KR20100130587A

KR20100130587A - 항암제 감수성의 판정 방법

Info

Publication number: KR20100130587A
Application number: KR1020107016145A
Authority: KR
Inventors: 유스케 다니가와라; 사요 스즈키; 신지 스기모토
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크; 가부시끼가이샤 야구르트혼샤
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2010-12-13
Also published as: RU2010136309A; EP2241334A1; CN104784706A; US20100323034A1; CA2713296A1; IL207169A0; EP2241334A4; AU2009208526A1; JPWO2009096196A1; CN101932338A; JP5461201B2; WO2009096196A1; NZ586972A; MX2010008496A; BRPI0906573A2; US9089540B2

Abstract

개개의 환자의 치료 반응성을 판별할 수 있는 항암제 감수성 판정 마커 및 그것을 이용하는 새로운 암 치료 수단을 제공한다.
칼슘 결합 단백질 S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 함유하는 항암제 감수성 판정 마커.

Description

항암제 감수성의 판정 방법{METHOD FOR DETERMINATION OF SENSITIVITY TO ANTI-CANCER AGENT}

본 발명은 대상이 되는 환자의 암이, 사용하고자 하는 항암제에 치료 반응성을 갖는지 여부를 판정하기 위해서 사용하는 항암제 감수성 판정 마커 및 그 응용에 관한 것이다.

항암제에는, 알킬화제, 백금제제, 대사 길항제, 항암성 항생 물질, 항암성 식물 알칼로이드 등의 종류가 있다. 그리고 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 그러나, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는지 여부를 항암제 감수성이라고 한다.

옥살리플라틴 (SP-4-2)-[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine-κN,κN＇][ethanedioato(2-)-κO¹,κO²]platinum (IUPAC) 은 제 3 세대 백금 착물계 항악성 종양약이다. 작용 기전은 선행 약제인 시스플라틴 (CDDP) 이나 카르보플라틴 (CBCDA) 과 마찬가지로, DNA 염기와의 가교 형성에 의한 DNA 합성 저해, 단백 합성 저해인 것으로 생각되고 있는데, CDDP 나 CBCDA 가 무효인 대장암에 대해서도 옥살리플라틴 (L-OHP) 은 항종양 효과를 나타내어, 종래의 백금 착물계 항악성 종양약과는 상이한 항종양 스펙트럼을 나타낸다. 미국에서는 2004년 1월에 플루오로우라실 (5-FU)/레보폴리네이트 (LV) 와의 병용으로 전이성 결장·직장암의 퍼스트 라인 치료로서 승인되어 있고, 일본에서도 2005년 4월, 치유 절제 불능인 진행·재발의 결장·직장암에 대한 레보폴리네이트 및 플루오로우라실의 정맥 내 지속 투여법과의 병용 (FOLFOX4 법) 으로 약가수재되었다. 진행 재발 대장암의 치료는, 1990년대 전반까지 실시되었던 5-FU/LV 요법에서의 생존율은 10 ∼ 12 개월인 것에 비해, 옥살리플라틴을 첨가한 FOLFOX 요법에서의 생존 기간은 19.5 개월로 거의 2 배까지 도달해 있다. 또한, stageII/III 증례를 대상으로 한 시험에서, 수술 후 보조 요법에 있어서의 5-FU/LV 요법과 비교한 FOLFOX 요법의 유용성도 보고되어 있어, 여전히 미승인이지만 향후의 대장암 수술 후 보조 요법에 대한 확대와 환자에 대한 유익성을 기대할 수 있는 약제이다.

그러나, 그런데도 또한 진행 재발 대장암에 대한 FOLFOX 요법의 주효율은 50 ％ 정도로, 바꾸어 말하면 치료를 받은 환자의 반 수는 효과가 얻어지지 않은 것을 의미한다. 또한, 옥살리플라틴의 사용에 의해 호중구 감소증 이외에 고빈도의 말초 신경 장애를 나타내고, 이것은 치사적 부작용은 아니지만 치료 계속을 곤란하게 하는 인자로도 되어 있다. 따라서, 치료 개시 전에 효과를 기대할 수 있는 환자 (반응자) 와, 효과를 기대할 수 없는 환자 (무반응자) 를 예측·진단할 수 있으면, 유효성과 안전성이 높은 화학 요법이 실현된다. 그리고, 일반적으로 암 화학 요법의 치료 스케줄은 장기간에 걸치기 때문에, 치료 계속 중에 있어서의 항암제에 대한 감수성의 시간 경과적 모니터는 치료 계속의 시비의 판정을 가능하게 하여, 환자 부담이나 부작용 경감으로 이어질뿐만 아니라 의료 경제의 관점에서도 유용한 것으로 생각된다. 개개의 환자에 있어서의 치료 반응성을 예측하여 적절한 치료를 선택하는 "Personalized Medicine" 을 위한 치료 반응성 예측 바이오마커의 확립은 급무이다.

옥살리플라틴의 치료 반응성에 관련된 인자로는, 주로,

1) 옥살리플라틴에 의해 초래되는 손상 DNA 의 제거·수복능의 항진

2) 세포 내에 있어서의 옥살리플라틴 (활성화체) 의 불활화 (해독)

3) 옥살리플라틴의 세포 내 축적량의 저하

등이 관여하고 있는 것으로 생각되고 있고, 대장암 환자를 대상으로 한 옥살리플라틴＋5-FU 병용 요법에 있어서의 치료 반응성이나 예후 예측 인자로서 1) ∼ 3) 과 관련된 임상 연구가 실시되고 있다.

1) 에 관해서는, 뉴클레오티드 제거 수복 (nucleotide excision repair：NER) 에 중요한 역할을 하는 Excision repair cross-complementing group 1 (ERCC1) 에 대해서, 종양 내 ERCC1 유전자 발현량이 예후 인자라는 보고 (비특허문헌 1) 나, ERCC1 의 일염기다형 (SNP) 의 하나인 C118T 에 대해 C/C 호모 접합체를 갖는 환자에서는, 적어도 하나 이상의 T 아렐을 갖는 환자보다 양호한 생존율이 보고되어 있다 (비특허문헌 2). Xeroderma pigmentosum D (XPD, ERCC2 로서도 알려져 있다) 에서는 Lys751Gln 의 아미노산 변이를 수반하는 유전다형이 종양 축소율이나 생존 기간에 관여한다고 보고되어 있다 (비특허문헌 2, 3). 염기 제거 수복 (base excision repair：BER) 에 있어서는, 알킬화제에 대한 노출 등에 의해 형성되는 DNA 단일 사슬 절단의 효율적인 수복에 관련된 것으로 생각되는 단백질을 코드하는 X-ray repair cross-complementing group 1 (XRCC1) 의 Arg399Gln 의 아미노산 변이를 수반하는 유전다형과 종양 축소 효과의 관계가 보고되었는데 (비특허문헌 4), 동일한 환자를 대상으로 한 그 후의 해석에 의해 임상 예후에는 영향을 미치지 않는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2). 시스플라틴에 대한 감수성 저하에는 DNA 미스매치 수복 (DNA mismatch repair：MMR) 도 관여하고 있는 것으로 생각되고 있는데, in vitro 의 검토에서는 옥살리플라틴에 의한 DNA 손상 부위의 수복에 MMR 은 관여하지 않는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 5).

2) 에 관해서, Glutathione-S-transferase (GST) 는 해독·대사의 제 II 상반응을 담당하는 효소의 하나로서, DNA 백금 부가체와 glutathione 의 포합체 형성을 촉매함으로써, 약제를 불활화한다. GST 서브타입 중, GSTP1 은 대장암에서의 발현량이 많고, Ile105Val 의 아미노산 변이를 수반하는 유전다형과 생존 기간이 관련되는 (생존 기간의 중앙값：Ile/Ile 7.9 개월, Ile/Val 13.3 개월, Val/Val 24.9 개월) 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 6).

3) 에 관해서는, 배양 세포를 사용한 검토에서는, 유기 카티온 트랜스포터 (OCTs) 가 옥살리플라틴의 세포 내에 대한 수송과 감수성에 관여하는 것이 보고되어 있는 것 이외에 (비특허문헌 7), ATP7A, ATP7B 등의 구리나 중금속의 수송에 관여하는 트랜스포터와 감수성의 관련에 대해서도 보고되어 있다 (비특허문헌 8, 9). 단, 이들의 발현과 옥살리플라틴 치료 반응성의 관련에 대해 임상적 검토는 실시되어 있지 않다.

FOLFOX 요법을 받은 진행 대장암 환자를 대상으로 한 최근의 임상 연구에 있어서는, ERCC1 의 유전다형 (Asn118Asn) 과 XPD 의 유전다형 (Lys751Gln) 이 독립적으로 무악화 기간 (PFS) 과 관련된 것이 보고되어 있는데, GSTP1 (Ile105Val) 에 대해서는 PFS 와의 관련은 발견되지 않고, 옥살리플라틴 유발 신경 독성과 관련된 경향이 관찰되었다 (비특허문헌 10).

in vitro 의 검토에서는, 백금 착물계의 선행 약제인 시스플라틴의 내성 관련 인자에 대해서는 수많은 보고가 이루어져 있고, 옥살리플라틴에 대해서도 FAS/FASL, Bcl-xL 등의 아포토시스 관련 인자와의 관련도 보고되어 있다 (비특허문헌 11, 12). 그러나, 옥살리플라틴은 시스플라틴과는 암 종류에 따라 상이한 치료 반응성을 나타내는 데다, 옥살리플라틴의 세포 장해 활성을 담당하는 백금 DNA 부가체에 대한 암 세포의 세포 응답은 거의 해명되지 않아, 옥살리플라틴을 사용한 화학 요법에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있는 명확한 바이오마커는 여전히 확립되어 있지 않다.

J. Clin. Oncol. 19, 4298-4304 (2001) Br. J. Cancer 91, 344-354 (2004) Cancer Res. 61, 8654-8658 (2001) Anticancer Res. 21, 3075-3079 (2001) Cancer Res. 56, 4881-4886 (1996) J. Natl. Cancer Inst. 94, 936-942 (2002) Cancer Res. 66, 8847-8857 (2006) Mol. Pharmacol. 66, 25-32 (2004) Clin. Cancer Res. 10, 4661-4669 (2004) J. Clin. Oncol. 25, 1247-1254 (2007) Clin. Cancer Res. 11, 4770-4774 (2005) J. Biol. Chem. 279, 46113-46121 (2004)

본 발명의 목적은 개개의 환자의 치료 반응성을 판별할 수 있는 항암제 감수성 판정 마커 및 그것을 이용하는 새로운 암 치료 수단을 제공하는 것에 있다.

그래서, 본 발명자들은 인간 암 세포주를 배양하고, 그들의 세포 내 단백질에 대해 표면 인핸스형 레이저 탈리 이온화 비행 시간형 질량 분석계 (SELDI-TOF MS) 를 사용하여 항암제 감수성 판정 마커의 탐색을 실시한 결과, 항암제에 대한 감수성의 저하에 수반하여 발현량이 상승되는 단백질을 알아내었고, 그 단백질이, 질량 분석계에 있어서, m/z 10,800 ∼ 11,400 의 피크로서 검출되는 3 종류의 단백질인 것을 알아내었다. 그리고, 또한 당해 단백질에 대해 검토한 결과, 그들은 칼슘 결합 EF-hand 모티프를 갖는 S100 단백질 패밀리의 일원으로서 알려져 있는 칼슘 결합 단백질 S100A7, S100A8 및 S100A10 인 것을 알아내었다.

이러한 지견에 기초하여, 거듭 검토한 결과, 암환자 유래의 생체 시료 중의 당해 S100A7, S100A8 또는 S100A10 의 농도를 측정하면, 당해 암환자의 암이 항암제에 대한 감수성을 갖는지 여부를 판정할 수 있는 것, 또한 이 물질의 발현 억제를 지표로 하면 항암제 감수성 항진제의 스크리닝이 가능해지는 것, 그리고 당해 항암제 감수성 항진제와 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 병용하면, 당해 항암제의 치료 효과가 비약적으로 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 칼슘 결합 단백질 S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 함유하는 항암제 감수성 판정 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 검체 중의 상기 S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 검체 중의 상기 S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 S100A7, S100A8 또는 S100A10 의 발현 억제를 지표로 하는 항암제 감수성 항진제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그리고, 또한 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 항암제 감수성 항진제를 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합하여 이루어지는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제의 조합인, 암 치료약 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커를 사용하면, 개개의 환자의 항암제 감수성을 치료 개시 전에 확실하게 판정할 수 있는 결과, 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해진다. 그리고 효과가 얻어지지 않는 항암제의 사용을 회피할 수 있기 때문에 불필요한 부작용을 회피할 수 있다. 또한, 항암제를 사용한 치료 스케줄은 장기간에 이르기 때문에, 치료 계속 중에 있어서도 치료 사이클마다 항암제 감수성을 판정함으로써, 그 암에 있어서의 항암제에 대한 감수성의 시간 경과적 평가가 가능해져, 치료를 계속해야 하는지 여부를 판정할 수 있다. 그 결과, 치료 효과가 얻어지지 않는 항암제의 계속 투여에 수반하는 암의 진행, 부작용의 증대를 방지할 수 있고, 환자의 부담 경감, 의료비의 삭감으로도 이어진다.

그리고 또한, 이 마커를 사용하면, 항암제 감수성을 항진시키는 약제를 스크리닝할 수 있고, 그 대상이 된 항암제와 항암제 감수성 항진제를 병용하면, 암 치료 효과가 비약적으로 향상된다.

도 1 은 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 (L-OHP) 감수성을 나타내는 도면이다.
도 2 는 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 (L-OHP) 에 대한 감수성과 단백질 A1 의 피크 강도의 변화를 나타내는 도면이다.
도 3 은 단백질 A1 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 (L-OHP) 감수성의 상관을 나타내는 도면이다.
도 4 는 단백질 A1 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 시스플라틴 (CDDP) 감수성의 상관을 나타내는 도면이다.
도 5 는 단백질 A1 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 시스플라틴 (CDDP) 감수성의 관계를 나타내는 도면이다 (시스플라틴에 대한 IC₅₀ 값을, 10 μM 를 컷오프값으로 하여 2 군으로 분류하여 비교).
도 6 은 단백질 A1 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 SN-38 감수성의 관계를 나타내는 도면이다 (SN-38 에 대한 IC₅₀ 값을, 20 nM 를 컷오프값으로 하여 2 군으로 분류하여 비교).
도 7 은 프로테인 칩 어레이를 사용한 SELDI-TOF MS 분석에 의한 단백질 A1 의 분자량을 나타내는 도면이다.
도 8 은 2 종류의 대장암 세포주 HT-29 (단백질 A1 이 고발현) 및 COLO320 (단백질 A1 이 저발현) 의 이차원 전기 영동 전개도와 LC/MS/MS 분석을 위한 스폿 선택을 나타낸다.
도 9 는 단백질 A2 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 감수성의 상관을 나타내는 도면이다.
도 10 은 단백질 A3 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 감수성의 관계를 나타내는 도면이다 (옥살리플라틴에 대한 IC₅₀ 값을, 5.0 μM 를 컷오프값으로 하여 2 군으로 분류하여 비교).
도 11 은 프로테인 칩 어레이를 사용한 SELDI-TOF MS 분석에 의한 단백질 A2 (Protein S100-A8, S100 calcium-binding protein A8) 및 단백질 A3 (Protein S100-A7, S100 calcium-binding protein A7) 을 나타내는 도면이다.
도 12 는 S100A9 의 피크 강도와 각 암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 감수성의 관계를 나타내는 도면이다 (옥살리플라틴에 대한 IC₅₀ 값을, 5.0 μM 를 컷오프값으로 하여 2 군으로 분류하여 비교).
도 13 은 HT-29 (S100A10 이 고발현) 및 COLO320 (S100A10 이 저발현) 에 있어서의, 웨스턴 블롯법을 이용한 S100A10 의 검출을 나타내는 도면이다.

본 발명에 있어서의 항암제 감수성 판정 마커는, S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 함유하는 것이다. 이들의 단백질은, 표면 인핸스형 레이저 탈리 이온화 비행 시간형 질량 분석계 (SELDI-TOF MS) 에 있어서, m/z 10,800 ∼ 10,900 (S100A8), m/z 11,000 ∼ 11,100 (S100A10) 및 m/z 11,300 ∼ 11,400 (S100A7) 의 피크로서 각각 검출되는 단백질이다.

이들의 단백질 S100A7, S100A8 및 S100A10 (이하 단백질 A 라고도 한다) 은, 후기 실시예에 나타내는 바와 같이, 배양 암 세포의 세포 내 단백질의 발현을 SELDI TOF MS 를 사용하여 검토한 결과, 옥살리플라틴 감수성 (IC₅₀ 값), 시스플라틴 감수성 (IC₅₀ 값), 이리노테칸 감수성 또는 SN-38 감수성 (IC₅₀ 값) 과 유의적인 상관성을 가지고 있었다. 즉, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸 또는 SN-38 고감수성의 암 세포에서는 단백질 A 의 발현량은 적고, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸 또는 SN-38 저감수성의 암 세포에서는 단백질 A 의 발현량은 많았다. 따라서, 단백질 A 는, 항암제 감수성 판정 마커, 그리고 백금 착물계 항암제 또는 식물 알칼로이드계 항암제의 감수성 판정 마커, 특히 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸, SN-38 또는 그들의 염의 감수성 판정 마커로서 유용하다.

여기서, S100A8 과 S100A7 은, S100A10 과 결합할 가능성이 있는 것이 알려져 있기 (Journal of Proteome Research 2005；4：1717-1721) 때문에, 항암제 감수성에 대해 이들이 어떠한 상호 작용을 가질 가능성도 있고, 또한 이들의 결합체도 항암제의 감수성 마커로서 사용할 수 있을 가능성이 있다. 그리고 S100A10 은, 자체의 다이머와, 아넥신 A2 (Annexin-2, Annexin II, Lipocortin II, Calpactin I heavy chain, Chromobindin-8, p36, Protein I, Placental anticoagulant protein IV, PAP-IV) 의 다이머에 의해 헤테로테트라머를 형성하는 것도 알려져 있기 때문에, 아넥신 A2 도 S100A10 과 마찬가지로, 항암제 감수성의 판정 마커로서 사용할 수 있을 가능성이 있다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커의 대상이 되는 항암제로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 옥살리플라틴, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 티오테파 (thiotepa), 멜파란 (melphalan), 부설판 (busulfan), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카르바진 (procarbazine), 테모졸로마이드 (temozolomide), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 메토트렉사트 (methotrexate), 페메트렉시드 (pemetrexed), 플루오로우라실 (fluorouracil), 테가풀/우라실 (tegaful·uracil), 독시플루리딘 (doxifluridine), 테가풀/기메라실/오테라실 (tegaful·gimeracil·oteracil), 카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine), 에노시타빈 (enocitabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 6-메르캅토푸린 (6-mercaptopurine), 플루다라빈 (fludarabin), 펜토스타틴 (pentostatin), 클라드리빈 (cladribine), 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicine), 피라루비신 (pirarubicin), 마이토잔트론 (mitoxantrone), 암루비신 (amurubicin), 악티노마이신 D (actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycine), 페플레오마이신 (pepleomycin), 마이토마이신 C (mytomycin C), 아클라루비신 (aclarubicin), 지노스타틴 (zinostatin), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 이리노테칸 (irinotecan), 이리노테칸 활성 대사물 (SN-38), 노기테칸 (nogitecan, topotecan), 에토포시드 (etoposide), 프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 아나스트로졸 (anastrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 레트로졸 (letrozole), 리툭시마브 (rituximab), 이마티니브 (imatinib), 게피티니브 (gefitinib), 겜투주마브·오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin), 보르테조미브 (bortezomib), 엘로티니브 (erlotinib), 세툭시마브 (cetuximab), 베바시주마브 (bevacizumab), 수니티니브 (sunitinib), 소라페니브 (sorafenib), 다사티니브 (dasatinib), 파니투무마브 (panitumumab), 아스파라기나아제 (asparaginase), 트레티노인 (tretinoin), 삼산화비소 (arsenic trioxide), 또는 그들의 염, 또는 그들의 활성 대사물 등을 들 수 있다. 이 중 백금 착물계 항암제 및 식물 알칼로이드계 항암제가 바람직하고, 특히 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸, SN-38 또는 그들의 염이 바람직하다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커를 사용하여 항암제 감수성을 판정하기 위해서는, 검체 중의 단백질 A 를 측정하면 된다. 여기서, 검체로는, 암을 가진 피험자 (암 환자) 유래의 생체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 암 조직 생검 검체, 암 적출 수술 표본, 변, 소변, 복수, 흉수, 뇌척수액, 객담 등을 들 수 있는데, 혈청이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 대상이 되는 암으로는, 인두암을 대표로 하는 입술, 구강 및 인두암, 식도암, 위암, 결장·직장암 등을 대표로 하는 소화기암, 폐암을 대표로 하는 호흡기 및 흉강 내장기암, 뼈 및 관절 연골암, 피부의 악성 흑색종, 유극세포암 및 그 밖의 피부의 암, 중피종을 대표로 하는 중피 및 연부 조직암, 유방 암, 자궁암, 난소암을 대표로 하는 여성 성기암, 전립선암을 대표로 하는 남성 성기암, 방광암을 대표로 하는 요로암, 뇌종양을 대표로 하는 눈, 뇌 및 중추 신경계암, 갑상선 및 그 밖의 내분비선암, 비호지킨 림프종이나 림프성 백혈병을 대표로 하는 림프 조직, 조혈 조직 및 관련 조직암, 및 이들을 원발소로 하는 전이 조직의 암 등을 들 수 있는데, 특히 위암이나 결장·직장암에 대해 바람직하게 이용할 수 있다.

검체 중의 단백질 A 의 측정 수단은, 예를 들어 SELDI-TOF MS, 면역학적 측정법 등에 의해 측정할 수 있다.

여기서 SELDI-TOF MS 에 의한 측정은 후기 실시예에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 면역학적 측정법에 있어서는, 항단백질 A 항체를 사용하는 면역학적 측정법이 바람직하다. 사용하는 항단백질 A 항체는 모노클로날 항체이어도 되고, 폴리클로날 항체이어도 된다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 라디오이뮤노어세이, 엔자임이뮤노어세이, 형광 이뮤노어세이, 발광 이뮤노어세이, 면역 침강법, 면역 비탁법, 웨스턴 블롯, 면역 염색, 면역 확산법 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 웨스턴 블롯 또는 엔자임이뮤노어세이이고, 특히 바람직한 것은 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역 흡착 정량법 (enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA) (예를 들어, sandwich ELISA) 이다.

대상으로 하는 항암제에 대한 감수성을 판정하기 위해서는, 항암제 투여 전의 암환자 유래의 생체 시료 중의 단백질 A 농도를 측정하여, 단백질 A 의 농도가 소정 표준 농도보다 높은 것으로 판단되는 농도를 갖는 경우에는, 그 암은 대상으로 하는 항암제에 대해 감수성은 아닌 것으로 판정할 수 있다. 또한, 항암제 투여 중의 암환자 유래의 생체 시료 중의 단백질 A 농도를 치료 사이클마다 측정하여 모니터링해 감으로써, 그 암에 있어서의 대상으로 하는 항암제에 대한 감수성을 시간 경과적으로 평가할 수 있기 때문에, 치료를 계속해야 할지 여부의 판정 마커가 된다.

대상으로 하는 항암제에 대해 감수성을 갖지 않는 경우에는, 그 약효를 기대할 수 없고, 항암제에 의한 부작용만이 발현되는 것으로 생각되기 때문에, 본 발명에 있어서의 항암제 감수성 판정 마커는, 불필요한 부작용의 발현 혹은 무효인 치료 계속에 수반하는 암의 진행이나 부작용의 증대를 회피하기 위한 마커로서도 사용할 수 있다.

또한, 단백질 A 의 농도가 소정 표준 농도보다 낮은 것으로 판단되는 농도를 갖는 경우에는, 그 암은 대상으로 하는 항암제에 대해 감수성을 갖는 것으로 판정할 수 있기 때문에, 치료 효과를 기대할 수 있는 환자를 적극적으로 선출하기 위한 마커로서도 사용할 수 있다.

또한, 단백질 A 를 지표로 하면, 항암제를 스크리닝할 수 있다. 즉, in vitro 에서는, 예를 들어, 단백질 A 의 농도가 높은 각종 암 세포주를 어떠한 물질에서 노출 후에 살세포 효과가 나타나면, 그 물질은 옥살리플라틴 등의 백금 착물계 항암제, 이리노테칸 등의 식물 알칼로이드계 항암제나 상기의 기존 항암제에 대한 감수성이 낮은 암에 대해서도 유효한 항암제이다. 또한, in vivo 에서는, 예를 들어, 담암 동물로서 그 생체 시료 중의 단백질 A 의 농도가 높은 동물에 어떠한 물질을 투여한 후, 종양 축소 효과가 나타나면, 그 물질은 옥살리플라틴 등의 백금 착물계 항암제, 이리노테칸 등의 식물 알칼로이드계 항암제나 상기의 기존 항암제에 대한 감수성이 낮은 암에 대해서도 유효한 항암제이다. 단백질 A 가 고농도인 각종 암 세포주나, 담암 동물로서 그 생체 시료 중의 단백질 A 의 농도가 높은 동물을 사용하여 단백질 A 를 지표로 한 스크리닝을 실시함으로써, 당해 물질이, 옥살리플라틴 등의 백금 착물계 항암제, 이리노테칸 등의 식물 알칼로이드계 항암제나 상기의 기존 항암제에 대한 감수성이 낮은 암에 대해서도 항종양 효과를 나타내는 항암제로서 유용한지 여부를 판정할 수 있다. 항암제 개발에 수반되는 노력이나 비용의 삭감이라는 면에서도 큰 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 항암제 감수성의 판정 방법을 실시하기 위해서는, 검체 중의 단백질 A 를 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 키트를 사용하는 것이 바람직하다. 당해 키트에는, 단백질 A 측정 시약, 측정 시약의 사용 방법, 및 항암제 감수성의 유무를 판정하기 위한 기준 등이 포함된다. 당해 기준에는, 단백질 A 의 표준 농도, 높은 것으로 판단되는 농도, 낮은 것으로 판단되는 농도, 측정 결과에 영향을 미치는 요인과 그 영향의 정도 등이 포함되고, 이들 농도는 대상으로 하는 항암제마다 설정할 수 있다. 당해 기준을 이용하여, 상기와 같이 판정할 수 있다.

단백질 A 의 발현 억제를 지표로 하면, 항암제 감수성 항진제를 스크리닝할 수 있다. 즉, in vitro 또는 in vivo 에 있어서 단백질 A 의 발현을 억제하는 물질은, 항암제 감수성을 항진시킨다. 예를 들어, in vitro 에서는, 각종 암 세포주에 있어서 항암제의 비존재 하 혹은 존재 하에서 단백질 A 의 농도를 저하시키는 물질은, 당해 항암제의 감수성을 항진시키는 물질 (항암제 감수성 항진제) 이다. 또한 in vivo 에서는, 담암 동물에 있어서의 항암제 투여 전, 혹은 투여 중에 있어서, 단백질 A 의 농도의 저하를 항진시키는 물질은, 당해 항암제의 감수성을 항진시키는 물질 (항암제 감수성 항진제) 이다.

이렇게 하여 얻어진 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 병용하면, 당해 항암제의 치료 효과가 비약적으로 향상된다. 항암제 감수성 항진제와 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합한 형태로는, 그들의 성분의 양방을 포함하는 하나의 조성물이어도 되고, 각각 별개의 제제의 조합이어도 된다. 또한, 그들의 성분은 각각 별개의 투여 경로이어도 된다.

여기서 사용되는 대상이 되는 항암제로서는, 상기와 동일하고, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 티오테파 (thiotepa), 멜파란 (melphalan), 부설판 (busulfan), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카르바진 (procarbazine), 테모졸로마이드 (temozolomide), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 메토트렉사트 (methotrexate), 페메트렉시드 (pemetrexed), 플루오로우라실 (fluorouracil), 테가풀/우라실 (tegaful·uracil), 독시플루리딘 (doxifluridine), 테가풀/기메라실/오테라실 (tegaful·gimeracil·oteracil), 카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine), 에노시타빈 (enocitabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 6-메르캅토푸린 (6-mercaptopurine), 플루다라빈 (fludarabin), 펜토스타틴 (pentostatin), 클라드리빈 (cladribine), 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicine), 피라루비신 (pirarubicin), 마이토잔트론 (mitoxantrone), 암루비신 (amurubicin), 악티노마이신 D (actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycine), 페플레오마이신 (pepleomycin), 마이토마이신 C (mytomycin C), 아클라루비신 (aclarubicin), 지노스타틴 (zinostatin), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 이리노테칸 (irinotecan), 이리노테칸 활성 대사물 (SN-38), 노기테칸 (nogitecan, topotecan), 에토포시드 (etoposide), 프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 아나스트로졸 (anastrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 레트로졸 (letrozole), 리툭시마브 (rituximab), 이마티니브 (imatinib), 게피티니브 (gefitinib), 겜투주마브·오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin), 보르테조미브 (bortezomib), 엘로티니브 (erlotinib), 세툭시마브 (cetuximab), 베바시주마브 (bevacizumab), 수니티니브 (sunitinib), 소라페니브 (sorafenib), 다사티니브 (dasatinib), 파니투무마브 (panitumumab), 아스파라기나아제 (asparaginase), 트레티노인 (tretinoin), 삼산화비소 (arsenic trioxide), 또는 그들의 염, 또는 그들의 활성 대사물 등을 들 수 있다. 이 중, 백금 착물계 항암제 및 식물 알칼로이드계 항암제가 바람직하고, 특히 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸, SN-38 또는 그들의 염이 바람직하다.

실시예

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1

(1) 방법

(a) 사용 세포

인간 대장암 세포주 11 종류 (COLO201, COLO205, COLO320, DLD-1, HCT-15, HT-29, LS174T, SW480, SW620, SW1116, WiDR) 는, 이하 (표 1) 로부터 입수하였다.

배양은, 접착 세포는 φ100 mm/Tissue Culture Dish (IWAKI), 부유 세포는 φ100 mm/Non-Treated Dish (IWAKI) 에서, 배지 (RPMI 1640, 2 mM Glutamine, 10 ％ Fetal Bovine Serum), 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건 하에서 실시하였다.

(b) 약제

옥살리플라틴 (L-OHP) 원말 (原末) 은, 주식회사 야쿠르트 본사에서 입수하였다.

(c) 옥살리플라틴에 대한 감수성의 평가

각 세포에 있어서, 옥살리플라틴 0 ∼ 1000 μ㏖/ℓ 로 48 시간 노출 후의 세포 생존율을 MTS assay (CellTiter96^TMAQ_ueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) 로 평가하고, IC₅₀ 값 (옥살리플라틴 미처리 well 에 대해 세포 수를 50 ％ 억제하는 농도) 을 산출하여 각 세포에 있어서의 옥살리플라틴 감수성으로 하였다. 감수성의 평가는 상이한 계대 수의 세포로 4 회 실시하여, 그 평균값과 표준 편차를 산출하였다.

(d) 세포 내 단백질의 추출

접착 세포는 dish 로부터 배지를 제거하고 빙랭 PBS 로 3 회 세정 후, 러버폴리스맨으로 박리하여 긁어모으고, 부유 세포는 세포 부유액을 PBS 로 재현탁하여 원심하는 형태로 3 회 세정 후의 세포 현탁액을 1.5 ㎖ 마이크로 튜브로 옮겼다. 4 ℃ 에서 1,200 × g, 10 분간 원심하여 세포를 모으고, 상청을 제거한 후에 세포 용해 버퍼 (9 ㏖/ℓ Urea, 2 ％ CHAPS, 1 mM DTT, 프로테아제인히비터칵테일 (Sigma)) 400 ㎕ 를 첨가하고, 빙랭 하에서 초음파 파쇄 처리를 실시한 후, 4 ℃ 에서 16,000 × g, 20 분간 원심하고, 상청을 액체 질소로 급속 동결 후, 분석할 때까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 상청의 일부를 사용하여 단백질 정량 (DC Protein Assay Kit, Bio-Rad) 을 실시하였다.

(e) 단백질 발현 해석을 위한 샘플 조정 및 프로테인 칩의 제조, 세포 내 단백질의 발현 해석

세포 용해 버퍼 (프로테아제인히비터를 제외함) 에서 5 ㎎/㎖ 로 조정하고, 다시 pH 4.5 의 희석/세정 버퍼 (50 mM sodium acetate buffer) (이하, 버퍼) 에서 1 ㎎/㎖ 로 조정한 샘플 100 ㎕ 를, 동일 버퍼에서 전 (前) 처리한 양이온 교환 칩 어레이 (CM10, Bio-Rad) 의 스폿에 apply 하고, 1 시간 인큐베이트하여 반응시킨 후, 버퍼에서 3 회 wash, milli Q 수 (水) 로 2 회 린스하였다. 풍건 (風乾) 후, energy absorbing molecule (EAM：50 ％ ACN/0.5 ％ TFA 용액에 의한 sinapinic acid 의 포화 용액) 을, 1.0 ㎕ 를 0.5 ㎕ 씩 2 회로 나누어 각 스폿에 apply 하고, 스폿 표면이 마른 후, 프로테인 칩 어레이의 분석을 실시하였다.

단백질 발현 해석은, 표면 인핸스형 레이저 탈리 이온화 비행 시간형 질량 분석계 (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry：SELDI-TOF MS) 로 실시하였다. 분석 기기로는, ProteinChip^TM Reader (Model PBSIIC, Bio-Rad) 를 사용하고, mass-to-charge ratio (m/z) 의 opitimization range 2,000 ∼ 30,000 Daltons, Laser intensity 220, Detector sensitivity 8, 1 샘플당 합계 104 shots 의 조건으로 분석을 실시하였다. signal-to-noise ratio (S/N 비) 5 이상인 피크의 추출과 단백질 발현 비교 해석은, CiphergenExpress^TM Data Manager 3.0 을 사용하여 실시하였다.

(f) 단백질 발현과 옥살리플라틴 감수성의 상관 분석

SELDI-TOF MS 에 의해 검출된 전체 단백질 피크에 대해서, 각 세포의 IC₅₀ 값과 피크 강도의 관계에 대해 상관 분석을 실시하였다. IC₅₀ 값의 로그값과 피크 강도의 관계에 대해 선형 회귀 분석을 실시하고, P 값 ＜ 0.05, 결정 계수 (r²；r, Pearson 상관 계수) ＞ 0.5 를 만족시키는 피크를 옥살리플라틴 감수성 관련 후보 단백질로서 선출하였다. 상관 분석 및 선형 회귀 분석은, SPSS 15.0 J for Windows (등록 상표) (버젼 15.0.1) 로 실시하였다.

(2) 결과

(a) 11 종류의 인간 대장암 세포주에 있어서의 옥살리플라틴 감수성의 평가

각 세포에 있어서의 IC₅₀ 값은 0.84 ± 0.20 ∼ 29.7 ± 13.6 μM 으로, 그 감수성에는 큰 폭이 관찰되었다 (도 1).

(b) 단백질 발현 해석

SELDI-TOF MS 를 사용한 전술한 분석 조건에 따른 발현 해석에 의해, 전부 42 개의 피크를 검출하였다.

(c) 단백질 발현과 옥살리플라틴 감수성의 상관 분석

상관 분석 및 선형 회귀 분석에 의해, m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크가 옥살리플라틴 감수성 (IC₅₀ 값) 과 유의적인 상관성을 갖는 것을 알아내었다 (도 2, 도 3).

실시예 2

(1) 방법

사용 세포는 인간 대장암 세포주 7 종류 (DLD-1, HCT-15, HT-29, LS174T, SW480, SW620, WiDR), 약제는 시스플라틴 (cis-Diammineplatinum (II) dichrolide, SIGMA) 을 사용하고, 0 ∼ 1000 μ㏖/ℓ 로 48 시간 노출 후의 세포 생존율을 실시예 1 과 동일하게 MTS assay 로 평가하여, IC₅₀ 값을 산출하였다. 세포 내 단백질의 추출, 단백질 발현 해석 및 시스플라틴 (CDDP) 감수성과의 상관 분석은 실시예 1 과 동일하게 실시하였다.

(2) 결과

(a) 7 종류의 인간 대장암 세포주에 있어서의 시스플라틴 감수성의 평가

각 세포에 있어서의 IC₅₀ 값은 3.33 ± 0.80 ∼ 26.9 ± 11.6 μM 으로, 그 감수성에는 큰 폭이 관찰되었다.

(b) 단백질 발현과 시스플라틴 감수성의 상관 분석

상관 분석 및 선형 회귀 분석에 의해, m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크가 시스플라틴 감수성 (IC₅₀ 값) 과 상관을 나타내는 경향을 관찰하였다 (도 4). 그리고, 시스플라틴 투여시에 있어서의 총 플라티나의 약물 동태학적 파라미터 (브리플라틴 ^TM 주 인터뷰폼으로부터) 에 기초하면, 시스플라틴 임상 사용 에 있어서의 1 회당 최고 투여량 (100 ㎎/㎡) 을 투여했을 때의 피크 혈중 농도 (Cmax) 는, 대략 9.5 ∼ 11.0 μM (일본인의 체표면적을 1.50 ∼ 1.73 ㎡ 로 하여 계산) 로 계산되는 점에서, 각 암 세포주의 시스플라틴에 대한 IC₅₀ 값에 대해 10 μM 를 컷오프값으로 하여, 고감수성 및 저감수성의 2 군으로 분류하였다. 그 결과, m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크의 피크 강도는 저감수성군에 있어서 유의적인 상승이 관찰되었다 (도 5).

실시예 3

(1) 방법

사용 세포는 인간 대장암 세포주 5 종류 (COLO320, HCT-15, HT-29, LS174T, HCT116 (HCT116 의 입수원 뱅크는 ECACC)), 약제는 이리노테칸 활성 대사물 (SN-38, 주식회사 야쿠르트 본사에서 입수) 을 사용하고, 0 ∼ 1000 n㏖/ℓ 로 72 시간 노출 후의 세포 생존율을 실시예 1 과 동일하게 MTS assay 로 평가하여, IC₅₀ 값을 산출하였다. 세포 내 단백질의 추출, 샘플 조정 및 프로테인 칩의 제조는 실시예 1 과 동일하게 실시하고, 분석은 ProteinChip^TM Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad) 를 사용하여, Mass Range 0 ∼ 70,000 Daltons, Focus Mass 11,000 Dalton, Energy 3000 nJ, 1 샘플당 합계 265 shots 의 조건으로 분석을 실시하였다. 단백질 발현 비교 해석은, Ciphergen Express^TM Data Manager 3.0 을 사용하여 실시하였다.

(2) 결과

(a) 5 종류의 인간 대장암 세포주에 있어서의 SN-38 감수성의 평가

각 세포에 있어서의 IC₅₀ 값은 3.39 ∼ 33.7 nM 이고, 그 감수성에는 큰 폭이 관찰되었다.

(b) 단백질 발현과 SN-38 감수성의 상관 분석

SN-38 의 약물 동태학적 파라미터 (캄프토^TM 인터뷰폼으로부터) 에 기초하면, 대장암 치료 레지멘 (180 ㎎/㎡/일) 에 의한 이리노테칸 투여 1 회째에 얻어지는 SN-38 의 혈중 농도 곡선하면적 (AUC_SN-38) 은 1449 nmol.h/ℓ 로 계산되고, 본 검토에서 사용한 72 시간 약제 노출에 의해 동등한 노출량이 얻어지는 SN38 의 농도는 20 nM 로 산출되기 때문에, 각 암 세포주의 SN-38 에 대한 IC₅₀ 값에 대해 20 nM 를 컷오프값으로 하여 고감수성 및 저감수성의 2 군으로 분류하였다. 그 결과, m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크의 피크 강도는 저감수성군에 있어서 유의적인 상승이 관찰되었다 (도 6).

실시예 4

실시예 1 에 있어서, m/z 11,000 ∼ 11,100 의 피크로서 검출된 단백질 (단백질 A1) 의 성질을 조사하기 위해서, pH 의 변화에 수반되는 피크 강도의 변화, 및 CM10 칩 어레이와는 상이한 화학 수식이 칩 표면에 주어진 프로테인 칩 어레이에 있어서의 검출의 유무에 대해 검토를 실시하였다.

(1) 방법

(a) 검토에 사용한 프로테인 칩 어레이와 버퍼 조건

양이온 교환 칩 어레이 (CM10, Bio-Rad) 및 음이온 교환 칩 어레이 (Q10, Bio-Rad) 에 대해서는, pH 3.0 (50 mM Glycine-HCl buffer), pH 3.5 (50 mM sodium acetate buffer), pH 4.0 (50 mM sodium acetate buffer), pH 4.5 (50 mM sodium acetate buffer), pH 5.0 (50 mM sodium acetate buffer), pH 5.5 (50 mM sodium acetate buffer), pH 6.0 (50 mM phosphate buffer), pH 6.5 (50 mM phosphate buffer), pH 7.0 (50 mM phosphate buffer), pH 7.5 (50 mM phosphate buffer), pH 8.0 (50 mM Tris-HCl buffer), pH 8.5 (50 mM Tris-HCl buffer), pH 9.0 (50 mM Glycine-NaOH buffer), pH 9.5 (50 mM Glycine-NaOH buffer), pH 10.0 (50 mM Glycine-NaOH buffer) 의 15 종류의 버퍼를 사용하고, 금속 수식 (Immobilized Metal Affinity Capture) 칩 어레이 (IMAC30, Bio-Rad) 에 대해서는 phosphate buffered saline (PBS) 을 사용하였다.

(b) CM10 및 Q10 칩 어레이를 사용한 분석을 위한 샘플 조정 및 프로테인 칩의 제조와 분석 조건

CM10 및 Q10 칩 어레이를 사용한 분석을 위한 샘플 조정 및 프로테인 칩의 제조는, (a) 의 각 버퍼를 사용하여 실시예 1 의 (1) 방법 상기 (e) 에 준하여 실시하였다. 단 분석 기기로는, ProteinChip^TM Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad) 를 사용하여, Mass Range 0 ∼ 70,000 Daltons, Focus Mass 11,000 Dalton, Energy 3000 nJ, 1 샘플당 합계 265 shots 의 조건으로 분석을 실시하였다.

(c) IMAC30 칩 어레이를 사용한 분석을 위한 샘플 조정 및 프로테인 칩의 제조와 분석 조건

IMAC30 칩 어레이는 50 mM NiSO₄ 로 스폿 표면의 활성화를 실시하고, milli Q 수에 의해 1 회 린스한 후, PBS 로 전 처리를 실시하였다. 샘플 조정 및 칩에 대한 샘플 apply 이후의 작업은, 버퍼로서 상기 (a) 의 PBS 를 사용하여, 실시예 1 의 (1) 방법 상기 (e) 에 준하여 실시하였다. 단 분석 기기로는, ProteinChip^TM Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad) 를 사용하여, Mass Range 0 ∼ 70,000 Daltons, Focus Mass 11,000 Dalton, Energy 6000 nJ, 1 샘플당 합계 265 shots 의 조건으로 분석을 실시하였다.

(2) 결과

실시예 1 에서, CM10 칩 어레이를 사용한 pH 4.5 의 분석 조건에 있어서 m/z 11,000 ∼ 11,100 의 피크로서 검출된 상기 후보 단백질은, CM10 칩 어레이 및 Q10 칩 어레이의 어느 것에 있어서도 pH 7.0 ∼ 7.5 에서 현저한 피크의 저하가 관찰되어, 이 후보 단백질의 등전점 (pI) 은, pI 7.0 ∼ 7.5 로 추정되었다. 또한, 칩 표면을 NiSO₄ 에 의해 활성화한 IMAC30 칩 어레이에서도 검출이 확인되었다.

실시예 5 (후보 단백질 A1 의 동정)

(1) 후보 단백질 A1 의 분자량의 추정

세포 내 단백질 추출 샘플에 대해, 분자량이 이미 알려진 bovine insulin (5733.51Da) 및 equine Cytochrome c (12360.96Da) 를 Calibrant 로서 사용하고, SELDI-TOF MS 를 사용하여 단백질 발현 해석시와 동일한 분석 조건 (CM10 칩 어레이 및 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.5) 으로 Internal Calibration 을 실시하였다. 그 결과, 후보 단백질 A1 피크의 분자량은 11072Da 로 추정되었다 (도 7).

(2) 후보 단백질 A1 의 정제와 동정

(정제)

후보 단백질 A1 의 정제 및 동정을 목적으로 하여, 단백질 발현 해석에 있어서 후보 단백질이 고발현을 나타낸 세포주 HT-29 및 저발현을 나타낸 세포주 COLO320 의 2 세포주로부터 발현 해석시와 동일한 방법에 의해 세포 내 단백질을 추출하였다. 단백질 정량의 결과에 기초하여 양 샘플로부터 등량을 분취하고, TCA 침전을 실시한 후, 회수한 침전을 냉에탄올/에테르 용매로 세정하여 실온에서 건조시켰다. 이 침전에 IEF lysis buffer (6M urea, 2M thiourea, 3 ％ CHAPS, 1 ％ Triton X-100, DeStreak reagent, GE 헬스케어 바이오사이언스) 를 첨가하고, 실온에서 교반 및 초음파 처리를 실시하였다.

조정한 IEF 샘플 용액을 원심하고, 상청을 Immobiline DryStrip gel (pH 3 ∼ 10 non-linear, 13 cm, GE 헬스케어 바이오사이언스) 에 apply 하여, 겔의 팽윤을 실시한 후, 등전점 전기 영동을 실시하였다 (5000V, 15 hr).

등전점 전기 영동 종료 후, Immobiline DryStrip gel 을 이차원 전기 영동용의 sample buffer (6M urea, 20 ％ glycerol, 2 ％ DTT, 2 ％ SDS, 100 mM Tris-HCl pH 8.8) 중에서 평형화시키고, 평형화가 종료된 Immobiline DryStrip gel 을 25 mA 의 정전류로 전기 영동을 실시하였다. 겔은 10 ∼ 18 ％, 16 × 16 cm 폴리아크릴아미드그라젠트겔 (바이오크라프트) 을 사용하고, 전기 영동 후의 겔은 CBB G-250 에 의해 염색 후, 5 ％ 아세트산으로 탈색을 실시하였다.

이차원 전기 영동의 화상 취득에는 GS-800 calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad), 화상 해석은 PDQuest 소프트웨어 (Bio-Rad) 를 사용하여 비교 해석을 실시하였다.

(동정)

프로테인 칩을 사용한 SELDI-TOF MS 분석에 의해 얻어진 후보 단백질 A1 에 관한 정보 (분자량 11072, pI 7.0 ∼ 7.5) 에 기초하여, 이차원 전기 영동으로 전개한 겔 상의 분자량 10 ∼ 15 kDa 및, 대략 pI 6.5 ∼ 8.0 의 범위 (중성 부근) 로 분리된 스폿을 대상으로 하고, 이들 중에서 COLO320 과 비교하여 HT-29 에서 높은 발현을 나타내었던 4 스폿을 선택하였다 (도 8). 이들의 스폿을 잘라내어, 공지된 방법에 따라 단백질의 겔 내 트립신 소화를 실시한 후, LCMS-IT-TOF (액체 크로마토그래프 질량 분석계, Shimadzu) 를 사용하여 분석 (MS/MS 측정) 을 실시하고, 얻어진 결과에 대해 MASCOT 데이터베이스 검색을 실시하였다.

분석을 실시한 4 스폿 중, 도 8 에 나타내는 스폿 4 에서 동정된 단백질 A1 (분자량 11,072, pI 7.3) 은, 프로테인 칩 어레이를 사용한 SELDI-TOF MS 분석에 의해 얻어진 결과 (분자량 11,072, pI 7.0 ∼ 7.5) 와 일치하였다. 이로 인해, 옥살리플라틴 감수성과 상관을 나타낸 m/z 11,000 ∼ 11,100 의 피크로서 검출된 후보 단백질 A1 은, S100A10 (S100 calcium-binding protein A10, Calpactin-1 light chain, Calpactin I light chain, p10 protein, p11, Cellular ligand of annexin II) 으로 동정되었다.

실시예 6 (S100A7 및 S100A8)

암 세포주의 세포 내 단백질 추출 샘플을, CM10 프로테인 칩 어레이, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 를 사용하고, 실시예 1 의 (1) 방법 상기 (e) 와 동일한 조건으로 분석한 결과, 옥살리플라틴 감수성과의 관련을 나타내는 2 개의 단백질 피크, 단백질 A2 및 단백질 A3 을 알아내었다.

단백질 A2 의 피크 강도는 각 암 세포주의 옥살리플라틴 (L-OHP) 감수성 (IC₅₀ 값) 과 유의적인 상관성을 나타내었다 (도 9).

또한, 각 암 세포주의 옥살리플라틴에 대한 IC₅₀ 값에 기초하여, 옥살리플라틴 임상 사용시의 피크 혈중 농도에 거의 상당하는 5.0 μM 를 컷오프값으로 하여 암 세포주를 고감수성 및 저감수성의 2 군으로 분류하면, 단백질 A3 의 피크 강도는 저감수성군에 있어서 유의적인 상승이 관찰되었다 (도 10). 또한, 세포주 LS174T 는, S/N 비가 5 미만이었기 때문에, 해석 대상으로부터 제외하였다.

단백질 A2 및 단백질 A3 의 피크는 S100A10 의 근방에 존재하고 있고, Calibrant 로서 bovine insulin (5733.51Da) 및 equine Cytochrome c (12360.96Da) 를 사용하여 Calibration 을 실시한 결과, 단백질 A2 는 10835Da, 단백질 A3 은 11340Da 로 추정되었다.

또한, 실시예 2 와 동일하게, CM10 칩 어레이 및 Q10 칩 어레이 각각에 대해 pH 3.0 ∼ pH 10.0 의 15 종류의 버퍼를 사용하고, 각 피크 강도의 변화를 SELDI-TOF MS 에 의해 분석한 결과, 10835Da 를 나타내는 피크는 pH 6.5 ∼ 7.0 에 있어서 현저한 피크의 저하를, 11340Da 를 나타내는 피크는 pH 6.0 ∼ 6.5 에 걸쳐 급격한 피크의 상승이 관찰되었기 때문에, 각각 pI 는 6.5 ∼ 7.0, 6.0 ∼ 6.5 로 추정되었다.

이들의 결과에 기초하여 데이터베이스 (Expasy TagIdent tool：http：//www.expasy.ch/tools/tagident.html) 를 검색한 결과, 10835Da 로 나타내는 피크는 S100A8 (S100 calcium-binding protein A8, Calgranulin-A, Migration inhibitory factor-related protein 8, MRP-8, p8 등), 11340Da 로 나타내는 피크는 S100A7 (S100 calcium-binding protein A7, Psoriasin) 인 것이 나타났다 (도 11).

비교예 1

실시예 6 과 동일하게 하여, SELDI-TOF MS 에 의해 분자량 13,242 의 S100A9 로 추정되는 피크에 대해서, 옥살리플라틴 감수성과의 관련에 대해 검토하였다. 그 결과, S100A9 발현량과 옥살리플라틴 감수성 사이에 유의적인 관련은 관찰되지 않았다 (도 12). 따라서, S100A9 에는 항암제 감수성과의 사이에 관련성은 없는 것이 판명되었다.

실시예 7

1) 방법

m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크의 고발현 세포 HT-29, 및 저발현 세포 COLO320 을 사용하고, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 세포 내 단백질을 추출 후, 16.5 ％ 폴리아크릴아미드겔에 1 레인당 단백량 10 ㎍ 을 apply 하고, 100 V 정전압으로 SDS-PAGE 를 실시하였다. 영동 후, 드라이블로팅시스템 (iBlot^TM, invitrogen) 을 이용하여 PVDF 막에 단백질을 블롯하고, 블로킹을 실시한 후, S100A10 에 대해서는 항 S100A10 모노클로날 항체 (Purified Mouse Anti-Annexin II light chain monoclonal antibody, BD Transduction Laboratories) 를, 내재성 단백질에 대해서는 항 GAPDH 모노클로날 항체 (anti-GAPDH monoclonal antibody, Ambion) 를 사용하여 일차 항체 반응을 실시하였다. 알칼리포스파타아제 표지 항마우스 IgG 항체와 이차 항체 반응시킨 후, 반응 기질로서 CDP-Star^TM chemiluminescent substrate 를 첨가하여 발광시키고, 루미노·이미지 애널라이저 (LAS-4000 mini, FUJIFILM) 에 의해 검출하였다. 블로킹 시약, 이차 항체 및 반응 기질은 Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit (Western Breeze^TM, invitrogen) 를 사용하였다.

(2) 결과

프로테인 칩 어레이를 사용한 단백질 발현 해석 (실시예 1) 에 있어서, m/z 로서 11,000 ∼ 11,100 으로 검출된 피크의 고발현 세포 HT-29, 및 저발현 세포 COLO320 에 있어서의 S100A10 의 발현은, 항 S100A10 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯법에 의해 확인되었다 (도 13).

Claims

칼슘 결합 단백질 S100A7, S100A8 또는 S100A10 을 함유하는 항암제 감수성 판정 마커.
제 1 항에 있어서,
항암제가 백금 착물계 항암제 또는 식물 알칼로이드계 항암제인 항암제 감수성 판정 마커.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
항암제가 옥살리플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸, SN-38 또는 그들의 염인 항암제 감수성 판정 마커.
검체 중의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 항암제 감수성 판정 마커를 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법.
제 4 항에 있어서,
검체가 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 것을 특징으로 하는 판정 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
검체가 항암제가 투여된 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 판정 방법.
검체 중의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 항암제 감수성 판정 마커를 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 판정 방법을 실시하기 위한 키트.
제 7 항에 있어서,
검체가 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 키트.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
검체가 항암제가 투여된 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 키트.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 항암제 감수성 판정 마커의 발현 억제를 지표로 하는 항암제 감수성 항진제의 스크리닝 방법.
제 10 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 항암제 감수성 항진제.
제 11 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합하여 이루어지는 암 치료용 조성물.
제 11 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제의 조합인, 암 치료약 제조를 위한 사용.
제 11 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.