TW201346037A - 用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法 - Google Patents
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一種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法，包含：步驟一：福馬林固定石蠟包埋組織；步驟二：切片及烘片；步驟三：硫氰酸鈉作用；步驟四：在面積24×32mm的組織加入20μl濃度5~10mg/ml第四型膠原蛋白酶或1mg/ml彈性蛋白酶，封片後於37℃作用0.5~1hr，來降解具自體螢光特性之細胞外基質；步驟五：以胃蛋白酶在37℃作用。又本發明另提供可用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法之試劑套組，藉由本發明來作檢體前處理，可顯著降低組織自體螢光現象，提高螢光探針信號與背景螢光比率，提升螢光原位雜交法檢驗品質與正確性。
Description
本發明係提供一種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法，尤指其技術上提供一種在螢光原位雜交法(FISH)之檢體前處理步驟增加第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)或彈性蛋白酶(elastase)處理步驟，藉以降低人類組織自體螢光現象，提高螢光原位雜交法螢光探針信號解析度。
螢光原位雜交法(FISH，Fluorescence In Situ Hybridization)是臨床診斷常使用的技術，可應用於早期診斷、治療方式之選擇或監測疾病的活動。例如：乳癌患者使用賀癌平(trastuzumab)治療是依據螢光原位雜交(FISH)檢測人類表皮生長因子受體-2(HER2)基因表現或當免疫組織化學染色(IHC)呈現人類表皮生長因子受體-2(HER2)基因2+時再以螢光原位雜交(FISH)做進一步確認，篩選出對藥物更有療效之患者；此外在棘皮動物微管結合蛋白4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因陽性的非小細胞肺腺癌(NSCLC)患者接受間變性淋巴瘤激酶及肝細胞生長因子受體(ALK/C-met)雙靶點小分子抑制劑，克卓替尼(Crizotinib)治療的患者可達90%以上的腫瘤縮小，57%的患者獲得客觀緩解，因此有效檢測出棘皮動物微管結合蛋白4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因對於臨床標靶治療有很大的助益。
螢光原位雜交法(FISH)是在不破壞去氧核醣核酸鏈狀結構的原則下，將去氧核醣核酸鏈透過變性原位分開，以螢光標定的去氧核醣核酸探針與之進行雜交結合，最後於螢光顯微鏡下直接觀察螢光訊號，分析細胞染色體中是否存有此去氧核醣核酸探針所對應的序列。目前最常用標定去氧核醣核酸或抗體之螢光物質為FITC異硫氰酸螢光素、奧勒崗綠(Oregon green)488、光譜綠(SpectrumGreen)，由於組織具有內源性螢光基團(endogenous fluorophores)如：膠原蛋白、彈性蛋白、還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NADH、黃素單核苷酸(FMN，Flavin mononucleotide)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD，Flavin adenine dinucleotide)及芳香族氨基酸(aromatic amino acids)，檢體若帶有強烈的背景自體螢光會直接影響螢光原位雜交術和免疫螢光染色判讀的準確性，此類內源性物質也可吸收類似短波長光而產生激發光，導致此類自體螢光現象所產生的背景光會降低螢光探針或抗體信號和背景螢光的比率，而導致螢光訊號的解析度和品質的不良。
然而臨床檢測時，由於檢體組織基質過強之背景螢光，遮蔽探針螢光訊號，先前胃蛋白酶(pepsin)檢體前處理步驟不能完善的降低檢體自體螢光現象，弱且解析不良的探針訊號，會影響訊號計數與判讀。
是以，針對上述習知存在之問題點，如何找到一種更具理想實用性之方法，係相關業者及研究人員須努力研發突破之目標及方向。有鑑於此，發明人本於多年從事相關之研究經驗，針對上述之目標，詳加設計與審慎評估後，終得一確具實用性之本發明。
先前螢光原位雜交法(FISH)檢體前處理步驟係以胃蛋白酶(pepsin)來打斷蛋白質的胜肽鍵結，降解蛋白質，降低完整蛋白所產生自體螢光的現象，並使螢光探針更易與染色體結合，唯細胞間質中尚有許多內源性螢光基團不會被胃蛋白酶所降解，致使胃蛋白酶不足改善檢體自體螢光現象。
為改善上述問題，本發明提供一種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法，包含以下步驟：步驟一：福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織；步驟二：切片及烘片；步驟三：硫氰酸鈉(NaSCN)作用；步驟四：在面積24×32mm的組織加入20μl濃度5~10mg/ml第四型膠原蛋白酶或1mg/ml彈性蛋白酶，封片後於37℃作用0.5~1hr，來降解具自體螢光特性之細胞外基質；及步驟五：以胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。
又本發明另提供兩種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法的試劑套組，其一係取由純度100%的溶組織梭菌(clostridium histolyticum)所產生之第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)100mg溶於10ml的磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度10mg/ml在-20℃的溫度下儲存；另一係取自豬胰腺(PORCINE PANCREAS)(≧4.0 units/mg protein)中的第一型胰彈性蛋白酶(ELASTASE PANCREATIC TYPE I)4mg溶於1ml磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度4mg/ml在-20℃的溫度下儲存。
本發明改善習用螢光原位雜交法(FISH)透過胃蛋白酶不足改善檢體自體螢光現象，故在螢光原位雜交法(FISH)之檢體前處理步驟增加第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)或彈性蛋白酶(elastase)處理步驟，來降解具內源性螢光基團之細胞外基質，可顯著降低人類組織自體螢光現象，改善習知檢體自體螢光的方法提高螢光探針信號解析度，提升螢光原位雜交法(FISH)檢驗品質與正確性。
有關本發明所採用之技術、手段及其功效，茲舉一較佳實施例並配合圖式詳細說明於后，相信本發明上述之目的、構造及特徵，當可由之得一深入而具體的瞭解。
參閱第一圖所示，本發明係提供一種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法，包含以下步驟：步驟一(S1)：福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織；步驟二(S2)：切片及烘片；步驟三(S3)：硫氰酸鈉(NaSCN)作用；步驟四(S4)：在面積24×32mm的組織加入20μl濃度5~10mg/ml第四型膠原蛋白酶或1mg/ml彈性蛋白酶，封片後於37℃作用0.5~1hr，來降解具自體螢光特性之細胞外基質；及步驟五(S5)：以胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。
本發明係以適當比例之以第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)以及彈性蛋白酶(elastase)前處理各種蠟塊組織，能夠降解具內源性螢光基團之細胞外基質，可顯著降低人類組織自體螢光現象，減少螢光檢測類之背景訊號，提高螢光探針信號解析度，提升螢光原位雜交法(FISH)檢驗品質與正確性。請參閱第二圖(A)所示，透過於螢光顯微鏡以異硫氰酸螢光素濾鏡(spectra green FITC filter)觀察，檢體空白片具強自體螢光；透過本發明之檢體前處理方法處理後，第二圖(B)顯示檢體空白片自體螢光下降。第三圖(A)顯示具自體螢光樣本經胃蛋白酶(pepsin)前處理後，進行人類表皮生長因子受體-2及染色體17著絲點(HER2/CEP17)之螢光原位雜交法，其中的綠點表示染色體17著絲點(CEP17)，紅點表示人類表皮生長因子受體-2(HER2)，於螢光顯微鏡下顯示，原始訊號圖具強烈背景，背景螢光遮蔽螢光原位雜交法探針訊號；而第三圖(B)顯示經過本發明之檢體前處理方法處理後，檢體自體螢光下降，背景螢光顯著降低，螢光原位雜交法探針訊號解析度和可計數訊號點數均有顯著增加。另請參閱第四圖(A)，在具自體螢光樣本經胃蛋白酶(pepsin)前處理後，進行人類表皮生長因子受體-2及染色體17著絲點(HER2/CEP17)螢光原位雜交法，於螢光顯微鏡觀察下，扣除背景後探針訊號不清，無法計數；而第四圖(B)顯示經過本發明之檢體前處理方法處理後，檢體自體螢光下降，背景螢光顯著降低，螢光原位雜交法探針訊號解析度和可計數訊號點數均有顯著增加，扣除背景後探針訊號清晰可計數。請參閱第五圖(A)所示，透過於螢光顯微鏡以異硫氰酸螢光素濾鏡(FITC filter)觀察，檢體空白片具強自體螢光；透過本發明之檢體前處理方法處理後，第五圖(B)顯示檢體空白片自體螢光下降。又第六圖(A)表示具自體螢光樣本經胃蛋白酶(pepsin)前處理後，進行棘皮動物微管結合蛋白4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)螢光原位雜交法，於螢光顯微鏡觀察，原始訊號圖具強烈背景，背景螢光遮蔽螢光原位雜交法探針訊號，扣除背景後探針訊號不清，無法計數；第六圖(B)表示透過本發明之檢體前處理方法處理後，檢體自體螢光下降，背景螢光顯著降低，螢光原位雜交法探針訊號解析度和可計數訊號點數均有顯著增加，扣除背景後探針訊號清晰可計數。
又本發明亦提供可用於上述之降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾之檢體前處理方法之兩種試劑套組，其一係取由純度100%的溶組織梭菌(clostridium histolyticum)所產生之第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)100mg溶於10ml的磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度10mg/ml在-20℃的溫度下儲存；另一試劑係取自豬胰腺(PORCINE PANCREAS)(≧4.0 units/mg protein)中的第一型胰彈性蛋白酶(ELASTASE PANCREATIC TYPE I)4mg溶於1ml磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度4mg/ml在-20℃的溫度下儲存。將此種試劑用於檢體前處理亦可改良目前螢光原位雜交法檢驗試劑套組之限制與缺點，達到與上述前處理方法相同之功效，因此本發明可應用在任何帶有自體螢光現象之檢體種類(如乳癌、肺癌、皮膚、腎臟...等檢體)。
本發明之試劑可因應不同之檢體來調配適當的濃度及作用時間，例如使用在乳腺組織檢體前處理時，可將上述之第四型膠原蛋白酶試劑在作用濃度5~10mg/ml、作用溫度37℃，並於30~60分鐘下作用；或使用在肺組織檢體前處理時，可將上述之彈性蛋白酶試劑在作用濃度1mg/ml、作用溫度37℃，並於30~60分鐘下作用。
綜上所述，本發明改善習知螢光原位雜交法(FISH)以胃蛋白酶(pepsin)檢體前處理步驟導致無法降低檢體自體螢光現象的問題，根據平行實驗結果驗證，具強自體螢光檢體，經新發明處理後檢體自體螢光顯著大幅下降，比較胃蛋白酶(pepsin)處理方法，經本發明處理後檢體探針訊號可清楚計數，探針訊號解析度大幅顯著提升。
前文係針對本發明之較佳實施例為本發明之技術特徵進行具體之說明；惟，熟悉此項技術之人士當可在不脫離本發明之精神與原則下對本發明進行變更與修改，而該等變更與修改，皆應涵蓋於如下申請專利範圍所界定之範疇中。
(S1)．．．步驟一
(S2)．．．步驟二
(S3)．．．步驟三
(S4)．．．步驟四
(S5)．．．步驟五
第一圖：係本發明之步驟流程圖。
第二圖(A)：係透過螢光顯微鏡顯示未使用本發明之方法處理之檢體空白片照片，可見其具強自體螢光。
第二圖(B)：係透過螢光顯微鏡顯示使用本發明之方法處理後之檢體空白片照片，可見其自體螢光下降。
第三圖(A)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本經胃蛋白酶前處理後，進行HER2/CEP17的螢光原位雜交法之照片，可見背景螢光遮蔽FISH探針訊號。
第三圖(B)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本使用本發明之方法處理後，進行HER2/CEP17的螢光原位雜交法之照片，可見檢體自體螢光下降。
第四圖(A)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本經胃蛋白酶前處理後，進行HER2/CEP17的螢光原位雜交法扣除背景後之照片，可見探針訊號不清，無法計數。
第四圖(B)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本使用本發明之方法處理後，進行HER2/CEP17的螢光原位雜交法扣除背景後之照片，可見探針訊號清晰可計數。
第五圖(A)：係透過螢光顯微鏡顯示未使用本發明之方法處理之另一檢體空白片照片，可見其具強自體螢光。
第五圖(B)：係透過螢光顯微鏡顯示使用本發明之方法處理後之另一檢體空白片照片，可見其自體螢光下降。
第六圖(A)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本經胃蛋白酶前處理後，進行EML4/ALK的螢光原位雜交法扣除背景後之照片，可見探針訊號不清，無法計數。
第六圖(B)：係透過螢光顯微鏡顯示具自體螢光樣本使用本發明之方法處理後，進行EML4/ALK的螢光原位雜交法扣除背景後之照片，可見探針訊號清晰可計數。
(S1)．．．步驟一
(S2)．．．步驟二
(S3)．．．步驟三
(S4)．．．步驟四
(S5)．．．步驟五
Claims (3)
- 一種用於降低螢光原位雜交法中自體螢光干擾的檢體前處理方法，包含以下步驟：步驟一：福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織；步驟二：切片及烘片；步驟三：硫氰酸鈉(NaSCN)作用；步驟四：在面積24×32mm的組織加入20μl濃度5~10mg/ml第四型膠原蛋白酶或1mg/ml彈性蛋白酶，封片後於37℃作用0.5~1hr，來降解具自體螢光特性之細胞外基質；及步驟五：以胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。
- 一種用於如專利範圍第1項所述之方法的試劑套組，其係取由純度100%的溶組織梭菌(clostridium histolyticum)所產生之第四型膠原蛋白酶(collagenase type IV)100mg溶於10ml的磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度10mg/ml在-20℃的溫度下儲存。
- 一種用於如專利範圍第1項所述之方法的試劑套組，其係取自豬胰腺(PORCINE PANCREAS)(≧4.0 units/mg protein)中的第一型胰彈性蛋白酶(ELASTASE PANCREATIC TYPE I)4mg溶於1ml磷酸緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)後，以濃度4mg/ml在-20℃的溫度下儲存。
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