에 상기 표면에 부착하는 세포를 선택하여, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 생산함으로써 생산할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상기 제1 효소는 트립신이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 트립신은 소화시킬 양막 조직 1 g당 5-20, 예를 들어, 10 ml 용액 내에 0.25% 트립신 (w/v)의 농도로 사용된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 트립신을 사용한 상기 소화는 37℃에서 약 15분 동안 진행되고 3회까지 반복된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 효소는 콜라게나제이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 콜라게나제는 소화시킬 양막 조직 1 g당 5 mL 내에 50 내지 500 U/L의 농도로 사용된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 콜라게나제를 사용한 상기 소화는 37℃에서 약 45-60분 동안 진행된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 콜라게나제를 사용한 소화 후에 형성된 단일-세포 현탁액은 단계 (2)와 단계 (3) 사이에 예를 들어, 75 ㎛ - 150 ㎛ 필터를 통해 여과된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 제1 효소는 트립신이고, 상기 제2 효소는 콜라게나제이다.

또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 단리된 세포 집단은 양막으로부터 양막 유래 부착성 세포의 하나 이상의 특징을 보이는 세포, 예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같이 양막 조직을 소화시킴으로써 수득되는 세포를 선택함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 세포 집단은 (a) RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4에 대해 음성이고, (b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 중 하나 이상에 대해 양성인 양막 세포를 선택하고; 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 세포는 추가로 VE-카드헤린^-이다. 구체적인 실시양태에서, 세포 집단은 (a) RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4에 대해 음성이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린에 대해 음성이고, (b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200의 각각에 대해 양성인 태반 세포를 선택하고; 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성함으로써 생산된다. 특정 실시양태에서, 면역학적 위치 결정에 의한 선택은 RT-PCR에 의한 선택 전에 수행된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선택은 1 내지 100 ng/mL VEGF의 존재 하에 4 내지 21일 동안 배양 후에 세포 마커 CD34를 발현하지 않는 세포를 선택하는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 세포 집단은 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ 및 VEGFR2/KDR⁺인 양막 세포를 선택하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 구체적인 실시양태에서, 세포 집단은 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺, VEGFR2/KDR⁺ 및 HLA-G^-인 양막 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및/또는 CXCR4^- (케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4) 중 하나 이상 또는 전부인 양막 세포를 선택하고, 상기 세포를 이들 특징 중 하나 이상을 보이지 않는 세포로부터 단리함으로써 생산된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^-인 양막 세포를 선택하고, 상기 세포를 VE-카드헤린⁺인 세포로부터 단리함으로써 생산된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD105⁺ 및 CD200⁺인 양막 세포를 선택하고, 상기 세포를 CD105^- 또는 CD200^-인 세포로부터 단리함으로써 생산된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 1 내지 100 ng/mL VEGF에 4 내지 21일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는다.

세포의 선택에서, 양막 유래 부착성 세포에 특이적인 특징에 대해 전체 세포 집단을 시험하는 것을 필요하지 않다. 대신에, 세포 집단의 세포의 하나 이상의 분취액 (예를 들어, 약 0.5% - 2%)를 상기 특징에 대해 시험할 수 있고, 그 결과는 집단 내의 나머지 세포에 귀속될 수 있다.

선택된 세포는 세포 (예를 들어, 약 10⁴ 내지 약 10⁵개의 세포)의 샘플을 기재, 예를 들어, 마트리겔™ 상에서 4 내지 14일, 예를 들어, 7일 동안 VEGF (예를 들어, 약 50 ng/mL)의 존재하에 배양하고, 세포를 싹 및/또는 세포성 네트워크 (network)의 외관에 대해 시각적으로 검사함으로써 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포인 것으로 확인될 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 세포 선택 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 상기 마커에 의해 선택할 수 있다. 예를 들어, 부착성 세포는 예를 들어, 면역학적 위치 결정, 예를 들어, 유동 세포측정 또는 FACS에서 하나 이상의 세포 표면 마커에 대한 항체(들)를 이용하여 선택할 수 있다. 선택은 항체를 자기 비드 (bead)와 함께 사용하여 달성할 수 있다. 특정 마커에 특이적인 항체는 당업계에 공지되어있고, 예를 들어, CD9 (에이빔 (Abeam)); CD54 (에이빔); CD105 (에이빔; 바이오디자인 인터내셔널 (BioDesign International, 미국 메인주 사코) 등); CD200 (에이빔) 사이토케라틴 (시그마알드리치 (SigmaAldrich))에 대한 항체가 상업적으로 이용가능하다. 다른 마커에 대한 항체도 또한 상업적으로 이용가능하고, 예를 들어, CD34, CD38 및 CD45에 대항 항체는 예를 들어, 스템셀 테크놀로지스 (StemCell Technologies) 또는 바이오디자인 인터내셔널로부터 입수가능하다. RT-PCR에 대해 적합한 OCT-4 서열에 대한 프라이머는 예를 들어, 밀리포어 (Millipore) 또는 인비트로겐 (Invitrogen)으로부터 상업적으로 입수할 수 있거나, GenBank 기탁 번호 DQ486513의 인간 서열로부터 쉽게 유도될 수 있다.

태반 및 양막 조직을 얻고, 양막 유래 부착성 세포를 얻기 위해 상기 조직을 처리하는 방법에 대한 상세한 내용은 아래에 제공되어 있다.

5.4.1 세포 수집 조성물

일반적으로, 세포는 생리학상 허용되는 용액, 예를 들어, 세포 수집 조성물을 사용하여 포유동물 태반, 예를 들어, 인간 태반으로부터의 양막으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 세포 수집 조성물은 세포자멸을 방지 또는 억제하고, 세포 사멸, 용해, 분해 등을 방지 또는 억제한다. 세포 수집 조성물은 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 관련 미국 특허 출원 공개 2007/0190042 (명칭 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs")에 상세히 기재되어 있다.

세포 수집 조성물은 양막 유래 부착성 세포의 수집 및/또는 배양에 적합한 임의의 생리학상 허용되는 용액, 예를 들어, 염수 용액 (예를 들어, 인산염-완충 염수, 크렙 (Kreb) 용액, 변형 크렙 용액, 이글 (Eagle) 용액, 0.9% NaCl 등), 완충 성분, 예를 들어, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES)을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양 배지 (예를 들어, DMEM, H.DMEM 등) 등을 포함할 수 있다.

세포 수집 조성물은 수집 시간에서 배양 시간까지 세포, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포를 보존하는, 즉, 세포가 죽는 것을 방지하거나, 세포의 사멸을 지연시키거나, 세포 집단 내의 죽는 세포의 수를 감소시키는 경향이 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 그러한 성분은 예를 들어, 세포자멸 억제제 (예를 들어, 카스파제 억제제 또는 JNK 억제제); 혈관확장제 (예를 들어, 황산마그네슘, 항고혈압약, 심방 나트륨뇨 펩티드 (ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 나트륨 니트로프루시드, 히드랄라진, 아데노신 삼인산염, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 포스포디에스테라제 억제제 등); 괴사 억제제 (예를 들어, 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 또는 클로나제팜); TNF-α 억제제; 및/또는 산소-운반 과불화탄소 (예를 들어, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데실 브로마이드 등)일 수 있다.

세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-분해 효소, 예를 들어, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 중성 프로테아제, RNase, 또는 DNase 등을 포함할 수 있다. 상기 효소는 콜라게나제 (예를 들어, 콜라게나제 I, II, III 또는 IV, 클로스트리듐 히스톨리쿰 (Clostridium histolyticum)으로부터의 콜라게나제 등); 디스파제, 테르몰리신, 엘라스타제, 트립신, 리버라제 (LIBERASE)™, 히알루로니다제 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 조직-소화 효소를 포함하는 세포 수집 조성물의 용도는 아래에서 보다 상세히 논의된다.

세포 수집 조성물은 살균 또는 정균 유효량의 항생제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 특정 실시양태에서, 항생제는 마크롤라이드 (예를 들어, 토브라마이신), 세팔로스포린 (예를 들어, 세팔렉신, 세프라딘, 세푸록심, 세프프로질, 세파클로르, 세픽심 또는 세파드록실), 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 페니실린 (예를 들어, 페니실린 V) 또는 퀴놀론 (예를 들어, 오플록사신, 시프로플록사신 또는 노르플록사신), 테트라사이클린, 스트렙토마이신 등이다. 특정 실시양태에서, 항생제는 그람 (Gram)(+) 및/또는 그람(-) 세균, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등에 대해 활성을 보인다.

또한, 세포 수집 조성물은 하나 이상의 다음 화합물을 포함할 수 있다: 아데노신 (약 1 mM 내지 약 50 mM); D-글루코스 (약 20 mM 내지 약 100 mM); 마그네슘 이온 (약 1 mM 내지 약 50 mM); 하나의 실시양태에서 내피 완전성 및 세포 생존력 유지에 충분한 양으로 존재하는 분자량이 20,000 달톤을 초과하는 거대분자 (예를 들어, 약 25 g/l 내지 약 100 g/l, 또는 약 40 g/l 내지 약 60 g/l로 존재하는 합성 또는 천연 생성 콜로이드, 다당류, 예컨대 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜); 항산화제 (예를 들어, 약 25 μM 내지 약 100 μM로 존재하는 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E); 환원제 (예를 들어, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM로 존재하는 N-아세틸시스테인); 세포 내로 칼슘의 도입을 억제하는 물질 (예를 들어, 약 2 μM 내지 약 25 μM로 존재하는 베라파밀); 니트로글리세린 (예를 들어, 약 0.05 g/L 내지 약 0.2 g/L); 하나의 실시양태에서 잔류 혈액의 응고 억제를 돕기에 충분한 양으로 존재하는 항응고제 (예를 들어, 약 1000 단위/l 내지 약 100,000 단위/l의 농도로 존재하는 헤파린 또는 히루딘); 또는 아밀로라이드 함유 화합물 (예를 들어, 약 1.0 μM 내지 약 5 μM로 존재하는 아밀로라이드, 에틸 이소프로필 아밀로라이드, 헥사메틸렌 아밀로라이드, 디메틸 아밀로라이드 또는 이소부틸 아밀로라이드).

본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 또한 예를 들어 아래에서 설명되는 바와 같이 소화 동안 및 후에 간단한 생리학상 허용되는 버퍼, 예를 들어, 인산염-완충 염수, 0.9% NaCl 용액, 세포 배양 배지 등 내로 수집될 수 있다.

5.4.2 태반의 수집 및 취급

일반적으로, 인간 태반은 출산 후에 또는 예를 들어 제왕절개 후에 그의 만출 직후에 회수된다. 바람직한 실시양태에서, 태반은 고지에 의한 동의 (informed consent) 후에 및 환자의 전체 의료력을 얻고 태반과 연관시킨 후에 환자로부터 회수한다. 바람직하게는, 의료력은 분만 후 계속된다. 그러한 의료력은 태반 또는 그로부터 수거한 세포의 후속적인 사용을 조화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 태반 세포, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포는 의료력의 면에서, 태반과 연관된 유아 또는 가까운 친척을 위한, 또는 유아의 부모, 형제자매, 또는 다른 친척을 위한 맞춤형 의학 (personalized medicine)을 위해 사용될 수 있다.

양막 유래 부착성 세포의 회수 전에, 제대혈 및 태반 혈액을 제거한다. 특정 실시양태에서, 분만 후에, 태반 내의 제대혈을 회수한다. 태반은 통상적인 제대혈 회수 과정으로 처리할 수 있다. 일반적으로, 태반을 방혈시키기 위해 바늘 또는 삽입관 (cannula)이 중력의 도움 하에 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 5,372,581 (Anderson); 미국 특허 5,415,665 (Hessel et al.) 참조). 바늘 또는 삽입관은 대체로 제대 정맥 내에 놓이고, 태반으로부터 제대혈을 배수시키는 것을 돕기 위해 태반을 부드럽게 마사지할 수 있다. 그러한 제대혈 회수는 상업적으로 수행될 수 있다 (예를 들어, 라이프뱅크 유에스에이 (LifeBank USA, 미국 뉴저지주 시더 놀스), 비아코드 (ViaCord), 코드 블러드 리지스트리 (Cord Blood Registry) 및 크리요셀 (Cryocell)). 바람직하게는, 태반은 제대혈 회수 동안 조직 파괴를 최소화하기 위해 추가의 조작 없이 중력에 의해 배수된다.

일반적으로, 제대혈의 회수 및 예를 들어, 관류 또는 조직 해리에 의한 세포의 수집을 위해 태반은 분만실로부터 다른 위치, 예를 들어, 실험실로 수송된다. 태반은 바람직하게는 예를 들어, 태반을 클램핑한 (clamped) 근위부 탯줄과 함께 멸균 집록식 (zip-lock) 플라스틱 백에 넣은 후 이를 절연 용기에 넣음으로써 멸균 단열 수송 장치 (태반 온도를 20-28℃로 유지하는) 내에서 수송한다. 또 다른 실시양태에서, 태반은 실질적으로 미국 특허 7,147,626에 기재된 바와 같이 제대혈 수집 키트 내에서 수송된다. 바람직하게는, 태반은 분만 후 4 내지 24시간에 실험실로 전달된다. 특정 실시양태에서, 근위부 탯줄은 바람직하게는 제대혈 회수 전에 태반 내로 삽입부의 4-5 cm 이내에 클램핑된다. 다른 실시양태에서, 근위부 탯줄은 제대혈 회수 후에 그러나 태반의 추가의 처리 전에 클램핑된다.

세포 수집 전에 태반은 멸균 조건 하에 및 예를 들어, 4 내지 25℃ (섭씨)의 온도에서, 예를 들어, 실온에서 저장될 수 있다. 태반은 임의의 잔류하는 제대혈을 제거하기 위해 태반을 관류시키기 전에 예를 들어, 0 내지 24시간 동안, 48시간 까지, 또는 48시간 초과 동안 저장될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 태반은 만출 후 약 0시간 내지 약 2시간 사이에 수거된다. 태반은 항응고제 용액 내에 예를 들어, 4 내지 25℃ (섭씨)의 온도에서 저장될 수 있다. 적합한 항응고제 용액은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 시트르산나트륨, 헤파린 또는 와파린 나트륨의 용액이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항응고제 용액은 헤파린의 용액 (예를 들어, 1:1000 용액 중 1% w/w)을 포함한다. 방혈시킨 태반은 바람직하게는 세포를 수집하기 전에 36시간 이내 동안 저장된다.

5.4.3 양막 조직의 물리적 파괴 및 효소에 의한 소화

하나의 실시양태에서, 예를 들어, 양막은 예를 들어, 손가락을 이용하는 무단 박리 (blunt dissection)에 의해 나머지 태반으로부터 분리된다. 양막은 효소에 의한 소화 및 부착성 세포 회수 전에 예를 들어, 부분 또는 조직 절편으로 박리될 수 있다. 양막 유래 부착성 세포는 전체 양막으로부터, 또는 양막의 작은 절편, 예를 들어, 면적 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 제곱밀리미터의 양막 절편으로부터 얻을 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 일반적으로 태반 양막 또는 그의 일부로부터, 만출 후 약 처음 3일 이내의 임의의 시간에, 그러나 바람직하게는 만출 후 약 0시간 내지 48시간에 또는 만출 후 약 8시간 내지 약 18시간에 수집할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 하나 이상의 조직-소화 효소를 이용한 효소에 의한 소화에 의해 양막 조직으로부터 추출된다. 양막 또는 그의 일부는 예를 들어, 상기 설명된 바와 같이 세포 수집 조성물에 용해되거나 그에 혼합된 하나 이상의 효소를 사용하여 소화될 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-파괴 효소(들)을 포함한다. 효소에 의한 소화는 바람직하게는 예를 들어, 순차적인 순서로 사용되는 효소의 조합물, 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 중성 프로테아제의 조합물, 예를 들어, 디스파제 및 콜라게나제의 조합물을 사용한다. 1종 초과의 프로테아제가 사용될 때, 프로테아제는 양막 조직을 소화시키기 위해 동시에 사용될 수 있거나, 연속적으로 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 예를 들어, 양막 조직을 트립신으로 3회 및 콜라게나제로 1회 소화시킨다.

하나의 실시양태에서, 양막 조직은 매트릭스 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 점액 용해 효소 중 하나 이상을 사용하여 효소에 의해 소화시킨다. 구체적인 실시양태에서, 양막 조직은 콜라게나제, 디스파제 및 히알루로니다제의 조합물로 소화시킨다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 양막 조직은 리버라제™ (뵈링거 만하임 코퍼레이션 (Boehringer Mannheim Corp., 미국 인디애나주 인디애나폴리스)) 및 히알루로니다제의 조합물로 소화시킨다. 양막 조직을 파괴하기 위해 사용될 수 있는 다른 효소는 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예를 들어 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제를 포함한다. 세린 프로테아제는 혈청 내의 알파 2 마이크로글로불린에 의해 억제될 수 있고, 따라서 특정 실시양태에서 소화를 위해 사용되는 배지는 혈청을 함유하지 않을 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 예를 들어, 세포 회수의 효율을 증가시키기 위해 양막 조직의 소화에서 EDTA 및 DNase를 사용한다. 다른 특정 실시양태에서, 점성 소화액 내에 세포가 포획되는 것을 피하기 위해 소화물을 희석시킨다.

조직 소화 효소에 대한 일반적인 농도는 예를 들어, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 IV에 대해 50-200 U/mL, 디스파제에 대해 1-10 U/mL, 및 엘라스타제에 대해 10-100 U/mL을 포함한다. 프로테아제는 조합물로, 즉, 동일한 소화 반응에서 2개 이상의 프로테아제가 사용될 수 있거나, 양막 유래 부착성 세포를 단리하기 위해 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 양막 조직 또는 그의 일부를 먼저 적절한 양의 트립신으로 약 0.25%의 농도에서 예를 들어, 15분 동안 37℃에서, 이어서 콜라게나제 I로 약 1 내지 약 2 mg/ml에서 예를 들어, 45분 동안 소화시킨다.

하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 다음과 같이 얻을 수 있다. 양막을 약 0.1" x 0.1" 내지 약 5" x 5", 예를 들어, 2" x 2" 크기의 절편으로 절단한다. 다음과 같이 삼중 트립신 처리에 의해 양막의 태아측으로부터 상피 단층을 제거한다. 양막의 절편을 가온 (예를 들어, 약 20℃ 내지 약 37℃) 트립신-EDTA 용액 (0.25%)이 있는 용기에 넣는다. 트립신의 부피는 약 5 mL/g (양막) 내지 약 50 mL/g (양막)일 수 있다. 온도를 일정하게 유지하면서, 용기를 약 5분 내지 약 30분, 예를 들어, 15분 동안 교반한다. 이어서, 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어 양막 절편을 수동으로 제거함으로써 또는 여과에 의해 양막의 절편을 트립신 용액으로부터 분리한다. 트립신 처리 단계를 적어도 1회 더 반복할 수 있다.

최종 트립신 처리의 완료 시에, 양막의 절편을 가온 트립신 중화 용액, 예를 들어 인산염-완충 염수 (PBS)/10% FBS, PBS/5% FBS 또는 PBS/3% FBS로 채운 용기 내로 다시 넣는다. 용기를 약 5초 내지 약 30분, 예를 들어, 5분 동안 교반한다. 이어서, 양막의 절편을 상기한 바와 같이 트립신 중화 용액으로부터 분리하고, 양막의 절편을 가온 PBS (pH 7.2)로 채운 용기에 넣는다. 용기를 약 5초 내지 약 30분 동안 교반한 후, 양막 절편을 상기한 바와 같이 PBS로부터 분리한다.

이어서, 양막의 절편을 가온 (예를 들어, 약 20℃ 내지 약 37℃) 소화 용액으로 채원 용기에 넣는다. 소화 용액의 부피는 약 5 mL/g (양막) 내지 약 50 mL/g (양막)일 수 있다. 소화 용액은 적절한 배양 배지, 예를 들어 DMEM 내에 소화 효소를 포함한다. 일반적인 소화 용액은 콜라게나제 유형 I (약 50 U/mL 내지 약 500 U/mL); 콜라게나제 유형 I (약 50 U/mL 내지 약 500 U/mL) + 디스파제 (약 5 U/mL 내지 약 100 U/mL); 및 콜라게나제 유형 I (약 50 U/mL 내지 약 500 U/mL), 디스파제 (약 2 U/mL 내지 약 50 U/mL) 및 히알루로니다제 (약 3 U/mL 내지 약 10 U/ mL)를 포함한다. 용기를 37℃에서 양막 소화가 실질적으로 완료될 때까지 (약 10분 내지 약 90분) 교반한다. 이어서, 가온 PBS/5% FBS를 용기에 약 1 mL/g (양막 조직) 내지 약 50 mL/g (양막 조직)의 비로 첨가한다. 용기를 약 2분 내지 약 5분 동안 교반한다. 이어서, 40 ㎛ 내지 100 ㎛ 필터를 사용하여 세포 현탁액을 여과하여 임의의 소화되지 않은 조직을 제거한다. 세포를 가온 PBS (약 1 mL 내지 약 500 mL) 내에 현탁시킨 후, 20℃에서 200 x g 내지 약 400 x g에서 약 5분 내지 약 30분 동안, 예를 들어 300 x g에서 약 15분 동안 원심분리한다. 원심분리 후에, 상등액을 제거하고, 세포를 적합한 배양 배지 내에 재현탁시킨다. 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 세포 현탁액을 여과하여 (40 ㎛ 내지 70 ㎛ 필터), 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있다.

상기 실시양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같이 현탁액 내의 세포를 수집하고 배양하여, 단리된 양막 유래 부착성 세포 및 상기 세포의 집단을 생성한다. 상기 실시양태에서, 남아있는 소화되지 않은 양막은 폐기될 수 있다. 예를 들어, 양막 조직으로부터 방출된 세포는 예를 들어, 원심분리에 의해 수집되고, 표준 세포 배양 배지 내에서 배양될 수 있다.

임의의 본원의 소화 프로토콜에서, 소화에 의해 얻어진 세포 현탁액은 예를 들어, 약 50 ㎛ 내지 약 150 ㎛, 예를 들어, 약 75 ㎛ 내지 약 125 ㎛의 공극을 갖는 필터를 통해 여과할 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 세포 현탁액은 2개 이상의 필터, 예를 들어, 125 ㎛ 필터 및 75 ㎛ 필터를 사용하여 여과할 수 있다.

본원에서 설명되는 임의의 방법과 함께, 상기 섹션 5.1에 설명된 바와 같이 AMDAC의 하나 이상의 특징을 보이는 세포를 선택함으로써 소화 동안 방출된 세포로부터 AMDAC를 단리할 수 있다.

예를 들어, AMDAC는 또한 트립신을 사용한 소화에 이어 콜라게나제를 사용한 소화를 포함하는 특이적인 2-단계 단리 방법을 이용하여 단리할 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 양막 또는 그의 일부를 트립신으로 소화시켜 상피 세포를 상기 양막으로부터 방출시키고; 양막 또는 그의 일부를 상기 상피 세포로부터 제거하고; 양막 또는 그의 일부를 콜라게나제로 추가로 소화시켜 양막 유래 부착성 세포를 상기 양막 또는 그의 일부로부터 방출시키고; 상기 양막 유래 부착성 세포를 상기 양막으로부터 분리시키는 것을 포함하는, 양막 유래 부착성 세포의 단리 방법을 본원에서 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 양막 또는 그의 일부의 소화를 적어도 1회 반복한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 콜라게나제를 사용하는 양막 또는 그의 일부의 소화를 적어도 1회 반복한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 트립신은 약 0.1%-1.0% (최종 농도)이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 트립신은 약 0.25% (최종 농도)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 콜라게나제는 약 50 U/mL 내지 약 1000 U/mL (최종 농도)이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 콜라게나제는 약 125 U/mL (최종 농도)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리 방법은 상기 양막 유래 부착성 세포를 세포 배양액 내에서 배양하고, 상기 양막 유래 부착성 세포를 상기 배양액 내에서 비-부착성 세포로부터 분리하여 양막 유래 부착성 세포의 농축된 집단을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포의 농축된 집단 내의 세포의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 상기 양막 유래 부착성 세포이다.

상기 방법의 보다 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4에 대해 음성이고, 유동 세포측정에 의해 결정할 때 HLA-G⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^- 중 하나 이상이다.

5.4.4 양막 유래 부착성 세포의 단리, 분류, 및 특성 결정

세포 펠렛을 상기 설명된 바와 같은 신선한 세포 수집 조성물, 또는 세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어, 둘베코 (Dulbecco) 변형 이글 배지 (DMEM); 이스코브 (Iscove) 변형 둘베코 배지 (IMDM), 예를 들어 2U/mL 헤파린 및 2 mM EDTA (깁코비알엘 (GibcoBRL, 미국 뉴욕주))를 함유하는 IMDM 무혈청 배지; FBS (예를 들어 2% v/v)를 함유하는 버퍼 (예를 들어 PBS, HBSS)의 혼합물 등 내에 재현탁시킬 수 있다.

예를 들어, 피브로넥틴과 같은 추가의 세포외 매트릭스 코팅을 갖거나 갖지 않는 표면, 예를 들어, 조직 배양 플라스틱 상에서 배양한 양막 유래 부착성 세포를 계대배양하거나 차별적인 부착에 의해 단리할 수 있다. 예를 들어, 상기 섹션 5.4.3에 설명된 바와 같이 수행된 양막 조직의 콜라게나제 소화로부터 얻어진 세포 현탁액을 예를 들어, 3-7일 동안 조직 배양 플라스틱 상에서 배양 배지 내에서 배양할 수 있다. 배양 동안, 현탁액 내의 많은 세포는 배양 표면에 부착하고, 계속된 배양 후에 양막 유래 부착성 세포를 발생시킨다. 양막 유래 부착성 세포를 발생시키지 않는 비-부착성 세포는 배지 교환 동안 제거된다.

양막으로부터 수집된 세포의 수 및 종류는 예를 들어, 표준 세포 검출 기술, 예를 들어 면역학적 위치 결정, 예를 들어, 유동 세포측정, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어, 조직 특이적 또는 세포-마커 특이적 항체를 사용한 염색), 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)를 이용하여 형태 및 세포 표면 마커의 변화를 측정함으로써, 광학 또는 공초점 현미경을 이용하는 세포의 형태의 검사에 의해, 및/또는 당업계에 잘 공지된 기술, 예를 들어 PCR 및 유전자 발현 프로파일링을 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이들 기술은 하나 이상의 특정 마커에 대해 양성인 세포를 확인하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, CD34에 대한 하나 이상의 항체를 사용하여, 상기 기술을 이용하여 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는지 결정할 수 있고; 그러한 경우, 세포는 CD34⁺이다.

양막-유래 세포, 예를 들어, 피콜 (Ficoll) 분리, 차별적인 부착, 또는 둘의 조합에 의해 단리된 세포는 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 분류될 수 있다. 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 특성에 기초하여 세포를 비롯한 입자를 분리하기 위한 잘 공지된 방법이다 (예를 들어, [Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165] 참조). 개별 입자 내의 형광 모이어티의 레이저 여기는 혼합물로부터 양성 및 음성 입자의 전자기 분리를 허용하는 작은 전하를 생성한다. 하나의 실시양태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드를 구분된 형광 표지로 표지한다. 세포를 세포 분류기를 통해 처리하여, 사용된 항체에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 세포를 분리시킨다. FACS 분류된 입자는 분리 및 클로닝을 용이하게 하기 위해 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰로 직접 침착될 수 있다.

하나의 분류 계획에서, 태반으로부터의 세포, 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포는 마커 CD49f, VEGFR2/KDR, 및/또는 FIt-1/VEGFR1의 발현에 기초하여 분류될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 예를 들어, 세포의 샘플에서 RT-PCR에 의한 OCT-4의 발현을 결정함으로써 OCT-4^-인 것으로 확인되고, 여기서 샘플 내의 세포가 30 사이클 후에 OCT-4에 대한 mRNA의 검출가능한 생산을 보이지 못하면 세포는 OCT-4^-이다. 예를 들어, VEGFR2/KDR⁺ 및 VEGFR1/Flt-1⁺인 양막으로부터의 세포는 VEGFR2/KDR^- 및 VEGFR1/Flt-1⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및/또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상인 세포로부터 분류될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CD49f⁺, VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및/또는 VE-카드헤린^- 중 하나 이상인 양막-유래, 조직 배양 플라스틱-부착성 세포, 또는 VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및 VE-카드헤린^-인 세포는 하나 이상의 그러한 마커(들)을 발현하지 않는 세포로부터 분류되고 선택된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 추가로 CD31⁺, CD34⁺, CD45⁺, CD133^- 및/또는 Tie-2⁺ 중 하나 이상 또는 전부인 CD49f⁺, VEGFR2/KDR⁺, VEGFR1/Flt-1⁺ 세포는 하나 이상 또는 임의의 상기 특징을 보이지 않는 세포로부터 분류된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 추가로 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺, TEM-7⁺, CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및/또는 CXCR4^- 중 하나 이상 또는 전부인 VEGFR2/KDR⁺, VEGFR1/Flt-1⁺ 세포는 하나 이상 또는 임의의 상기 특징을 보이지 않는 세포로부터 분류된다.

양막 유래 부착성 세포에 대한 선택은 소화로부터 생성되는 세포 현탁액, 또는 예를 들어, 원심분리 또는 유동 세포측정을 이용한 분리에 의해 소화물로부터 수집된 단리된 세포에 대해 수행할 수 있다. 발현된 마커에 의한 선택은 단독으로, 또는 예를 들어, 배양액 내에서 그들의 부착 특성에 기초하여 세포를 선택하기 위한 절차와 함께 달성할 수 있다. 예를 들어, 부착성 선택은 마커 발현에 기초하여 분류 전에 또는 분류 후에 달성할 수 있다.

태반 세포의 항체-매개 검출 및 분류에 관하여, 특정 마커에 대해 특이적인 임의의 항체를 세포의 검출 및 분류 (예를 들어, 형광-활성화 세포 분류)를 위해 적합한 임의의 형광단 또는 다른 표지와 함께 사용할 수 있다. 특이적인 마커에 대한 항체/형광단 조합물은 CD105에 대한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 접합된 모노클로날 항체 (R&D 시스템즈 인크 (R&D Systems Inc., 미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 입수가능함); CD200에 대한 피코에리트린 (PE) 접합된 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시즈 파밍엔 (BD Biosciences Pharmingen)); VEGFR2/KDR-비오틴 (CD309, 압캠 (Abcam)) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본원에 개시되는 임의의 마커에 대한 항체는 항체의 검출을 용이하게 하는 항체에 대한 임의의 표준 표지, 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 아세틸콜린에스테라제 스트렙타비딘/비오틴, 아비딘/비오틴, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린 (PE), 루미놀, 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린으로 표지될 수 있고, 적합한 방사성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

양막 유래 부착성 세포는 단일 마커에 대한 항체로 표지되고, 단일 마커에 기초하여 검출 및 분류될 수 있거나, 많은 상이한 마커에 대한 다수의 항체로 동시에 표지되고 복수의 마커에 기초하여 분류될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 세포를 분리하기 위해, 예를 들어, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 다른 양막 세포로부터 분리하기 위해 자기 비드를 사용할 수 있다. 세포는 자기 활성화된 세포 분류 (MACS) 기술 (입자를 자기 비드 (0.5-100 ㎛ 직경)에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 분리시키는 방법)을 이용하여 분류될 수 있다. 특정 세포 표면 분자 또는 합텐을 특이적으로 인식하는 항체의 공유 첨가를 비롯한, 다양한 유용한 변형을 자기 미세구 상에서 수행할 수 있다. 이어서, 비드를 세포와 혼합하여 결합시킨다. 이어서, 세포를 자기장을 통해 통과시켜 특이적 세포 표면 마커를 가진 세포를 분리시킨다. 이어서, 하나의 실시양태에서, 이들 세포를 단리하고 추가의 세포 표면 마커에 대한 항체에 결합된 자기 비드와 재혼합할 수 있다. 세포를 다시 자기장을 통해 통과시켜, 두 항체 모두에 결합된 세포를 단리시킨다. 이어서, 클로날 단리를 위해 그러한 세포를 별개의 접시, 예를 들어 미량역가 접시로 희석시킬 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 트리판 블루 배제 검정, 플루오레세인 디아세테이트 흡수 검정, 프로피듐 요오다이드 흡수 검정 (생존력을 평가하기 위해); 및 티미딘 흡수 검정 또는 MTT 세포 증식 검정 (증식을 평가하기 위해)을 이용하여 생존력, 증식 가능성, 및 수명 (longevity)에 대해 평가할 수 있다. 수명은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해, 예를 들어 연장된 배양에서 집단 배가의 최대 수를 결정함으로써 결정할 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 또한 당업계에 공지된 다른 기술, 예를 들어, 목적하는 세포의 선택적 성장 (양성 선택), 원치않는 세포의 선택적 파괴 (음성 선택); 예를 들어, 대두 어글루티닌을 사용할 때 혼합된 집단 내에서 차별적인 세포 응집력에 기초한 분리; 동결-해동 절차; 여과; 통상적인 및 때 (zonal) 원심분리; 역류 원심 침전 (centrifugal elutriation) (역류 원심분리); 단위 중력 분리; 역류 분배; 전기영동; 등을 이용하여 다른 태반 세포로부터 분리할 수 있다.

5.5 양막 유래 부착성 세포의 배양

5.5.1 배양 배지

단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 상기 세포의 집단은 세포 배양을 개시하거나 접종하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 일반적으로 세포외 매트릭스 또는 생체분자, 예를 들어 라미닌, 콜라겐 (예를 들어, 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴, 및 세포외 막 단백질 (예를 들어, 마트리겔™ (비디 디스커버리 랩웨어 (BD Discovery Labware, 미국 매사추세츠주 베드포드))로 코팅되거나 코팅되지 않은 멸균 조직 배양 용기에 옮겨진다.

AMDAC는 예를 들어, 줄기 세포의 배양을 위해 적합한 배지 내에서 확립될 수 있다. 확립 배지는 예를 들어 EGM-2 배지 (론자 (Lonza)), DMEM + 10% FBS, 또는 60% DMEM-LG (깁코), 40% MCDB-201 (시그마), 2% 우태아 혈청 (FCS) (하이클론 래보러토리즈), 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS), 1X 레놀렌산-소 혈청 알부민 (LA-BSA), 10^-9 M 덱사메타손 (시그마), 10^-4 M 아스코르브산 2-인산염 (시그마), 표피 성장 인자 (EGF) 10 ng/ml (R&D 시스템즈), 혈소판 유래-성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D 시스템즈), 및 100 U 페니실린/1000 U 스트렙토마이신을 포함하는 배지 (본원에서 "표준 배지"로서 칭함)를 포함할 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 세포, 예를 들어, 부착성 태반 줄기 세포의 배양을 위해 허용되는 것으로 당업계에서 인정되는 임의의 배지 내에서 임의의 조건 하에 배양될 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 혈청을 포함한다. 다양한 실시양태에서, AMDAC의 배양 또는 계대배양을 위한 배지는 스템프로 (STEMPRO)® (인비트로겐), MSCM-sf (사이언셀 (ScienCell, 미국 캘리포니아주 칼스바드)), MESENCULT®-ACF 배지 (스템셀 테크놀로지스 (캐나다 밴쿠버), 표준 배지, EGF가 없는 표준 배지, PDGF가 없는 표준 배지, DMEM + 10% FBS, EGM-2 (론자), EGM-2MV (론자), 2%, 10% 및 20% ES 배지, ES-SSR 배지, 또는 α-MEM-20% FBS를 포함한다. 양막 유래 부착성 세포의 배양을 위해 허용되는 배지는 예를 들어, DMEM, IMDM, DMEM (고 또는 저 글루코스), 이글 기초 배지, 햄 (Ham) F10 배지 (F10), 햄 F-12 배지 (F12), 이스코브 변형 둘베코 배지, 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM, 론자), ADVANCESTEM™ 배지 (하이클론), KNOCKOUT™ DMEM (인비트로겐), 레이보비츠 (Leibovitz) L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 상급 DMEM (깁코), DMEM/MCDB201 (시그마), 및 CELL-GRO FREE 등을 포함한다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄), LA+BSA (리놀렌산-소 혈청 알부민), 덱스트로스, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-1, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-LG (둘베코 변형 필수 배지, 저 글루코스)/MCDB 201 (병아리 섬유모세포 기초 배지); 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 10% 우태 혈청 (FBS; 예를 들어 규정 우태 혈청, 하이클론 (미국 유타주 로간))을 포함하는 DMEM-HG (고 글루코스); 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 15% FBS를 포함하는 DMEM-HG; 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 10% FBS, 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 10% 말 혈청, 및 히드로코티손을 포함하는 IMDM (이스코브 변형 둘베코 배지); 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 10% FBS, EGF 및 헤파린을 포함하는 M199; 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 10% FBS, GLUTAMAX™ 및 겐타미신을 포함하는 α-MEM (최소 필수 배지); 10% FBS, GLUTAMAX™ 및 겐타미신을 포함하는 DMEM; 약 2 내지 약 20%, 예를 들어, 약 15% (v/v) 우태 혈청 (예를 들어, 규정 우태 혈청, 하이클론 (미국 유타주 로간)), 항생제/항진균제 (예를 들어, 페니실린 약 100 단위/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 및/또는 암포테리신 B 0.25 ㎍/ml (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)), 및 0.001% (v/v) β-머캅토에탄올 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)을 포함하는 DMEM-LG; 2 내지 20% FBS, 비-필수 아미노산 (인비트로겐), 베타-머캅토에탄올을 보충한 KNOCK0UT™-DMEM 기초 배지, KNOCKOUT™ 혈청 대체물을 보충한 KNOCKOUT™ 기초 배지, 2 내지 20% FBS를 포함하는 알파-MEM, EGF, VEGF, bFGF, R3-IGF-1, 히드로코티손, 헤파린, 아스코르브산, FBS, 겐타미신을 보충한 EBM2™ 기초 배지 등을 포함한다.

배양 배지에 하나 이상의 성분, 예를 들어, 혈청 (예를 들어, FCS 또는 FBS, 예를 들어, 약 2-20% (v/v); 말 혈청 (ES); 인간 혈청 (HS)); 베타-머캅토에탄올 (BME), 바람직하게는 약 0.001% (v/v); 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 에리트로포이에틴 (EPO); 아미노산, 예를 들어 L-발린; 및 미생물 오염을 제어하기 위한 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제, 예를 들어, 페니실린 G, 스트렙토마이신 술페이트, 암포테리신 B, 겐타미신, 및 니스타틴을 단독으로 또는 조합으로 보충할 수 있다.

양막 유래 부착성 세포 (AMDAC)는 표준 조직 배양 조건에서 예를 들어, 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 내에서 배양될 수 있다. 세포는 또한 현적법을 이용하여 배양될 수 있다. 본 방법에서, 세포를 약 1 x 10⁴ 세포/mL로 약 5 mL의 배지 내에 현탁시키고, 1 방울 이상의 배지를 조직 배양 용기, 예를 들어, 100 mL 페트리 (Petri) 접시의 뚜껑의 내부 상에 놓는다. 방울은 예를 들어, 단일 방울 또는 예를 들어, 멀티채널 피펫터 (pipetter)로부터 다수 방울일 수 있다. 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고, 접시 분위기 내에 습기 함량을 유지하기 위해 충분한 부피의 액체, 예를 들어, 멸균 PBS를 함유하는 접시의 저변의 상단부 상에 놓고, 세포를 배양한다. AMDAC는 또한 표준 또는 고용량 또는 고출력 배양 시스템, 예를 들어 T-플라스크, 코닝 (Corning) HYPER플라스크®, 셀 팩토리스 (Cell Factories, 넝크 (Nunc)), 1-, 2-, 4-, 10 또는 40-트레이 셀 스택스 (Tray Cell stacks) 등에서 배양할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 세포에서 미분화된 표현형을 유지하는 작용을 하는 화합물의 존재 하에 배양된다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 치환 3,4-디히드로피리디몰[4,5-d]피리미딘이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 화합물은 다음 화학 구조를 가진 화합물이다:

화합물은 양막 유래 부착성 세포, 또는 상기 세포의 집단과 예를 들어, 약 1 μM 내지 약 10 μM의 농도에서 접촉될 수 있다.

5.5.2 양막 유래 부착성 세포의 팽창 및 증식

일단 단리된 양막 유래 부착성 세포, 또는 단리된 상기 세포의 집단 (예를 들어, 세포 또는 세포 집단이 생체 내에서 정상적으로 그와 회합되는 양막 세포의 적어도 50%로부터 분리된 양막 유래 부착성 세포 또는 상기 세포의 집단)에서, 세포는 시험관 내에서 증식되고 팽창될 수 있다. 예를 들어, 부착성 세포 또는 양막 유래 부착성 세포의 집단은 조직 배양 용기, 예를 들어, 접시, 플라스크, 멀티웰 플레이트 등 내에서 세포가 40-70% 합류로 증식하기 위해 충분한 시간 동안, 즉, 세포 및 그들의 자손체가 조직 배양 용기의 배양 표면적의 40-70%를 점령할 때까지 배양할 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 배양 용기 내에 세포 성장을 허용하는 밀도로 접종될 수 있다. 예를 들어, 세포는 저밀도 (예를 들어, 약 400 내지 약 6,000개의 세포/cm²) 내지 고밀도 (예를 들어, 약 20,000개 또는 그 초과의 세포/cm²)로 접종될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기 내에서 약 0 내지 약 5 부피%의 CO₂에서 배양된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기 내에서 약 0.1 내지 약 25%의 O₂에서, 바람직하게는 공기 내에서 약 5% 내지 약 20%의 O₂에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃에서 배양된다.

세포는 바람직하게는 인큐베이터 내에서 배양된다. 배양 동안, 배양 배지는 정적일 수 있거나, 예를 들어, 배양 동안 생물반응기를 이용하여 교반될 수 있다. 양막 유래 부착성 세포는 바람직하게는 낮은 산화 스트레스 하에 (예를 들어, 글루타티온, 아스코르브산, 카탈라제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등을 첨가하여) 성장된다.

양막-유래 혈관신생 세포는 합류로 성장될 수 있지만, 세포는 바람직하게는 합류로 성장되지 않는다. 예를 들어, 40%-70% 합류가 얻어지면, 세포를 계대배양할 수 있다. 예를 들어, 세포는 조직 배양 표면으로부터 분리시키기 위해 당업계에 잘 공지된 기술을 이용하여 효소에 의해 처리할 수 있고, 예를 들어, 트립신 처리할 수 있다. 세포를 피펫을 사용하여 제거하고 계수한 후에, 약 20,000-100,000개의 세포, 바람직하게는 약 50,000개의 세포, 또는 약 400 내지 약 6,000개의 세포/cm²를 신선한 배양 배지를 함유하는 새로운 배양 용기로 계대배양할 수 있다. 일반적으로, 새로운 배지는 그로부터 세포를 제거한 것과 동일한 종류의 배지이다. 양막 유래 부착성 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 또는 그 초과로 계대배양될 수 있다. AMDAC는 배양액 내에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 적어도 50회 또는 그 초과로 배가될 수 있다.

5.6 양막 유래 부착성 세포의 보존

양막 유래 부착성 세포는 보존될 수 있고, 즉, 장기간 저장을 허용하는 조건, 또는 예를 들어, 본원에서 설명되는 방법을 이용하여 예를 들어, 수집 동안 또는 본원에 설명되는 조성물의 생산 전에 예를 들어, 세포자멸 또는 괴사에 의한 세포 사멸을 억제하는 조건 하에 놓일 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2007/0190042에 기재되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 세포자멸 억제제, 괴사 억제제 및/또는 산소-운반 과불화탄소를 포함하는 조성물을 사용하여 보존될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 세포 또는 상기 세포의 집단을 보존하는 방법은 상기 세포 또는 세포 집단을 세포자멸 억제제 및 산소-운반 과불화탄소를 포함하는 세포 수집 조성물과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포자멸 억제제는 세포자멸 억제제와 접촉되지 않은 세포 집단에 비해 세포 집단 내에서 세포자멸을 감소 또는 방지하기 위해 충분한 양으로 충분한 시간 동안 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제는 카스파제 억제제이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제는 JNK 억제제이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 JNK 억제제는 양막 유래 부착성 세포의 분화 또는 증식을 조정하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 상기 세포자멸 억제제 및 상기 산소-운반 과불화탄소를 별개의 상 내에 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 상기 세포자멸 억제제 및 상기 산소-운반 과불화탄소를 에멀젼 내에 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 유화제, 예를 들어, 레시틴을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제 및 상기 과불화탄소는 세포 접촉 시간에 약 0℃ 내지 약 25℃이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제 및 상기 과불화탄소는 세포 접촉 시간에 약 2℃ 내지 10℃ 또는 약 2℃ 내지 약 5℃이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 수송 동안 수행된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 동결 및 해동 동안 수행된다.

양막 유래 부착성 세포의 집단은 예를 들어, 상기 세포의 집단을 세포자멸 억제제 및 장기 (organ)-보존 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 보존될 수 있고, 여기서 상기 세포자멸 억제제는 세포자멸 억제제와 접촉되지 않은 세포 집단에 비해 세포 집단 내에서 세포자멸을 감소 또는 방지하기 위해 충분한 양으로 충분한 시간 동안 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 장기-보존 화합물은 UW 용액 (미국 특허 4,798,824에 기재되어 있음; ViaSpan으로도 알려짐; 또한 [Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)]) 또는 미국 특허 5,552,267 (Stern et al.)에 기재되어 있는 용액이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 장기-보존 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산, 라피노스 또는 이들의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 산소-운반 과불화탄소를 2개의 상 내에 또는 에멀젼으로서 추가로 포함한다.

방법의 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 관류 동안 세포자멸 억제제 및 산소-운반 과불화탄소, 장기-보존 화합물, 또는 이들의 조합물을 포함하는 세포 수집 조성물과 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 조직 파괴의 과정, 예를 들어, 양막 조직의 효소에 의한 소화 동안 상기 세포 수집 조성물과 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 조직 파괴에 의한 수집, 예를 들어, 양막 조직의 효소에 의한 소화 후에 상기 세포 수집 조성물과 접촉된다.

일반적으로, 양막 유래 부착성 세포의 수집, 농축 및 단리 동안, 저산소증 및 기계적 스트레스로 인한 세포 스트레스를 최소화 또는 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 방법의 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포, 또는 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단은 상기 보존 동안 6시간 미만 동안 수집, 농축 또는 단리 동안 저산소 조건에 노출되고, 여기서 저산소 조건은 예를 들어, 정상 대기 산소 농도 미만; 정상 혈액 산소 농도 미만 등인 산소 농도이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 또는 상기 세포의 집단은 상기 보존 동안 2시간 미만 동안 상기 저산소 조건에 노출된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 또는 상기 세포의 집단은 1시간 미만 또는 30분 미만 동안 상기 저산소 조건에 노출되거나, 수집, 농축 또는 단리 동안 저산소 조건에 노출되지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 수집, 농축 또는 단리 동안 전단 스트레스에 노출되지 않는다.

양막 유래 부착성 세포는 일반적인 방식으로 또는 본원에서 개시되는 구체적인 방법에 의해, 예를 들어 작은 용기, 예를 들어, 앰풀 내에서 냉동보존 매질 내에 냉동보존될 수 있다. 적합한 냉동보존 매질은 배양 배지, 예를 들어 성장 배지, 또는 세포 동결 배지, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 세포 동결 배지, 예를 들어, 시그마알드리치 카탈로그 번호 C2695, C2639 (DMSO를 함유하지 않는 세포 동결 배지-무혈청 1X) 또는 C6039 (최소 필수 배지, 글리세롤, 송아지 혈청 및 소 혈청을 함유하는 세포 동결 배지-글리세롤 1X)로 확인되는 세포 동결 배지, 론자 프로프리즈 (PROFREEZE)™ 2x 배지, 메틸셀룰로스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 우태 혈청, 우태아 혈청, 또는 플라스말라이트 (Plasmalyte)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 냉동보존 매질은 바람직하게는 DMSO (디메틸술폭시드) 또는 글리세롤을 예를 들어, 약 1% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 5% 내지 10% (v/v)의 농도로 포함하고, 임의로 우태 혈청 또는 인간 혈청을 포함한다. 냉동보존 매질은 추가의 물질, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및/또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 단리된 양막 유래 부착성 세포는 바람직하게는 냉동보존 동안 약 1℃/min으로 냉각된다. 바람직한 냉동보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 냉동보존된 세포는 사용을 위해 해동 전에 액체 질소의 증기상으로 이송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 앰풀이 약 -80℃에 도달하면 이들은 액체 질소 저장 구역으로 이송된다. 냉동보존은 또한 자동 (controlled-rate) 냉동기를 이용하여 수행될 수 있다. 냉동보존된 세포는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동된다.

5.7 양막 유래 부착성 세포의 뱅크 ( bank )의 생산

양막 유래 부착성 세포는 그러한 세포의 로트의 세트, 예를 들어, 개별 투여가능 용량의 세트를 생산하기 위해 많은 상이한 방식으로 배양될 수 있다. 복수의 태반에서 얻어진 혈관신생 양막 세포의 로트의 세트는 예를 들어, 장기간 저장을 위해 세포의 뱅크에 배열될 수 있다. 일반적으로, 양막 유래 부착성 세포는 세포의 초기 배양액으로부터 얻어져서 종자 배양액을 형성하고, 이는 제어된 조건 하에 팽창되어, 대략 동등한 수의 배가물로부터 세포의 집단을 형성한다. 로트는 바람직하게는 단일 태반의 조직으로부터 유래하지만 복수의 태반의 조직으로부터 유래할 수 있다.

하나의 비-제한적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포의 로트 또는 용량은 다음과 같이 얻어진다. 양막 조직을 먼저 상기 섹션 5.4.3에 설명된 바와 같이 파괴시키고, 예를 들어, 연속적인 트립신 및 콜라게나제 소화를 이용하여 소화시킨다. 콜라게나제-소화된 조직으로부터의 세포를 예를 들어, 약 1-3주, 바람직하게는 약 2주 동안 배양한다. 비-부착성 세포의 제거 후에, 형성되는 고밀도 콜로니를 예를 들어, 트립신 처리에 의해 수집한다. 이들 세포를 수집하고 편리한 부피의 배양 배지 내에 재현탁시키고, 계대배양 (Passage) 0 세포로서 규정한다.

이어서, 계대배양 0 세포를 사용하여, 팽창 배양액을 접종할 수 있다. 팽창 배양액은 임의의 배열의 별개의 세포 배양 장치, 예를 들어, 셀 팩토리스 (넝크™)일 수 있다. 계대배양 0 배양액 내의 세포는 예를 들어, 1 x 10³, 2 x 10³, 3 x 10³, 4 x 10³, 5 x 10³, 6 x 10³, 7 x 10³, 8 x 10³, 9 x 10³, 1 x 10⁴, 1 x 10⁴, 2 x 10⁴, 3 x 10⁴, 4 x 10⁴, 5 x 10⁴, 6 x 10⁴, 7 x 10⁴, 8 x 10⁴, 9 x 10⁴, 또는 10 x 10⁴개의 부착성 세포로 팽창 배양액을 접종하기 위해 임의의 정도로 세분될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 팽창 배양액을 접종하기 위해 약 1 x 10³ 내지 약 3 x 10⁴개의 계대배양 0 세포가 사용된다. 팽창 배양액의 수는 계대배양 0 세포의 수에 따라 결정될 수 있고, 그로부터 부착성 세포가 얻어지는 특정 태반(들)에 따라 그 수가 더 많거나 더 적을 수 있다.

이어서, 팽창 배양액은 배양액 내의 세포의 밀도가 특정 값, 예를 들어, 약 1 x 10⁵ 세포/cm²에 도달할 때까지 성장될 수 있다. 세포는 본 시점에 수집되고 냉동보존되거나, 상기 설명된 바와 같이 새로운 팽창 배양액 내로 계대배양될 수 있다. 세포는 사용 전에 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 계대배양될 수 있다. 집단 배가의 누적 수의 기록은 바람직하게는 팽창 배양(들) 동안 유지된다. 계대배양 0 배양액으로부터 세포를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40회 배가 동안 또는 60회 배가까지 팽창시킬 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 세포 집단을 개별 용량으로 나누기 전에 집단 배가의 수는 약 15 내지 약 30회 배가이다. 세포는 팽창 과정 내내 계속하여 배양될 수 있거나, 팽창 동안 하나 이상의 지점에서 동결될 수 있다.

개별 용량을 위해 사용할 세포는 나중에 사용하기 위해 동결될, 예를 들어, 냉동보존될 수 있다. 개별 용량은 예를 들어 mL당 약 1백만 내지 약 5천만 개의 세포를 포함할 수 있고, 총 약 10⁶ 내지 약 10¹⁰개의 세포를 포함할 수 있다.

따라서, 하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 뱅크는 제1 복수의 집단 배가를 위해 인간 분만후 태반으로부터 1차 배양 양막 유래 부착성 세포를 팽창시키고; 세포를 냉동보존하여 매스터 (Master) 세포 뱅크를 형성하고; 임의로 제2 복수의 집단 배가를 위해 매스터 세포 뱅크로부터의 많은 세포를 팽창시키고; 팽창된 세포를 냉동보존하여 워킹 (Working) 세포 뱅크를 형성하고; 임의로 제3 복수의 집단 배가를 위해 워킹 세포 뱅크로부터의 많은 팽창된 양막 유래 부착성 세포를 팽창시키고; 생성되는 팽창된 세포를 개별 용량으로 냉동보존하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있고, 여기서 상기 개별 용량은 집합적으로 세포 뱅크를 구성한다. 뱅크는 전적으로 양막 유래 부착성 세포의 용량 또는 로트를 포함할 수 있거나, 양막 유래 부착성 세포의 로트 및 또 다른 유형의 세포, 예를 들어, 또 다른 종류의 줄기 또는 전구 세포의 로트 또는 용량의 조합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별 용량은 단지 양막 유래 부착성 세포만을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 1차 배양액 내의 모든 상기 세포는 동일한 태반의 것이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁴ 내지 약 10⁵개의 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁵ 내지 약 10⁶개의 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁷ 내지 약 10⁸개의 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁸ 내지 약 10⁹개의 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 개별 용량은 약 10⁹ 내지 약 10¹⁰개의 세포를 포함한다.

특정 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 워킹 세포 뱅크로부터 해동되고 복수의 집단 배가를 위해 배양될 수 있다. 목적하는 수의 세포가 생성되거나 목적하는 수의 집단 배가가 일어나면, 부착성 세포를 예를 들어 원심분리에 의해 수집하고, 예를 들어, 덱스트란, 예를 들어, 5% 덱스트란을 포함하는 용액 내에 재현탁시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 덱스트란은 덱스트란-40이다. 특정 실시양태에서, 세포를 2회 수집하고, 덱스트란 및 냉동보존제를 포함하는 용액, 예를 들어, 10% HSA 및 2%-20%, 예를 들어, 5% DMSO를 포함하는 5% 덱스트란 (예를 들어, 덱스트란-40) 용액 내에 재현탁시키고 냉동보존한다. 냉동보존된 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 사용 직전에 해동될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 그로부터 태반이 얻어지는 공여체 (예를 들어, 모체)를 적어도 하나의 병원체에 대해 시험한다. 특정 실시양태에서, 모체가 시험된 병원체에 대해 양성으로 시험되면, 태반으로부터 전체 로트를 폐기한다. 그러한 시험은 계대배양 0 세포의 확립 전후, 또는 팽창 배양 동안을 비롯한, 양막 유래 부착성 세포의 로트의 생산 동안 임의의 시간에 수행될 수 있다. 존재를 시험하는 병원체는 비제한적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (유형 I 및 II), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스바이러스 등을 포함할 수 있다.

5.8 양막 유래 부착성 세포의 용도

양막 유래 부착성 세포를 포함하는 조성물을 본원에서 제공한다. 그러한 조성물의 예는 제약 조성물 (아래 섹션 5.8.1 참조); 매트릭스 및 스캐폴드 (아래 섹션 5.8.2 참조), 및 양막 유래 부착성 세포에 의해 조건화된 배지 (아래 섹션 5.8.3 참조)을 포함한다.

5.8.1 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 조성물

특정 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 제약 조성물 내에 함유되거나 제약 조성물의 성분이다. 세포는 개체에게 쉽게 투여가능한 형태, 예를 들어, 의료용으로 적합한 용기 내에 담긴 양막 유래 부착성 세포로 제조될 수 있다. 그러한 용기는 예를 들어, 주사기, 멸균 플라스틱 백, 플라스크, 자 (jar), 또는 그로부터 양막 유래 혈관신생 세포 집단이 쉽게 분배될 수 있는 다른 용기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 수여체에 대한 액체의 정맥내 투여를 위해 적합한 혈액 백 또는 다른 플라스틱의 의학적으로 허용되는 백일 수 있다. 특정 실시양태에서, 용기는 세포의 냉동보존을 허용하는 용기이다. 본원에서 제공되는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물 내의 세포는 단일 공여체로부터 또는 다수 공여체로부터 유래된 양막 유래 부착성 세포를 포함할 수 있다. 세포는 의도된 수여체에 완전히 HLA-매칭 (matching)될 수 있거나, 부분적으로 또는 완전히 HLA-미스매칭될 수 있다.

따라서, 하나의 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 내의 양막 유래 부착성 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 용기 내에 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용기는 백, 플라스크, 또는 자이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 백은 멸균 플라스틱 백이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 백은 예를 들어, 정맥내 주입, 볼러스 주사 등에 의한 상기 부착성 세포의 정맥내 투여에 적합하거나 허용하거나 용이하게 한다. 백은 투여 전에 또는 투여 동안 세포 및 하나 이상의 다른 용액, 예를 들어, 약물의 혼합을 허용하는 상호연결된 다수의 내강 (lumen) 또는 구획 (compartment)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 냉동보존 전에, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 용액은 세포의 냉동보존을 용이하게 하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 생리학상 허용되는 수용액 내에 함유된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 생리학상 허용되는 수용액은 0.9% NaCl 용액이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 상기 세포의 수여체에 HLA-매칭된 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 상기 세포의 수여체에 적어도 부분적으로 HLA-미스매칭된 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 양막 유래 부착성 세포는 복수의 공여체로부터 유래한다. 다양한 구체적인 실시양태에서, 상기 용기는 약, 적어도, 또는 최대 1 x 10⁶개의 상기 세포, 5 x 10⁶개의 상기 세포, 1 x 10⁷개의 상기 줄기 세포, 5 x 10⁷개의 상기 세포, 1 x 10⁸개의 상기 세포, 5 x 10⁸개의 상기 세포, 1 x 10⁹개의 상기 세포, 5 x 10⁹개의 상기 세포, 또는 1 x 10¹⁰개의 상기 세포를 포함한다. 임의의 상기한 냉동보존된 집단의 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 약, 적어도, 또는 5회 이하, 10회 이하, 15회 이하, 또는 20회 이하로 계대배양된다. 임의의 상기한 냉동보존된 세포의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 상기 용기 내에서 팽창된다. 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포의 단일 단위 용량은 다양한 실시양태에서 약, 적어도, 또는 1 x 10⁵, 5 x 10⁵, 1 x 10⁶, 5 x 10⁶, 1 x 10⁷, 5 x 10⁷, 1 x 10⁸, 5 x 10⁸, 1 x 10⁹, 5 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 5 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹ 이하 또는 그 초과의 양막 유래 부착성 세포를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 50% 또는 그 초과의 생존가능한 세포를 포함하는 (즉, 집단 내의 적어도 50%의 세포가 기능적이거나 생존한다) 양막 유래 부착성 세포의 집단을 포함한다. 바람직하게는, 집단 내의 세포의 적어도 60%가 생존가능하다. 보다 바람직하게는, 제약 조성물 내의 집단 내의 세포의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 생존가능하다.

5.8.2 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 매트릭스

매트릭스, 히드로겔, 스캐폴드 등을 포함하는 조성물을 본원에서 추가로 제공한다. 그러한 조성물은 액체 현탁액 내의 상기 세포 대신에 또는 그에 추가로 사용될 수 있다.

매트릭스는 예를 들어, 영구 또는 분해성 탈세포화 조직, 예를 들어, 탈세포화 양막, 또는 합성 매트릭스일 수 있다. 매트릭스는 3차원 스캐폴드일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스는 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 펙틴, 오르니틴, 또는 비트로넥틴을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 매트릭스는 양막 또는 양막-유래 생체물질이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스는 세포외 막 단백질을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스는 합성 화합물을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 매트릭스는 생물활성 화합물을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 생물활성 화합물은 성장 인자, 시토킨, 항체, 또는 5,000 달톤 미만의 유기 분자를 포함한다.

본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 천연 매트릭스, 예를 들어, 태반 생체물질, 예를 들어 양막 물질 상에 접종될 수 있다. 그러한 양막 물질은 예를 들어, 포유동물 태반으로부터 직접 박리된 양막; 고정된 또는 열-처리된 양막, 실질적으로 건조한 (즉, <20% H₂O) 양막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양막 및 융모막 등일 수 있다. 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포가 그 위에 접종될 수 있는 바람직한 태반 생체물질은 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2004/0048796 (Hariri)에 기재되어 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 매트릭스는 세포외 매트릭스를 포함하는 조성물이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 조성물은 마트리겔™ (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))이다.

본원에서 설명되는 단리된 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 주사를 위해 적합한 히드로겔 용액 내에 현탁될 수 있다. 히드로겔은 예를 들어, 공유, 이온성 또는 수소 결합을 통해 가교결합하여, 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는 3차원 열린 격자 (open-lattice) 구조를 생성하는 유기 중합체 (천연 또는 합성)이다. 상기 조성물을 위해 적합한 히드로겔은 자가조립형 (self-assembling) 펩티드, 예를 들어 RAD16을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 세포를 포함하는 히드로겔 용액은 삽입을 위한 그 내부에 세포가 분산되어 있는 매트릭스를 형성하기 위해 예를 들어, 틀 (mold) 내에서 경화될 수 있다. 상기 매트릭스 내의 양막 유래 부착성 세포는 또한 세포가 예를 들어, 삽입 전에 유사분열에 의해 팽창되도록 배양될 수 있다. 히드로겔-형성 물질은 다당류, 예를 들어 알지네이트 및 그의 염, 펩티드, 폴리포스파진, 및 폴리아크릴레이트 (이온 결합에 의해 가교결합됨), 또는 블록 (block) 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체 (각각 온도 또는 pH에 의해 가교결합됨))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히드로겔 또는 매트릭스는 생분해성이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포를 포함하는 조성물은 계내 중합성 겔을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2002/0022676; [Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002)]; [Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)] 참조). 일부 실시양태에서, 전하를 띈 측쇄기를 가진 중합체 또는 그의 1가 이온성 염은 수성 용액, 예를 들어 물, 완충 염 용액, 또는 수성 알콜 용액에 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄기를 가진 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 술폰화 중합체, 예를 들어 술폰화 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산 및 비닐 에테르 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성된, 산성 측쇄기를 가진 공중합체가 또한 사용될 수 있다. 산성기의 예는 카르복실산기, 술폰산기, 할로겐화 (바람직하게는 플루오르화) 알콜기, 페놀성 OH기, 및 산성 OH기이다.

구체적인 실시양태에서, 매트릭스는 생체흡수성 물질, 예를 들어, PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드 (blend), 또는 히알루론산으로부터 제조된 다섬유 야안 (yarn)으로 이루어질 수 있는 펠트 (felt)이다. 상기 야안은 권축 (crimping), 절단, 카딩 (carding) 및 니들링 (needling)으로 이루어지는 표준 직물 가공 기술을 이용하여 펠트로 제조된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포는 복합재 구조체일 수 있는 포움 (foam) 스캐폴드 상에 접종될 수 있다. 추가로, 3차원 프레임워크는 유용한 형상, 예를 들어 복원, 대체 또는 확대시킬 신체 내의 구체적인 구조체로 성형될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 스캐폴드의 예는 부직 매트 (nonwoven mat), 다공성 포움, 또는 자가조립형 펩티드를 포함한다. 부직 매트는 글리콜산 및 락트산의 합성 흡수성 공중합체 (예를 들어, PGA/PLA)로 구성된 섬유를 사용하여 형성될 수 있다 (VICRYL, 에티콘, 인크. (Ethicon, Inc., 미국 뉴저지주 소머빌)). 동결-건조, 또는 동결건조와 같은 공정 (예를 들어, 미국 특허 6,355,699 참조)에 의해 형성된, 예를 들어, 폴리(ε-카프로락톤)/폴리(글리콜산) (PCL/PGA) 공중합체로 구성된 포움이 또한 스캐폴드로서 사용될 수 있다.

본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 3차원 프레임워크 또는 스캐폴드 상에 접종되고 생체 내에 삽입될 수 있다. 그러한 프레임워크는 예를 들어, 조직 형성, 예를 들어, 뼈 형성 또는 혈관구조의 형성을 자극하는 임의의 하나 이상의 성장 인자, 세포, 약물 또는 다른 성분과 조합으로 삽입될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 태반 양막 유래 부착성 세포는 복합재 구조체일 수 있는 포움 스캐폴드 상에 접종될 수 있다. 그러한 포움 스캐폴드는 복원, 대체 또는 확대시킬 신체 내의 구체적인 구조체의 일부와 같은 유용한 형상으로 성형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 부착을 향상시키기 위해, 프레임워크를 예를 들어, 0.1M 아세트산으로 처리한 후 폴리라이신, PBS 및/또는 콜라겐 내에서 인큐베이팅한 후, 세포를 접종한다. 매트릭스의 외부 표면은 세포의 부착 또는 성장 및 조직의 분화를 개선하기 위해, 예를 들어 매트릭스를 플라즈마-코팅함으로써 또는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴-4-술페이트, 콘드로이틴-6-술페이트, 더마탄 술페이트, 케라틴 술페이트 등), 세포 매트릭스, 및/또는 예를 들어 젤라틴, 알지네이트, 아가, 아가로스 및 식물 고무 등을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다른 물질의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, 매트릭스는 그를 비-혈전생성성으로 만드는 물질을 포함하거나 그러한 물질로 처리된다. 이들 처리 및 물질은 또한 내피 성장, 이동, 및 세포외 매트릭스 침착을 촉진하고 유지할 수 있다. 이들 물질 및 처리의 예는 천연 물질, 예를 들어 기저 막 단백질, 예를 들어 라미닌 유형 IV 콜라겐, 합성 물질, 예를 들어 EPTFE, 및 분할 (segmented) 폴리우레탄우레아 실리콘, 예를 들어 퍼스판 (PURSPAN)™ (더 폴리머 테크놀로지 그룹, 인크. (The Polymer Technology Group, Inc. 미국 캘리포니아주 버클리))을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 매트릭스는 또한 항혈전제, 예를 들어 헤파린을 포함할 수 있고; 스캐폴드는 또한 본원에서 제공되는 부착성 세포로 접종하기 전에 표면 전하를 변경시키도록 처리될 수 있다 (예를 들어, 플라즈마를 사용한 코팅).

프레임워크는 세포 부착을 향상시키기 위해 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포의 접종 전에 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포의 접종 전에, 나일론 매트릭스를 0.1 몰 아세트산으로 처리하고 폴리라이신, PBS, 및/또는 콜라겐 내에서 인큐베이팅하여 나일론을 코딩할 수 있다. 폴리스티렌은 황산을 이용하여 유사하게 처리될 수 있다.

또한, 세포의 부착 또는 성장 및 조직의 분화를 개선하기 위해 3차원 프레임워크의 외부 표면은 예를 들어, 프레임워크를 플라즈마 코팅함으로써 또는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴-4-술페이트, 콘드로이틴-6-술페이트, 더마탄 술페이트, 케라틴 술페이트), 세포 매트릭스, 및/또는 젤라틴, 알지네이트, 아가, 아가로스, 또는 식물 고무를 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 물질의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, 매트릭스는 매트릭스를 비-혈전생성성으로 만드는 물질, 예를 들어, 천연 물질, 예를 들어 기저 막 단백질, 예를 들어 라미닌 유형 IV 콜라겐, 및 합성 물질, 예를 들어 ePTFE 또는 분할 폴리우레탄우레아 실리콘, 예를 들어 퍼스판 (더 폴리머 테크놀로지 그룹, 인크., 미국 캘리포니아주 버클리)을 포함하거나 그러한 물질로 처리된다. 그러한 물질은 스캐폴드를 비-혈전생성성으로 만들기 위해 예를 들어, 헤파린, 및 물질의 표면 전하를 변경시키는 처리, 예를 들어 플라즈마 코팅으로 추가로 처리될 수 있다.

양막 유래 부착성 세포를 포함하는 치료 세포 조성물은 또한 매트릭스-세포 복합체의 형태로 제공될 수 있다. 매트릭스는 생체적합성 스캐폴드, 격자, 자가조립형 구조 등 (생체흡수성이든 아니든), 액체, 겔, 또는 고체를 포함할 수 있다. 그러한 매트릭스는 치료적 세포 처리, 수술적 복원, 조직 공학처리, 및 상처 치유의 분야에 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 매트릭스에 부착한다. 다른 실시양태에서, 세포는 매트릭스 공간 내에 포획되거나 함유된다. 그 내부에서 세포가 매트릭스와 밀접하게 회합되어 성장하고 치료를 위해 사용될 때 수여체의 세포의 내성장 (ingrowth)을 자극 및 지지하거나 혈관신생을 자극 또는 지지하는 매트릭스-세포 복합체가 가장 바람직하다. 매트릭스-세포 조성물은 삽입, 주사, 수술적 부착, 다른 조직을 사용한 이식, 주사 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 개체의 신체 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 매트릭스는 생체 내에서 또는 계내에서 형성된다. 예를 들어, 계내 중합성 겔은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 겔의 예는 당업계에 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포는 그러한 3차원 매트릭스, 예를 들어 스캐폴드 상에 접종되어 생체 내에 삽입되고, 여기서 접종된 세포는 프레임워크 상에서 또는 내에서 증식하거나, 다른 세포와 협력하여 또는 협력하지 않으면서 생체 내에서 대체 조직을 확립시키는 것을 도울 수 있다. 3차원 프레임워크 상에서 양막 유래 부착성 세포 또는 그의 동시-배양액의 성장은 바람직하게는 3차원 조직 또는 그의 기초 (foundation)를 형성시키고, 이것은 예를 들어, 손상된 또는 질병에 걸린 조직의 복원을 위해 생체 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 3차원 스캐폴드는 예를 들어 혈관의 복원에 사용하기 위해 관형 (tubular) 구조를 형성하기 위해; 또는 순환계 또는 관상 구조체의 측면에서 사용될 수 있다. 본 발명의 한 측면에 따라, 양막 유래 부착성 세포 또는 그의 동시-배양액은 3차원 프레임워크 또는 매트릭스, 예를 들어 스캐폴드, 포움 또는 히드로겔 상에 접종된다. 프레임워크는 다양한 형상, 예를 들어 전체적으로 평평한, 전체적으로 원통형 또는 관형으로 형성될 수 있거나, 고려되는 교정 구조체에 요구되거나 바람직할 수 있는 바와 같이 완전히 자유 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 3차원 구조 상에서 성장하는 한편, 다른 실시양태에서, 세포는 단지 생존하거나 심지어 죽지만, 수여체 내에서 새로운 조직의 내성장 또는 혈관생성을 자극 또는 촉진한다.

본 발명의 세포는 배양액 내에서 자유롭게 성장되고, 배양액으로부터 제거되고, 3차원 프레임워크 상에 접종될 수 있다. 예를 들어, 약 10⁶ 내지 5 x 10⁷ 세포/ml의 세포 농도를 사용하여 3차원 프레임워크를 접종하면 바람직하게는 비교적 더 짧은 기간 내에 3차원 지지체를 확립시킨다. 더욱이, 일부 용도에서, 목적하는 결과에 따라 보다 많은 수 또는 보다 적은 수의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 매트릭스는 그의 폭이 그가 궁극적으로 삽입될 관형 장기의 내부 원주와 대략 동일한 스트립 (예를 들어, 직사각형 형상)으로 절단할 수 있다. 양막 유래 부착성 세포는 스캐폴드 상에 접종되고 액체 배지 내에 부유 또는 현탁시킴으로써 인큐베이팅될 수 있다. 적절한 기의 합류 시에, 스캐폴드를 긴 가장자리를 함께 연결함으로써 관으로 감을 수 있다. 이어서, 적절한 직경의 적합한 물질의 섬유를 사용하여 2개의 가장자리를 함께 봉합함으로써, 밀봉부를 밀폐할 수 있다. 세포가 내강을 폐색하는 것을 방지하기 위해, 관형 프레임워크의 열린 단부 중 하나를 노즐에 고정시킬 수 있다. 관형 프레임워크의 내부를 통한 유동을 생성하기 위해 액체 배지를 인큐베이션 챔버에 연결된 공급원 챔버로부터 노즐을 통해 가압할 수 있다. 다른 열린 단부를 그로부터 배지가 공급원 챔버를 통해 재순환될 수 있는 수집 챔버에 이르는 유출 구멍 (aperture)에 고정시킬 수 있다. 인큐베이션이 완료되면 관을 노즐 및 유출 구멍에서 떼어낼 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 94/25584를 참조한다.

일반적으로, 2개의 3차원 프레임워크를 임의의 다음 방법을 이용하여 본 발명에 따른 관으로 조합할 수 있다. 2개 이상의 평평한 프레임워크를 다른 것의 꼭대기에 놓고 함께 봉합할 수 있다. 이어서, 생성되는 2-층 시트를 감고, 상기한 바와 같이 함께 연결하고 고정시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 내층으로서 역할을 할 하나의 관형 스캐폴드를 양막 유래 부착성 세포로 접종하고 인큐베이팅할 수 있다. 제2 스캐폴드는 관형 프레임워크의 외부 원주보다 약간 더 큰 폭을 갖는 평평한 스트립으로서 성장될 수 있다. 적절한 성장이 얻어진 후, 평평한 프레임워크를 관형 스캐폴드의 외부에 감싼 후, 평평한 프레임워크의 2개의 가장자리의 밀봉부를 밀폐하고 평평한 프레임워크를 내부 관에 고정한다. 또 다른 실시양태에서, 직경이 약간 상이한 2개 이상의 관형 망 (mesh)을 따로 성장시킬 수 있다. 보다 작은 직경의 프레임워크를 더 큰 것의 내부에 삽입하고 고정할 수 있다. 각각의 이들 방법에 대해, 2중층 관에 방법을 재적용함으로써 보다 많은 층을 추가할 수 있다. 스캐폴드들은 양막 유래 부착성 세포의 임의의 성장기에 조합될 수 있고, 조합된 스캐폴드의 인큐베이션은 원할 때까지 계속될 수 있다.

상기한 것과 함께, 본원에서 제공되는 세포 및 치료 조성물은 삽입형 (implantable) 장치와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 스텐트, 인공 판막, 심실 보조 장치, 구글리엘미 (Guglielmi) 분리형 (detachable) 코일 등과 동시투여될 수 있다. 장치는 그러한 치료를 필요로 하는 개체에게 제공되는 지배적 치료를 구성할 수 있으므로, 세포 등은 본 발명의 삽입된 장치의 영역에서 적합한 치유를 보조, 자극 또는 촉진하기 위해 지지 또는 2차 치료로서 이용될 수 있다. 본 발명의 세포 및 치료 조성물은 또한 생체 내에서 사용될 때 문제를 최소화하기 위해 특정 삽입형 장치를 예비처리하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 예비처리된 장치, 예를 들어 코팅된 장치는 국소 또는 전신 감염, 또는 예를 들어, 혈관의 재협착 또는 추가의 폐색 위험이 감소되어, 그를 수여받는 환자에 의해 더 잘 관용될 수 있다.

5.8.3 양막 유래 부착성 세포에 의해 조건화된 배지

양막 유래 부착성 세포에 의해 조건화된 배지, 즉, 부착성 세포에 의해 분비되거나 배출된 하나 이상의 생체분자를 포함하는 배지를 본원에서 추가로 제공한다. 다양한 실시양태에서, 조건화 배지는 세포가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 그 초과 동안 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회의 집단 배가 또는 그 초과 동안 성장된 배지를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조건화 배지는 양막 유래 부착성 세포가 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 합류로 또는 100%가지의 합류로 성장된 배지를 포함한다. 그러한 조건화 배지는 세포 집단, 예를 들어, 줄기 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 성체 줄기 세포 등의 집단의 배양을 지지하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조건화 배지는 양막 유래 부착성 세포, 및 양막 유래 부착성 세포가 아닌 세포가 함께 배양된 배지를 포함한다.

조건화 배지는 본원에서 제공되는 부착성 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 배양액을 본원에서 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 조건화 배지는 복수의 양막 유래 부착성 세포, 예를 들어, 집단을 포함한다.

5.9 변형된 양막 유래 부착성 세포

5.9.1 유전적으로 변형된 양막 유래 부착성 세포

또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 관심있는 핵산 또는 폴리펩티드를 생산하기 위해 또는 관심있는 핵산 또는 폴리펩티드를 생산하는 분화된 세포, 예를 들어, 뼈형성 세포, 근세포, 혈관주위 세포, 또는 혈관신생 세포를 생산하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 양막 유래 부착성 세포는 혈관신생 인자, 예를 들어 혈관신생촉진 분자, 가용성 인자 및 수용체 또는 이동촉진 분자, 예를 들어 케모킨, 예를 들어, 기질 세포 유래 인자 1 (SDF-I) 또는 케모킨 수용체를 생산하기 위해 변형될 수 있다. 유전자 변형은 예를 들어 비-통합성 복제 벡터, 예를 들어, 유두종 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터; 통합성 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터; 또는 복제-결함 바이러스 벡터를 포함하고 이로 제한되지 않는 바이러스-기반 벡터를 사용하여 달성할 수 있다. DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법은 리포좀, 전기천공, 입자 총, 직접적인 DNA 주사 등의 사용을 포함한다.

본원에서 제공되는 부착성 세포는 하나 이상의 적절한 발현 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위, 내부 리보좀 도입 부위에 의해 제어되거나 그와 작동적으로 연관되는 DNA로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 DNA는 선택가능 마커를 포함한다. 외래 DNA의 도입 후에, 공학처리된 부착성 세포를 예를 들어, 농축 배지 내에서 성장시킨 후, 선택 배지로 교체할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 공학처리하기 위해 사용되는 DNA는 관심있는 폴리펩티드, 예를 들어, 시토킨, 성장 인자, 분화제 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

부착성 세포를 공학처리하기 위해 사용되는 DNA는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, 유두종 바이러스 프로모터, 엡스타인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스 프로모터, 엘라스틴 유전자 프로모터 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 프로모터는 조절가능하여, 뉴클레오티드 서열이 원하는 경우에만 발현되도록 한다. 프로모터는 유도성 (예를 들어, 메탈로티오네인 및 열 충격 단백질과 연관된 것) 또는 구성적일 수 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적이거나 조직 특이성을 보인다. 그러한 프로모터의 예는 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Shani, 1985, Nature 314:283) (골격근)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본원에서 개시되는 양막 유래 부착성 세포는 그러한 세포 내에서 하나 이상의 유전자의 발현을 "녹아웃 (knock out)" 또는 "녹다운 (knock down)"시키기 위해 공학처리되거나 다른 방식으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 세포에 천연적인 유전자의 발현은 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 유전자를 완전히 불활성화시킴으로써 발현의 억제에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 단백질의 중요한 영역을 코딩하는 엑손, 또는 그 영역에 5'인 엑손은 표적 유전자로부터 정상 mRNA의 생산을 방지하여 유전자를 불활성화시키는 양성 선택가능 마커, 예를 들어, neo에 의해 차단될 수 있다. 유전자는 또한 유전자의 일부에 결실을 일으킴으로써 또는 전체 유전자를 결실시킴으로써 불활성화될 수 있다. 게놈 내에서 멀리 떨어져 있는 표적 유전자에 대한 2개의 상동성 영역을 갖는 구성체를 사용함으로써, 2개의 영역 사이에 개재하는 서열을 결실시킬 수 있다 (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084). 또한, 부착성 세포에서 표적 유전자 활성 수준을 감소시키기 위해, 표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스, 모르폴리노, DNA자임 (DNAzyme), 작은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 및 리보자임 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 주조직적합성 유전자 복합체 (HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 분자는 면역 반응에 관하여 가장 다재다능한 것으로 나타났다. 삼중 나선 분자는 표적 유전자 활성의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [L.G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn.]을 참조한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시되는 양막 유래 부착성 세포는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 유전적으로 변형될 수 있고, 여기서 관심있는 폴리펩티드의 발현은 외인성 인자, 예를 들어, 폴리펩티드, 작은 유기 분자 등에 의해 제어가능하다. 관심있는 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 관심있는 폴리펩티드는 IL-12 또는 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1Ra)이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 관심있는 폴리펩티드는 인터류킨-1 수용체 길항제 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 융합체이고, 외인성 인자는 항엽산제, 예를 들어, 메토트렉세이트이다. 그러한 구성체는 메토트렉세이트와 접촉 시에 IL-1Ra, 또는 IL-1Ra 및 DHFR의 융합체를 발현하는 양막 유래 부착성 세포의 공학처리에서 유용하다. 그러한 구성체는 예를 들어 류마티스성 관절염의 치료에 사용될 수 있다. 본 실시양태에서, IL-1Ra 및 DHFR의 융합체는 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트에 노출 시에 번역상 상향조절된다. 따라서, 또 다른 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 유전적으로 공학처리하기 위해 사용되는 핵산은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 외인성 인자의 존재 하에 번역상 상향조절되는 융합 단백질로서 발현된다. 폴리펩티드는 일시적으로 또는 장기간 (예를 들어, 수 주 또는 수 개월에 걸쳐) 발현될 수 있다. 그러한 핵산 분자는 공학처리된 세포의 양성 선택을 허용하거나 공학처리된 세포의 시각화를 허용하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 적절한 시각화 조건, 예를 들어, 루시퍼라제 (Luc) 하에 형광성인 폴리펩티드를 코딩한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 그러한 핵산 분자는 IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc를 포함할 수 있고, 여기서 IL-1Ra는 인터류킨-1 수용체 길항제이고, IRES는 내부 리보좀 도입 부위이고, DHFR은 디히드로폴레이트 리덕타제이다.

5.9.2 불멸화 양막 유래 부착성 세포주

포유동물 양막 유래 부착성 세포는 성장-촉진 유전자, 즉, 성장-촉진 단백질의 생산 및/또는 활성이 외부 인자에 의해 제어가능하도록 적절한 조건 하에 형질감염된 세포의 성장을 촉진하는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 임의의 적합한 벡터를 사용하는 형질감염에 의해 조건부 불멸화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 성장-촉진 유전자는 종양유전자, 예를 들어 비제한적으로 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 큰 T 항원, 폴리오마 큰 T 항원, E1a 아데노바이러스 또는 인간 유두종바이러스의 E7 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 나루시마 (Narushima, M.) 등 (Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282)에 의해 인간 췌장 β-세포주에 대해 예시되는 바와 같이 cre-lox 재조합을 이용하여 불멸화될 수 있다.

성장-촉진 단백질의 외부 조절은 성장-촉진 유전자를 외부 조절가능한 프로모터, 예를 들어, 그의 활성이 예를 들어, 형질감염된 세포의 온도 또는 세포와 접촉하는 배지의 조성을 변형함으로써 제어될 수 있는 프로모터의 제어 하에 놓음으로써 달성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 테트라사이클린 (tet)-제어된 유전자 발현 시스템을 사용할 수 있다 ([Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992]; [Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996] 참조). tet의 부재 하에, 상기 벡터 내에서 tet-제어된 전사활성인자 (tTA)는 ph_CMV _*-1 (tet 작동인자 서열에 융합된 인간 사이토메갈로바이러스로부터 최소 프로모터)로부터의 전사를 강하게 활성화시킨다. tTA는 에스체리키아 콜라이 (Escherichia coli)의 트랜스포존 (transposon)-10-유래 tet 내성 오페론의 리프레서 (repressor) (tetR) 및 단순 헤르페스 바이러스의 VP16의 산성 도메인의 융합 단백질이다. 낮은 비-독성 농도의 tet (예를 들어, 0.01-1.0 ㎍/mL)는 tTA에 의한 전사활성화를 거의 완전히 폐지한다.

하나의 실시양태에서, 벡터는 선택가능 마커, 예를 들어, 약물 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 함유한다. 세균 네오마이신 내성 유전자 (neo^R)가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 하나의 그러한 마커이다. neo^R를 보유하는 세포는 당업자에게 공지된 수단, 예를 들어 성장 배지에 예를 들어, 100-200 ㎍/mL G418의 첨가에 의해 선택할 수 있다.

형질감염은 레트로바이러스 감염을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 수단에 의해 달성할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양액은 벡터에 대한 생산자 세포주로부터 수집된 조건화 배지 및 N2 보충물 함유 DMEM/F12의 혼합물과의 인큐베이션에 의해 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이 제조된 태반 세포는 1 부피의 조건화 배지 및 2 부피의 N2 보충물 함유 DMEM/F12 내에서 약 20시간 동안 인큐베이션에 의해 예를 들어, 시험관 내에서 5일 후에 감염시킬 수 있다. 이어서, 선택가능 마커를 보유하는 형질감염된 세포를 상기한 바와 같이 선택할 수 있다.

형질감염 후에, 배양액은 증식을 허용하는, 예를 들어, 적어도 30%의 세포가 24시간 기간 내에 배가하도록 허용하는 표면 상에 계대배양한다. 바람직하게는, 기재는 폴리오르니틴 (10 ㎍/mL) 및/또는 라미닌 (10 ㎍/mL)으로 코팅된 조직 배양 플라스틱으로 이루어지는 폴리오르니틴/라미닌 기재, 폴리라이신/라미닌 기재 또는 피브로넥틴으로 처리된 표면이다. 이어서, 배양액에 3-4일마다 하나 이상의 증식 증진 인자를 보충하거나 보충하지 않을 수 있는 성장 배지를 공급한다. 증식 증진 인자는 배양액이 50% 합류 미만일 때 성장 배지에 첨가될 수 있다.

조건부 불멸화된 양막 유래 부착성 세포주는 80-95% 합류일 때 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 트립신 처리에 의해 계대배양시킬 수 있다. 약 제20회 계대배양까지, 일부 실시양태에서 선택을 유지하는 것이 유익하다 (예를 들어, 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 세포에 대해 G418을 첨가함으로써). 세포는 또한 장기간 저장을 위해 액체 질소 내에 동결시킬 수 있다.

클로날 세포주는 상기한 바와 같이 제조된 조건부 불멸화된 부착성 세포주로부터 단리될 수 있다. 일반적으로, 그러한 클로날 세포주는 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 제한 희석에 의해 또는 클로닝 링 (cloning ring)을 사용하여 단리하고 팽창시킬 수 있다. 클로날 세포주는 일반적으로 상기 설명된 바와 같이 공급되고 계대배양될 수 있다.

클로날일 수 있지만 그러할 필요가 없는 조건부 불멸화된 인간 양막 유래 부착성 세포주는 일반적으로 분화를 용이하게 하는 배양 조건 하에 성장-촉진 단백질의 생산 및/또는 활성을 억제함으로써 분화하도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 성장-촉진 단백질을 코딩하는 유전자가 외부에서 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있으면, 성장-촉진 유전자의 전사를 억제하도록 조건, 예를 들어, 배지의 온도 또는 조성을 변형시킬 수 있다. 상기 논의된 테트라사이클린-제어된 유전자 발현 시스템에 있어서, 분화는 성장-촉진 유전자의 전사를 억제하기 위해 테트라사이클린의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 일반적으로, 분화를 개시하기 위해 4-5일 동안 1 ㎍/mL 테트라사이클린이 충분하다. 추가의 분화를 촉진하기 위해, 추가의 물질을 성장 배지 내에 포함시킬 수 있다.

5.10 양막 유래 부착성 세포를 사용한 치료 방법

5.10.1 순환계 질병

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포, 상기 세포의 집단, 및 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단은 혈관신생이 유익할 다양한 질병 상태 또는 병태를 보이는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 질병 상태 또는 병태의 예는 심근경색, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 말초 동맥 질병, 좌심 발육부전 증후군, 당뇨성 궤양, 욕창성 궤양, 정맥 궤양, 동맥 궤양, 화상, 불유합 골절, 종양 연관 골 손실, 골관절염 및 상악안면골 복원을 포함한다. 양막 유래 부착성 세포 및 상기 세포의 집단은 또한 외상성 조직 손실을 보이는 개체에서 혈관신생을 촉진하기 위해 또는 흉터 형성을 방지하기 위해, 또는 전체 관절 대체 또는 치과 보철을 한 개체에서 사용될 수 있다.

보다 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포 및 상기 세포의 집단은 순환계의 부전증이 있는 개체, 예를 들어, 말초혈관 질병 또는 관상 동맥 질병이 있는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

한 측면에서, 치료 세포 조성물을 심장 또는 순환계의 질병 또는 손상이 있는 환자에게 투여하고, 심장 기능의 개선에 대해 환자를 평가하는 것을 포함하는 심장 질병 또는 손상이 있는 환자의 치료 방법을 본원에서 제공하고, 여기서 상기 세포 조성물은 본원에서 설명되는 양막 유래 부착성 세포를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 심장 질병은 심근병증이다. 구체적인 실시양태에서, 심근병증은 특발성이거나, 원인이 알려진 심근병증이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 심근병증은 성질이 허혈성 또는 비허혈성이다. 또 다른 실시양태에서, 심장 또는 순환계의 질병은 혈관성형술, 동맥류, 협심증, 대동맥 협착증, 대동맥염, 부정맥, 동맥경화증, 동맥염, 비대칭 중격 비대 (ASH), 죽상경화증, 심방세동 및 조동, 세균성 심내막염, 바로우 증후군 (승모판 탈출증), 서맥, 버거 질병 (폐색성 혈전혈관염), 심비대, 심근병증, 심장염, 경동맥 질병, 대동맥 축착, 선천성 심장 질병 (선천성 심내 결손증), 울혈성 심부전, 관상 동맥 질병, 아이젠멩거 증후군, 색전증, 심내막염, 홍색사지통증, 세동, 섬유근육 형성이상, 심차단, 심잡음, 고혈압, 저혈압, 특발성 영아 동맥 석회화, 가와사끼 질병 (점막피부성 림프절 증후군, 점막피부성 림프절 질병, 영아 다발성 동맥염), 대사 증후군, 미세혈관 협심증, 심근경색 (심장 마비), 심근염, 발작성 심방성 빈맥증 (PAT), 결절성 동맥주위염 (다발동맥염, 결절성 다발동맥염), 심장막염, 말초혈관 질병, 중증 하지 허혈, 당뇨병성 혈관병, 정맥염, 폐동맥 협착증, 레이노 질병, 신동맥 협착증, 신혈관성 고혈압, 류마티스성 심장 질병, 중격 결손, 무증상성 허혈, 증후군 X, 빈맥, 다까야스 동맥염, 팔로 사징증, 대혈관 전위증, 삼첨판 폐쇄증, 총동맥간증, 판막성 심장 질병, 정맥류성 궤양, 정맥류성 정맥, 혈관염, 심실 중격 결손, 월프-파킨슨-화이트 증후군, 또는 심내막 융기 결손 중 하나 이상을 포함한다.

다른 실시양태에서, 심장 또는 순환계의 질병은 급성 류마티스열, 급성 류마티스성 심장막염, 급성 류마티스성 심내막염, 급성 류마티스성 심근염, 만성 류마티스성 심장 질병, 승모판 질병, 승모판 협착증, 류마티스성 승모판 폐쇄 부전증, 대동맥 판막의 질병, 다른 심내막 구조의 질병, 허혈성 심장 질병 (급성 및 아급성), 협심증, 폐 순환의 질병 (급성 폐성 심장 질병, 폐 색전증, 만성 폐성 심장 질병), 척추 후측만곡성 심장 질병, 심근염, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 심내막 탄력섬유증, 방실 차단, 심장 부정맥, 심근 변성, 순환계의 질병, 예를 들어 뇌혈관 질병, 뇌전 동맥의 폐색 및 협착증, 뇌동맥의 폐색, 동맥, 세동맥 및 모세혈관의 질병 (죽상경화증, 동맥류), 또는 정맥 및 림프관의 질병 중 하나 이상을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 치료는 또 다른 세포 종류와 함께 또는 그 없이 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 치료 세포 조성물을 사용한 심근병증이 있는 환자의 치료를 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 환자는 치료로부터, 예를 들어 다른 세포, 예를 들어 심장 내에 존재하는 줄기 세포 또는 전구 세포의 성장을 지지하는 세포의 능력으로부터, 조직의 조직 내성장 또는 혈관생성으로부터, 및 유익한 세포성 인자, 케모킨, 시토킨 등의 존재로부터 이익을 경험하지만, 세포는 환자 내에서 통합하거나 증식하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 세포를 사용한 치료적 처치로부터 이익을 얻지만, 세포는 환자 내에서 장기간 동안 생존하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 세포는 수, 생존력 또는 생화학적 활성이 점차 감쇠하고, 다른 실시양태에서 세포의 감쇠에는 활성, 예를 들어 성장, 분할 또는 생화학적 활성의 기간이 앞선다. 다른 실시양태에서, 늙은 생존불가능한 또는 심지어 죽은 세포가 유익한 치료 효과를 가질 수 있다.

순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 개선 (여기서, 개체에게 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포 또는 치료 조성물 투여한다)은 순환계 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 검출가능한 개선에 의해 평가 또는 입증할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 개선 (여기서, 개체에게 본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포 또는 치료 조성물을 투여한다)은 양막 유래 부착성 세포 투여 전의 개체에 비해 심장 기능의 하나 이상의 징후의 검출가능한 개선, 예를 들어, 흉부 심박출량 (CO), 심장 지수 (CI), 폐 동맥 쐐기압 (PAWP), 및 심장 지수 (CI), % 분획 단축 (%FS), 박출률 (EF), 좌심실 박출률 (LVEF); 좌심실 이완기말 직경 (LVEDD), 좌심실 수축기말 직경 (LVESD), 수축성 (예를 들어 dP/dt), 압력-용적 루프 (loop), 심장 일의 측정치, 심방 또는 심실 기능의 증가; 펌핑 효율의 증가, 펌핑 효율 손실 속도의 감소, 혈역동학적 기능 손실의 감소; 및 심근병증과 연관된 합병증의 감소 중 하나 이상의 검출가능한 개선의 입증에 의해 평가 또는 입증할 수 있다.

본원에서 제공되는 치료 조성물을 수여받는 개체의 개선은 또한 주관적인 척도, 예를 들어, 투여 후 자신의 건강 상태에 대한 개체의 자가-평가에 의해 평가할 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포의 투여의 성공은 투여된 양막 유래 부착성 세포의 개체 내의 생존에 기초하지 않는다. 대신에, 성공은 상기한 바와 같이 심장 또는 순환계 건강의 개선의 하나 이상의 척도에 기초한다. 따라서, 세포는 환자의 심장에 또는 혈관 내로 통합하여 박동할 필요가 없다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 치료 방법은 치료적 양막 유래 부착성 세포를 중간엽 계통을 따라, 예를 들어, 심근생성, 혈관신생 또는 혈관형성 표현형을 향해, 또는 근육세포, 심근세포, 내피 세포, 심근 세포, 심장외막 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포 (예를 들어, 혈관 평활근 세포)와 같은 세포로 분화하도록 유도하는 것을 포함한다.

그를 필요로 하는 개체에 대한 양막 유래 부착성 세포, 또는 그러한 세포를 포함하는 치료 조성물의 투여는 예를 들어, 이식, 삽입 (예를 들어, 세포 자체의 또는 매트릭스-세포 조합물의 일부로서 세포의), 주사 (예를 들어, 질병 또는 병태의 부위에 직접, 예를 들어, 심근경색이 있는 개체의 심장에서 허혈 부위에 직접), 주입, 카테터를 통한 전달, 또는 세포 요법을 제공하기 위해 당업계에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 달성할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 치료 세포 조성물은 그를 필요로 하는 개체에게 예를 들어, 개체에서 하나 이상의 부위로의 주사에 의해 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 치료 세포 조성물은 예를 들어, 심장 내의 허혈 영역으로 심장내 주사에 의해 제공된다. 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 심장의 표면 상에, 인접 영역으로, 또는 심지어 보다 먼 영역으로 주사된다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 질병에 걸린 또는 손상된 영역으로 향할 수 있다.

관상 또는 혈관계의 질병 또는 병태가 있는 개체에게 양막 유래 부착성 세포를 세포가 치료상 유익할 임의의 시간에 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 치료 조성물은 심근경색의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 이내에 투여된다. 심근경색에 근접한 시간대, 예를 들어, 1-3 또는 1-7일 내의 투여가 심근경색에 먼 시간대, 예를 들어, 3 또는 7일 후의 투여에 비해 더 바람직하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 치료 조성물은 질병 또는 병태의 최초 진단의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 이내에 투여된다.

심근경색의 치료에 사용하기 위한 키트를 또한 본원에서 제공한다. 키트는 예를 들어 제약상 허용되는 담체와 혼합함으로써 제약상 허용되는 형태로 제조될 수 있는 치료 세포 조성물, 및 어플리케이터 (applicator)를 사용지시서와 함께 제공한다. 이상적으로, 키트는 심근경색 또는 유사한 심장 사건이 있었던 것으로 진단된 환자에게 적용되도록 현장에서, 예를 들어 진료실에서, 또는 응급 치료 제공자에 의해 사용될 수 있다.

본원에서 제공되는 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 줄기 세포 (즉, 양막 유래 부착성 세포가 아닌 줄기 세포), 근육모세포, 근육세포, 심근모세포, 심근세포, 또는 근육모세포, 근육세포, 심근모세포 및/또는 심근세포의 전구세포와 함께 투여된다.

구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 치료 방법은 양막 유래 부착성 세포, 예를 들어, 상기 세포를 포함하는 치료 조성물을 심장 또는 순환계의 질병이 있는 환자에게 투여하고; 심장 기능의 개선에 대해 환자를 평가하는 것을 포함하고, 여기서 치료 세포 조성물은 매트릭스-세포 복합체로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 매트릭스는 적어도 상기 세포를 포함하는 스캐폴드, 바람직하게는 생체흡수성 스캐폴드이다.

이를 위해, 심장발생, 혈관신생, 헴혈관신생 (hemangiogenic), 또는 혈관형성 경로를 따라 줄기 또는 전구 세포 분화를 자극하는 하나 이상의 인자의 존재 하에 인큐베이팅된 양막 유래 부착성 세포의 집단을 본원에서 제공한다. 그러한 인자는 당업계에 공지되어 있고; 분화를 위한 적합한 조건의 결정은 일상적인 실험으로 달성할 수 있다. 그러한 인자는 성장 인자, 케모킨, 시토킨, 세포 생성물, 탈메틸화제, 및 심장발생, 혈관신생, 헴혈관신생, 또는 혈관형성 경로 또는 계통을 따라 예를 들어, 줄기 세포의 분화를 자극하는 것으로 현재 공지되거나 나중에 결정되는 다른 자극과 같은 인자를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

양막 유래 부착성 세포는 탈메틸화제, BMP, FGF, Wnt 인자 단백질, 헤지호그 (Hedgehog), 및/또는 항-Wnt 인자 중 적어도 하나를 포함하는 인자의 존재 하에 세포의 배양에 의해 심장발생, 혈관신생, 헴혈관신생 또는 혈관형성 경로 또는 계통을 따라 분화될 수 있다.

탈메틸화제의 포함은 세포가 중간엽 라인을 따라 심근생성 경로를 향하여 분화하도록 허용하는 경향이 있다. 분화는 예를 들어, 심장미오신, 골격 미오신, 또는 GATA4 중 적어도 하나의 발현에 의해; 또는 자발적이거나 달리 유도된 박동 리듬의 획득에 의해; 또는 부정맥을 유도하지 않으면서 적어도 부분적으로 환자의 심장 근육 내로 통합하는 능력에 의해 결정할 수 있다. 그러한 분화를 개시시키기 위해 사용될 수 있는 탈메틸화제는 5-아자시티딘, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 디메틸술폭시드, 켈레리트린 클로라이드, 레티노산 또는 그의 염, 2-아미노-4-(에틸티오)부티르산, 프로카인아미드, 및 프로카인을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본원의 특정 실시양태에서, 상기 확인된 하나 이상의 인자를 사용하여 유도된 세포는 심근생성, 혈관신생, 헴혈관신생 또는 혈관형성 세포, 또는 전구세포가 될 수 있다. 바람직하게는, 세포의 적어도 일부는 적어도 부분적으로, 심장의 심장 근육, 혈관 및 다른 구조체, 심장 또는 말초 혈관 등을 포함하고 이로 제한되는 않는 수여체의 심혈관계 내로 통합할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 분화된 양막 유래 부착성 세포는 심근생성 세포 또는 그들의 전구세포의 2개 이상의 징후를 획득하는 세포로 분화하고, 수여체의 심장 또는 혈관구조 내로 부분적으로 또는 완전히 통합할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 개체에게 투여되는 세포는 부정맥, 심내 결손, 혈관 결함, 또는 개체의 순환계 또는 건강의 다른 이상을 증가시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 예를 들어, 심근세포로, 또는 적어도 심근생성, 혈관신생, 헴혈관신생, 또는 혈관형성 라인을 따라 분화하는, 환자의 심장 근육, 혈관, 혈액 등에 자연적으로 존재하는 줄기 세포의 분화를 촉진하는 역할을 한다.

양막 유래 부착성 세포 및 상기 세포의 집단은 개체, 예를 들어, 심장 또는 순환계의 질병, 질환 또는 병태가 있거나 그에 침범하는 질병, 질환 또는 병태가 있는 개체에게 치료상 또는 예방상 제공될 수 있다. 그러한 질병, 질환 또는 병태는 죽상경화증, 심근병증, 또는 심장 손상, 예를 들어, 허혈성 손상, 예를 들어 심근경색 또는 상처 (급성 또는 만성)으로 인한 울혈성 심부전을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 개체에게 치료 유효량의 양막 유래 부착성 세포를, 예를 들어 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 세포 집단으로 투여한다. 구체적인 실시양태에서, 집단은 약 50% 양막 유래 부착성 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 집단은 양막 유래 부착성 세포의 실질적으로 균질한 집단이다. 다른 실시양태에서, 집단은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 33%, 40%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80%, 또는 90%의 양막 유래 부착성 세포를 포함한다.

양막 유래 부착성 세포는 개체에게 세포 및 또 다른 치료제, 예를 들어 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF), IL-8, 항혈전생성제 (예를 들어, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, 및 PPack (덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤); 항트롬빈 화합물, 혈소판 수용체 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 수용체 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제, 및/또는 혈소판 억제제), 항세포자멸제 (예를 들어, EPO, EPO 유도체 및 유사체, 및 그의 염, TPO, IGF-I, IGF-II, 간세포 성장 인자 (HGF), 또는 카스파제 억제제), 소염제 (예를 들어, P38 MAP 키나제 억제제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 억제제, 페미롤라스트 (Pemirolast), 트라닐라스트 (Tranilast), 레미케이드 (Remicade), 시롤리무스 (Sirolimus), 비스테로이드성 소염 화합물, 예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 테폭살린 (Tepoxalin), 톨메틴 (Tolmetin), 또는 수프로펜 (Suprofen)), 면역억제 또는 면역조정제 (예를 들어, 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린, 타크롤리무스 (Tacrolimus), mTOR 억제제, 예를 들어 시롤리무스 또는 에버롤리무스 (Everolimus)); 항증식제, 예를 들어 아자티오프린 및 미코페놀레이트 모페틸; 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론 또는 히드로코티손; 항체, 예를 들어 모노클로날 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맙 (Basiliximab), 다클리주마 (Daclizuma), 폴리클로날 항-T-세포 항체, 예를 들어 항-흉선세포 글로불린 (ATG), 항-림프구 글로불린 (ALG), 및 모노클로날 항-T 세포 항체 OKT3, 또는 그 개시내용 전체 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 7,468,276 및 미국 특허 출원 공개 2007/0275362에 기재된 부착성 태반 줄기 세포, 및/또는 항산화제 (예를 들어, 프로부콜; 비타민 A, C 및 E, 조효소 Q-10, 글루타티온, L 시스테인, N-아세틸시스테인, 또는 항산화제 유도체, 유사체 또는 상기한 것의 염)를 포함하는 치료 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 치료 조성물은 하나 이상의 추가의 세포 종류, 예를 들어, 성체 세포 (예를 들어, 섬유모세포 또는 내배엽 세포), 또는 줄기 또는 전구 세포를 추가로 포함한다. 그러한 치료제 및/또는 하나 이상의 추가의 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 개별적으로 또는 조합으로 또는 2개 이상의 그러한 화합물 또는 물질로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 치료할 개체는 포유동물이다. 구체적인 실시양태에서, 치료할 개체는 인간이다. 구체적인 실시양태에서, 개체는 가축 또는 애완용 동물이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 치료할 개체는 말, 양, 소 또는 수송아지, 돼지, 개 또는 고양이이다.

5.10.2 뇌졸중 및 다른 허혈성 질병

특정 실시양태에서, 개체에게 치료 유효량의 AMDAC를 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어, 뇌 내의 또는 주변에 또는 말초 혈관구조 내에 혈액 유동의 파괴가 있는 개체의 치료 방법을 본원에서 제공한다. 특정 구체적인 실시양태에서, 허혈은 말초 동맥 질병 (PAD), 예를 들어 중증 하지 허혈 (CLI)이다. 다른 특정 실시양태에서, 허혈은 중추 신경계 (CNS)의 허혈이다. 다른 특정 실시양태에서, 허혈은 말초 동맥 질병, 허혈성 혈관 질병, 허혈성 심장 질병, 허혈성 뇌 질병, 또는 허혈성 신장 질병이다.

구체적인 실시양태에서, 상기 혈액 유동의 파괴는 뇌졸중이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중, 예를 들어, 두개내 대뇌 출혈 또는 자발적 지주막하 출혈이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 파괴는 혈종이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 혈종은 경막 혈종, 경막하 혈종 또는 지주막하 혈종이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 혈종은 두개골 상의 외부 힘, 예를 들어 두부 손상에 의해 야기된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 파괴는 일과성 허혈성 발작 (TIA), 예를 들어, 재발성 TIA이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 파괴는 혈관연축, 예를 들어, 출혈성 뇌졸중 후의 혈관연축이다.

방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 치료 유효량은 상기 개체가 보이는 뇌 또는 CNS 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상 또는 그에 기여하는 신경학적 결손, 예를 들어, 무산소 손상 또는 저산소 손상의 제거, 검출가능한 개선, 중증도의 저하, 또는 진행의 저속화를 일으키는 AMDAC의 수이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 AMDAC의 상기 치료 유효량은 상기 개체에게 예를 들어, 상기 혈액 유동 파괴 이후 뇌 또는 CNS 내의 또는 주변의 제2 또는 후속적 혈액 유동 파괴에 의해 유발된 신경학적 손상을 감소 또는 제거하기 위해 예방상 투여된다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 예를 들어, 뇌졸중, 무산소 손상 또는 저산소 손상과 같은 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 상기 증상은 반신마비 (신체의 한쪽의 마비); 반부전마비 (신체의 한쪽의 약화); 얼굴의 근육 약화; 무감각; 감각의 감소; 변경된 후각, 미각, 청각 또는 시각; 후각, 미각, 청각 또는 시각 상실; 눈꺼풀 처짐 (안검하수); 눈 근육의 검출가능한 약화; 감소된 구역 반사; 감소된 연하 능력; 빛에 대한 감소된 동공 반응성; 감소된 얼굴 감각; 감소된 균형; 안구진탕; 변경된 호흡수; 변경된 심박수; 머리를 한쪽으로 돌리는 능력이 감소되거나 없는, 흉쇄유돌근의 약화; 혀의 약화; 실어증 (말을 하지 못하거나 언어를 이해하지 못함); 행위상실증 (변경된 수의 운동); 시야 결함; 기억 결핍; 편측무시 또는 편측공간 무시 (병변 반대측의 시야측 상의 공간에 대한 주의력 결핍); 와해된 (disorganized) 사고; 혼동; 과잉성행동 몸짓의 발생; 질병불각증 (결핍의 존재의 지속적인 부정); 보행 장애; 변경된 운동 조화; 현기증; 불균형; 의식 상실; 두통; 및/또는 구토 중 하나 이상이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 설명되는 치료 방법은 제2 치료제를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 치료제는 신경보호제이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 치료제는 NXY-059 (페닐부틸니트론의 디술포닐 유도체: 이나트륨 4-((tert-부틸이미노)-메틸)벤젠-1,3-디술포네이트 N-옥시드 또는 이나트륨 4-((옥시도-tert-부틸-아자뉴밀리덴)메틸)벤젠-1,3-디술포네이트; 디수펜톤으로도 알려짐)이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 제2 치료제는 혈전용해제이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 혈전용해제는 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA)이다. 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴가 출혈인 실시양태에서, 제2 치료제는 항고혈압약, 예를 들어, 베타 차단제 또는 이뇨 약물, 이뇨 약물과 칼륨-보전성 이뇨 약물의 조합물, 베타 차단제와 이뇨 약물의 조합물, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제와 이뇨제의 조합물, 안지오텐신-II 길항제 및 이뇨 약물, 및/또는 칼슘 채널 차단제 및 ACE 억제제일 수 있다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 제2 치료제는 칼슘 채널 차단제, 글루타메이트 길항제, 감마 아미노부티르산 (GABA) 효현제, 항산화제 또는 유리 라디칼 스캐벤저이다.

치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 21-30일, 예를 들어, 21일 내에, 예를 들어, 뇌졸중, 무산소 손상 또는 저산소 손상의 증상 발생의 21-30일, 예를 들어, 21일 내에 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 14일 내에 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 7일 내에 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 48시간 내에 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 24시간 내에 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 12시간 내에 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 상기 개체의 뇌 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상의 발생의 3시간 내에 투여된다.

구체적인 실시양태에서, 상기 혈액 유동 파괴는 중증 하지 허혈이다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CLI는 하지의 동맥의 중증 차단이고, 이는 혈류를 현저하게 감소시킨다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CLI는 허혈성 안정시 통증, 개인이 움직이지 않는 동안 다리 및 발의 중증 통증, 발 또는 다리 상의 비-치유성 미란 (sore), 발의 통증 또는 무감각, 다리 또는 발의 번질번질하고 평탄하고 건조한 피부, 발톱의 비후화, 다리 또는 발의 맥박의 부재 또는 감소, 개방성 미란, 치유되지 않을 피부 감염 또는 궤양, 다리 또는 발의 건성 괴저 (건조한 흑색 피부)를 특징으로 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, CLI는 손발가락 및/또는 전체 사지의 상실을 일으킬 수 있다. 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 치료 유효량은 상기 개체가 보이는 뇌 또는 CNS 내의 또는 주변의 혈액 유동 파괴의 하나 이상의 증상, 사지 기능의 손실 및/또는 그에 기여하는 산소 결핍 (저산소증/무산소증), 예를 들어, 무산소 손상 또는 저산소 손상의 제거, 검출가능한 개선, 중증도의 저하, 또는 진행의 저속화를 일으키는 AMDAC의 수이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 AMDAC의 상기 치료 유효량은 상기 개체에게 예를 들어 상기 혈액 유동 파괴 이후 사지 내의 또는 주변의 제2 또는 후속적 혈액 유동 파괴에 의해 유발된 조직 손상을 감소 또는 제거하기 위해 예방상 투여된다.

5.10.3 투여량 및 투여 경로

그를 필요로 하는 개체에게 AMDAC의 투여는 치료할 질병 또는 병태에 관련한 임의의 의학적으로 허용되는 경로에 의해 이루어질 수 있다. 상기한 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC는 볼러스 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 정맥내 주입은 약 1 내지 약 8시간에 걸친 정맥내 주입이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 두개내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 근육내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 복강내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 동맥내 투여된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 허혈 영역 내에 투여된다. 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 허혈에 대해 말초 영역에 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 근육내, 피부내, 또는 피하 투여된다.

상기한 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC는 상기 개체에게 1회 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 AMDAC는 상기 개체에게 2회 이상의 별개의 투여로 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁴ 내지 1 x 10⁵개의 단리된 AMDAC, 예를 들어, AMDAC를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁶개의 단리된 AMDAC를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁷개의 단리된 AMDAC를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 2 x 10⁶ 내지 약 3 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 3 x 10⁶ 내지 약 4 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 4 x 10⁶ 내지 약 5 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 5 x 10⁶ 내지 약 6 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 6 x 10⁶ 내지 약 7 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 7 x 10⁶ 내지 약 8 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 kg당 약 8 x 10⁶ 내지 약 9 x 10⁶개의 단리된 태반 세포; 또는 상기 개체 1 kg당 약 9 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 상기 개체 1 kg당 약 1 x 10⁷ 내지 약 2 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 상기 개체 1 kg당 약 1.3 x 10⁷ 내지 약 1.5 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 상기 개체 1 kg당 약 3 x 10⁷개까지의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 약 5 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 약 20 ml 용액 내의 약 150 x 10⁶개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 약 5 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 10% 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란-40, 5% 인간 혈청 알부민, 및 임의로 면역억제제를 포함하는 용액 내에 함유된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 약 5 x 10⁷ 내지 3 x 10⁹개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 약 9 x 10⁸개의 단리된 태반 세포 또는 약 1.8 x 10⁹개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 약 5 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸개의 단리된 태반 세포를 두개내 투여하는 것을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 약 9 x 10⁷개의 단리된 태반 세포를 두개내 투여하는 것을 포함한다.

5.11 양막 유래 부착성 세포의 분화

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포는 분화될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포는 예를 들어, 세포를 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 접촉시킴으로써 또는 아래 섹션 5.11.2, 6.3.3, 또는 6.3.4에 설명된 바와 같이, 상기 세포가 내피 세포, 근형성 세포, 또는 혈관주위세포의 적어도 하나의 특징을 보이도록 충분히 분화되었다. 보다 구체적인 실시양태에서, 내피 세포, 근형성 세포 또는 혈관주위 세포의 상기 특징은 CD9, CD31, CD54, CD102, NG2 (신경/아교 항원 2) 또는 알파 평활근 액틴 중 중 하나 이상의 발현이고, 이는 OCT-4^-, VEGFR2/KDR⁺, CD9⁺, CD54⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및 VE-카드헤린^-인 양막 세포에 비해 증가된다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 내피 세포, 근형성 세포 또는 혈관주위 세포의 상기 특징은 CD9, CD31, CD54, CD102, NG2 (신경/아교 항원 2) 또는 알파 평활근 액틴 중 하나 이상의 발현이고, 이는 OCT-4^-, VEGFR2/KDR⁺ 및 VEGFR1/Flt-1⁺인 양막 세포에 비해 증가된다.

5.11.1 혈관신생의 유도

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포로부터 혈관신생은 다음과 같이 달성할 수 있다. 양막 유래 부착성 세포를, 예를 들어 내피 세포 배지, 예를 들어, EGM®-2 (론자), 또는 60% DMEM-LG (깁코), 40% MCDB-201 (시그마); 2% 우태아 혈청 (하이클론 랩스.); 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1x 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 5 x 10^-9 M 덱사메타손 (시그마); 10^-4 M 아스코르브산 2-인산염 (시그마); 표피 성장 인자 10 ng/mL (R&D 시스템즈); 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D 시스템즈)를 포함하는 배지 내에서 계대배양 3으로 배양한다. 이어서, 세포를 MATRI 겔™, 또는 콜라겐-1을 포함하는 기재 상에, 예를 들어 96-웰 플레이트 내에서, 예를 들어 약 1.5 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 동일한 배지 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를, 예를 들어 약 10 내지 50 ng/ml로 포함하는, FBS (0-5% v/v)를 가진 DMEM 내에 플레이팅한다. 배지는 매주 약 2회 교환할 수 있다. 혈관신생은 예를 들어, 50X 내지 100X의 배율에서 현미경 하에 가시적인 혈관-유사 구조체의 발아 및 관 형성에 대한 세포의 시각 검사에 의해 입증된다.

5.11.2 심장 세포로의 분화 유도

본원에서 제공되는 양막 유래 부착성 세포의 근육성 (심장발생) 분화는 예를 들어, 세포를 심근세포로의 분화를 유도하는 세포 배양 조건에 놓음으로써 달성할 수 있다. 바람직한 심근세포 배지는 레티노산, 1 μM; 염기성 섬유모세포 성장 인자, 10 ng/mL; 및 전환 성장 인자 베타-1, 2 ng/mL; 및 표피 성장 인자, 100 ng/mL을 보충한 DMEM/20% CBS를 포함한다. KnockOut 혈청 대체물 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 CBS 대신 사용할 수 있다. 별법으로, 양막 유래 부착성 세포는 1 내지 100, 예를 들어, 50 ng/mL의 심장친화성 1을 보충한 DMEM/20% CBS 내에서 24시간 동안 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 양막 유래 부착성 세포는 5-7일 동안 단백질-비함유 배지 내에서 10-14일 배양된 후, 예를 들어, 인간 심근을 1% 제대혈 혈청을 보충한 1% HEPES 버퍼 내에서 균질화시킴으로서 생산된 인간 심근 추출액으로 자극할 수 있다.

분화는 예를 들어, RT/PCR에 의한 심장 액틴 유전자 발현의 입증에 의해, 또는 세포의 가시적인 박동에 의해 확인할 수 있다. 부착성 세포는 세포가 이들 특징 중 하나 이상을 보일 때 심장 세포로 분화된 것으로 간주된다.

6. 실시예

6.1 실시예 1: 양막으로부터 부착성 세포의 단리 및 팽창

본 실시예는 양막 유래 부착성 세포의 단리 및 팽창을 입증한다.

6.1.1 단리

양막 유래 부착성 세포는 다음과 같이 양막으로부터 단리하였다. 양막/융모막을 태반으로부터 절단하고, 양막을 융모막으로부터 수동으로 분리하였다. 양막을 멸균 PBS로 세정하여 잔류 혈액, 혈병 및 다른 물질을 제거하였다. 멸균 거즈를 사용하여, 세정에 의해 제거되지 않은 추가의 혈액, 혈병 또는 다른 물질을 제거하고, 양막을 PBS로 다시 세정하였다. 과잉의 PBS를 막으로부터 제거하고, 양막을 스캘펄 (scalpel)로 2" x 2" 절편으로 절단하였다. 상피 세포 방출을 위해, 멸균 자켓형 (jacketed) 유리 처리 용기를 튜브 및 커넥터 (connector)를 이용하여 순환식 37℃ 수조에 연결함으로써 처리 용기를 설치하고 교반 플레이트 상에 장치하였다. 트립신 (0.25%, 300 mL)을 처리 용기 내에서 37℃로 가온하고; 양막 절편을 첨가하고, 양막/트립신 현탁액을 예를 들어, 100 RPM-150 RPM에서 37℃에서 15분 동안 교반하였다. 멸균 수용기 (receptacle)를 처리 용기 다음의 멸균 필드 상에 놓고 멸균 75 ㎛ 내지 125 ㎛ 스크린을 수용기 내로 삽입함으로써 멸균 스크리닝 시스템을 조립하였다 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카). 양막 절편을 15분 동안 교반한 후, 처리 용기의 내용물을 스크린에 옮기고, 예를 들어, 멸균 족집게 (tweezer)를 사용하여 양막 절편을 처리 용기로 다시 옮기고; 상피 세포를 함유하는 트립신 용액을 폐기하였다. 양막 절편을 상기 설명된 바와 같이 다시 300 mL 트립신 용액 (0.25%)과 함께 교반하였다. 스크린을 약 100-150 mL의 PBS로 세정하고, PBS 용액을 폐기하였다. 양막 절편을 15분 동안 교반한 후, 처리 용기의 내용물을 스크린으로 옮겼다. 이어서, 양막 절편을 다시 처리 용기으로 옮기고; 상피 세포를 함유하는 트립신 용액을 폐기하였다. 양막 절편을 상기 설명된 바와 같이 다시 300 mL 트립신 용액 (0.25%)과 함께 교반하였다. 스크린을 약 100-150 mL의 PBS로 세정하고, PBS 용액을 폐기하였다. 양막 절편을 15분 동안 교반한 후, 처리 용기의 내용물을 스크린으로 옮겼다. 이어서, 양막 절편을 다시 처리 용기로 옮기고, 상피 세포를 함유하는 트립신 용액을 폐기하였다. 양막 절편을 PBS/5% FBS (1:1 부피 비의 양막 대 PBS/5% FBS 용액) 내에서 37℃에서 약 2-5분 동안 교반하여 트립신을 중화시켰다. 신선한 멸균 스크린 시스템을 조립하였다. 트립신을 중화시킨 후, 처리 용기의 내용물을 새로운 스크린으로 옮기고, 양막 절편을 다시 처리 용기로 옮겼다. 실온, 멸균 PBS (400 mL)를 처리 용기에 첨가하고, 처리 용기의 내용물을 약 2-5분 동안 교반하였다. 스크린을 약 100-150 mL의 PBS로 세정하였다. 교반 후에, 처리 용기의 내용물을 스크린으로 옮기고; 처리 플라스크를 PBS로 세정하고, PBS 용액을 폐기하였다. 이어서, 처리 용기를 300 mL의 예온한 DMEM으로 채우고, 양막 절편을 DMEM 용액 내로 옮겼다.

양막 유래 부착성 세포의 방출을 위해, 처리된 양막을 다음과 같이 콜라게나제로 추가로 처리하였다. 멸균 콜라게나제 원액 용액 (500 U/mL)은 적절한 양의 콜라게나제 분말 (공급자로부터 받은 콜라게나제 로트의 활성이 다양함)을 DMEM 내에 용해시킴으로써 제조하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 개별 멸균 용기에 분배하였다. CaCl₂ 용액 (0.5 mL, 600 mM)을 각각의 100 mL 용량에 첨가하고, 용량을 동결시켰다. 콜라게나제 (100 mL)를 처리 용기 내의 양막 절편에 첨가하고, 처리 용기를 30-50분 동안 또는 시각 검사에 의해 양막 소화가 완료될 때까지 교반하였다. 양막 소화가 완료된 후, 100 mL의 예온한 멸균 PBS/5% FBS를 처리 용기에 첨가하고, 처리 용기를 추가로 2-3분 동안 교반하였다. 교반 후에, 플라스크의 내용물을 멸균 60 ㎛ 스크린으로 옮기고, 액체를 진공 여과에 의해 수집하였다. 처리 용기를 400 mL의 PBS로 세정하고, PBS 용액을 멸균-여과하였다. 이어서, 여과된 세포 현탁액을 300xg에서 15분 동안 20℃에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 예온한 PBS/2% FBS (총 약 10 mL) 내에 재현탁시켰다.

6.1.2 확립

신선하게 단리된 혈관신생 양막 세포를 60% DMEM-LG (깁코); 40% MCBD-201 (시그마); 2% FBS (하이클론 랩스), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 10 ng/mL 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 1 n-덱사메타손 (시그마); 100 μM 아스코르브산 2-인산염 (시그마); 10 ng/mL 표피 성장 인자 (R&D 시스템즈); 및 10 ng/mL 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) (R&D 시스템즈)를 함유하는 성장 배지에 첨가하고, T-플라스크 내에 10,000 세포/cm²의 접종 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 배양 장치(들)을 >90% 습도에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이팅하였다. 세포 부착, 성장 및 형태를 매일 모니터링하였다. 비-부착성 세포 및 부스러기는 배지 교환에 의해 제거하였다. 배지 교환은 매주 2회 수행하였다. 전형적인 섬유모세포형/방추형 (spindle) 형태를 갖는 부착성 세포는 초기 플레이팅의 수일 후에 나타났다. 합류가 40%-70%에 도달할 때 (초기 플레이팅의 4-11일 후에), 세포는 5분 동안 실온 (37℃)에서 트립신 처리 (0.25% 트립신-EDTA)에 의해 수거하였다. PBS-5%FBS로 중화한 후에, 세포를 200-400 g에서 5-15분 동안 실온에서 원심분리한 후, 성장 배지 내에 재현탁시켰다. 상기 시점에서, AMDAC 라인은 초기 계대배양에서 성공적으로 확립된 것으로 간주되었다. 초기 계대배양 양막 유래 부착성 세포를 일부 경우에 냉동보존하거나 팽창시켰다.

6.1.3 배양 절차

양막 유래 부착성 세포를 상기한 성장 배지 내에서 배양하고, 2000-4000개/cm²의 밀도로 적절한 조직 배양액-처리된 배양 장치(들) 내에 접종하였다. 이어서, 배양 장치(들)을 >90% 습도에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이팅하였다. 배양하는 동안, AMDAC는 부착하고 증식할 것이다. 세포 성장, 형태 및 합류를 매일 모니터링하였다. 배양액을 5일 또는 그 초과로 팽창시키면, 신선한 영양분을 보충하기 위해 배지 교환을 매주 2회 수행하였다. 합류가 40%-70%에 도달할 때 (접종의 3-7일 후에), 세포는 5분 동안 실온 (37℃)에서 트립신 처리 (0.05%-0.25% 트립신-EDTA)에 의해 수거하였다. PBS-5%FBS로 중화시킨 후에, 세포를 200-400 g에서 5-15분 동안 실온에서 원심분리한 후, 성장 배지 내에 재현탁시켰다.

상기 방식으로 단리하고 배양한 AMDAC는 대개 플레이팅된 1 x 10⁶개의 세포로부터 33530+/-15090 콜로니-형성 단위 (섬유모세포) (CFU-F)를 생산하였다.

6.2 실시예 2: 양막 유래 부착성 세포의 표현형 특징

6.2.1 유전자 및 단백질 발현 프로파일

본 실시예는 특징적인 세포 표면 마커, mRNA, 및 단백체 (proteomic) 발현을 포함하여 양막 유래 부착성 세포의 표현형 특성 결정을 설명한다.

샘플 제조: 양막 유래 부착성 세포는 실시예 1에 설명된 바와 같이 얻었다. 계대배양 6의 세포를 상기 실시예 1에서 설명한 바와 같이 성장 배지에서 약 70% 합류로 성장시키고, 트립신으로 처리하고, PBS 내에서 세척하였다. NTERA-2 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC 번호 CRL-1973)를 4.5 g/L 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 내에 성장시켰다. 유핵 세포를 계수하여 최소 2 x 10⁶ 내지 1 x 10⁷개의 세포를 얻었다. 이어서, 세포를 QIAshredder를 이용하여 퀴아겐 (Qiagen) RNeasy 키트 (퀴아겐, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 용해시켜 용해물을 얻었다. 이어서, RNA 단리는 퀴아겐 RNeasy 키트를 사용하여 수행하였다. RNA 양 및 질은 나노드롭 (Nanodrop) ND1000 분광광도계, 25 ng/μL의 RNA/반응을 사용하여 결정하였다. cDNA 반응물은 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티) 하이 커패시티 (High Capacity) cDNA 아카이브 (Archive) 키트를 사용하여 제조하였다. 실시간 PCR 반응은 어플라이드 바이오시스템즈의 타크만® 범용 (universal) PCR 매스터 믹스 (master mix)를 사용하여 수행하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 7300 실시간 PCR 시스템에서 표준 방식으로 40 사이클 동안 반응을 진행하였다.

샘플 분석 및 결과: 실시간 PCR 방법 및 특이적 타크만® 유전자 발현 프로브 및/또는 타크만® 인간 혈관신생 어레이 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여, 세포는 줄기 세포-관련, 혈관신생 및 심근생성 마커의 발현에 대해 특성화되었다. 그 결과는 관련 세포 대조군에 비해 목적하는 유전자의 상대적인 발현, 또는 도처에서 발현되는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 (예를 들어, GAPDH, 18S, 또는 GUSB)에 비해 목적하는 유전자의 상대적인 발현 (델타 Ct)으로서 표현되었다.

양막 유래 부착성 세포는 다양한 줄기 세포 관련, 혈관신생 및 심근생성 유전자를 발현하고, NTERA-2 세포에 비해 OCT-4 발현의 상대적인 부재를 보였다. 표 1은 선택된 혈관신생, 심근생성, 및 줄기 세포 유전자의 발현을 요약한 것이다.

컬럼 "mRNA"는 특정 마커에 대한 mRNA의 존재 또는 부재가 각각의 경우에서 결정됨을 나타낸다.

별개의 실험에서, AMDAC는 아릴 탄화수소 수용체 핵 전위자 2 (ARNT2), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양인자 (BDNF), 아교-유래 신경영양인자 (GDNF), 뉴로트로핀 3 (NT-3), NT-5, 저산소증-유도 인자 1α (HIF1A), 저산소증-유도 단백질 2 (HIG2), 헴 옥시게나제 (디사이클링) 1 (HMOX1), 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타제 [Cu-Zn] (SOD3), 카탈라제 (CAT), 전환 성장 인자 β1 (TGFB1), 전환 성장 인자 β1 수용체 (TGFB1R), 및 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR/c-met)에 대한 유전자를 발현하는 것으로 추가로 밝혀졌다.

6.2.2 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 유동 세포측정

유동 세포측정은 세포의 정체를 규정하기 위해 양막 유래 부착성 세포의 표현형 마커를 정량하기 위한 방법으로 사용되었다. 세포 샘플을 동결된 원액으로부터 수득하였다. 해동 전 및 시약 제조 동안, 세포 바이알을 드라이 아이스 상에 유지하였다. 이어서, 샘플을 37℃ 수조를 사용하여 신속하게 해동하였다. 동결 세포의 사전 계수는 초기 해동 후 세포수 의존성 희석을 위한 계산을 위해 사용되었다. 간단히 설명하면, 냉동바이알을 부드럽게 교반하면서 약 30초 동안 37℃ 수조에서 해동하였다. 해동 직후에, 약 100-200 μL의 차가운 (2 내지 8℃) 해동 용액 (2.5% 알부민 및 5% 겐트란 (Gentran) 40이 존재하는 PBS)을 냉동바이알에 첨가하고, 혼합하였다. 부드럽게 혼합한 후, 냉동바이알 내의 총 부피를 동일 부피의 차가운 (2 내지 8℃) 해동 용액이 존재하는 15 mL 원추형 관으로 옮겼다. 세포를 원추형 관 내에서 400 g에서 5분 동안 실온에서 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다. 잔류 부피를 피펫으로 측정하고 (추정치); 잔류 부피 및 세포 펠렛을 실온에서 PBS 중의 1% FBS 내에 재현탁시켜 250 x 10³개 세포/100 μL 버퍼의 세포 농도를 얻었다. 예를 들어, 1 x 10⁶개의 세포를 400 μL 1% FBS 내에 재현탁시킬 것이다. 세포 현탁액을 예비-표지된 5 mL FACS 튜브 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson (BD), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)) 내에 넣었다. 각각의 1차 항체 이소형에 대해, 100 μL의 세포 현탁액을 하나의 이소형 대조군 튜브 내로 분취하였다. 표현형 분석 전에, 모든 항체의 농도는 잠재적인 4 로그 역동 범위 (four-log dynamic range)에 걸쳐 우수한 신호 대 노이즈 (noise) 비 및 CD 항원의 적당한 검출을 달성하기 위해 최적화되었다. 각각의 샘플을 염색하기 위해 사용된 각각의 이소형 및 샘플 항체의 부피를 결정하였다. 이소형 및 샘플 튜브 내의 항체의 양 (㎍)을 표준화하기 위해, 각각의 항체의 농도를 (1/실제 항체 농도 (㎍/μL)) x (2.5 x 10⁵ 세포에 대한 항체의 목적하는 최종 양 (㎍)) = 첨가된 항체의 # μL로 계산하였다. 이소형과 샘플 모두에 대한 항체의 매스터 믹스는 각각의 튜브에 첨가된 적절한 양의 항체로 제조하였다. 세포를 암소에서 실온에서 15-20분 동안 염색하였다. 염색 후에, 각각의 샘플 내의 미결합된 항체를 원심분리 (400 g x 5분)에 의해 제거한 후, 2 mL의 1% FBS PBS (실온)를 사용하여 세척하고, 150 μL의 실온 1% FBS PBS 내에 재현탁하였다. 이어서, 샘플을 제조자의 지시에 따라 사용하기 위해 제조된 벡톤 디킨슨 FACSCalibur, FACSCantoI 또는 BD FACSCantoII 유동 세포측정기로 분석하였다. 다중-파라미터 유동 세포측정 데이타 세트 (측면 산란검출기 (SSC), 전면 산란검출기 (FSC) 및 통합된 형광 프로파일 (FL))는 온-더-플라이 (on-the-fly) 기기 보상 파라미터를 설정하지 않으면서 얻었다. 보상 파라미터는 제조자의 지시에 따라 FACSDiva 소프트웨어를 사용한 획득 후에 결정하였다. 이들 기기 설정을 각각의 샘플에 적용하였다. 상기 연구에 사용된 형광단 접합체는 알로피코시아닌 (APC), 알렉사플루오르 (AlexaFluor) 647 (AF647), 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE) 및 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP) (모두 비디 바이오사이언시즈 제품)이었다. 표 2는 혈관신생 마커를 포함하는 선택된 세포-표면 마커의 발현을 요약한 것이다.

컬럼 "면역학적 위치 결정 유동 세포측정"은 특정 마커의 존재 또는 부재가 면역학적 위치 결정, 구체적으로 유동 세포측정에 의해 결정되었음을 나타낸다.

또 다른 실험에서, AMDAC 세포 항-인간 CD49f (클론 GoH3, 피코에리트린-접합됨; 비디 파밍엔 (BD Pharmingen) 파트 No. 555736)로 표지하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 약 96%의 AMDAC가 항-CD49f로 표지되었다 (즉, CD49f⁺이었다).

다른 실험에서, AMDAC는 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 CD49a, CD106, CD119, CD130, c-met (간세포 성장 인자 수용체; HGFR), CXC 케모킨 수용체 1 (CXCR1), PDGFRA, 및 PDGFRB를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 또한, AMDAC는 면역학적 위치 결정에 의해 CD49e, CD62E, 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 12A (TNFRSF12A), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R), CXCR2, CXCR3, CXCR4^-, CXCR6, 케모킨 수용체 1 (CCRl), CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R), 인슐린 수용체 (CD220), 인터류킨 수용체 4 (IL4-R; CD124), IL6-R (CD126), TNF-R1a 및 1b (CD120a, b), 및 erbB2/Her2의 발현이 결여된 것으로 밝혀졌다.

6.2.3 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 면역조직화학 (IHC)/면 역형 광화학 ( IFC )

계대배양 6의 양막 유래 부착성 세포를 4-웰 챔버 슬라이드 상에서 약 70% 합류까지 성장시키고, 각각 30분 동안 4% 포르말린 용액으로 고정하였다. 고정 후에, 슬라이드를 5분 동안 PBS로 2회 세정하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS 중의 2차 항체와 동일한 숙주로부터 10% 정상 혈청, 2x 카제인, 및 0.3% 트리톤 (Triton) X100과 함께 20분 동안 실온에서 항습 챔버 내에서 인큐베이팅하였다. 과잉 혈청을 제거하고, 슬라이드를 가습 챔버 내에서 1차 항체 (염소 폴리클로날 IgG (산타 크루즈 (Santa Cruz; 미국 캘리포니아주 산타 크루즈))와 함께 인큐베이팅하였다. 인큐베이션을 위한 시간 및 온도는 사용되는 항체에 대한 최적 조건을 선택함으로써 결정하였다. 일반적으로, 인큐베이션 시간은 37℃에서 1 내지 2시간 또는 4℃에서 철야이었다. 이어서, 슬라이드를 각각 5분 동안 PBS로 3회 세정하고, 1차 항체 (토끼 항-염소 항체 (산타 크루즈))의 숙주에 대해 생성된 형광-접합된 항-면역글로불린 2차 항체와 함께 항습 챔버 내에서 20-30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 그 후, 슬라이드를 각각 5분 동안 PBS로 3회 세정하고, 핵을 대조염색하기 위해 DAPI VECTASHIELD® (벡터 랩스 (Vector Labs)) 마운팅 (mounting) 용액을 이용하여 커버슬립을 탑재하였다. 니콘 (Nikon) 형광 현미경을 이용하여 세포 염색을 시각화하였다. 모든 사진은 상응하는 이소형 (염소 IgG (산타 크루즈))의 배경에 대해 표준화된 동일한 노출 시간에 찍었다. 표 3은 양막 유래 부착성 세포에 의한 혈관신생 단백질의 발현에 대한 결과를 요약한 것이다.

양막 유래 부착성 세포는 표 3에 제시된 단백질 중 하나인 혈관신생 마커 종양 내피 마커 7 (TEM-7)을 발현하였다 (도 2 참조).

6.2.4 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 막 단백체학

막 단백질 정제: 계대배양 6의 세포를 성장 배지 내에서 약 70% 합류로 성장시키고, 트립신 처리하고, PBS 내에 세척하였다. 이어서, 세포를 세포 용해에 앞서 프로테아제 억제제 칵테일 (P8340, 시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)을 함유하는 용액과 함께 15분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 10 mM HCl 용액을 첨가하여 용해시키고 (따라서, 세제 사용을 피함), 10분 동안 400 g에서 원심분리하여 핵을 펠렛화하여 제거하였다. 핵후 (post-nuclear) 상등액을 초원심분리관에 옮기고, T-1270 회전자가 있는 WX80 초원심분리기 (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific, 미국 노쓰캐롤리나주 애쉬빌))를 사용하여 100,000 g에서 150분 동안 원심분리하여 막 단백질 펠렛을 생성하였다.

프로테오리포좀 ( proteoliposome )의 생성, 고정 및 소화: 막 단백질 펠렛을 나노닉스 (Nanoxis) 버퍼 (10 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8)를 사용하여 수회 세척하였다. 막 단백질 펠렛을 1.5 mL의 나노닉스 버퍼 내에 현탁시킨 후, 20분 동안 얼음 상에서 VIBRA-CELL™ VC505 초음파 분산기 (소닉스 앤 머티리얼스, 인크. (Sonics & Materials, Inc., 미국 커텍티컷주 뉴타운))를 사용하여 팁-초음파분리하였다. 프로테오리포좀의 크기는 FM1-43 염료 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용한 염색에 의해 결정하고 형광 현미경으로 시각화하였다. 프로테오리포좀 현탁액의 단백질 농도는 BCA 검정 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))에 의해 결정하였다. 이어서, 프로테오리포좀을 표준 피펫 팁을 사용하여 LPI™ Flow Cell (나녹시스 아베 (Nanoxis AB, 스웨덴 고덴부르크) 상에 주입하고 1시간 동안 고정시켰다. 고정 후에, 일련의 세척 단계를 수행하고, 5 ㎍/mL에서 트립신 (프린스톤 세퍼레이션스 (Princeton Separations,미국 뉴저지주 아델피))을 LPI™ Flow Cell 상에 직접 주입하였다. 칩을 37℃에서 철야 인큐베이팅하고, 트립신 분해 펩티드를 LPI™ 칩으로부터 용출시킨 후, Sep-Pak 카트리지 (워터스 코퍼레이션 (Waters Corporation, 미국 매사추세츠주 밀포드))를 이용하여 탈염시켰다.

LTQ 선형 이온 포착 LC / MS / MS 분석: 각각의 트립신 분해 소화 샘플을 180분 구배 (버퍼 A: 물, 0.1% 포름산; 버퍼 B: 아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 사용하여 축 탈용매화 (axial desolvation) 진공-보조 나노모세관 전기분사 이온화 (ADVANCE) 공급원 (미크롬 바이오소시스, 인크.)에 직접 연결된 0.2 mm x 150 mm 3 ㎛ 200Å MAGIC C18 컬럼 (미크롬 바이오리소시스, 인크. (Michrom Bioresources, Inc. 미국 캘리포니아주 오스번) 상에서 분리하였다. ADVANCE 공급원은 3 μL/min의 상당히 더 높은 유속에서 작동하면서 전통적인 nanoESI에 대등한 감도를 달성한다. 각각의 전체 스캔 질량 스펙트럼 다음에 10개의 데이타-의존 MS/MS 스캔을 사용한 LTQ 선형 이온 포착 질량 분광계 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 캘리포니아주 산 호세))로 용출 펩티드를 분석하였다. 7개의 분석적 반복 실험 데이타세트를 각각의 생물학적 샘플에 대해 수집하였다.

생물정보학 ( Bioinformatics ): 각각의 세포주에 대해 수집한 7개의 분석적 반복 실험 데이타세트에 대응하는 7개의 RAW 파일을 소서러 솔로 (Sorcerer Solo)™ 워크스테이션 (세이지-엔 리써치 (Sage-N Research, 미국 캘리포니아주 산 호세))에서 SEQUEST 알고리즘을 실행시켜 IPI 인간 데이타베이스에 대한 단일 검색으로서 검색하였다. 1.2 amu의 펩티드 질량 오차가 특정되었고, 메티오닌의 산화가 차별적인 변형으로서 특정되었고, 카르바미도메틸화가 정적 변형으로서 특정되었다. 트랜스-프로테오믹 파이프라인 (Trans-Proteomic Pipeline) (TPP)의 스캐폴드 소프트웨어 실행은 막 단백체 데이타의 분류 및 분석을 위해 사용되었다. 단백질은 펩티드 확률 95%, 단백질 확률 95% 및 1 특유 (unique) 펩티드인 것으로 확인될 경우에 분석에 고려되었다. 막 단백체 데이타세트는 사내에서 개발한 커스텀 펄 스트립트 (custom Perl script)를 사용하여 비교하였다.

결과: 표 4에 제시된 바와 같이, 양막 유래 부착성 세포는 다양한 혈관신생 및 심근생성 마커를 발현하였다.

6.2.5 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 분비단백질체 (secretome) 프로파일링

단백질 어레이: 계대배양 6의 양막 유래 부착성 세포를 성장 배지에 동일한 세포수로 플레이팅하고, 조건화 배지를 4일 후에 수집하였다. 세포-조건화 배지 내의 다수의 혈관신생 시토킨/성장 인자에 대한 동시의 정량적 분석을 레이바이오테크 (RayBiotech) 혈관신생 단백질 어레이 (미국 조지아주 노르크로스)를 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 단백질 어레이를 2 mL 1X 차단 버퍼 (레이 바이오테크 (Ray Biotech))로 실온에서 30분 (min) 동안 인큐베이팅하여 막을 차단하였다. 후속적으로, 차단 버퍼를 따라내고, 막을 1 mL의 샘플 (4일 동안 각각의 세포에 의해 조건화된 성장 배지)과 함께 실온에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 샘플을 따라내고, 막을 교반하면서 2 mL의 1X 세척 버퍼 I (레이 바이오테크)로 실온에서 3 x 5 min 세척하였다. 이어서, 막을 교반하면서 2 mL의 1X 세척 버퍼 II (레이 바이오테크)로 실온에서 2 x 5 min 세척하였다. 그 후, 1 mL의 희석된 비오틴-접합된 항체 (레이 바이오테크)를 각각의 막에 첨가하고, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이팅하고 상기 설명된 바와 같이 세척 버퍼로 세척하였다. 이어서, 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (2 mL)을 각각의 막에 첨가하고, 막을 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 막을 다시 세척하고, 설명서에 따라 ECL™ 검출 키트 (아머샴 (Amersham))로 인큐베이팅하고, 코닥 (Kodak) 겔 로직 (Gel Logic) 2200 영상화 시스템을 사용하여 결과를 시각화하고 분석하였다. AMDAC에 의한 다양한 혈관신생 단백질의 분비는 도 3에 제시한다.

ELISA: 세포-조건화 배지의 단일 혈관신생 시토킨/성장 인자의 정량적 분석은 R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스)의 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, ELISA 검정을 제조자의 지시에 따라 수행하고, 조건화 배지 내의 각각의 혈관신생 성장 인자의 양을 1 x 10⁶개의 세포로 표준화하였다. 양막 유래 부착성 세포 (n = 6)는 100만 개의 세포당 약 4500 pg VEGF 및 100만 개의 세포당 약 17,200 pg IL-8을 보였다.

별개의 실험에서, AMDAC는 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, PECAM-1 (CD31; 혈소판 내피 세포 부착 분자), 라미닌 및 피브로넥틴도 분비하는 것으로 확인되었다.

6.2.6 AMDAC 마이크로 RNA 발현은 혈관신생 활성을 입증한다

본 실시예는 AMDAC가 각각 혈관신생 기능과 서로 관련되는, 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준의 특정 마이크로RNA (miRNA), 및 더 낮은 수준의 다른 특정 miRNA를 발현함을 보여준다.

혈관신생 촉진 (pro-angiogenic) miR-296은 성장 인자 수용체 수준의 조절을 통해 혈관신생 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 내피 세포 내의 miR-296은 간세포 성장 인자-조절된 티로신 키나제 기질 (HGS) mRNA를 직접 표적화하여 감소된 수준의 HGS를 유도하고 이에 의해 성장 인자 수용체 VEGFR2 및 PDGFRb의 HGS-매개 분해를 감소시킴으로써 혈관신생에 유의하게 기여한다 (문헌 [Wuerdinger et al., Cancer Cell 14:382-393 (2008)] 참조). 또한, miR-15b 및 miR-16은 혈관신생에 관련되는 중요한 혈관신생 촉진 인자인 VEGF의 발현을 조절하고, miR-15b 및 miR-16의 저산소증-유도된 감소는 혈관신생 촉진 시토킨인 VEGF의 증가에 기여하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Kuelbacher et al., Trends in Pharmacological Sciences, 29(1):12-15 (2007)] 참조).

AMDAC를 상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조하였다. 미르바나 (MIRVANA)™ miRNA 단리 키트 (앰비온 (Ambion), Cat# 1560))를 사용하여 AMDAC 및 BM-MSC 세포 (비교 대상으로 사용)로부터 마이크로RNA (miRNA)를 제조하였다. 0.5 x 10⁶ 내지 1.5 x 10⁶개의 세포를 변성 용해 버퍼 내에서 파괴하였다. 이어서, 샘플을 산-페놀+클로로포름으로 추출하여 작은 RNA 종에 대해 고농축된 RNA를 단리하였다. 100% 에탄올을 첨가하여 샘플을 25% 에탄올 농도로 만들었다. 상기 용해물/에탄올 혼합물을 유리 섬유 필터를 통해 통과시킬 때, 큰 RNA는 고정되고, 작은 RNA 종은 여액에 수집되었다. 이어서, 여액의 에탄올 농도를 55%로 증가시키고, 혼합물을 작은 RNA가 고정되는 제2 유리 섬유 필터를 통과시켰다. 상기 RNA를 세척하고, 낮은 이온 강도 용액 내에서 용출하였다. 회수된 작은 RNA의 농도 및 순도는 260 및 280 nm에서 그의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

AMDAC는 다음과 같은 혈관신생 miRNA를 발현하는 것으로 밝혀졌다: miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, (혈관신생성 miRNA 클러스터 17-92의 멤버), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. AMDAC는 또한 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC)에 비해 다음과 같은 혈관신생 miRNA를 더 높은 수준으로 발현하는 것으로 밝혀졌다: miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 (혈관신생성 miRNA 클러스터 17-92의 멤버), miR-296. 이들 결과는 AMDAC가 높은 수준의 VEGFR2/KDR을 발현한다는 관찰과 밀접하게 상호관련된다 (위 참조). 이와 반대로, AMDAC는 BM-MSC에 비해 다음 혈관신생성 miRNA를 더 낮은 수준으로 발현하는 것으로 밝혀졌다: miR-20a, miR-20b, (혈관신생성 miRNA 클러스터 17-92의 멤버), miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. miR-15b 및 miR-16의 감소된 발현은 AMDAC에서 관찰된 VEGF의 보다 높은 수준의 발현과 상호관련되었다.

6.3 실시예 3: 양막 유래 부착성 세포의 기능적 특성 결정

본 실시예는 혈관신생 및 분화능과 연관된 AMDAC의 상이한 특징을 보여준다.

6.3.1 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 HUVEC 관 형성

인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 EGM-2 배지 (캄브렉스 (Cambrex, 미국 뉴저지주 이스트 루터포드))에서 3일 동안 계대배양 3 이하로 계대배양하고, 약 70%-80%의 합류에서 수거하였다. HUVEC를 기초 배지/항생제 (DMEM/F12 (깁코))로 1회 세척하고, 동일한 배지 내에 목적하는 농도로 재현탁시켰다. HUVEC는 제조 1시간 이내에 사용하였다. 인간 태반 콜라겐 (HPC)을 10 mM HCl (pH 2.25) 내에 1.5 mg/mL의 농도로 넣고, 버퍼를 사용하여 pH 7.2로 "중화"하고, 사용시까지 빙상에 유지시켰다. HPC를 4000 세포/㎕의 최종 세포 농도로 HUVEC 현탁액과 조합하였다. 생성되는 HUVEC/HPC 현탁액을 즉시 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트에 3 ㎕/웰로 분배하였다 (플레이트 주위는 증발을 방지하기 위해서 멸균 PBS로 미리 충전하여야 한다; 조건당 n = 5). HUVEC 방울을 콜라겐 중합화를 위해 배지를 첨가하지 않으면서 37℃ 및 5% CO₂에서 75-90분 동안 인큐베이팅하였다. "건식" 인큐베이션의 완료시에, 각각의 웰을 200 ㎕의 조건화된 AMDAC 배지 (n = 5 세포주) 또는 대조군 배지 (예를 들어, 음성 대조군으로서 DMEM/F12, 및 양성 대조군으로서 EGM-2)로 부드럽게 채우고, 37℃ 및 5% CO₂에서 20시간 동안 인큐베이팅하였다. 조건화 배지는 계대배양 6에서 양막 유래 부착성 세포를 성장 배지 내에서 4 - 6시간 동안 인큐베이팅함으로써 제조하고; 부착 및 도말 후에, 배지를 24시간 동안 DMEM/F12로 변경하였다. 인큐베이션 후에, HUVEC 방울을 휘젓지 않으면서 배지를 웰로부터 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, HUVEC 방울을 10초 동안 고정하고, Diff-Quik 세포 염색 키트로 1분 동안 염색한 후, 멸균수로 3회 세정하였다. 염색된 방울을 공기 건조하고, 각각의 웰의 영상을 자이스 스테레오 디스카버리 (Zeiss SteReo Discovery) V8 현미경을 사용하여 얻었다. 이어서, 영상을 컴퓨터 소프트웨어 패키지 "ImageJ" 및/또는 MatLab을 사용하여 분석하였다. 영상을 컬러로부터 8-비트 그레이 스케일 (grayscale) 영상으로 전환하고, 흑백 영상으로 전환하기 위해 한계점에 적용하였다. 이어서, 영상을 입자 분석 특징을 사용하여 분석하고, 이를 통해 계수 (개별 입자의 수), 총 면적, 평균 크기 (개별 입자의), 및 검정에서 내피 관 형성량에 동등시되는 면적비를 포함하여 화소 밀도 데이타를 얻었다.

조건화 배지는 증식 관 형성의 유도에 의해 입증되는 바와 같이 내피 세포에 대한 혈관신생 효과를 제시하였다 (도 4 참조).

6.3.2 HUVEC 이동 검정

본 실험은 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 능력을 입증하였다. HUVEC는 피브로넥틴 (FN)-코팅 12-웰 플레이트에서 합류시까지 성장시키고, 웰을 가로질러 무세포성 선을 만들기 위해 단층을 1 mL 플라스틱 피펫 끝부분으로 "상처를 내었다". "상처낸" 세포를 성장 3일 후에 5개의 양막 유래 부착성 세포주로부터 얻은 무혈청 조건화 배지 (EBM2; 캄브렉스)와 함께 인큐베이팅함으로써 HUVEC 이동을 시험하였다. 세포가 없는 EBM2 배지를 대조군으로서 사용하였다. 15시간 후에, 무세포 영역 내로의 세포 이동을 도립 현미경을 사용하여 기록하였다 (n = 3). 이어서, 사진을 컴퓨터 소프트웨어 패키지 "ImageJ" 및/또는 MatLab을 사용하여 분석하였다. 영상을 컬러로부터 8-비트 그레이 스케일 영상으로 전환하고, 흑백 영상으로 전환하기 위해 한계점에 적용하였다. 이어서, 영상을 입자 분석 특징을 사용하여 분석하고, 이를 통해 계수 (개별 입자의 수), 총 면적, 평균 크기 (개별 입자의), 및 검정에서 내피 이동량에 동등시되는 면적비를 포함하여 화소 밀도 데이타를 얻었다. 세포 이동 정도를 초기에 기록된 상처 선의 크기에 대해 평가하고, 그 결과를 1x10⁶개의 세포로 표준화하였다.

양막 유래 부착성 세포에 의해 분비된 영양 인자는 세포 이동의 유도에 의해 입증되는 바와 같이 내피 세포에 대한 혈관신생 효과를 제시하였다 (도 5).

별개의 실험에서, HUVEC는 FN-코팅 96-웰 플레이트에서 합류 미만으로 성장시키고, 증식의 유도는 세포를 각각 5개의 양막 유래 부착성 세포주로부터의 무혈청 조건화 배지 (EBM-2 배지, 3일)와 함께 인큐베이팅함으로써 시험하였다. EBM-2 배지를 음성 대조군으로서 사용하고, EGM-2를 양성 대조군으로서 사용하였다. 48시간 후에, 세포 증식을 프로메가 셀 타이터 (Promega Cell Titer) 96® AZ 원 설루션 (One Solution) 세포 증식 검정 (프로메가 (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨))을 사용한 DNA 함량 측정에 의해 평가하였다. 오류 막대는 분석적 반복 실험 (n=3)의 표준 편차를 나타내고, 결과를 1 x 10⁶개의 세포로 표준화하였다.

양막 유래 부착성 세포에 의해 분비된 영양 인자는 DNA 농도의 증가를 야기하였고, 이것은 HUVEC 증식을 나타낸다. 도 6을 참조하고, 여기서 "CM"은 조건화 배지이다.

6.3.3 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 아세틸화된 저밀도 지단백질 ( AcLDL ) 흡수

배양액 내의 내피 세포 및 미세아교 세포는 형광 AcLDL을 흡수하는 그들의 능력에 의해 확인할 수 있다. LDL의 아포단백질 (apoprotein)의 라이신 잔기가 아세틸화될 경우, LDL 복합체는 더 이상 LDL 수용체에 결합하지 않고, 대신에 높은 세포 특이적 방식으로 내피 세포 및 대식세포에 의해 흡수될 수 있다.

양막 유래 부착성 세포는 일반적으로 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능 및 양막 유래 부착성 세포의 분화 가능성에 대한 VEGF의 효과를 평가하기 위해 VEGF가 없는 성장 배지에서, 또는 VEGF와 함께 EGM2-MV (캄브렉스)에서 성장시켰다. 세포를 70-80% 합류에 도달할 때까지 4 내지 7일 동안 12-웰 플레이트에서 그들의 각각의 배지 내에서 배양한 후, 10 ㎍/mL 아세틸화된 LDL (인비트로겐)과 함께 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 칼세인 (Calcein) AM (인비트로겐)으로 역염색하고, 형광 현미경을 사용하여 아세틸화된 LDL 흡수에 대해 평가하였다. 아세틸화된 LDL 흡수에 대한 대조 세포로서 HUVEC를 EGM2-MV에서 성장시키고, 상기한 바와 같이 분석하였다. 양막 유래 부착성 세포는 정상 성장 조건 하에서 아세틸화된 LDL의 최소 흡수를 보였지만, VEGF를 사용한 자극을 통해 그 흡수를 증가시키도록 유도/분화되었다. 도 7을 참조한다.

6.3.4 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 관 형성

양막 유래 부착성 세포를 일반적으로 세포의 혈관신생 효능뿐만 아니라 세포의 분화 가능성에 대한 VEGF의 효과를 평가하기 위해 VEGF가 없는 성장 배지 또는 VEGF가 없는 EGM2-MV 내에서 성장시켰다. 관 형성에 대한 대조 세포로서 HUVEC를 EGM2-MV 내에서 성장시켰다. 세포를 각각의 배지 내에서 70-80% 합류에 도달할 때까지 4 내지 7일 동안 배양하였다. 냉 (4℃) 마트리겔™ 용액 (50 μL; 비디 바이오사이언시즈)을 12-웰 플레이트의 웰로 분배하고, 플레이트를 60 min 동안 37℃에서 인큐베이팅하여 용액을 겔화시켰다. AMDAC 및 HUVEC 세포를 트립신 소화시키고, 적절한 배지 (VEGF 함유 및 비함유) 내에 재현탁시키고, 100 ㎕의 희석시킨 세포 (1 내지 3 x 10⁴ 세포)를 각각의 마트리겔™-함유 웰에 첨가하였다. 0.5 내지 100 ng VEGF의 존재 또는 부재 하에 중합화된 마트리겔™ 상의 세포를 4 내지 24시간 동안 5% CO₂ 인큐베이터 내에 37℃에서 놓았다. 인큐베이션 후에, 세포를 표준 광학 현미경을 이용하여 관 형성의 징후에 대해 평가하였다.

양막 유래 부착성 세포는 VEGF의 부재 하에 최소 관 형성을 나타냈지만, VEGF를 사용한 자극을 통해 관-유사 구조체를 형성하도록 유도/분화되었다 (도 8 참조).

6.3.5 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능 평가를 위한 저산소 반응성

내피 세포 및/또는 내피 전구 세포의 혈관신생 기능성을 평가하기 위해, 세포를 저산소 및 정상 산소 조건 하에 혈관신생 성장 인자를 분비하는 능력에 관하여 평가할 수 있다. 저산소 조건 하의 배양은 대체로 내피 세포 또는 내피 전구 세포에 의한 혈관신생 성장 인자의 증가된 분비를 유도하고, 이는 조건화 배지 내에서 측정될 수 있다. 양막 유래 부착성 세포를 그들의 표준 성장 배지 내에서 동일한 세포수로 플레이팅하고, 약 70-80% 합류로 성장시켰다. 후속적으로, 세포를 무혈청 배지 (EBM-2)로 교환하고, 48 h 동안 정상 산소 (21% O₂) 또는 저산소 (1% O₂) 조건 하에 인큐베이팅하였다. 조건화 배지를 수집하고, 혈관신생 성장 인자의 분비를 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트 (R&D 시스템즈)를 사용하여 분석하였다. ELISA 검정을 제조자의 지시에 따라 수행하였고, 조건화 배지 내의 각각의 혈관신생 성장 인자 (VEGF 및 IL-8)의 양을 1 x 10⁶개의 세포로 표준화하였다.

양막 유래 부착성 세포는 저산소 조건 하에 다양한 혈관신생 성장 인자의 상승된 분비를 보였다 (도 9 참조).

별개의 실험에서, AMDAC를 동일한 세포수로 표준 성장 배지 내에 플레이팅하고, 약 70-80% 합류로 성장시켰다. 후속적으로, 세포를 무혈청 배지 (EBM-2)로 교환하고, 48 h 동안 정상 산소 (21% O₂) 또는 저산소 (1% O₂) 조건 하에 인큐베이팅하였다. 세포를 혈관 발달 및 혈관신생에 관여된 수용체인 세포 마커 CD202b (Tie2, Tek, 또는 안지오포이에틴-1 수용체로도 알려짐에 대해 유동 세포측정 분석으로 처리하였다. 조건화 배지를 수집하고, 혈관신생 성장 인자의 분비를 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트 (R&D 시스템즈)를 사용하여 분석하였다. 유동 세포측정 분석은 상기 설명된 바에 따라 수행하고, ELISA 검정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 조건화 배지 내의 각각의 혈관신생 성장 인자의 양을 1 x 10⁶개의 세포로 표준화하였다. AMDAC는 정상 산소 조건에 비해 저산소 조건 하에 CD202b의 상승된 발현을 보였다 (도 10 참조).

6.3.6 양막 유래 부착성 세포의 혈관신생 효능의 평가를 위한 심근생성 분화

심근세포 계통을 향한 전구 세포의 분화를 유도하기 위해, 현적 배양 (HD, 세포의 증식을 중지시키고 분화 과정을 시작하기 위해)과 특이적 인자를 사용한 성장-정지된 세포의 후속적인 처리의 조합을 몇몇 기에서 수행하였다. 현적 배양 후에, 세포를 액티빈 A, 뼈 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF2로도 알려진 bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGFA로도 알려진 VEGF) 및 dickkopf 상동체 1 (DKK1)의 조합물을 사용하여 16일 기간에 걸쳐 유도하였다. 간단히 설명하면, 양막 유래 부착성 세포를 표준 성장 배지 내에서 약 70% 합류로 성장시켰다. 이어서, 이전에 설명된 바와 같이 세포를 트립신 처리하고 버퍼 내에서 세척하였다. 700개의 세포를 함유하는 20 ㎕ 방울을 관련 배지 내에 현탁시키고, 멀티채널 피펫을 사용하여 100 mm 페트리 접시의 뚜껑 내부 면에 놓는다. 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고, 방울이 건조되지 않도록 하기 위해 25 mL의 멸균 PBS를 함유한 접시의 상단부 상에 놓는다. 현적 배양액을 48 h 동안 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 세포의 응집체를 추가의 유도를 위해 계통 특이적 분화 배지를 함유하는 0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트로 재접종하였다.

자극 단계는 다음과 같이 진행하였다: 기 1, 4일 BMP4 (0.5 ng/mL); 기 2, 5일 BMP4 (10 ng/mL), bFGF (5 ng/mL), 액티빈 A (3 ng/mL); 기 3, 3일 VEGF (10 ng/mL), DKK1 (150 ng/mL); 기 4, 4일 VEGF (10 ng/mL), DKK1 (150 ng/mL), bFGF (5 g/mL) (+/- 5-10 nM 5-아자-시티딘). 후속적으로, 처리된 세포의 총 RNA를 제조하고, 심근생성 마커에 대한 qRT-PCR 분석을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다.

결과는 양막 유래 부착성 세포가 다양한 심근세포 마커를 발현하도록 유도/분화될 수 있음을 보여주었다 (도 11 참조).

6.3.7 AMDAC -조건화 배지에 대한 HUVEC 반응

AMDAC를 48시간 동안 60% DMEM-LG (깁코); 40% MCBD-201 (시그마); 2% FBS (하이클론 랩스), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 10 ng/mL 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 1 n-덱사메타손 (시그마); 100 μM 아스코르브산 2-인산염 (시그마); 10 ng/mL 표피 성장 인자 (R&D 시스템즈); 및 10 ng/mL 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) (R&D 시스템즈)를 함유하는 성장 배지 내에서 배양한 후, 추가로 48 hrs 동안 무혈청 배지 내에서 배양하였다. AMDAC 배양액으로부터 조건화 배지를 수집하고, 이를 사용하여 5, 15 및 30분 동안 혈청-결핍 HUVEC를 자극하였다. HUVEC을 후속적으로 용해시키고, 혈관신생 경로 신호전달에서 기능을 하는 것으로 알려진 인단백질에 대해 BD™ CBA (Cytometric Bead Assay) 셀 시그날링 플렉스 키트 (Cell Signaling Flex Kit) (비디 바이오사이언시즈)로 염색하였다. AMDAC는 HUVEC에서 AKT-1 (세포자멸 과정을 억제함), AKT-2 (인슐린 신호전달 경로에서 중요한 신호전달 단백질임), 및 ERK 1/2 세포 증식 경로의 강한 활성제인 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 AMDAC의 혈관신생 능력을 추가로 입증한다.

6.4 실시예 4: AMDAC 에 의한 혈관신생의 유도

본 실시예는 병아리 융모요막 (CAM)을 사용한 생체내 검정에서 AMDAC가 혈관신생을 촉진하는 것을 입증한다.

2개의 별개의 CAM 분석을 수행하였다. 제1 CAM 분석에서, 상이한 AMDAC 제제로부터의 무손상 세포 펠렛을 평가하였다. 제2 CAM 분석에서, 상이한 AMDAC 제제의 상등액을 평가하였다. 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)는 양성 대조군으로서, MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 참조물 (음성 대조군)로서 사용하였다. 연구의 종점은 모든 처리군 및 대조군의 혈관 밀도를 결정하는 것이었다.

6.4.1 세포를 사용한 CAM 검정

상기 설명된 바와 같이 제조하고 냉동보존한 3가지 AMDAC 세포 제제 (본원에서 로트 1, 로트 2 및 로트 3으로 칭함)를 사용하였다. AMDAC를 투여를 위해 해동하고, CAM 상에 투여된 세포의 수를 결정하였다.

연구 설계: 연구는 각 군에 10개의 배아를 갖는 7개의 군을 포함하였다. 연구의 설계를 표 6에 기재한다.

CAM 검정 절차: 신선한 수정란을 표준 난 인큐베이터에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅하였다. 제3일에, 난을 멸균 조건 하에 깨고, 배아를 20개의 100 mm 플라스틱 플레이트에 넣고, 저변 선반 상에 물 저장기가 있는 배아 인큐베이터 내에서 37℃에서 배양하였다. 인큐베이터 내의 습도를 일정하게 유지시키도록 작은 펌프를 사용하여 물 저장기 내로 공기를 계속 버블링시켰다. 제6일에, 멸균 실리콘 "O" 고리를 각각의 CAM 상에 놓은 후, 멸균 후드 내에서 AMDAC를 7.69 x10⁵ 세포/40 μL의 배지/마트리겔™ 혼합물 (1:1)의 밀도에서 각각의 "O" 고리 내로 전달하였다. 표 2A 및 2B는 사용된 세포의 수 및 투여를 위해 각각의 세포 제제에 첨가된 배지의 양을 나타낸다. 비히클 대조군 배아에는 40 μL의 비히클 (PBS/마트리겔™, 1:1)을, 양성 대조군에는 40 ㎕의 DMEM 배지/마트리겔™ 혼합물 (1:1) 중의 100 ng/ml bFGF를, 배지 대조군에는 40 ㎕의 DMEM 배지만을 투여하였다. 각각의 투여가 종료된 후, 배아를 다시 인큐베이터에 돌려보냈다. 제8일에, 배아를 인큐베이터에서 제거하고 실온에서 유지하면서, 100X의 배율에서 영상 캡쳐 (capturing) 시스템을 이용하여 각각의 "O" 고리 아래에서 혈관 밀도를 결정하였다.

혈관 밀도는 CAM 상에서 처리 부위에 존재하는 혈관의 수를 나타내기 위해 산술 수 0 내지 5 또는 지수 수 1 내지 32를 사용한 혈관신생 스코어링 시스템에 의해 측정하였다. 보다 높은 스코어링 수는 보다 높은 혈관 밀도를 나타내는 한편, 0은 혈관신생이 없음을 나타낸다. 각각의 투여 부위에서 억제 %는 각각의 개별 실험에 대한 대조군 샘플로부터 얻은 평균 스코어로 나눈 그 부위에 대해 기록된 스코어를 이용하여 계산하였다. 주어진 화합물의 각각의 용량에 대한 억제 %를 8-10개의 배아로부터 그 용량에 대해 얻어진 모든 결과를 모음으로써 계산하였다.

모든 세포는 계대배양 6에서 사용되었다.

결과

혈관 밀도 스코어의 결과를 도 12에 제시한다. 결과는 줄기 세포 현탁액, 또는 100 ng/mL의 bFGF, 또는 MDAMB231 유방암 세포 현탁액으로 각각 처리한 병아리 융모요막의 혈관 밀도 스코어는 비히클 대조군 CAM의 것에 비해 통계상 유의하게 더 높았음을 명백하게 나타낸다 (P < 0.001, 스튜던트 (Student's) "t" 시험). 줄기 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 혈관 밀도에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 추가로, AMDAC 제제의 혈관 밀도의 유도는 일부 변동을 보였지만, 그러한 변동은 통계상 유의하지 않았다. 5가지 줄기 세포 제제의 각각의 유도 효능이 대략 동일한 것으로 결론짓는다.

6.4.2 AMDAC 세포 상등액을 사용하는 CAM 검정

MDA-MB-231 세포로부터 및 상기 AMDAC CAM 검정에 설명된 상이한 줄기 세포 제제 각각으로부터의 상등액 샘플을 제2 CAM 검정에서 사용하였다. AMDAC CAM 검정에서와 같이, bFGF 및 MDA-MB-231 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다.

연구 설계: 연구는 각 군에 10개의 배아를 갖는 7개의 군을 포함하였다. 연구의 설계를 표 8에 기재한다.

AMDAC 세포는 계대배양 6에서 사용되었다.

CAM 검정 절차: 검정 절차는 AMDAC CAM 검정에서 상기 설명한 바와 동일하였다. 유일한 차이는 각각의 줄기 세포 제제 또는 MDA-MB-231 세포로부터의 상등액을 시험 물질로서 사용한 점이다. 투여를 위해, 각각의 상등액을 마트리겔™과 혼합하고 (1:1 부피), 40 μL의 혼합물을 각각의 배아에 투여하였다.

결과

혈관 밀도 스코어 (도 13 참조)는 각각의 줄기 세포 제제의 상등액에 의한 혈관 형성의 유도가 상이하였음을 나타낸다. AMDAC의 3개의 로트로부터 상등액 샘플은 각각 P < 0.01, P < 0.001 및 P < 0.02 (스튜던트 "t" 시험)으로 혈관 유도에 대한 유의한 효과를 보여주었다. 예상된 바와 같이, 양성 대조군 bFGF는 또한 상기 CAM 검정 1에서 보인 것과 같이 강력한 혈관 형성 유도를 보였다 (P < 0.001, 스튜던트 "t" 시험). 그러나, MDA-MB-231 인간 유방암 세포로부터의 상등액은 비히클 대조군에 비해 혈관 형성에 대해 유의한 유도를 보이지 않았다. 앞서 제시된 바와 같이, 배양 배지 단독으로는 임의의 효과를 갖지 않았다.

6.5 실시예 5: AMDAC 는 신경 보호 효과를 보인다

본 실시예는 AMDAC가 산소-글루코스 결핍 (OGD) 손상 (insult) 검정을 이용할 때 저-산소 및 저-글루코스 조건에서 신경보호 효과를 갖고, 반응성 산소종을 감소시킴을 입증한다. 따라서, 이들 결과는 AMDAC가 허혈성 병태, 예를 들어 뇌졸중 또는 말초혈관 질병을 치료하는데 유용할 것이고, 허혈성 병태로 인해 생기는 재관류 손상에 대해 보호할 것임을 나타낸다.

인간 뉴런 (사이언셀, 카탈로그 # 1520)을 제조자의 권장사항에 따라 배양하였다. 간단히 설명하면, 배양 용기를 37℃에서 1시간 동안 멸균 증류수 중의 폴리-L-라이신 (2 ㎍/mL)으로 코팅하였다. 용기를 이중 증류된 H₂O로 3회 세척하였다. 뉴런 배지 (사이언셀)를 용기에 첨가하고, 인큐베이터 내에서 37℃로 평형화시켰다. 뉴런을 해동하고, 원심분리 없이 용기에 직접 첨가하였다. 후속적인 배양 동안, 배지를 배양 개시 다음날 교환하고, 그 후 이틀마다 교환하였다. 뉴런은 대개 제4일에 손상을 위해 준비된다.

OGD 배지 (둘베코 변형 이글 배지-글루코스 비함유)는 부분적으로 액체 배지 중의 산소 용해도를 감소시키기 위해 먼저 배지를 수조 내에서 가온함으로써 제조하였다. 용존 산소를 제거하기 위해, 100% 질소를 0.5 ㎛ 확산기 (diffusing stone)를 사용하여 배지를 통해 30분 동안 버블링하였다. HEPES 버퍼를 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 배지를 스파징 (sparge)의 끝에 뉴런에 직접 첨가하였다. 침액형 (dip-type) 산소 센서를 사용한 산소 수준의 확인을 위해 배지의 작은 샘플을 분취하였다. 산소 수준은 대개 0.9% 내지 약 5.0% 산소로 감소되었다.

저산소 챔버는 기체 발생 (gassing) 전에 챔버를 37℃에서 인큐베이터 내에 적어도 4시간 동안 (바람직하게는 철야) 놓음으로써 준비하였다. 배양 용기 내의 배지를 제거하고 탈기시킨 배지로 교체하고, 배양 용기를 저산소 챔버에 넣었다. 이어서, 저산소 챔버를 시스템을 통해 20-25 Lpm의 속도로 적어도 5분 동안 95% N₂/5% CO₂ 기체로 플러싱하였다. 시스템을 37℃에서 인큐베이터 내에서 4시간 동안 인큐베이팅하면서, 챔버를 1시간 후 1회 더 탈기시켰다.

손상 절차 종료시에, OGD 배지를 흡인시키고, 가온 배지를 뉴런에 첨가하였다. 24-28시간 후에, AMDAC 및 뉴런을 6-웰 플레이트의 웰 당 각각 100,000개의 세포로 동일한 수로 플레이팅하였다. 뉴런 배지를 뉴런에 첨가하고, 6일 동안 동시-배양하였다.

각각의 조건에 대해 6-웰 플레이트 내의 무작위 필드의 현미경 사진을 찍었다. 전형적인 뉴런 형태를 갖는 세포를 확인하고, 신경돌기 길이를 기록하였다. 신경돌기의 평균 길이는 뉴런 건강과 양성으로 상호관련되고, 뉴런 및 AMDAC의 동시-배양액에서 더 길었고, 이것은 AMDAC가 세포를 손상으로부터 보호하였음을 나타낸다.

반응성 산소종 검정

AMDAC는 저산소 동안 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제 및 헴 옥시게나제 유전자를 발현하는 것으로 결정되었다. 반응성 산소종을 제거하고 세포를 그러한 산소종으로부터 보호하는 AMDAC의 능력을 반응성 산소종 발생제로서 과산화수소를 사용하는 검정에서 결정하였다.

검정 설명: 표적 세포 (성상세포; 사이언셀 리서치 래보래토리스 (ScienCell Research Laboratories))를 폴리-L-라이신으로 예비-코팅된 96-웰 흑색 웰 플레이트에 6000/cm²로 접종하였다. 성상세포를 5% 이산화탄소를 이용하여 37℃에서 성장 배지 내에서 철야 부착시켰다. 다음날, 배양 배지를 제거하고, 세포를 형광생성 프로브인 세포 투과성 염료 DCFH-DA (디클로로플루오레세인 디아세테이트)와 함께 인큐베이팅하였다. 과잉의 염료는 둘베코 인산염 완충 염수 또는 행크 (Hank) 완충 염 용액으로 세척하여 제거하였다. 이어서, 30-60분 동안 1000 μM 과산화수소를 첨가함으로써 반응성 산소종을 사용하여 세포를 손상시켰다. 이어서, 과산화수소 함유 배지를 제거하고, 무혈청, 글루코스 미함유 성장 배지로 교체하였다. AMDAC (로트 1 또는 로트 2로 지정된 세포), 또는 BM-MSC를 6000/cm²로 첨가하고, 세포를 추가로 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 표준 형광 플레이트 판독기에서 480Ex 및 530Em에서 판독하였다. 배지의 반응성 산소종 함량은 세포의 세포질액 내의 DCFH-DA 수준에 정비례하였다. 반응성 산소종 함량은 예비-결정된 DCF 표준 곡선에 비교하여 측정하였다. 모든 실험은 N=24로 수행하였다.

검정을 위해, 20X DCFH-DA 원액 용액을 우태 혈청이 없는 세포 배양 배지 내에 1X로 희석하고 균질하도록 교반함으로써 1X DCFH-DA를 사용 직전에 제조하였다. 과산화수소 (H₂O₂) 희석액은 필요한 경우에 DMEM 또는 DPBS 내에 제조하였다. 표준 곡선은 1 mM DCF 표준물을 세포 배양 배지 내에 희석하고, 100 ㎕의 DCF 표준물을 형광 측정에 적합한 96 웰 플레이트에 옮기고, 100 ㎕의 세포 용해 버퍼를 첨가함으로써, 0 μM 내지 10 μM의 농도 범위에서 1:10 희석 시리즈로서 작성하였다. 형광을 480Ex 및 530Em에서 판독하였다.

결과: 사용된 AMDAC의 두 로트는 모두 성상세포 동시-배양액에서 반응성 산소종의 농도를 유의하게 감소시켰다 (도 14a 및 14b 참조). 이와 반대로, BM-MSC는 성상세포 동시-배양액에서 반응성 산소종을 유의하게 감소시키지 못하였다.

6.6 양막 유래 부착성 세포를 사용한 치료 방법

6.6.1 심근경색의 치료

50대 중반의 남성 개체가 20분 초과 동안 좌측 팔로 방사상으로 퍼지는 흉통, 호흡 곤란, 오심, 심계항진, 발한을 나타냈다. 심전도 결과 및 크레아틴 키나제의 혈액 수준의 등락을 이용하여, 심장의 전방벽의 심근경색 (경벽성)의 감별 진단이 이루어졌다. 개체를 니트로글리세린 및 스트렙토키나제로 안정화시킨 후에, 개체에게 0.9% 염수 중 1 x 10⁸ 내지 5 x 10⁸개의 AMDAC를 국소 마취제가 있는 심장 주사기를 사용하여 이환된 영역에 직접 투여하였다. 개체를 다음 72시간 동안 응급상황에 기초하여 모니터링하였다. 개체를 경색 영역의 재혈관생성 정도를 평가하기 위해 심전도 및/또는 염료 시각화 기술에 의해, 치료 후 다음 3개월에 걸쳐 추가로 모니터링하였다. 심전도 결과가 AMDAC의 투여 전보다 식별가능하게 정상에 가까운 경우에 또는 시각화될 때 경색 영역이 식별가능하게 재혈관화되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.2 심근병증의 치료

개체가 무호흡, 다리 및 발목 부음, 및 불규칙한 심박을 나타냈다. 다른 원인을 배제한 후, 확증적 심전도를 사용하여 심근병증의 진단이 이루어졌다. 초음파 영상에 의해 개체가 울혈성 심근병증이 있음을 확인하였다. 개체에게 0.9% 염수 중 1 x 10⁸ 내지 5 x 10⁸개의 AMDAC를 국소 마취제가 있는 심장 주사기를 사용하여 심장 동맥에 직접 투여하였다. 개체를 보다 많은 정상 혈액 유동을 나타내는 초음파 영상 판독치의 변화에 대해, 및 무호흡 감각의 개선과 다리 및 발목 부음의 감소에 대해 다음 3개월에 걸쳐 모니터링하였다. 임의의 이들 징후가 모니터링 기간 동안 개선을 보이는 경우에 개체에 대한 치료 유효성이 확립된다.

6.6.3 말초혈관 질병의 치료

개체는 매달릴 때 붉게 변하는 시리고 저린 발, 및 다리의 통증, 약화 및 피로를 나타냈다. 당뇨병을 배제한 후, 말초 동맥 질병의 진단이 이루어졌다. 개체에게 450 mL 0.9% 염수 중 1 x 10⁹ 내지 5 x 10⁹개의 AMDAC를 정맥내 투여하고, 다음 3개월 동안 격주로 모니터링하였다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.4 말초혈관 질병의 치료

개체는 매달릴 때 붉게 변하는 시리고 저린 발, 및 다리의 통증, 약화 및 피로를 나타냈다. 당뇨병을 배제한 후, 말초 동맥 질병의 진단이 이루어졌다. 개체에게 5 mL 0.9% 염수 중 1 x 10⁸ 내지 5 x 10⁸개의 AMDAC를 근육내 투여하고/하거나 동등한 양을 발가락 사이에 국소적으로 정맥내 또는 동맥내 투여하고, 다음 3개월 동안 격주로 모니터링하였다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.5 말초혈관 질병의 조합 치료

개체는 매달릴 때 붉게 변하는 시리고 저린 발, 및 다리의 통증, 약화 및 피로를 나타냈다. 당뇨병을 배제한 후, 말초 동맥 질병의 진단이 이루어졌다. 개체에게 450 mL 0.9% 염수 중 1 x 10⁹ 내지 5 x 10⁹개의 AMDAC를 정맥내 투여하고, 다음 3개월 동안 격주로 모니터링하였다. 개체는 또한 실로스타졸 100 mg을 매일 2회 복용하도록 처방받았다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.6 말초혈관 질병의 조합 치료

개체는 매달릴 때 붉게 변하는 시리고 저린 발, 및 우측 다리의 통증, 약화 및 피로를 나타냈다. 당뇨병을 배제한 후, 말초 동맥 질병의 진단이 이루어졌다. 개체를 혈관성형술 및 대퇴 동맥 내에 스텐트를 삽입하는 수술로 치료하였다. 후속적으로, 개체에게 450 mL 0.9% 염수 중 1 x 10⁹ 내지 5 x 10⁹개의 AMDAC를 정맥내 투여하고, 다음 3개월 동안 격주로 모니터링하였다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.7 AMDAC 를 사용한 뇌졸중의 치료

52세의 남성이 신체의 좌측면에서 반신마비, 및 부분 실어증을 나타냈다. 허혈성 뇌졸중의 진단이 이루어졌다. 자기 공명 영상화를 이용하여 허혈 영역을 위치결정한 후, 개체를 이환된 측면 상에서 두개골 내에 개구부를 생성하기 위한 수술을 위해 준비하였다. 개구부가 만들어진 후, 1-2 mL 0.9% 염수 용액 중 5 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸개의 AMDAC를 허혈 영역에 투여하였다. 개체를 다음 7-14일에 걸쳐 뇌졸중, 특히 반신마비 또는 실어증의 임의의 증상의 개선 징후에 대해 모니터링하였다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

6.6.8 AMDAC 를 사용한 뇌졸중의 치료

52세의 남성이 신체의 좌측면에 반신마비, 및 부분 실어증을 나타냈다. 허혈성 뇌졸중의 진단이 이루어졌다. 자기 공명 영상화를 이용하여 허혈 영역을 위치결정한 후, 개체를 이환된 측면 상에서 두개골 내에 개구부를 생성하기 위한 수술을 위해 준비하였다. 개구부가 만들어진 후, 450 mL 0.9% 염수 용액 중의 1 x 10⁹ 내지 5 x 10⁹개의 AMDAC를 정맥내 투여하였다. 개체를 다음 7-14일에 걸쳐 뇌졸중, 특히 반신마비 또는 실어증의 임의의 증상의 개선 징후에 대해 모니터링하였다. 상기 설명된 임의의 증상이 모니터링 기간 동안 개선되는 경우에 치료 유효성이 확립된다.

균등물:

본 발명은 본원에서 설명되는 구체적인 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 설명된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 상기 변형은 첨부되는 청구의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 그 개시내용은 전부가 본원에 참고로 포함된다.

Claims

조직 배양 플라스틱에 부착성이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- (옥타머 결합 단백질 4)인 단리된 양막 유래 부착성 세포.
제1항에 있어서, RT-PCR에 의해 결정할 때 HLA-G^-인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 추가로 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD49f⁺인 단리된 세포.
제3항에 있어서, OCT-4^-, HLA-G^- 및 CD49f⁺인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD90⁺, CD105⁺ 또는 CD117^-인 단리된 세포.
제5항에 있어서, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-인 단리된 세포.
제6항에 있어서, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^- 및 HLA-G^-이고, 유동 세포측정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VEGFR1/Flt-1⁺ (혈관 내피 성장 인자 수용체 1) 및 VEGFR2/KDR⁺(혈관 내피 성장 인자 수용체 2)인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺ (안지오포이에틴 수용체), TEM-7⁺ (종양 내피 마커 7), CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^- (안지오텐신-I-전환 효소, ACE), CD146^- (흑색종 세포 부착 분자), 또는 CXCR4^- (케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4) 중의 하나 이상인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9⁺, CD10⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD98⁺, Tie-2⁺ (안지오포이에틴 수용체), TEM-7⁺ (종양 내피 마커 7), CD31^-, CD34^-, CD45^-, CD133^-, CD143^-, CD146^- 및 CXCR4^-인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 VE-카드헤린^-인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 추가로 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD105⁺ 및 CD200⁺에 대해 양성인 단리된 세포.
제1항에 있어서, 50 ng/mL VEGF에 7일 동안 노출한 후 면역학적 위치 결정에 의해 검출할 때 CD34를 발현하지 않는 것인 단리된 세포.
제1항의 세포를 포함하는 단리된 세포 집단.
제14항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 50%가 제1항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제14항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 90%가 제1항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제7항의 세포를 포함하는 단리된 세포 집단.
제17항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 50%가 제7항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제11항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 90%가 제7항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제4항에 따른 세포를 포함하는, 양막이 아닌 단리된 세포 집단.
제14항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 50%가 제4항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제14항에 있어서, 상기 집단 내의 세포의 적어도 90%가 제4항에 따른 세포인 단리된 세포 집단.
제1항 또는 제7항에 따른 단리된 양막 유래 부착성 세포를 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 배아 줄기 세포, 혈액 세포, 말초 혈액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 혈액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 관류액으로부터 단리된 줄기 세포, 태반 조직으로부터 단리된 줄기 세포, 제대혈로부터 단리된 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 기질 세포, 조혈 줄기 세포, 신체 줄기 세포, 연골세포, 섬유모세포, 근육 세포, 내피 세포, 혈관모세포, 내피 전구 세포, 혈관주위세포, 심근세포, 근육세포, 심근모세포, 근육모세포, 배아 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포를 닮도록 조작된 세포인 단리된 세포 집단.
제24항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 상기 집단 내의 세포의 적어도 10%를 구성하는 것인 단리된 세포 집단.
제24항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 상기 집단 내의 세포의 적어도 25%를 구성하는 것인 단리된 세포 집단.
제24항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 조혈 줄기 또는 전구 세포인 단리된 세포 집단.
제28항에 있어서, 상기 조혈 줄기 또는 전구 세포가 CD34⁺ 세포인 단리된 세포 집단.
조직 배양 플라스틱에 부착성이고, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고,
(a) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1, 또는 VEGFR2/KDR (CD309) 중 하나 이상을 발현하거나;
(b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G 또는 VE-카드헤린의 발현이 결핍되거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2의 발현이 결핍되거나;
(c) ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1, 또는 VEGFR2/KDR에 대한 mRNA를 발현하거나;
(d) 단백질 CD49d, 콘넥신-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴-1, ADAM 17, 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A, 알파-액티닌 1, 메갈린, 대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II, 액티빈 수용체 유형 IIB 전구체, Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포, 미오신-결합 단백질 C, 또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A 중 하나 이상을 발현하거나;
(e) VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 또는 갈렉틴-1을 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비하거나;
(f) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 마이크로RNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 또는 miR-296을 발현하거나;
(g) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 마이크로RNA miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 또는 miR-16을 발현하거나;
(h) miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, 또는 miR-16을 발현하거나;
(i) 21% O₂ 하의 CD202b, IL-8 또는 VEGF의 발현에 비해 약 5% O₂ 미만에서 배양될 때 증가된 수준의 CD202b, IL-8 또는 VEGF를 발현하는 것
인 단리된 양막 유래 부착성 세포.
제29항에 있어서, RT-PCR에 의해 결정할 때 OCT-4^-이고, 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD49f⁺, HLA-G^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD117^-이고,
(a) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1, 및/또는 VEGFR2/KDR (CD309)를 발현하고/하거나;
(b) 면역학적 위치 결정에 의해 결정할 때 CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G 및/또는 VE-카드헤린의 발현이 결핍되거나, RT-PCR에 의해 결정할 때 SOX2의 발현이 결핍되고/되거나;
(c) ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1, 및/또는 VEGFR2/KDR에 대한 mRNA를 발현하고/하거나;
(d) CD49d, 콘넥신-43, HLA-ABC, 베타 2-마이크로글로불린, CD349, CD318, PDL1, CD106, 갈렉틴-1, ADAM 17, 안지오텐시노겐 전구체, 필라민 A, 알파-액티닌 1, 메갈린, 대식세포 아세틸화된 LDL 수용체 I 및 II, 액티빈 수용체 유형 IIB 전구체, Wnt-9 단백질, 아교 섬유 산성 단백질, 성상세포, 미오신-결합 단백질 C, 및/또는 미오신 중쇄, 비-근육 유형 A 중 하나 이상을 발현하고/하거나;
(e) VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 및 갈렉틴-1 중의 하나 이상을 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비하고/하거나;
(f) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 수준으로 마이크로RNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, 및/또는 miR-296을 발현하고/하거나;
(g) 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 더 낮은 수준으로 마이크로RNA miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16을 발현하고/하거나;
(h) miRNA miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, 및/또는 miR-16을 발현하고/하거나;
(i) 21% O₂ 하의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF의 발현에 비해 약 5% O₂ 미만에서 배양될 때 증가된 수준의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF를 발현하는 것
인 단리된 양막 유래 부착성 세포.
제29항의 세포의 단리된 집단.
제30항의 세포의 단리된 집단.
제1항, 제2항, 제4항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 영구 또는 분해성 탈세포화 또는 합성 매트릭스 또는 스캐폴드.
제33항에 있어서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드가 양막; 탈수 세포외 매트릭스; 태반 콜라겐, 또는 태반 세포외 막인 매트릭스 또는 스캐폴드.
제1항 또는 제7항의 세포의 집단을 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체에게 상기 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 검출가능한 개선에 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 치료 방법.
제1항 또는 제7항의 세포의 집단을, 양막 유래 부착성 세포의 투여 전의 개체에 비해 흉부 심박출량 (CO), 심장 지수 (CI), 폐 동맥 쐐기압 (PAWP), 심장 지수 (CI), % 분획 단축 (%FS), 박출률 (EF), 좌심실 박출률 (LVEF); 좌심실 이완기말 직경 (LVEDD), 좌심실 수축기말 직경 (LVESD), 수축성 (dP/dt), 심방 또는 심실 기능의 감소, 펌핑 효율의 증가, 펌핑 효율 손실 속도의 감소, 혈역동학적 기능 손실의 감소, 또는 심근병증과 연관된 합병증의 감소인 심장 기능의 하나 이상의 징후의 검출가능한 개선에 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 순환계 질병 또는 질환이 있는 개체의 치료 방법.
치료 유효량의 제1항 또는 제7항의 양막 유래 부착성 세포를 투여하는 것을 포함하는, CNS 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴가 있는 개체의 치료 방법.
치료 유효량의 제1항 또는 제7항의 양막 유래 부착성 세포를 투여하는 것을 포함하는, 사지 내의 또는 주변의 혈액 유동의 파괴가 있는 개체의 치료 방법.