JP6836625B2 - 抗がん剤の感受性の判定マーカー - Google Patents
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Description
従って、本発明の課題は、さらに新たな抗がん剤感受性判定マーカーを提供することにある。
また、高感受性細胞株と低感受性細胞株において発現しているタンパク質の発現量に差のあるタンパク質を表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(SELDI−TOF MS)で検討した。なお、発現量に差のあるタンパク質を広く探索するために、SELDI−TOF MSにおいては、陽イオン用、陰イオン用両方のチップを使用し、マトリックスとして高分子用のSPA(EAM:50%ACN/0.5%TFA溶液によるsinapinic acidの飽和溶液)と低分子用のCHCA(α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)を用いて検討した。また、細胞内タンパク質抽出工程では、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるためにラバーポリスマンで剥がさずそのまま細胞溶解液を用い細胞内タンパク質を抽出した。その結果、高感受性細胞株と低感受性細胞株において、細胞内発現量に違いのあったタンパク質について推定される分子量及び等電点の情報を得た。これらのタンパク質をデータベース検索することで、Cytochrome c oxidase subunit 5A(COX5A)を同定した。また、高感受性細胞株および低感受性細胞株の細胞抽出液の二次元電気泳動を行い、推定される分子量及び等電点の範囲にあり、かつ発現量に差のあるスポットを見出し、そのスポットをLC−MS/MSで解析し、データベースで検索することで、Retinol−binding protein 1(CRBP1)を同定した。
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該タンパク質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが、抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、これら物質の発現変動を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
〔1〕PHB、ANXA5、ANXA1、TALDO、C1QBP、IPYR、CRBP1及びCOX5Aから選ばれる1以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。
〔2〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔1〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔3〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔1〕又は〔2〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔4〕がん患者由来の生体試料中のPHB、ANXA5、ANXA1、TALDO、C1QBP、IPYR、CRBP1及びCOX5Aから選ばれる1以上の分子の量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法。
〔5〕さらに、前記測定結果を対照レベルと比較することにより、当該がん患者の抗がん剤に対する感受性を判定する工程を含む〔4〕記載の判定方法。
〔6〕生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である〔4〕又は〔5〕記載の判定方法。
〔7〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔4〕〜〔6〕のいずれかに記載の判定方法。
〔8〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔4〕〜〔7〕のいずれかに記載の判定方法。
〔9〕がん患者由来の生体試料中のPHB、ANXA5、ANXA1、TALDO、C1QBP、IPYR、CRBP1及びCOX5Aから選ばれる1以上の分子の量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする〔4〕〜〔8〕のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
〔10〕抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のPHB、ANXA5、ANXA1、TALDO、C1QBP、IPYR、CRBP1及びCOX5Aから選ばれる1以上の分子の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
〔11〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔10〕記載のスクリーニング方法。
〔12〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔10〕又は〔11〕記載のスクリーニング方法。
〔13〕〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
〔14〕〔13〕記載の感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合わせてなるがん治療用組成物。
〔15〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔14〕記載のがん治療組成物。
〔16〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩である〔14〕又は〔15〕記載のがん治療用組成物。
さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。
ANXA5およびANXA1は、泌尿生殖管、腸管のがんの診断等に使用され得る(特表2008-545634号公報)が、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でANXA5、ANXA1の濃度が上昇することは全く知られていない。
TALDOは、がんマーカーについての報告はなく、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でTALDOの濃度が上昇することは全く知られていない。
C1QBPは、腎細胞がんの診断マーカーとして使用できること(特表2006−514554号公報)は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でC1QBPの濃度が上昇することは全く知られていない。
IPYRは、in vitroで結腸直腸がんを診断する方法に使用できること(特表2008-502889号公報)は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でIPYRの濃度が上昇することは全く知られていない。
CRBP1は、乳がんや大腸がんにおいてレチノールによる細胞増殖抑制作用を助長すること(Kaleagasioglu F,et.al.,Arzneimittelforschung(1993)43(4):487−90)は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でCRBP1の濃度が上昇することは全く知られていない。
COX5Aは、マウス大腸がんモデルにおいて、癌細胞でその発現が正常細胞に比べて低いこと(Yasui Y,et.al.,J Carcinog(2009)8:10)は知られている。また、前記特許文献3の段落(0068)にて、COX5Aは、タンパク質Gの候補の一つとして挙がっている。しかし、特許文献3においてタンパク質Gは、抗がん剤低感受性細胞株で高感受性株に比べてその濃度が上昇しており、本願とは逆の結果を示しているので、特許文献3のタンパク質GはCOX5Aでないと考えられる。このため、COX5Aが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でCOX5Aの濃度が上昇することは全く知られていないと言える。
ここで、がん患者としては、がんを有する被験者又はがんを有していた被験者が包含される。生体試料としては、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
すなわち、がん細胞株又は担癌動物に抗がん剤及び試験物質を添加又は投与し、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のPHB、ANXA5、ANXA1、TALDO、C1QBP、IPYR、CRBP1及びCOX5Aから選ばれる1以上の分子の発現量を遺伝子レベル又はタンパク質レベルで測定する工程、及び当該発現量の変動に基づいて、前記がん細胞株又は担癌動物の前記抗がん剤に対する感受性を亢進する試験物質を選択する工程を行うことにより、前記抗がん剤に対する感受性亢進剤をスクリーニングすることができる。
ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド(cyclophosphamide)、イフォスファミド(ifosfamide)、チオテパ(thiotepa)、メルファラン(melphalan)、ブスルファン(busulfan)、ニムスチン(nimustine)、ラニムスチン(ranimustine)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、テモゾロミド(temozolomide)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ネダプラチン(nedaplatin)、メトトレキサート(methotrexate)、ペメトレキセド(pemetrexed)、フルオロウラシル(fluorouracil)、テガフール/ウラシル(tegaful・uracil)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、テガフール/ギメラシル/オテラシル(tegaful・gimeracil・oteracil)、カペシタビン(capecitabine)、シタラビン(cytarabine)、エノシタビン(enocitabine)、ゲムシタビン(gemcitabine)、6−メルカプトプリン(6−mercaptopurine)、フルダラビン(fuludarabin)、ペントスタチン(pentostatin)、クラドリビン(cladribine)、ヒドロキシウレア(hydroxyurea)、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicine)、ピラルビシン(pirarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アムルビシン(amurubicin)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ブレオマイシン(bleomycine)、ペプレオマイシン(pepleomycin)、マイトマイシンC(mytomycin C)、アクラルビシン(aclarubicin)、ジノスタチン(zinostatin)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビノレルビン(vinorelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、イリノテカン(irinotecan)、イリノテカン活性代謝物(SN−38)、ノギテカン(nogitecan、topotecan)、エトポシド(etoposide)、プレドニゾロン(prednisolone)、デキサメタゾン(dexamethasone)、タモキシフェン(tamoxifen)、トレミフェン(toremifene)、メドロキシプロゲステロン(medroxyprogesterone)、アナストロゾール(anastrozole)、エキセメスタン(exemestane)、レトロゾール(letrozole)、リツキシマブ(rituximab)、イマチニブ(imatinib)、ゲフィチニブ(gefitinib)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin)、ボルテゾミブ(bortezomib)、エルロチニブ(erlotinib)、セツキシマブ(cetuximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、スニチニブ(sunitinib)、ソラフェニブ(sorafenib)、ダサチニブ(dasatinib)、パニツムマブ(panitumumab)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、トレチノイン(tretinoin)、三酸化ヒ素(arsenic trioxide)、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン又はその塩が好ましい。
ヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定
(1)方法
(a)使用細胞
ヒト大腸癌細胞株9種類(SW480、Ls174T、Lovo、SW620、HCT116、HCT15、HT29、DLD−1及びWiDr)は、以下(表1)より入手した。
培養は、φ100mm/Tissue Culture Dish(IWAKI)、培地(D−MEM、2mM Glutamine、10% Fetal Bovine Serum)、37℃、5%CO2の条件下にて行った。
オキサリプラチン(L−OHP)原末は、和光純薬工業および株式会社ヤクルト本社より入手した。
前記9種類のヒト大腸癌細胞株を、96wellプレートに1500個/well播種し、24時間後にオキサリプラチンを添加した。薬剤曝露48時間後の細胞生存率をMTS assay(CellTiter96TM AQueousOneSolution Cell Proliferation Assay、Promega)にて評価し、吸光度からIC50値を求めた。薬剤曝露条件はControl(0μM)、0.001μM、0.01μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、1000μMの11条件を用いた。感受性の評価は、1回の試験においてそれぞれの細胞株、薬剤曝露時間、薬剤曝露条件について3サンプルずつ測定し、異なる継代数の細胞にて3回実施した。解析は、MTS assayの結果から算出した生存率をもとに行った。
IC50値は、表2に示す値となった。表2より、SW480、Ls174T及びLovoをオキサリプラチン高感受性株、SW620、HCT116及びHCT15をオキサリプラチン中感受性株、HT29、DLD−1及びWiDrをオキサリプラチン低感受性株と分類した。
2D−DIGEによるオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
(1)使用細胞
試験例1にてオキサリプラチン高感受性株として分類したSW480、Ls174T及びLovo、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したHT29、DLD-1及びWiDrを使用した。
dishより培地を除き氷冷PBSで3回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液(2M thiourea, 7M Urea, 4% CHAPS, 50mM Tris−HCl pH9)を加え細胞を溶解し、1.5mLマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、4℃にて13,000×rpm、10分間遠心して上清を回収した。2D Quant kit(GE Healthcare)を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で5mg/mLに調製した後、分注して分析するまで−80℃にて保存した。
CyDye DIGE fluors,minimal labeling kit(GE Healthcare)を使用して細胞内タンパク質を標識した。それぞれの細胞溶解液50μgに対し400pmolの試薬(Cy2、Cy3、Cy5)で標識し、十分に混和した。遠心機で軽く遠心し、4℃暗所で30分間静置した。10mMリジンを添加し反応を停止した。溶液を混和し、軽く遠心して4℃暗所で10分間静置した。使用まで−80℃にて保存した。
各ゲルにアプライしたサンプルを表3に示す。
内部標準は全ての細胞溶解液を等量ずつ混和したものを使用した。
それぞれのゲル用に、(3)で標識したタンパク質サンプルを50μg(12μL)ずつ1.5mLマイクロチューブに入れ、混和した。36μLの2xサンプルバッファー(2M thiourea、7M urea、4% CHAPS、2%PharmalytepH3−10、2% Destreak Reagent)を混和したタンパク質サンプルに添加し、氷上で10分間静置した。各サンプル150μg溶液を膨潤液(2M thiourea、7M urea、4% CHAPS、2%PharmalytepH3−10、1% Destreak Reagent)で450μLに調整し、4℃にて13,000×rpm、10分間遠心した。各ストリップホルダーにサンプルの上清を450μL加え、Immunobiline DryStrip pH3−10NL,24cm(GE Healthcare)をストリップホルダーに設置した後、Ettan IPGphor2を使用して、等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動の条件を表4に示す。
SDS−PAGE用に24cmの15%アクリルアミドゲルを作成した。一次元目泳動済みのImmunobiline DryStripを10cm dishに入れ、平衡化バッファーA(50mM Tris−HCl pH8.8、6M Urea、30%グリセロール、1%SDS、0.25%DTT、BPB)で満たし15分間振盪しながら平衡化させた。平衡化バッファーB(50mM Tris−HCl pH8.8、6M Urea、30%グリセロール、1%SDS、4.5%ヨードアセトアミド、BPB)に変え15分間振盪しながら平衡化させた。平衡化したImmunobiline DryStripをSDS−PAGE用ゲルに設置し、泳動層(Tris/Tricin/SDS buffer)にて7mAで泳動した。
Typhoon Trio(GE Healthcare)で撮影し、DeCyder 2D Software Ver6.5(GE Healthcare)で解析し、P<0.001で、かつ、発現量の差が1.3倍以上のスポットを解析した。
標識していない内部標準150μgを(4)、(5)同様に二次元電気泳動した。
次に(5)で得られたスポットを回収するために、ゲルをPlusOneTM Silver Staining Kit,Protein(GE Healthcare)で銀染色した。
まず、ゲルにFixing solution(30% Ethanol、10% Glacial acetic acid)を250mL添加し、60分間静置した。この作業を2回繰り返し、ゲルを固定した。固定したゲルに、Sensitizing solution(30% Ethanol、4% Sodium Thiosulphate(5% w/v)、6.8% Sodium acetate)を250mL添加して120分間静置することでゲルを増感させ、Milli−QTM水により、8分間洗浄し、当該洗浄を5回繰り返した。洗浄したゲルに、Silver soluton (10% Silver nitrate solution(2.5% w/v))を250mL添加して60分間銀反応させ、Milli−Q水にて1分間洗浄し、当該洗浄を4回繰り返した。洗浄後のゲルにDeveloping soluion(2.5%Sodium carbonate、0.08% formaldehyde(37% w/v))を250mL添加して、2〜5分間現像し、Stop solution(1.46% EDTA−Na2・2H2O)を250mL添加して、45分間静置し、反応を止めた。Milli−Q水で30分間洗浄し、当該洗浄を2回繰り返した後、解析する目的のスポットをスポットペッカー(Gene World)で採取し、1.5mLマイクロチューブに4スポットずつ移した。
(6)までの操作で回収された16スポット(図1の枠)について、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、LCMS−IT−TOF(液体クロマトグラフ質量分析計、Shimadzu)を用いて分析(MS/MS測定)を行い、得られた結果についてMASCOTデータベース検索を行った。
6タンパク質の大腸癌細胞株中での発現量とIC50値との相関
実施例1にて同定された6タンパク質について、試験例1にて使用した9種類の大腸癌細胞株中での発現量と試験例1で算出したIC50値との相関を確認した。
(a)使用細胞
試験例1記載の9種類の大腸癌細胞株を使用した。
(b)細胞内タンパク質の抽出
dishより培地を除き氷冷PBSで3回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液(9M Urea, 2% CHAPS, 50mM Tris−HCl pH9)を加え細胞を溶解し、1.5mLマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、4℃にて13,000×rpm、10分間遠心して上清を回収した。BCA ProteinAssay Kit(Thermo)を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で5mg/mLに調製した後、分注して分析するまで−80℃にて保存した。
10%アクリルアミドゲルに試験例1記載の9種類の大腸癌細胞株をそれぞれ10μL/Lane(50μg/Lane)添加し、泳動層(Tris/Glycin/SDS buffer)にて、1枚20mMでSDS−PAGEを行った。セミドライ式ブロッター(BIO−RAD)を用い1枚当たり72mA、30分間にて、PVDF膜(GE−Healthcare)にtransferを行い、5% skim milk/TBS−T(Tris Buffered Saline with Tween20)を用い室温で一時間blokkingし、表5に示した一次抗体を添加し、4℃、over nightで反応させた。
PHB及びC1QBPは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が多く、低感受性株で発現量が少なく、高い正の相関を示した(図2、図3)。
ANXA5、ANXA1、TALDO及びIPYRは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が少なく、低感受性株で発現量が多く、高い負の相関を示した(図4〜図7)。
SELDI−TOF MSを用いたオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
(1)方法
(a)使用細胞
試験例1にてオキサリプラチン高感受性株として分類したSW480、Ls174T及びLovo、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したHT29、DLD-1及びWiDrを使用した。
実施例2の(1)方法(b)細胞内タンパク質の抽出、と同様の方法で行った。
細胞溶解バッファーをpH4の希釈/洗浄バッファー(50mM sodium acetate buffer)(以下、pH4バッファー)にて0.5mg/mLに調製したサンプル100μLを、pH4バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ(CM10、Bio−Rad)のスポットにapplyし、30分インキュベートして反応させた後、pH4バッファーにて3回洗浄、milliQ水にて2回リンスした。風乾後、energy absorbing molecule(高分子側の確認用としてSPA(EAM:50% ACN/0.5% TFA溶液によるsinapinic acidの飽和溶液)を、低分子側の確認用としてCHCA(α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)を使用)1.0μLを、0.5μLずつ2回に分けて各スポットにapplyし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
また、前記同様に、pH8の希釈/洗浄バッファー(50mM Tris−HCl buffer)(以下、pH8バッファー)にて0.5mg/mLに調製したサンプル100μLを、pH8バッファーにて前処理した陰イオン交換チップアレイ(Q10、Bio−Rad)のスポットにapplyし、1時間インキュベートして反応させた後、pH8バッファーにて3回洗浄、Milli−Q水にて2回リンスした。風乾後、energy absorbing molecule(EAM及びCHCAを使用)1.0μLを、0.5μLずつ2回に分けて各スポットにapplyし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(surface−enhanced laser desorption/ionization time−of−flightmass spectrometry:SELDI−TOF MS)にて行った。分析機器としては、ProteinChipT M Reader(Model PCS4000 Personal Edition、Bio−Rad)を用いた。
マトリックスとしてSPAを使用した場合、Mass Range 10,000〜50,000 Daltons、Focus Mass 18,000 Dalton,Energy4,000 nJ、1サンプルあたり合計265shots の条件にて分析を行った。
マトリックスとしてCHCAを使用した場合、Mass Range 2,000〜20,000 Daltons、Focus Mass 7,700 Dalton、Energy 1,500 nJ、1サンプルあたり合計265shots の条件にて分析を行った。
signal−to−noise ratio(S/N比)5以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、CiphergenExpress T M Data Manager 3.0 を用いて行った。
オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際に、p<0.001で発現量に違いのあったピークを最終的に2種類抽出した(候補タンパク質A及びB)。また、pHの変動による発現量の変動から候補タンパク質A及びBの等電点を推定した。
チップとしてCM10を使用した際に見出された候補タンパク質Aは、図8に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Aは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のp値は、p=7.9×10-6であり、m/z 15847Da、等電点(PI)4.5〜5.5(図9)であった。
また、チップとしてQ10を使用した際に見出された候補タンパク質Bは、図10に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Bは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のp値は、p=1.0×10-4であり、m/z 12506Da、等電点(PI)4.0〜5.0(図11)であった。
候補タンパク質Aの二次元電気泳動による解析
候補タンパク質Aの同定を目的として、さらに二次元電気泳動による解析を行った。
オキサリプラチン高感受性株であるSW480及び低感受性株であるWiDrを用いて、実施例2の(1)方法(b)細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で細胞内タンパク質を抽出し、5mg/mLに調整した後、分析するまで−80℃にて保存した。
細胞溶解液50μgを膨潤液(2M thiourea、7M urea、4% CHAPS、2%PharmalytepH3−10、1% Destreak Reagent)で125μLに調整した。調整したサンプル溶液を4℃にて13,000×rpm、10分間遠心し、上清をImmobiline DryStrip gel(pH3〜10 non―linear、13cm、GEヘルスケア バイオサイエンス)に添加し、ゲルの膨潤を行った後、等電点電気泳動を行った。電気泳動の条件を表7に示す。
次に得られたスポットを回収するために、ゲルをPlusOne SilverStaining Kit,Protein(GE Healthcare)で銀染色した。銀染色によるスポットの回収は、実施例1(6)スポットの回収、と同様の方法で行った。
実施例3で得られた候補タンパク質Aに関する情報(分子量及び等電点)に基づき、二次元電気泳動にて展開したゲル上の分子量10,000〜30,000Da及び、およそpH4.5〜6.5の範囲に分離されたスポット(図12の枠内)を対象とし、これらの中からSW480とWiDrを比較した際に発現量に差のある8スポットを選択し、これらのスポットを回収した。
Western blotによるタンパク質発現の確認
(1)CRBP1の確認
実施例2の(1)方法(b)細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株の細胞内タンパク質を抽出後、15%ポリアクリルアミドゲルに1レーンあたりタンパク量50μgをapplyし、20mA定電流にてSDS−PAGEを行った。泳動後、ドライブロッティングシステム(iBlotTM 、invitrogen)を用いてPVDF膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行った後、抗CRBP1モノクローナル抗体(sc−53989、santa cruz)(×1/200)を、内在性タンパク質については抗GAPDHモノクローナル抗体(anti−GAPDH monoclonal antibody、Ambion)(×1/10000)を用いて一次抗体反応を行った。アルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体(×1/20000)と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてCDP−StarT M chemiluminescent substrateを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー(LAS−4000mini、富士フィルム)により検出した。ブロッキング試薬、二次抗体および反応基質はChemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit(WesternBreezeT M 、invitrogen)を用いた。
一次抗体として、抗COX5Aモノクローナル抗体(sc−376907、santa cruz)(×1/200添加)を使用した以外は、前記(1)CRBP1の確認と同様の方法で行った。その結果、オキサリプラチン高感受性株におけるCOX5Aの発現は、抗COX5A抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された(図14)。
siRNAの導入によるヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の変化
(1)方法
(a)使用細胞
試験例1記載の9種類の大腸癌細胞株のオキサリプラチン高感受性株としてLs174Tを、中感受性株としてHCT116を、低感受性株としてHT29及びDLD−1を使用した。
試験例1記載のオキサリプラチン原末を使用した。
前記ヒト大腸癌細胞株を、6wellのプレートに1×105個/well播種し、24時間後に無血清のDMEM培地(Wako, 044-29765)に交換した。1wellあたり、150pmolの表8に示した各siRNAを250μL Opti MEM(GIBCO,No.319985)に溶解した溶液、及び4.5μLのLipofectamin RNAiMAX Reagent(invitrogen,No.13778−150)と250μL Opti MEM(GIBCO,No.319985)を混合した溶液を混合し、10〜20分間インキュベートした。インキュベート後、ヒト大腸癌細胞株を培養した6wellプレートの各wellに500μLずつ添加し、添加して4〜6時間後に各wellを、血清を添加したDMEM培地(Wako, 044-29765)に交換した。siRNA添加後24時間後に細胞を回収した。
また、使用したヒト大腸癌細胞株と導入したsiRNAの組み合わせを表9に示した。なお、Control siRNAは、life technologies社のNo. 4390843を使用した。
試験例1(1)(c)記載の方法で、siRNAを導入したヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定(IC50値の測定)を行った。
(a)PHB siRNA
結果を表10に示す。siRNA導入により、PHBをノックアウトしたLs174T、HCT116、HT29、DLD−1の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのControl siRNAと比較して、IC50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、PHBがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例2の結果とも一致した。
結果を表11に示す。siRNA導入によりANXA5をノックアウトしたHCT116、HT29の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのControl siRNAと比較して、IC50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ANXA5がオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例2の結果とも一致した。
結果を表12に示す。siRNA導入によりTALDOをノックアウトしたLs174T、HCT116、HT29の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのControl siRNAと比較して、IC50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、TALDOがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例2の結果とも一致した。
結果を表13に示す。siRNA導入によりC1QBPをノックアウトしたHCT116は、Control siRNAと比較して、IC50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、C1QBPがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例2の結果とも一致した。
結果を表14に示す。siRNA導入によりIPYRをノックアウトしたLs174Tは、Control siRNAと比較して、IC50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、IPYRがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例2の結果とも一致した。
Claims (11)
- TALDOからなる抗がん剤感受性判定マーカーであって、抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である、マーカー。
- さらに、C1QBPからなる請求項1記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
- さらに、CRBP1からなる請求項1又は2記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
- がん患者由来の生体試料中のTALDOの量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法であって、抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である、方法。
- 生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である請求項4記載の判定方法。
- さらに、C1QBPの量を測定する工程を含む請求項4又は5記載の判定方法。
- さらに、CRBP1の量を測定する工程を含む請求項4〜6のいずれかに記載の判定方法。
- がん患者由来の生体試料中のTALDOの量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項4〜7のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
- 抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のTALDOの発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法であって、抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である、方法。
- さらに、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のC1QBPの発現変動を指標とする請求項9記載の抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
- さらに、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のCRBP1の発現変動を指標とする請求項9又は10に記載の抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
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