JP5461201B2 - 抗がん剤感受性の判定方法 - Google Patents
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Description
1)オキサリプラチンによりもたらされる損傷DNAの除去・修復能の亢進
2)細胞内におけるオキサリプラチン(活性化体)の不活化(解毒)
3)オキサリプラチンの細胞内蓄積量の低下
などが関与していると考えられており、大腸癌患者を対象にしたオキサリプラチン+5−FU併用療法における治療反応性や予後予測因子として1)〜3)と関連する臨床研究が行われている。
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該S100A7、S100A8又はS100A10の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、この物質の発現抑制を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
また、本発明は、検体中の前記S100A7、S100A8又はS100A10を測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、検体中の前記S100A7、S100A8又はS100A10を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
さらに本発明は、前記S100A7、S100A8又はS100A10の発現抑制を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤との組み合せの、がん治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを投与することを特徴とするがん治療方法を提供するものである。
さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。
対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、抗がん剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
また、タンパク質Aの濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者を積極的に選出するためのマーカーとしても使用できる。
ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド(cyclophosphamide)、イフォスファミド(ifosfamide)、チオテパ(thiotepa)、メルファラン(melphalan)、ブスルファン(busulfan)、ニムスチン(nimustine)、ラニムスチン(ranimustine)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、テモゾロミド(temozolomide)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ネダプラチン(nedaplatin)、メトトレキサート(methotrexate)、ペメトレキセド(pemetrexed)、フルオロウラシル(fluorouracil)、テガフール/ウラシル(tegaful・uracil)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、テガフール/ギメラシル/オテラシル(tegaful・gimeracil・oteracil)、カペシタビン(capecitabine)、シタラビン(cytarabine)、エノシタビン(enocitabine)、ゲムシタビン(gemcitabine)、6−メルカプトプリン(6−mercaptopurine)、フルダラビン(fuludarabin)、ペントスタチン(pentostatin)、クラドリビン(cladribine)、ヒドロキシウレア(hydroxyurea)、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicine)、ピラルビシン(pirarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アムルビシン(amurubicin)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ブレオマイシン(bleomycine)、ペプレオマイシン(pepleomycin)、マイトマイシンC(mytomycin C)、アクラルビシン(aclarubicin)、ジノスタチン(zinostatin)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビノレルビン(vinorelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、イリノテカン(irinotecan)、イリノテカン活性代謝物(SN−38)、ノギテカン(nogitecan、topotecan)、エトポシド(etoposide)、プレドニゾロン(prednisolone)、デキサメタゾン(dexamethasone)、タモキシフェン(tamoxifen)、トレミフェン(toremifene)、メドロキシプロゲステロン(medroxyprogesterone)、アナストロゾール(anastrozole)、エキセメスタン(exemestane)、レトロゾール(letrozole)、リツキシマブ(rituximab)、イマチニブ(imatinib)、ゲフィチニブ(gefitinib)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin)、ボルテゾミブ(bortezomib)、エルロチニブ(erlotinib)、セツキシマブ(cetuximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、スニチニブ(sunitinib)、ソラフェニブ(sorafenib)、ダサチニブ(dasatinib)、パニツムマブ(panitumumab)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、トレチノイン(tretinoin)、三酸化ヒ素(arsenic trioxide)、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち、白金錯体系抗がん剤及び植物アルカロイド系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン、SN−38又はそれらの塩が好ましい。
(1)方法
(a)使用細胞
ヒト大腸癌細胞株11種類(COLO201、COLO205、COLO320、DLD−1、HCT−15、HT−29、LS174T、SW480、SW620、SW1116、WiDR)は、以下(表1)より入手した。
培養は、接着細胞はφ100mm/Tissue Culture Dish(IWAKI)、浮遊細胞はφ100mm/Non−Treated Dish(IWAKI)にて、培地(RPMI 1640、2mM Glutamine、10% Fetal Bovine Serum)、37℃、5%CO2の条件下にて行なった。
オキサリプラチン(L−OHP)原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。
各細胞において、オキサリプラチン0〜1000μmol/Lにて48時間曝露後の細胞生存率をMTS assay(CellTiter96TMAQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega)にて評価し、IC50値(オキサリプラチン未処理wellに対して細胞数を50%抑制する濃度)を算出して各細胞におけるオキサリプラチン感受性とした。感受性の評価は異なる継代数の細胞にて4回行い、その平均値と標準偏差を算出した。
接着細胞はdishより培地を除き氷冷PBSで3回洗浄後、ラバーポリスマンにて剥がしてかき集め、浮遊細胞は細胞浮遊液をPBSにて再懸濁して遠心する形で3回洗浄後の細胞懸濁液を1.5mLマイクロチューブに移した。4℃にて1,200×g、10分間遠心して細胞を集め、上清を除いた後に細胞溶解バッファー(9mol/L Urea、2% CHAPS、1mM DTT、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma))400μLを加え、氷冷下で超音波破砕処理を行なった後、4℃にて16,000×g、20分間遠心し、上清を液体窒素にて急速凍結後、分析するまで−80℃にて保存した。上清の一部を用いてタンパク質定量(DC Protein Assay Kit、Bio−Rad)を行なった。
細胞溶解バッファー(プロテアーゼインヒビターを除く)にて5mg/mLに調整し、さらに、pH4.5の希釈/洗浄バッファー(50mM sodium acetate buffer)(以下、バッファー)にて1mg/mLに調整したサンプル100μLを、同バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ(CM10、Bio−Rad)のスポットにapplyし、1時間インキュベートして反応させた後、バッファーにて3回wash、milliQ水にて2回リンスした。風乾後、energy absorbing molecule(EAM:50% ACN/0.5% TFA溶液によるsinapinic acidの飽和溶液)を、1.0μLを0.5μLずつ2回に分けて各スポットにapplyし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行なった。
タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(surface−enhanced laser desorption/ionization time−of−flight mass spectrometry:SELDI−TOF MS)にて行なった。分析機器としては、ProteinChipTM Reader(Model PBSIIC、Bio−Rad)を用い、mass−to−charge ratio(m/z)のopitimization range 2,000〜30,000 Daltons、Laser intensity 220、Detector sensitivity 8、1サンプルあたり合計104 shotsの条件にて分析を行った。signal−to−noise ratio(S/N比)5以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、CiphergenExpressTM Data Manager 3.0を用いて行なった。
SELDI−TOF MSにより検出されたすべてのタンパク質ピークについて、各細胞のIC50値とピーク強度の関係について相関分析を行なった。IC50値の対数値とピーク強度の関係について線形回帰分析を行い、P値<0.05、決定係数(r2;r,Pearson相関係数)>0.5を満たすピークをオキサリプラチン感受性関連候補タンパク質として選出した。相関分析及び線形回帰分析は、SPSS 15.0J for Windows(登録商標)(バージョン15.0.1)にて行なった。
(a)11種類のヒト大腸癌細胞株におけるオキサリプラチン感受性の評価
各細胞におけるIC50値は0.84±0.20〜29.7±13.6μMであり、その感受性には大きな幅が認められた(図1)。
SELDI−TOF MSを用いた前述の分析条件による発現解析により、全部で42個のピークを検出した。
相関分析及び線形回帰分析により、m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークがオキサリプラチン感受性(IC50値)と有意な相関性をもつことを見出した(図2、図3)。
(1)方法
使用細胞はヒト大腸癌細胞株7種類(DLD−1、HCT−15、HT−29、LS174T、SW480、SW620、WiDR)、薬剤はシスプラチン(cis−Diammineplatinum(II)dichrolide、SIGMA)を使用し、0〜1000μmol/Lにて48時間曝露後の細胞生存率を実施例1と同様にMTS assayにて評価し、IC50値を算出した。細胞内タンパク質の抽出、タンパク質発現解析およびシスプラチン(CDDP)感受性との相関分析は実施例1と同様に行なった。
(a)7種類のヒト大腸癌細胞株におけるシスプラチン感受性の評価
各細胞におけるIC50値は3.33±0.80〜26.9±11.6μMであり、その感受性には大きな幅が認められた。
相関分析及び線形回帰分析により、m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークがシスプラチン感受性(IC50値)と相関を示す傾向を認めた(図4)。さらに、シスプラチン投与時における総プラチナの薬物動態学的パラメータ(ブリプラチンTM注インタビューフォームより)にもとづくと、シスプラチン臨床使用における1回あたりの最高投与量(100mg/m2)を投与した際のピーク血中濃度(Cmax)は、およそ9.5〜11.0μM(日本人の体表面積を1.50〜1.73m2として計算)と計算されることから、各がん細胞株のシスプラチンに対するIC50値について10μMをカットオフ値として、高感受性及び低感受性の2群に分類した。その結果、m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークのピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた(図5)。
(1)方法
使用細胞はヒト大腸癌細胞株5種類(COLO320、HCT−15、HT−29、LS174T、HCT116(HCT116の入手元バンクはECACC))、薬剤はイリノテカン活性代謝物(SN−38、株式会社ヤクルト本社より入手)を使用し、0〜1000nmol/Lにて72時間曝露後の細胞生存率を実施例1と同様にMTS assayにて評価し、IC50値を算出した。細胞内タンパク質の抽出、サンプル調整およびプロテインチップの作成は実施例1と同様に行い、分析はProteinChipTM Reader(Model PCS4000 Personal Edition、Bio−Rad)を用い、Mass Range 0〜70,000 Daltons、Focus Mass 11,000 Dalton、Energy 3000 nJ、1サンプルあたり合計265shotsの条件にて分析を行なった。タンパク質発現比較解析は、CiphergenExpressTM Data Manager 3.0を用いて行なった。
(a)5種類のヒト大腸癌細胞株におけるSN−38感受性の評価
各細胞におけるIC50値は3.39〜33.7nMであり、その感受性には大きな幅が認められた。
SN−38の薬物動態学的パラメータ(カンプトTMインタビューフォームより)にもとづくと、大腸癌治療レジメン(180mg/m2/日)によるイリノテカン投与1回目に得られるSN−38の血中濃度曲線下面積(AUCSN−38)は1449nmol.h/Lと計算され、本検討で用いた72時間薬剤曝露により同等の曝露量が得られるSN38の濃度は20nMと算出されることから、各がん細胞株のSN−38に対するIC50値について20nMをカットオフ値として、高感受性及び低感受性の2群に分類した。その結果、m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークのピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた(図6)。
実施例1において、m/z 11,000〜11,100のピークとして検出されたタンパク質(タンパク質A1)の性質を調べるために、pHの変化に伴うピーク強度の変化、およびCM10チップアレイとは異なる化学修飾がチップ表面に施されたプロテインチップアレイにおける検出の有無について検討を行った。
(a)検討に用いたプロテインチップアレイとバッファー条件
陽イオン交換チップアレイ(CM10、Bio−Rad)及び陰イオン交換チップアレイ(Q10、Bio−Rad)に対しては、pH3.0(50mM Glycine−HCl buffer)、pH3.5(50mM sodium acetate buffer)、pH4.0(50mM sodium acetate buffer)、pH4.5(50mM sodium acetate buffer)、pH5.0(50mM sodium acetate buffer)、pH5.5(50mM sodium acetate buffer)、pH6.0(50mM phosphate buffer)、pH6.5(50mM phosphate buffer)、pH7.0(50mM phosphate buffer)、pH7.5(50mM phosphate buffer)、pH8.0(50mM Tris−HCl buffer)、pH8.5(50mM Tris−HCl buffer)、pH9.0(50mM Glycine−NaOH buffer)、pH9.5(50mM Glycine−NaOH buffer)、pH10.0(50mM Glycine−NaOH buffer)の15種類のバッファーを用い、金属修飾(Immobilized Metal Affinity Capture)チップアレイ(IMAC30、Bio−Rad)に対してはphosphate buffered saline(PBS)を用いた。
CM10及びQ10チップアレイを用いた分析のためのサンプル調整及びプロテインチップの作成は、(a)の各バッファーを用いて実施例1の(1)方法前記(e)に準じて実施した。ただし分析機器としては、ProteinChipTM Reader(Model PCS4000 Personal Edition、Bio−Rad)を用い、Mass Range 0〜70,000 Daltons、Focus Mass 11,000 Dalton、Energy 3000 nJ、1サンプルあたり合計265shots の条件にて分析を行なった。
IMAC30チップアレイは50mM NiSO4にてスポット表面の活性化を行い、milliQ水により1回リンスした後、PBSにて前処理を行った。サンプル調整及びチップへのサンプルapply以降の作業は、バッファーとして上記(a)のPBSを用い、実施例1の(1)方法前記(e)に準じて実施した。ただし分析機器としては、ProteinChipTM Reader(Model PCS4000 Personal Edition、Bio−Rad)を用い、Mass Range 0〜70,000 Daltons、Focus Mass 11,000 Dalton、Energy 6000nJ、1サンプルあたり合計265shots の条件にて分析を行なった。
実施例1で、CM10チップアレイを用いたpH4.5の分析条件においてm/z 11,000〜11,100のピークとして検出された上記候補タンパク質は、CM10チップアレイ及びQ10チップアレイいずれにおいてもpH7.0〜7.5において顕著なピークの低下を認め、この候補タンパク質の等電点(pI)は、pI 7.0〜7.5と推定された。また、チップ表面をNiSO4により活性化したIMAC30チップアレイにても検出が確認された。
(1)候補タンパク質A1の分子量の推定
細胞内タンパク質抽出サンプルについて、分子量既知のbovine insulin(5733.51Da)及びequine Cytochrome c(12360.96Da)をCalibrantとして用い、SELDI−TOF MSを用いてタンパク質発現解析時と同じ分析条件(CM10チップアレイ及び50mM sodium acetate buffer,pH4.5)にてInternal Calibrationを行なった。その結果、候補タンパク質A1ピークの分子量は11072Daと推定された(図7)。
(精製)
候補タンパク質A1の精製及び同定を目的として、タンパク質発現解析において候補タンパク質が高発現を示した細胞株HT−29及び低発現を示した細胞株COLO320の2細胞株より発現解析時と同様の方法により細胞内タンパク質を抽出した。タンパク質定量の結果にもとづき両サンプルより等量を分取し、TCA沈殿を行なった後、回収した沈殿を冷エタノール/エーテル溶媒にて洗浄し室温にて乾燥した。この沈殿にIEF lysis buffer(6M urea,2M thiourea,3% CHAPS,1% Triton X−100,DeStreak reagent、GEヘルスケア バイオサイエンス)を加え、室温で攪拌及び超音波処理を行なった。
調整したIEFサンプル溶液を遠心し、上清をImmobiline DryStrip gel(pH3〜10 non−linear,13cm,GEヘルスケア バイオサイエンス)にapplyし、ゲルの膨潤を行なった後、等電点電気泳動を行なった(5000V,15hr)。
等電点電気泳動終了後、Immobiline DryStrip gelを二次元電気泳動用のsample buffer(6M urea,20% glycerol,2% DTT,2% SDS,100mM Tris−HCl pH8.8)中で平衡化し、平衡化の終了したImmobiline DryStrip gelを25mAの定電流にて電気泳動を行なった。ゲルは10〜18%、16×16cmポリアクリルアミドグラジェントゲル(バイオクラフト)を用い、電気泳動後のゲルはCBB G−250により染色後、5%酢酸にて脱色を行なった。
二次元電気泳動の画像取得にはGS−800 calibrated Imaging Densitometer(Bio−Rad)、画像解析はPDQuestソフトウェア(Bio−Rad)を用い比較解析を行った。
プロテインチップを用いたSELDI−TOF MS分析により得られた候補タンパク質A1に関する情報(分子量 11072、pI 7.0〜7.5)に基づき、2次元電気泳動にて展開したゲル上の分子量10〜15kDa及び、およそpI 6.5〜8.0の範囲(中性付近)に分離されたスポットを対象とし、これらの中からCOLO320と比較してHT−29において高い発現を示していた4スポットを選択した(図8)。これらのスポットを切り出し、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、LCMS−IT−TOF(液体クロマトグラフ質量分析計、Shimadzu)を用いて分析(MS/MS測定)を行い、得られた結果についてMASCOTデータベース検索を行なった。
がん細胞株の細胞内タンパク質抽出サンプルを、CM10プロテインチップアレイ、50mM Tris−HCl buffer(pH8.0)を用いて、実施例1の(1)方法前記(e)と同様の条件にて分析した結果、オキサリプラチン感受性との関連を示す2つのタンパク質ピーク、タンパク質A2及びタンパク質A3を見出した。
タンパク質A2のピーク強度は各がん細胞株のオキサリプラチン(L−OHP)感受性(IC50値)と有意な相関性を示した(図9)。
また、各がん細胞株のオキサリプラチンに対するIC50値にもとづき、オキサリプラチン臨床使用時のピーク血中濃度にほぼ相当する5.0μMをカットオフ値としてがん細胞株を高感受性及び低感受性の2群に分類すると、タンパク質A3のピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた(図10)。なお、細胞株LS174Tは、S/N比が5未満であったため、解析対象から除外した。
これらの結果にもとづきデータベース(Expasy TagIdent tool:http://www.expasy.ch/tools/tagident.html)検索した結果、10835Daで示されるピークはS100A8(S100 calcium−binding protein A8、Calgranulin−A、Migration inhibitory factor−related protein 8、MRP−8、p8など)、11340Daで示されるピークはS100A7(S100 calcium−binding protein A7、Psoriasin)であることが示された(図11)。
実施例6と同様にして、SELDI−TOF MSにより分子量13,242のS100A9と推定されるピークについて、オキサリプラチン感受性との関連について検討した。その結果、S100A9発現量とオキサリプラチン感受性との間に有意な関連は認められなかった(図12)。従って、S100A9には抗がん剤感受性との間に関連性はないことが判明した。
1)方法
m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークの高発現細胞HT−29、および低発現細胞COLO320を用いて、実施例1と同様の方法により細胞内タンパク質を抽出後、16.5%ポリアクリルアミドゲルに1レーンあたりタンパク量10μgをapplyし、100V定電圧にてSDS−PAGEを行なった。泳動後、ドライブロッティングシステム(iBlotTM、invitrogen)を用いてPVDF膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行なった後、S100A10に対しては抗S100A10モノクローナル抗体(Purified Mouse Anti−Annexin II light chain monoclonal antibody、BD Transduction Laboratories)を、内在性タンパク質については抗GAPDHモノクローナル抗体(anti−GAPDH monoclonal antibody、Ambion)を用いて一次抗体反応を行なった。アルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてCDP−StarTM chemiluminescent substrateを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー(LAS−4000mini、FUJIFILM)により検出した。ブロッキング試薬、二次抗体および反応基質はChemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit(WesternBreezeTM、invitrogen)を用いた。
プロテインチップアレイを用いたタンパク質発現解析(実施例1)において、m/zとして11,000〜11,100に検出されたピークの高発現細胞HT−29、および低発現細胞COLO320におけるS100A10の発現は、抗S100A10モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された(図13)。
Claims (6)
- カルシウム結合タンパク質S100A7、S100A8又はS100A10を含有するオキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカーであって、
マーカーがS100A7又はS100A8の場合は抗がん剤がオキサリプラチン及びその塩から選ばれるものであり、S100A10の場合は抗がん剤がオキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれるものである大腸がん感受性判定マーカー。 - オキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性を判定する目的で、検体中のカルシウム結合タンパク質S100A7、S100A8又はS100A10を測定する方法であって、
測定対象がS100A7又はS100A8の場合は抗がん剤がオキサリプラチン及びその塩から選ばれるものであり、S100A10の場合は抗がん剤がオキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれるものである測定対象を測定する方法。 - 検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料であることを特徴とする請求項2記載の測定方法。
- 検体が、オキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤を投与された、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項2又は3記載の測定方法。
- 検体中のカルシウム結合性タンパク質S100A7、S100A8又はS100A10を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項記載の測定方法を実施するためのキット。
- 請求項1記載の抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカーの発現抑制を指標とするオキサリプラチン、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性亢進剤のスクリーニング方法。
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