CN105699638A - 抗癌剂感受性的判定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够判别各个患者的治疗反应的抗癌剂感受性判定标记和利用其的新的癌症治疗方法。一种抗癌剂感受性判定标记，其包含钙结合蛋白质S100A10，所述抗癌剂包含氟尿嘧啶或其盐、或者氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合。

Description

抗癌剂感受性的判定方法

(本申请是2010年10月29日递交的发明名称为“抗癌剂感受性的判定方法”的申请201080049208.2的分案申请)

技术领域

本发明涉及用于判定作为对象的患者的癌对于欲使用的抗癌剂是否具有治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记及其应用。

背景技术

抗癌剂，有烷基化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物碱等种类。这些抗癌剂中，根据癌的种类不同，有时显示效果，有时不显示效果。但是，已知即使是认为有效的种类的癌，也因各个患者而异有时显示效果，有时不显示效果。这种抗癌剂对于各个患者的癌是否显示效果称为抗癌剂感受性。

奥沙利铂(SP-4-2)-[(1R,2R)-环己烷-1,2-二胺-κN,κN’][乙二酸络(2-)-κO¹,κO²]铂((SP-4-2)-[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine-κN,κN’][ethanedioato(2-)-κO¹,κO²]platinum，IUPAC)是第3代铂配位化合物类抗恶性肿瘤药。据认为，其作用机理与先前的药剂顺铂(CDDP)和卡铂(CBDCA)同样，通过与DNA碱基形成交联而导致DNA合成抑制、蛋白合成抑制，但奥沙利铂(L-OHP)即使对于CDDP和CBDCA无效的大肠癌而言也表现出抗肿瘤效果，表现出和以往的铂配位化合物类抗恶性肿瘤药不同的抗肿瘤谱。美国已经在2004年1月承认其与氟尿嘧啶(5-FU)/左亚叶酸盐(LV)的并用作为转移性结肠-直肠癌的第一线治疗，在日本，在2005年4月在国民健康保险的药价中也收载了对于“不能切除治愈的晚期、复发的结肠-直肠癌”，其与左亚叶酸盐和氟尿嘧啶的静脉内持续给药法的并用(FOLFOX4法)。对于晚期复发大肠癌的治疗而言，在二十世纪90年代前半叶之前一直采用的5-FU/LV疗法的生存率是10～12个月，与此相对，加入了奥沙利铂的FOLFOX疗法的生存期为19.5个月，达到几乎2倍。并且，在2009年8月，相同的通过与左亚叶酸盐和氟尿嘧啶的静脉内持续给药法的并用所进行的“结肠癌中的术后辅助化学疗法”追加了效能、效果，是能够在大肠癌患者中扩大使用并能够期待有益性的药剂。

但是，尽管如此，FOLFOX疗法对于晚期复发的大肠癌发挥的效率也仅为50％左右，换言之，意味着接受治疗的患者中有半数得不到效果。另外，因奥沙利铂的使用而导致中性粒细胞减少症，此外呈现高频率的末梢神经损伤，尽管这些并不是致死的副作用，但都是导致难以继续治疗的因素。因此，在治疗开始前，利用能够预测可以期待效果的患者(反应)和不能期待效果的患者(无反应)而早期诊断治疗反应性的生物标记，就能够实现有效性和安全性高的化学疗法。

关于对铂类药物的化学疗法的感受性/耐性因子的报告有很多，但是这些多是以顺铂为对象的，对于结构、功能上相关联的奥沙利铂的治疗反应性，认为主要与下述1)～3)等相关，作为在以大肠癌患者为对象的奥沙利铂+5-FU并用疗法中的治疗反应性和预后预测因素，正在进行与1)～3)相关的研究。

1)奥沙利铂引起损伤的DNA的切除、修复能力的增强、

2)在细胞内的奥沙利铂(活性体)的失活(解毒)、

3)奥沙利铂的细胞内积蓄量的降低。

关于1)，对于在核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair:NER)中发挥重要作用的切除修复交叉互补基因1(Excisionrepaircross-complementinggroup1，ERCC1)而言，有报告肿瘤内ERCC1的基因表达量是预后因素(非专利文献1)，对于作为ERCC1的单核苷酸多态性(SNP)之一的C118T而言，有报告具有C/C纯合子的患者比具有至少1个以上的T等位基因的患者具有良好的生存率(非专利文献2)。有报告在着色性干皮病基因D(xerodermapigmentosumD，XPD，也作为ERCC2已知)中，伴有Lys751Gln的氨基酸突变的遗传多态性与肿瘤缩小率和生存期相关(非专利文献2、3)。有报告报告了X射线修复交叉互补基因1(X-rayrepaircross-complementinggroup1，XRCC1)的伴有Arg399Gln的氨基酸突变的遗传多态性与肿瘤缩小效果的关系，其中，该X射线修复交叉互补基因1编码据认为在碱基切除修复(baseexcisionrepair：BER)中与有效修复因暴露于烷基化剂等形成的DNA单链切断的蛋白质相关(非专利文献4)，但是有报告，根据以同一个患者为对象的后续分析，其对临床预后没有影响(非专利文献2)。尽管据认为DNA错配修复(DNAmismatchrepair：MMR)也参与对顺铂的感受性下降，但是有报告，在体外(invitro)的研究中，MMR不参与由奥沙利铂导致的DNA损伤部位的修复(非专利文献5)。

关于2)，谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是承担解毒、代谢的第Ⅱ相反应的酶之一，通过催化DNA铂加成物与谷胱苷肽形成抱合体而将药剂失活。有报告在GST亚型中，GSTP1在大肠癌中的表达量增高，伴随Ⅰle105Val的氨基酸突变的遗传多态性与生存期相关(生存期中间值：Ⅰle/Ⅰle为7.9个月、Ⅰle/Val为13.3个月、Val/Val为24.9个月)(非专利文献6)。

关于3)，有报告在使用培养细胞进行的研究中，有机阳离子转运体(OCTs)与奥沙利铂向细胞内输送和感受性相关(非专利文献7)，此外，也有报告ATP7A、ATP7B等与铜或重金属的输送相关的转运蛋白与感受性的相关(非专利文献8、9)。但是，关于它们的表达与奥沙利铂治疗反应性的关联，尚未进行临床研究。

在以接受了FOLFOX疗法的晚期大肠癌患者为对象的最近的临床研究中，报告了ERCC1的遗传多态性(Asn118Asn)和XPD的遗传多态性(Lys751Gln)独立地与无进展生存期(PFS)相关，但对于GSTP1(Ile105Val)而言，没有发现与PFS的关联，而确认与奥沙利铂诱发神经毒性关联的倾向(非专利文献10)。

在体外(invitro)研究中，关于铂配位化合物类的先前药剂顺铂的耐性相关因素有大量报告，关于奥沙利铂，也报告了与FAS/FASL、Bcl-xL等凋亡相关因素的关联(非专利文献11、12)。但是，除了奥沙利铂因癌种类而异而表现出与顺铂不同的治疗反应性以外，癌细胞对于担负奥沙利铂的细胞损伤活性的铂DNA加成物的细胞应答几乎尚未阐明，能够预测对于使用奥沙利铂的化学疗法的治疗反应性的明确的生物标记尚未确立。

氟尿嘧啶，是1957年开发的氟化嘧啶类抗癌剂，现在为消化器官癌化学疗法的基本药剂。进入癌细胞的氟尿嘧啶通过下述作用机理发挥杀细胞效果，即，主要通过活性代谢物一磷酸氟代脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine-5’-monophosphate，FdUMP)引起胸苷酸合酶(thymidylatesynthase，TS)抑制，从而引起DNA合成抑制，此外，通过作为相同的活性代谢物的5-氟尿苷三磷酸(5-fluorouridinetriphosphate，FUTP)引起RNA功能抑制等。

对于氟化嘧啶类抗癌剂的治疗反应性的预测，至今为止进行了很多研究，特别是对作为氟尿嘧啶的分解酶的双氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)和作为活性代谢物的标的酶胸苷酸合酶(thymidylatesynthase，TS)的报告很多。有报告在氟尿嘧啶异化代谢的限速酶DPD高表达的肿瘤中表现为氟尿嘧啶耐性(非专利文献13)，但是使用临床检测体的验证报告并不多。对于TS表达而言，有报告指出不论采用酶活性、蛋白质水平还是RNA水平等的测定方法，其多寡均为氟化嘧啶类抗癌剂的治疗效果决定因子(非专利文献14、15)。但是，这些所有的报告中，没有得到必然一致的结果，并且不知道在治疗早期预测对氟尿嘧啶的治疗反应性的明确的生物标记。

此外，也有报告，在氟尿嘧啶耐性的转移性大肠癌患者中，肿瘤内ERCC1和TS的mRNA表达量是5-FU/L-OHP并用疗法的治疗反应性预测因子(非专利文献16)。但是最近，在以晚期大肠癌患者为对象的化学疗法的治疗反应性生物标记相关的大规模临床试验(FOCUSTrial)的报告中，ERCC1不是5-FU/L-OHP并用疗法的有意义的效果预测因子，只有Ⅰ型拓扑异构酶(Topoisomerase-1，Topo1)显示了弱的关联性(非专利文献17)。这表示尚未确立能够可靠发现可以期待由5-FU/L-OHP并用疗法带来高治疗效果的患者的生物标记。并且，通常，癌化学疗法的治疗疗程是长期进行的，在治疗过程中，对抗癌剂感受性的经时监控能够判断是否继续治疗，不仅从患者负担和降低副作用方面出发，而且从医疗经济的观点出发也是有用的。为了实现预测各个患者的治疗反应性并早期诊断，选择适宜的药剂和治疗方法进行“个别化治疗”，确立能够进行5-FU、L-OHP和5-FU/L-OHP并用时的效果预测或治疗反应性的早期诊断的生物标记是当务之急。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：J.Clin.Oncol.19,4298-4304(2001)

非专利文献2：Br.J.Cancer91,344-354(2004)

非专利文献3：CancerRes61,8654-8658(2001)

非专利文献4：AnticancerRes.21,3075-3079(2001)

非专利文献5：CancerRes.56,4881-4886(1996)

非专利文献6：J.Natl.CancerInst.94,936-942(2002)

非专利文献7：CancerRes.66,8847-8857(2006)

非专利文献8：Mol.Pharmacol.66,25-32(2004)

非专利文献9：Clin.CancerRes.10,4661-4669(2004)

非专利文献10：J.Clin.Oncol.25,1247-1254(2007)

非专利文献11：Clin.CancerRes.11,4770-4774(2005)

非专利文献12：J.Biol.Chem.279,46113-46121(2004)

非专利文献13：EuropeanJournalofCancer2004；40:939-950.

非专利文献14：CancerTreatmentReviews2002；28:27-47

非专利文献15：JClinOncol2004；22:529-536

非专利文献16：JClinOncol2001；19:4298-4304

非专利文献17：JClinOncol2008；26:2690-2698.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记和利用其的新的癌症治疗方法。

用于解决课题的方法

为此，本发明的发明人培养人癌细胞株，使用表面增强激光解析电离飞行时间型质量分析仪(SELDI-TOFMS)对药剂暴露后的细胞内蛋白质的经时表达变化进行网罗式分析，由此，进行抗癌剂感受性判定标记的探索。对于对5-FU、L-OHP、和两者并用(5-FU/L-OHP)表现出高感受性、低感受性的2种人大肠癌细胞，暴露于5-FU单剂、L-OHP单剂、5-FU/L-OHP并用，研究药剂暴露后的细胞内蛋白质的经时表达变化。其结果，在5-FU暴露后，发现在高感受性细胞中细胞内观察到表达水平上升的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z5300～5400的峰被检测出的蛋白质、作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7000～7080的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7840～7920的峰被检测出的蛋白质、作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质、作为m/z18290～18470的峰被检测出的蛋白质、作为m/z24660～24750的峰被检测出的蛋白质、作为m/z35980～36290的峰被检测出的蛋白质、作为m/z9100～9200的峰被检测出的蛋白质、钙结合蛋白质S100A10。

同样，在L-OHP暴露后，发现在高感受性细胞和低感受性细胞中观察到细胞内表达水平的不同的经时变化的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z5300～5400的峰被检测出的蛋白质、作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7000～7080的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7840～7920的峰被检测出的蛋白质、作为m/z12440～12560的峰被检测出的蛋白质、作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质、作为m/z18290～18470的峰被检测出的蛋白质、作为m/z24660～24750的峰被检测出的蛋白质、作为m/z35980～36290的峰被检测出的蛋白质、作为m/z9100～9200的峰被检测出的蛋白质。

在5-FU/L-OHP并用暴露后，发现在高感受性细胞和低感受性细胞中观察到细胞内表达水平的不同的经时变化的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z5300～5400的峰被检测出的蛋白质、作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7000～7080的峰被检测出的蛋白质、作为m/z7840～7920的峰被检测出的蛋白质、m/z8920～9000的峰被检测出的蛋白质、作为m/z12440～12560的峰被检测出的蛋白质、作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质、作为m/z18290～18470的峰被检测出的蛋白质、作为m/z24660～24750的峰被检测出的蛋白质、作为m/z35980～36290的峰被检测出的蛋白质、作为m/z9100～9200的峰被检测出的蛋白质、钙结合蛋白质S100A10。

此外，在高感受性细胞和低感受性细胞中，发现药剂暴露前的细胞内表达水平不同的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质、作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质、作为m/z8650～8750的峰被检测出的蛋白质、作为m/z11760～11890的峰被检测出的蛋白质。

基于上述发现进一步进行研究，结果发现：如果测定来自癌症患者机体的试样中的该蛋白质的浓度，就能够判定该癌症患者的癌相对于5-FU、L-OHP、或者5-FU/L-OHP的并用疗法是否具有感受性，此外，如果以这些物质的表达改变为指标，就能够进行抗癌剂感受性增强剂的筛选，而且，如果并用该抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂，就能够大幅提高该抗癌剂的治疗效果，由此完成本发明。

即，本发明提供一种抗癌剂感受性判定标记，其包含选自在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z5300～5400的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质A)、作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质B)、作为m/z7000～7080的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质C)、作为m/z7840～7920的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质D)、m/z8920～9000的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质E)、作为m/z12440～12560的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质G)、作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质H)、作为m/z18290～18470的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质I)、作为m/z24660～24750的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质J)、作为m/z35980～36290的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质K)、作为m/z8650～8750的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质L)、作为m/z9100～9200的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质M)、和作为m/z11760～11890的峰被检测出的蛋白质(以下，称为蛋白质N)中的蛋白质。

此外，本发明提供一种抗癌剂感受性判定标记，所述抗癌剂包括氟尿嘧啶或其盐、或氟尿嘧啶或其盐与奥沙利铂或其盐的组合，该癌剂感受性判定标记包含钙结合蛋白质S100A10(以下，称为蛋白质F)。

此外，本发明提供一种抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于，测定检测体中的上述蛋白质A～N。

此外，本发明提供一种用于实施抗癌剂感受性判定方法的试剂盒，其特征在于，包含用于测定检测体中的上述蛋白质A～N的方案。

此外，本发明提供一种以上述蛋白质A～N的表达改变为指标的抗癌剂感受性增强剂的筛选方法。

此外，本发明提供一种通过上述筛选方法得到的抗癌剂感受性增强剂。

此外，本发明提供一种含有上述抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合的癌治疗用组合物。

此外，本发明提供用于判定抗癌剂感受性的上述蛋白质A～N。

发明的效果

使用本发明的抗癌剂感受性判定标记，能够在治疗开始前或治疗开始早期适宜判定各个患者的抗癌剂感受性，结果能够选择治疗效果高的抗癌剂。而且，能够避免没有效果的抗癌剂的使用，因此能够避免不必要的副作用。此外，使用抗癌剂的治疗周期长，因此，通过在治疗过程中在每个治疗疗程中判定抗癌剂感受性，就能够经时地评价该癌对抗癌剂的感受性，能够判定是否应该继续治疗。其结果，能够防止没有治疗效果的抗癌剂的继续给药所带来的癌的进展、副作用的增大，从而能够减轻患者的负担，削减医疗费用。

此外，使用该标记，就能够筛选增强抗癌剂感受性的药剂，如果并用作为其对象的抗癌剂和抗癌剂感受性增强剂，就能够大幅提高癌治疗效果。本发明的抗癌剂感受性判定标记的测定试剂，作为抗癌剂感受性判定试剂是有用的。

附图说明

图1为表示HCT116和DLD-1中，对5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用的生存率(％)的图。

图2为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质A的细胞内水平的经时变化的图。

图3为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质B的细胞内水平的经时变化的图。

图4为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质C的细胞内水平的经时变化的图。

图5为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质D的细胞内水平的经时变化的图。

图6为表示HCT116和DLD-1中，5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质E的细胞内水平的经时变化的图。

图7为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质F的细胞内水平的经时变化的图。

图8为表示HCT116和DLD-1中，L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质G的细胞内水平的经时变化的图。

图9为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质H的细胞内水平的经时变化的图。

图10为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质I的细胞内水平的经时变化的图。

图11为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质J的细胞内水平的经时变化的图。

图12为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质K的细胞内水平的经时变化的图。

图13为表示HCT116和DLD-1中，使用蛋白质印迹法检测出S100A10的图。

图14为表示HCT116和DLD-1中，5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用暴露后的蛋白质M的细胞内水平的经时变化的图。

具体实施方式

本发明中的抗癌剂感受性判定标记为蛋白质A～N，更详细而言，在表面增强激光解析电离飞行时间型质量分析仪(SELDI-TOFMS)中，使用阳离子交换芯片，在pH4.5的条件下，分别在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z5300～5400的峰被检测出的蛋白质(蛋白质A)、本体或其片段是作为m/z6130～6230的峰被检测出的蛋白质(蛋白质B)、本体或其片段是作为m/z7000～7080的峰被检测出的蛋白质(蛋白质C)、本体或其片段是作为m/z7840～7920的峰被检测出的蛋白质(蛋白质D)、本体或其片段是作为m/z8920～9000的峰被检测出的蛋白质(蛋白质E)、本体或其片段是作为m/z11020～11120的峰被检测出的蛋白质(蛋白质F)、本体或其片段是作为m/z12440～12560的峰被检测出的蛋白质(蛋白质G)、本体或其片段是作为m/z17100～17270的峰被检测出的蛋白质(蛋白质H)、本体或其片段是作为m/z18290～18470的峰被检测出的蛋白质(蛋白质I)、本体或其片段是作为m/z24660～24750的峰被检测出的蛋白质(蛋白质J)、本体或其片段是作为m/z35980～36290的峰被检测出的蛋白质(蛋白质K)、本体或其片段是作为m/z8650～8750的峰被检测出的蛋白质(蛋白质L)、本体或其片段是作为m/z9100～9200的峰被检测出的蛋白质(蛋白质M)、本体或其片段是作为m/z11760～11890的峰被检测出的蛋白质(蛋白质N)。

如后述的实施例所示，蛋白质F判定为钙结合蛋白质S100A10。S100A10作为具有钙结合EF-hand基序的S100蛋白质家族的一员已知。由于还已知S100A10自身的二聚体与膜联蛋白A2(膜联蛋白-2(Annexin-2)、膜联蛋白Ⅱ(AnnexinII)、脂皮质蛋白Ⅱ(LipocortinII)、依钙结合蛋白Ⅰ重链(CalpactinIheavyChain)、嗜铬粒结合蛋白-8(Chromobindin-8)、p36、蛋白Ⅰ(ProteinI)、胎盘抗凝蛋白类Ⅳ(PlacentalanticoagulantproteinIV)、PAP-Ⅳ)的二聚体形成异四聚体，所以，膜联蛋白A2也和S100A10同样，存在能够作为抗癌剂感受性的判定标记使用的可能性。

蛋白质A～C、F、H～K，如后述的实施例所示，使用SELDI-TOFMS研究培养癌细胞的细胞内蛋白质的表达，结果，5-FU暴露后，在对5-FU为低感受性的DLD-1中，观察到细胞内水平的上升。另一方面，在对5-FU高感受性的HCT116中，没有观察到明显的变化。因此，蛋白质A～C、F、H～K作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

蛋白质D、M，如后述的实施例所示，5-FU暴露后，在对5-FU为高感受性的HCT116中，观察到细胞内水平的降低。另一方面，在对5-FU低感受性的DLD-1中，没有观察到明显的变化。因此，蛋白质D、M作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

蛋白质A～C、G～K，如后述的实施例所示，L-OHP暴露后，在对L-OHP低感受性的DLD-1中，观察到细胞内水平的上升。另一方面，在对L-OHP高感受性的HCT116中，没有观察到显著地变化。因此，蛋白质A～C、G～K作为抗癌剂感受性判定标记，特别是L-OHP的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

此外，在本发明者的在先申请(WO2009/96196号国际公开小册子)中已经阐明，蛋白质F(钙结合蛋白质S100A10)能够作为L-OHP的抗癌剂感受性判定标记，本次的实验也得到同样的结果。

蛋白质D、M，如后述的实施例所示，在L-OHP暴露后，在对L-OHP高感受性的HCT116中，观察到细胞内水平的降低。另一方面，在L-OHP低感受性的DLD-1中，没有观察到显著变化。因此，蛋白质D、M作为抗癌剂感受性判定标记，特别是L-OHP的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

蛋白质A～C、F、H～K，如后述的实施例所示，在5-FU/L-OHP并用暴露后，在对5-FU/L-OHP并用低感受性的DLD-1中，观察到细胞内水平的上升。另一方面，在对5-FU/L-OHP并用高感受性的HCT116中，没有观察到显著变化。因此，蛋白质A～C、F、H～K作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU/L-OHP并用时的抗癌剂感受性判定标记是有用的。如前所述，已知蛋白质F作为L-OHP的抗癌剂感受性判定标记是有用的，但该蛋白质F作为5-FU/L-OHP并用时的抗癌剂感受性标记有用是本发明首次得到的见解。

蛋白质E、G，如后述的实施例所示，在5-FU/L-OHP并用暴露后，在对5-FU/L-OHP高感受性的HCT116中，观察到细胞内水平的上升。另一方面，在对5-FU/L-OHP并用低感受性的DLD-1中，没有观察到显著的变化。因此，蛋白质E、G作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU/L-OHP并用时的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

蛋白质D、M，如后述的实施例所示，在5-FU/L-OHP并用暴露后，在对5-FU/L-OHP并用高感受性的HCT116中，观察到细胞内水平的降低。另一方面，在对5-FU/L-OHP并用低感受性的DLD-1中，没有观察到显著的变化。因此，蛋白质D、M作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU/L-OHP并用时的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

蛋白质B、H、L、N，如后述的实施例所示，在对5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用均为高感受性的HCT116中，药剂暴露前(非暴露时)的细胞内水平，与对上述药剂均为低感受性的DLD-1比较，显示有意义的高值。因此，蛋白质B、H、L、N作为抗癌剂感受性判定标记，特别是5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用时的抗癌剂感受性判定标记是有用的。

作为本发明的抗癌剂感受性判定标记的对象的抗癌剂，没有特别限定，例如，可以举出奥沙利铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟/尿嘧啶(tegaful/uracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奥替拉西(tegaful/gimeracil/oteracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟达拉滨(fuludarabin)、喷司他汀(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、羟基脲(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依达比星(idarubicine)、吡柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氨柔比星(amurubicin)、放线菌素D(actinomycinD)、博来霉素(bleomycine)、派来霉素(pepleomycin)、丝裂霉素C(mytomycinC)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁(zinostatin)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、伊立替康活性代谢物(SN-38)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、利妥昔(rituximab)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenictrioxide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选氟化嘧啶类抗癌剂、铂配位化合物类抗癌剂，特别优选氟尿嘧啶、奥沙利铂或者它们的盐。进而，在氟尿嘧啶或其盐、奥沙利铂或其盐的并用剂中能够适宜地利用。

在使用本发明的抗癌剂感受性判定标记判定抗癌剂感受性时，测定检测体中的蛋白质A～N即可。在此，作为检测体，可以列举来自患有癌的被检验者(癌患者)机体的试样，例如，可以列举血液、血清、血浆、癌组织活检样本、癌摘除手术标本、便、尿、腹水、胸水、脑脊液、痰等，但特别优选血清。

另外，作为本发明对象的癌，可以列举以喉癌为代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、胃癌、结肠-直肠癌等为代表的消化器官癌、以肺癌为代表的呼吸器官和胸腔内脏器官癌、骨及关节软骨癌、皮肤的恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌及其它皮肤癌、以间皮瘤为代表的间皮和软组织癌、以乳腺癌、子宫癌、卵巢癌为代表的女性性器官癌、以前列腺癌为代表的男性性器官癌、以膀胱癌为代表的尿路癌、以脑肿瘤为代表的眼、脑和中枢神经系统癌、甲状腺和其它内分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴细胞性白血病为代表的淋巴组织、造血组织和关联组织癌、以及以这些癌为原发病灶的转移组织的癌等，但特别是能够对胃癌和结肠-直肠癌适合地利用。

检测体中的蛋白质A～N的测定方法，例如能够通过SELDI-TOFMS、免疫学测定方法等测定。

在此，利用SELDI-TOFMS的测定可以采用后述的实施例中记载的方法进行。另外，在免疫学测定法中，优选使用抗蛋白质A～N的抗体的免疫学测定法。所使用的抗蛋白质A～N的抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。更具体而言，例如，可以列举放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析、免疫沉降法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫染色、免疫扩散法等，但优选蛋白质印迹或酶免疫分析，特别优选蛋白质印迹、酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay：ELISA)(例如，夹心酶联免疫分析，sandwichELISA)。

对于蛋白质A～C、F、H～K而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU时，判定对抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些蛋白质浓度，当抗癌剂给药前后蛋白质的浓度上升时，能够判定该癌症没有抗癌剂感受性，当与抗癌剂给药前相比，在给药后蛋白质浓度没有变化或者降低时，能够判定该癌症具有抗癌剂感受性。即，蛋白质A～C、F、H～K的浓度在给药后早期的阶段中，当具有判定为比规定的标准浓度低的浓度时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂具有感受性，因此，能够作为用于对能够期待治疗效果的患者继续积极治疗的标记使用。

此外，给药后早期的阶段中，当蛋白质A～C、F、H～K的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂没有感受性。当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待其药效，在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药时，存在癌的进展、副作用增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还能够作为用于避免不能期待药效的抗癌剂的继续给药所引起的癌的进展和副作用增大的标记使用。

对于蛋白质A～C、G～K而言，当作为对象的抗癌剂为L-OHP时，此外，对于蛋白质A～C、F、H～K而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU/L-OHP并用时，能够与上述同样判定对于抗癌剂的感受性。

对于蛋白质D、M而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU时，在判定对于抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些蛋白质浓度，当抗癌剂给药前后蛋白质的浓度降低时，能够判定该癌症具有抗癌剂感受性，当与抗癌剂给药前相比，给药后蛋白质浓度没有变化或者上升时，能够判定该癌症没有抗癌剂感受性。即，蛋白质D、M的浓度在给药后早期的阶段中，当判定为比规定的标准浓度低时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂具有感受性，因此，能够作为用于对能够期待治疗效果的患者继续积极治疗的标记使用。

此外，给药后早期的阶段中，当蛋白质D、M的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂没有感受性。当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待其药效，在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药时，存在癌的进展、副作用增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还能够作为用于避免不能期待药效的抗癌剂的继续给药所引起的癌的进展和副作用增大的标记使用。

对于蛋白质D、M而言，当作为对象的抗癌剂为L-OHP时，此外，当作为对象的抗癌剂为5-FU/L-OHP并用时，能够与上述同样判定对于抗癌剂的感受性。

对于蛋白质E、G而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU/L-OHP时，判定对抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些蛋白质浓度，当抗癌剂给药前后蛋白质的浓度上升时，能够判定该癌症具有抗癌剂感受性，当与抗癌剂给药前相比，在给药后蛋白质浓度没有变化或者降低时，能够判定该癌症没有抗癌剂感受性。即，蛋白质E、G的浓度在给药后早期的阶段中，当判定为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂具有感受性，因此，能够作为用于对能够期待治疗效果的患者继续积极治疗的标记使用。

此外，给药后早期的阶段中，当蛋白质E、G的浓度判断为比规定的标准浓度低时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂没有感受性。当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待其药效，在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药时，存在癌的进展、副作用增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还能够作为用于避免不能期待药效的抗癌剂的继续给药所引起的癌的进展和副作用增大的标记使用。

对于蛋白质B、H、L、N而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用时，判定对抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前来自癌症患者机体的试样中的这些蛋白质浓度，当这些蛋白质的浓度判断为比规定的标准浓度低时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂没有感受性。当对于作为对象的抗癌剂没有感受性时，认为不能期待其药效，而只能表现出抗癌剂的副作用，因此，本发明的抗癌剂感受性判定标记也能够作为用于避免表现出不必要的副作用或者无效治疗继续进行所引起的癌的进展和副作用增大的标记使用。

此外，当这些蛋白质的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对于作为对象的抗癌剂具有感受性，因此，能够作为用于将能够期待治疗效果的患者积极选出的标记使用。

其中，对于蛋白质B、H而言，作为抗癌剂给药中的标记，当与抗癌剂给药前相比，给药后的蛋白质浓度没有变化或者降低时，能够判定该癌具有抗癌剂感受性，作为抗癌剂给药前的标记，当判定为比规定的标准浓度低时，能够判定该癌没有抗癌剂感受性。由于在抗癌剂的给药中或者抗癌剂给药前，作为标记所发挥的作用不同，因此优选留意这一点进行使用。

在实施本发明的抗癌剂感受性的判定方法时，优选使用含有用于测定检测体中的蛋白质A～N的方案的试剂盒。该试剂盒中，包含蛋白质A～N的测定试剂、测定试剂的使用方法、以及用于判定抗癌剂感受性有无的基准等。该基准包括蛋白质A～N的标准浓度、判定为高的浓度、判断为低的浓度、对测定结果产生影响的主要原因和其影响程度等，这些浓度能够针对每个作为对象的抗癌剂进行设定。使用该基准，能够如前所述进行判定。

对于蛋白质A～D、F、H～K、M而言，如果以这些蛋白质的表达改变，具体而言以表达抑制为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(invitro)或体内(invivo)，抑制蛋白质A～D、F、H～K、M表达的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(invitro)，各种癌细胞株中，在抗癌剂的存在下使蛋白质的浓度降低的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体内(invivo)，在荷癌症动物中，在抗癌剂给药前后，使蛋白质的浓度降低增强的物质，是增强该抗癌剂的感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。对于蛋白质A～D、G～K、M而言，当作为对象的抗癌剂为L-OHP时，或者，对于蛋白质A～D、F、H～K、M而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU/L-OHP并用时，也能够与上述同样进行抗癌剂感受性增强剂的筛选。

对于蛋白质E、G而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU/L-OHP并用时，如果以这些蛋白质的表达改变，具体而言以表达上升为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(invitro)或体内(invivo)，使蛋白质E、G的表达上升的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(invitro)，各种癌细胞株中，在抗癌剂的存在下使蛋白质的浓度上升的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体内(invivo)，在荷癌症动物中，在抗癌剂给药前后，使蛋白质的浓度上升增强的物质，是增强该抗癌剂的感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。

对于蛋白质B、H、L、N而言，当作为对象的抗癌剂为5-FU、L-OHP、5-FU/L-OHP并用时，如果以这些蛋白质的表达改变，具体而言以表达上升为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(invitro)或体内(invivo)，使蛋白质的表达上升的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(invitro)，各种癌细胞株中，在抗癌剂不存在下使蛋白质的浓度上升的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体内(invivo)，在荷癌症动物中，在抗癌剂给药前，使蛋白质的浓度上升增强的物质，是增强该抗癌剂的感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。

如果并用这样得到的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂，就能够大幅提升该抗癌剂的治疗效果。作为组合抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的方式，可以是包含这些成分两者的一种组合物，也可以是各自分别的制剂的组合。此外，也可以将这些成分分别以各自的给药方式给药。

作为在此使用的作为对象的抗癌剂，与前述同样，例如，可以举出奥沙利铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟/尿嘧啶(tegaful/uracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奥替拉西(tegaful/gimeracil/oteracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟达拉滨(fuludarabin)、喷司他汀(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、羟基脲(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依达比星(idarubicine)、吡柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氨柔比星(amurubicin)、放线菌素D(actinomycinD)、博来霉素(bleomycine)、派来霉素(pepleomycin)、丝裂霉素C(mytomycinC)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁(zinostatin)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、伊立替康活性代谢物(SN-38)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、利妥昔(rituximab)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenictrioxide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选氟化嘧啶类抗癌剂、铂配位化合物类抗癌剂，特别优选氟尿嘧啶、奥沙利铂或者它们的盐。进而，在氟尿嘧啶或其盐、奥沙利铂或其盐的并用剂中能够适宜地利用。

实施例

接着，举出实施例，更详细的说明本发明。

实施例1

(1)方法

(a)使用细胞

2种人大肠癌细胞株(HCT-116、DLD-1)从ECACC获得。培养在以下条件下进行，即，Φ100mm/TissueCultureDish(IWAKI)，培养基(D-MEM，2mMGlutamine，10％FetalBovineSerum)，37℃，5％CO₂。(b)药剂

氟尿嘧啶(5-FU)从Sigma公司购入，奥沙利铂(L-OHP)散装粉末从株式会社益力多本社获得。

(c)5-FU、L-OHP以及5-FU和L-OHP并用(5-FU/L-OHP)时的感受性评价

使用2种大肠癌细胞株HCT116、DLD-1，通过MTSassay(CellTiter96^TMAQ_ueousOneSolutionCellProliferationAssay，Promega)评价在药剂暴露24小时后和48小时后的细胞生存率。药剂暴露条件为，作为5-FU单剂，使用对照(Control)(0μM)、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、1000μM、10000μM这11个条件；作为L-OHP单剂，使用对照(Control)(0μM)、0.001μM、0.01μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、1000μM这11个条件。作为并用，使用分别向5-FU的2μM、10μM、30μM、100μM这4个浓度，加入L-OHP的0.01μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、1000μM的9个浓度的36个条件，以及与各并用条件相同浓度的5-FU单剂4个条件和对照(Control)(0μM)。在感受性评价中，在1次试验中，对各个细胞株、药剂暴露时间、药剂暴露条件，每次进行3个样品的测定，用不同培养代数的细胞实施3次。

以根据MTSassay的结果计算出的生存率为基础进行分析。在判定有无并用效果时，比较并用时的生存率(viability)和与并用时使用的相同浓度的各药剂在单剂暴露时的生存率，如果与双方相比生存率有意义地下降，则判定具有并用效果。

(d)药剂暴露实验

基于上述(c)的结果，在暴露实验中使用的药剂浓度，作为5-FU+L-OHP的并用，为2μM+1μM、2μM+10μM、100μM+1μM、100μM+10μM这4种，作为与这些并用暴露时使用的相同浓度的各药剂单独暴露，5-Fu为2μM、100μM，L-OHP为1μM、10μM，加上这些中没有药剂的对照(Control)全部9个条件，进行暴露实验。药剂暴露时间为暴露前(0小时)、4小时、12小时、24小时、48小时5种，在暴露结束的时刻计测细胞数，提取细胞内蛋白质。

(e)细胞内蛋白质的提取

从培养皿(dish)除去培养基，用冰冷的PBS中清洗3次，之后，以橡胶刮子剥离收集，将细胞悬液移到1.5mL的微量离心管中。在4℃以1200×g离心10分钟，收集细胞，除去上清液之后，每1000万个细胞数加入200μL的细胞溶解缓冲液(9mol/LUrea，2％CHAPS，1mMDTT，蛋白酶抑制剂(Sigma))，在冰冷下进行超声波破碎处理，之后，在4℃以16000×g离心分离20分钟，在液氮中急速冻结上清液，在分析前保存在-80℃。使用上清液的一部分进行蛋白质定量(DCProteinAssayKit，Bio-Rad)。

(f)用于蛋白质表达分析的样品制备和蛋白质芯片的制作、细胞内蛋白质的表达分析

用细胞溶解缓冲液(除去蛋白酶抑制剂)制备为2.5mg/mL，接着，以pH4.5的稀释/清洗缓冲液(50mMsodiumacetatebuffer)(以下，称为缓冲液)制备为0.5mg/mL，将该样品100μL供给以同样的缓冲液进行过前处理的阳离子交换芯片阵列(CM10，Bio-Rad)的点，孵育1小时进行反应后，以缓冲液清洗3次，以milliQ水冲洗2次。风干后，将1.0μL能量吸收分子(energyabsorbingmolecule，EAM：50％ACN/0.5％TFA溶液的芥子酸(sinapinicacid)饱和溶液)以每次0.5μL分2次供给到各点，点表面干燥后，进行蛋白质芯片阵列的分析。

蛋白质表达分析通过表面增强激光解析电离飞行时间型质量分析仪(surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry：SELDI-TOFMS)进行。作为分析仪器，使用ProteinChip^TMReader(ModelPCS4000PersonalEdition，Bio-Rad)，在MassRange0～70000Daltons、FocusMass8000Dalton、Energy3000或4000nJ、每一个样品合计265shots的条件下进行分析。Signal-to-noiseratio(S/N比)2以上的峰的提取和蛋白质表达比较分析使用CiphergenExpress^TMDataManager3.0进行。

(g)候补峰的选择

通过SELDI-TOFMS分析的结果，在S/N比2以上的条件下各样品提取88～143个蛋白质峰。首先，通过CiphergenExpress^TMDataManager3.0做成峰簇。接着，挑选在各条件下，药剂暴露后随着时间而峰强度有意义地变化的峰、和各暴露时间(4、12、24、48小时)下随着药剂暴露条件而峰强度有意义地变化的峰。找出两者都可检测出的峰，即，确认了既随着暴露时间而表达变化也随着药剂条件而表达变化的峰。

(2)结果

(a)HCT-116和DLD-1的药剂感受性的评价

以100μM的5-FU暴露48小时后的细胞生存率，HCT116为约24％，DLD-1为约49％，确认DLD-1与HCT116相比为5-FU低感受性。以1μM的L-OHP暴露48小时后的细胞生存率，HCT116为约37％，DLD-1为约82％，确认DLD-1与HCT116相比为L-OHP低感受性。对于5-FU/L-OHP并用而言，5-FU2μM+L-OHP1μM暴露24小时后，以及5-FU100μM+L-OHP10μM暴露48小时后，在HCT116中，与各个单剂暴露后的细胞生存率相比，在并用时显示为有意义的低细胞生存率，确认了并用效果，但在DLD-1中没有确认有意义的并用效果。因此，确认HCT116对于5-FU/L-OHP并用为高感受性细胞，DLD-1为低感受性细胞(图1)

(b)蛋白质表达分析

通过使用SELDI-TOFMS的蛋白质组分析方法，网罗式分析5-FU暴露、或者L-OHP暴露、或者5-FU/L-OHP并用暴露所伴随的细胞内蛋白质的变动。利用(1)方法所示的方法进行分析，结果发现各药剂暴露后显示特征变动的以下蛋白质。

(5-FU)

对5-FU暴露后的细胞内蛋白质的经时变化进行分析的结果，(1)5-FU暴露后的细胞内水平，只在DLD-1中上升，或者与HCT116比较，在DLD-1中观察到更大上升的峰(图2、图3、图4(甲)、图7(甲)、图9、图10、图11(甲)、图12)

·m/z5300～5400(蛋白质A)

·m/z6130～6230(蛋白质B)

·m/z7000～7080(蛋白质C)

·m/z11020～11120(蛋白质F)

·m/z17100～17270(蛋白质H)

·m/z18290～18470(蛋白质I)

·m/z24660～24750(蛋白质J)

·m/z35980～36290(蛋白质K)

(2)5-FU暴露后，在HCT116观察到细胞内水平降低的峰(图5(丙)、图14)

·m/z7840～7920(蛋白质D)

·m/z9100～9200(蛋白质M)

(L-OHP)

对L-OHP暴露后的细胞内蛋白质的经时变化进行分析的结果，

(1)L-OHP暴露后的细胞内水平，只在DLD-1中上升，或者与HCT116比较，在DLD-1中观察到更大上升的峰(图2、图3、图4(乙)、图7(乙)、图8(甲)、图9、图10、图11(丙)、图12)

·m/z5300～5400(蛋白质A)

·m/z6130～6230(蛋白质B)

·m/z7000～7080(蛋白质C)

·m/z11020～11120(蛋白质F)

·m/z12440～12560(蛋白质G)

·m/z17100～17270(蛋白质H)

·m/z18290～18470(蛋白质I)

·m/z24660～24750(蛋白质J)

·m/z35980～36290(蛋白质K)

(2)L-OHP暴露后，在HCT116中观察到细胞内水平降低的峰(图5(甲)、图14)

·m/z7840～7920(蛋白质D)

·m/z9100～9200(蛋白质M)

(5-FU/L-OHP)

对5-FU/L-OHP并用暴露后的细胞内蛋白质的经时变化进行分析的结果，

(1)5-FU/L-OHP暴露后的细胞内水平，只在DLD-1中上升，或者与HCT116比较，在DLD-1中观察到更大上升的峰(图2、图3、图4(丙)、图7(丙)、图9、图10、图11(乙)、图12)。

·m/z5300～5400(蛋白质A)

·m/z6130～6230(蛋白质B)

·m/z7000～7080(蛋白质C)

·m/z11020～11120(蛋白质F)

·m/z17100～17270(蛋白质H)

·m/z18290～18470(蛋白质I)

·m/z24660～24750(蛋白质J)

·m/z35980～36290(蛋白质K)

(2)5-FU/L-OHP并用暴露后，在HCT116中观察到细胞内水平上升的峰(图6、图8(乙))

·m/z8920～9000(蛋白质E)

·m/z12440～12560(蛋白质G)

(3)5-FU/L-OHP并用暴露后，在HCT116中观察到细胞内水平降低的峰(图5(乙)、图14)

·m/z7840～7920(蛋白质D)

·m/z9100～9200(蛋白质M)

(药剂暴露前的细胞内水平)

药剂暴露前(非暴露时)的细胞内水平，与DLD-1比较，在HCT116中显示有意义的高值的峰

·m/z6130～6230(蛋白质B)

·m/z8650～8750(蛋白质L)

·m/z11760～11890(蛋白质N)

·m/z17100～17270(蛋白质H)

蛋白质B中的药剂暴露前的细胞内水平，作为通过SELDI-TOFMS分析得到的峰强度(μA)(平均值±S.D.，n＝27)，在HCT116中为55.4±9.2，在DLD-1中为28.9±6.4，同样，蛋白质L在HCT116中为88.2±2.2，在DLD-1中为32.1±1.3，蛋白质N在HCT116中为85.1±9.3，在DLD-1中为50.6±6.0，蛋白质H在HCT116中为15.5±2.1，在DLD-1中为3.86±1.34，上述任一个蛋白在HCT116中的药剂暴露前(非暴露时)细胞内水平均显示比DLD-1有意义的高值。

实施例2

对于在实施例1中发现的全部的峰，作为分子量已知的标准物质，使用insulinoxidizedBchain(bovine)(m/z3496.94+1H)、Insulin(bovine)(m/z5733.51+1H)、Cytochromec(equine)(m/z12360.96+1H)、Apomyoglobin(equine)(m/z16952.27+1H)、Aldorase(reabbitmuscle)(m/z39212.28+1H)，使用夹持各目的峰的2种标准物质的分子量2点的分子量补正(internalcalibration)进行m/z确认。其结果，实施例1中发现的峰分别确认是在m/z5300～5400(蛋白质A)、m/z6130～6230(蛋白质B)、m/z7000～7080(蛋白质C)、m/z7840～7920(蛋白质D)、m/z8920～9000(蛋白质E)、m/z11020～11120(蛋白质F)、m/z12440～12560(蛋白质G)、m/z17100～17270(蛋白质H)、m/z18290～18470(蛋白质I)、m/z24660～24750(蛋白质J)、m/z35980～36290(蛋白质K)、m/z8650～8750(蛋白质L)、m/z9100～9200(蛋白质M)、m/z11760～11890(蛋白质N)之间检测出的。

实施例3

对于在实施例1发现的全部峰，为了更详细的研究其性质，对随着pH变化的峰强度变化进行了研究。

(1)方法

(a)研究所使用的蛋白质芯片阵列和缓冲液条件

对于阳离子交换芯片阵列(CM10，Bio-Rad)，使用pH3.0(50mMGlycine-HCLbuffer)、pH3.5(50mMsodiumacetatebuffer)、pH4.0(50mMsodiumacetatebuffer)、pH4.5(50mMsodiumacetatebuffer)、pH5.0(50mMsodiumacetatebuffer)、pH5.5(50mMsodiumacetatebuffer)、pH6.0(50mMphosphatebuffer)、pH6.5(50mMphosphatebuffer)pH7.0(50mMphosphatebuffer)、pH7.5(50mMphosphatebuffer)、pH8.0(50mMTris-HCLbuffer)、pH8.5(50mMTris-HCLbuffer)、pH9.0(50mMGlycine-NaOHbuffer)、pH9.5(50mMGlycine-NaOHbuffer)、pH10.0(50mMGlycine-NaOHbuffer)的15种缓冲液。

(b)用于使用CM10芯片阵列进行分析的样品制备和蛋白质芯片的制作和分析条件

用于使用CM10芯片阵列的分析的样品制备和蛋白质芯片的制作，使用(a)的各缓冲液，按照实施例1的(1)方法的上述(f)为基准实施。

(2)结果

使用CM10芯片阵列的分析中，能够判断观察到峰强度降低的pH在该蛋白质的离子化丧失的等电点(pI)附近。其结果，在实施例1检测出的峰的等电点(pI)推定：

·m/z7000～7080(蛋白质C)pH3.5～6.5

·m/z8920～9000(蛋白质E)pH4.0～7.0

·m/z11020～11120(蛋白质F)pH7.0～8.0

·m/z12440～12560(蛋白质G)pH4.5～7.5

·m/z17100～17270的(蛋白质H)pH5.0～8.0

·m/z18290～18470(蛋白质I)pH6.5～9.5

·m/z24660～24750(蛋白质J)pH3.5～6.5

·m/z35980～36290(蛋白质K)pH3.0～6.5

·m/z8650～8750(蛋白质L)pH4.5～7.0

·m/z9100～9200(蛋白质M)pH4.5～7.5

·m/z11760～11890(蛋白质N)pH4.5～7.5

相当于pI附近。m/z5300～5400(蛋白质A)、m/z6130～6230(蛋白质B)、m/z7840～7920(蛋白质D)的峰强度降低，pH不明确。

实施例4

对于在实施例1中发现的峰，基于实施例2和实施例3的信息，使用TheExPASyproteomicsserver的TagIdenttool(http://au.expasy.org/tools/tagident.html)进行数据库检索。其结果如下所示。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5a]

[表5b]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

[表10]

[表11]

数据库检索的结果，m/z11020～11120(蛋白质F)只检索到一种蛋白质(ProteinS100-A10)。蛋白质F(钙结合蛋白质S100A10)能够作为L-OHP的抗癌剂感受性判定标记利用，在本发明的发明人的在先申请(WO2009/96196号国际公开小册子)中已经阐明，通过这次的实施例，确认了其不仅是L-OHP感受性的治疗前预测的标记，还可以成为治疗开始后早期判定治疗反应性的标记，此外，还可作为在5-FU单剂或5-FU和L-OHP并用时能够使用的标记。

实施例5

实施例4的数据库检索的结果，m/z11020～11120(蛋白质F)只检索到一种蛋白质(ProteinS100-A10)，由此，确认其在HCT116和DLD-1中表达。

(1)方法

对于HCT116和DLD-1，通过与实施例1同样的方法，提取细胞内蛋白质，之后通过100V定电压进行SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质转印在PVDF膜上，进行封闭后，使用抗S100A10单克隆抗体(PurifiedMouseAnti-AnnexinIIlightchainmonoclonalantibody，BDTransductionLaboratories)进行一次抗体反应。在与碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG抗体进行二次抗体反应后，添加作为反应底物的CDP-Star^TMchemiluminescentsubstrate使其发光，通过发光图像分析仪(LAS-4000mini，FUJIFILM)检测。

(2)结果

实施例1中，m/z11020～11120(蛋白质F)的HCT116和DLD-1中S100A10的表达，通过使用抗S100A10单克隆抗体的蛋白质印迹法得到确认(图13)。

Claims (16)

1.一种抗癌剂的感受性判定标记，其特征在于：

其包含钙结合蛋白质S100A10，

所述抗癌剂包含氟尿嘧啶或其盐、或者氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合。

2.如权利要求1所述的感受性判定标记，其特征在于：

所述抗癌剂是氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合，

作为抗癌剂感受性判定对象的癌是大肠癌。

3.一种抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于：

测定检测体中的权利要求1所述的钙结合蛋白质S100A10。

4.如权利要求3所述的判定方法，其特征在于：

检测体是来自患有癌的被检验者机体的试样。

5.如权利要求3或4所述的判定方法，其特征在于：

检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者机体的试样。

6.一种试剂盒，用于实施权利要求3或4所述的判定方法，所述试剂盒的特征在于：

包含用于测定检测体中的权利要求1所述的钙结合蛋白质S100A10的方案。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：

检测体是来自患有癌的被检验者机体的试样。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：

检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者机体的试样。

9.一种抗癌剂感受性增强剂的筛选方法，其特征在于：

以权利要求1所述的钙结合蛋白质S100A10的表达改变作为指标。

10.如权利要求9所述的抗癌剂感受性增强剂的筛选方法，其特征在于：

所述抗癌剂是氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合，

作为抗癌剂感受性判定对象的癌是大肠癌。

11.一种由权利要求9或10所述的方法得到的抗癌剂感受性增强剂。

12.一种癌治疗用组合物，其特征在于：

含有权利要求11所述的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合。

13.钙结合蛋白质S100A10作为抗癌剂的感受性判定标记在用于判定抗癌剂感受性的试剂盒的制造中的用途，其特征在于：

所述试剂盒包含用于测定检测体中的钙结合蛋白质S100A10的方案，

所述抗癌剂包含氟尿嘧啶或其盐、或者氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于：

所述抗癌剂是氟尿嘧啶或其盐和奥沙利铂或其盐的组合，

作为抗癌剂感受性判定对象的癌是大肠癌。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于：

检测体是来自患有癌的被检验者机体的试样。

16.如权利要求14或15所述的用途，其特征在于：

检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者机体的试样。