WO2016031816A1 - 抗がん剤の感受性の判定マーカー - Google Patents

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祐介 谷川原
可奈子 原
美紀 中村
伸二 杉本
寛行 高橋
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株式会社ヤクルト本社
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Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent sensitivity determination marker used for determining whether or not a cancer of a subject patient has therapeutic reactivity to an anticancer agent to be used, and use thereof.
  • anticancer agents such as alkylating agents, platinum preparations, antimetabolites, anticancer antibiotics, and anticancer plant alkaloids. These anticancer agents may or may not be effective depending on the type of cancer. However, it is known that some types of cancer that are recognized as effective may or may not be effective depending on the individual patient. Whether or not an anticancer drug shows an effect on such individual patient's cancer is called anticancer drug sensitivity.
  • Oxaliplatin (SP-4-2)-[(1R, 2R) -cyclohexane-1,2-diamine- ⁇ N, ⁇ N ′] [ethanedioato (2-)- ⁇ O 1 , ⁇ O 2 ] platinum (IUPAC) is the third It is a next generation platinum complex antineoplastic agent.
  • the mechanism of action is thought to be DNA synthesis inhibition and protein synthesis inhibition by cross-linking with DNA bases, as with the preceding drugs cisplatin (CDDP) and carboplatin (CBDCA).
  • CDDP cisplatin
  • CBDCA carboplatin
  • oxaliplatin (L-OHP) exhibits an antitumor effect and exhibits an antitumor spectrum different from that of conventional platinum complex antineoplastic agents.
  • the cancer chemotherapy treatment schedule is generally long-term, monitoring over time of the sensitivity to anticancer drugs during treatment can be used to determine whether treatment should continue or not, and this will only reduce patient burden and side effects. It is considered useful from the viewpoint of medical economy. Predicting treatment response in individual patients, and predicting the effects of anticancer drugs such as oxaliplatin or response in order to realize “individualized treatment” in which early diagnosis is performed and appropriate drugs and treatment regimens are selected It is urgent to establish a biomarker that enables early diagnosis of sex.
  • the present inventors cultured a plurality of human cancer cell lines, measured the drug sensitivity of these cancer cell lines, exposed the drug to cell lines having different drug sensitivity, Changes in expression of intracellular proteins over time are comprehensively analyzed using a surface-enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer (SELDI-TOF MS), and compared with drug sensitivities, anti-cancer
  • the drug sensitivity determination marker was searched and several markers were reported (Patent Documents 1 to 3).
  • the subject of this invention is providing the novel anticancer agent sensitivity determination marker further.
  • the present inventor first classifies cancer cell lines into three types, high sensitivity, medium sensitivity and low sensitivity, depending on the degree of sensitivity to an anticancer drug (oxaliplatin: L-OHP). Proteins with different expression levels of proteins expressed in low-sensitivity cell lines were examined by two-dimensional differential electrophoresis (2D-DIGE). As a result, spots with different intracellular expression levels were found in the high-sensitivity cell line and the low-sensitivity cell line, the spots were analyzed by LC-MS / MS, and the database was searched to identify 10 proteins.
  • 2D-DIGE two-dimensional differential electrophoresis
  • PHB Prohibitin
  • ANXA5 Annexin A5
  • ANXA1 Annexin A1
  • TALDO Transaldolase
  • C1QBP Complement component 1Q subcomponent-binding protein
  • IPYR Inorganic Pyrophosphatase
  • SELDI-TOF MS uses both cations and anions, and a polymer SPA (EAM: 50% ACN). / Saturative solution of sinapinic acid with 0.5% TFA solution) and CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid) for low molecules.
  • the intracellular proteins were extracted using the cell lysate as they were without peeling off with a rubber policeman. As a result, we obtained information on the estimated molecular weight and isoelectric point for proteins with different intracellular expression levels in the highly sensitive and low sensitive cell lines.
  • Cytochrome oxidase subunit 5A (COX5A) was identified by searching the database for these proteins.
  • two-dimensional electrophoresis of cell extracts of highly sensitive cell lines and low sensitive cell lines is performed to find spots that are within the estimated molecular weight and isoelectric point ranges and that have different expression levels.
  • Retinol-binding protein 1 (CRBP1) was identified by analyzing with LC-MS / MS and searching the database.
  • an anticancer drug sensitivity determination marker comprising one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1, and COX5A.
  • a method for determining the sensitivity of an anticancer agent comprising a step of measuring the amount of one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A in a biological sample derived from a cancer patient .
  • the determination method according to [4] further comprising a step of determining the sensitivity of the cancer patient to the anticancer agent by comparing the measurement result with a control level.
  • the determination method according to [4] or [5] wherein the biological sample is a biological sample derived from a cancer patient administered with an anticancer agent.
  • a composition for cancer treatment comprising a combination of the sensitivity enhancer according to [13] and an anticancer agent to be subjected to sensitivity enhancement.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention it is possible to accurately determine the anticancer drug sensitivity of an individual patient before the start of treatment or early after the start of the treatment. Is possible. Furthermore, unnecessary side effects can be avoided because it is possible to avoid the use of anticancer agents that are not effective. In addition, because treatment schedules using anticancer agents are long-term, the sensitivity of anticancer agents to cancer over time can be determined by determining anticancer agent sensitivity for each treatment cycle even during treatment. Evaluation is possible and it is possible to determine whether or not to continue treatment.
  • the measurement reagent of the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention is useful as an anticancer drug sensitivity determination reagent.
  • the result of 2D-DIGE is shown.
  • the frame in the figure shows the selected 16 spots.
  • the relationship between the expression level of PHB and oxaliplatin sensitivity (IC 50 value) to cancer cells is shown.
  • IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr. It shows the relationship between oxaliplatin sensitivity (IC 50 value) for the expression amount and the cancer cells C1QBP.
  • IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr.
  • IC 50 value oxaliplatin sensitivity
  • IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr. It shows the relationship between oxaliplatin sensitivity (IC 50 value) for the expression amount and the cancer cells ANXA1.
  • IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr. It shows the relationship between oxaliplatin sensitivity (IC 50 value) for the expression amount and the cancer cells TALDO.
  • IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr. It shows the relationship between oxaliplatin sensitivity (IC 50 value) for the expression amount and the cancer cells IPYR. IC 50 values are plotted from the left for SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1, and WiDr.
  • the SELDI-TOF MS result of candidate protein A is shown.
  • the prediction of isoelectric point of candidate protein A is shown.
  • the SELDI-TOF MS result of candidate protein B is shown.
  • the prediction of isoelectric point of candidate protein B is shown.
  • the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention are 8 kinds of proteins, PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1, and COX5A. As shown in Examples below, these proteins are expressed using 2D-DIGE or SELDI-TOF MS as the difference in the expression level of the protein expressed in a cell line highly sensitive to an anticancer drug and a cell line low in sensitivity. As a result, it was found that the expression level of PHB, C1QBP, CRBP1 and COX5A was increased in highly sensitive strains.
  • PHB is a tumor suppressor gene (Japanese Patent Laid-Open No. 5-271294) and can be used as a prostate cancer marker (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-196221), sensitivity determination of anticancer agents is known. It is not known at all that it can be used as a marker, and that the concentration of PHB increases in cancer cells with high anticancer drug sensitivity.
  • ANXA5 and ANXA1 can be used for diagnosis of urogenital tract and intestinal cancer (Japanese Patent Publication No. 2008-545634), but it can be used as a marker for determining sensitivity to anticancer agents, and has low sensitivity to anticancer agents.
  • TALDO can be used as an anticancer drug sensitivity determination marker, and it is not known at all that the concentration of TALDO is increased in cancer cells with low anticancer drug sensitivity.
  • C1QBP can be used as a diagnostic marker for renal cell cancer (Japanese Patent Publication No. 2006-514554), it can be used as an anticancer drug sensitivity determination marker, and cancer cells with high anticancer drug sensitivity. It is not known at all that the concentration of C1QBP increases.
  • IPYR can be used in a method for diagnosing colorectal cancer in vitro (Japanese Patent Publication No. 2008-502889), it can be used as an anticancer drug sensitivity determination marker, It is not known at all that the concentration of IPYR increases in low cancer cells.
  • CRBP1 is known to promote cell growth-suppressing action by retinol in breast cancer and colorectal cancer (Kaleagasioglu F, et.al., Arzneimitelutzutzfeld (1993) 43 (4): 487-90). It has not been known at all that it can be used as a marker for determining cancer drug sensitivity, and that the concentration of CRBP1 increases in cancer cells with high anticancer drug sensitivity.
  • COX5A is expressed in cancer cells in a mouse colorectal cancer model as compared with normal cells (Yasui Y, et. Al., J Carcinog (2009) 8:10).
  • COX5A is listed as one of the candidates for protein G.
  • the concentration of protein G in Patent Document 3 is an anticancer agent low-sensitivity cell line and its concentration is higher than that of the high-sensitivity cell line, and shows the opposite result to the present application, G is considered not to be COX5A. For this reason, it can be said that it is not known at all that COX5A can be used as an anticancer drug sensitivity determination marker and that the concentration of COX5A increases in anticancer drug sensitive cancer cells.
  • an anticancer agent used as the target of the anticancer agent sensitivity determination marker of this invention for example, oxaliplatin, cyclophosphamide (ifosfamide), thiotepa (thiotepa), melphalan ( melphalan, busulfan, nimustine, ranimustine, dacarbazine (da), procarbazine, templatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin methotrexate , Pemetrexed, fluorouracil, tegafur / uracil (tegaful erac), doxyfluridine, tegafur / gimeracil / citabin, tegafur / citabin enocitabine, gemcitabine, 6-mercaptopurine, fludarabine, pentostatin, cladribine, hydroxyurea, hydroxyurea
  • the measurement result is a control level (standard concentration, concentration of anticancer agent sensitivity determination marker of the present invention before administration of anticancer agent, etc.)
  • the cancer patient includes a subject having cancer or a subject having cancer.
  • the biological sample include blood, serum, plasma, cancer tissue biopsy specimen, cancer excision surgical specimen, stool, urine, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, sputum and the like, and serum is particularly preferable.
  • digestive organs represented by lip, oral and pharyngeal cancer, esophageal cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colon / rectal cancer, etc.
  • Respiratory and thoracic organ cancers such as cancer, lung cancer, bone and joint cartilage cancer, skin malignant melanoma, squamous cell carcinoma and other skin cancers, mesothelioma
  • the molecular measuring means selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A in the sample is, for example, electrophoresis (2D-DIGE etc.), mass spectrometry (SELDI-TOF MS, LC / MS , LC / MS / MS, etc.), immunological measurement methods (immunoblotting, ELISA, etc.).
  • the measurement by 2D-DIGE and SELDI-TOF MS can be carried out by the method described in Examples below.
  • measurement by mass spectrometry such as LC / MS and LC / MS / MS is performed by quantitatively analyzing a molecule selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A according to a conventional method. can do.
  • a measurement method using an antibody against a molecule selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1, and COX5A is preferable.
  • the antibody against the molecule selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A to be used may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. More specifically, for example, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, Western blot, immunostaining, immunodiffusion method, etc. can be mentioned, preferably Western blot Alternatively, an enzyme immunoassay is preferred, and Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, sandwich ELISA) are particularly preferred.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ANXA5, ANXA1, TALDO, and IPYR are used to determine the sensitivity to an anticancer agent when the target anticancer agent is oxaliplatin or a salt thereof.
  • the amount for example, concentration of ANXA5, ANXA1, TALDO and / or IPYR in a biological sample derived from a cancer patient may be measured. If the concentration is determined to be lower than the predetermined standard concentration, the cancer can be determined to be sensitive to the target anticancer drug, so these anticancer drug sensitivity determination markers are It can be used as a marker for actively continuing treatment for patients who can expect a therapeutic effect.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention can be used as a marker for actively continuing treatment for a patient who can expect a therapeutic effect, and in addition, an anticancer drug whose drug effect cannot be expected. It can also be used as a marker for avoiding the progression of cancer and the increase in side effects associated with continuous administration.
  • PHB, C1QBP, CRBP1 and COX5A can be used to determine sensitivity to an anticancer agent when the target anticancer agent is oxaliplatin or a salt thereof.
  • the amount for example, concentration of PHB, C1QBP, CRBP1 and / or COX5A in a biological sample derived from a cancer patient may be measured.
  • concentration is determined to be higher than a predetermined standard concentration, it can be determined that the cancer is sensitive to the target anticancer agent. It can be used as a marker for actively continuing treatment for patients who can expect a therapeutic effect.
  • concentration is determined to be lower than the predetermined standard concentration, it can be determined that the cancer is not sensitive to the target anticancer agent.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention can be used as a marker for actively continuing treatment for a patient who can expect a therapeutic effect, and in addition, an anticancer drug whose drug effect cannot be expected. It can also be used as a marker for avoiding the progression of cancer and the increase in side effects associated with continuous administration.
  • Implementation of the method for determining sensitivity to an anticancer drug of the present invention includes a protocol for measuring one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A in a sample. It is preferable to use a kit.
  • the kit includes a measurement reagent and protocol for one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A (determining how to use the measurement reagent and whether it has anticancer drug sensitivity) Standards for doing so).
  • the standard affects the standard concentration of one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A, the concentration determined to be high, the concentration determined to be low, and the measurement result.
  • the factors to be given and the degree of the effect are included, and these concentrations can be set for each target anticancer agent. Using the reference, it can be determined as described above.
  • the expression variation of one or more molecules selected from PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR, CRBP1 and COX5A in a biological sample derived from a cancer cell line or a tumor-bearing animal is changed.
  • it becomes possible to screen for anticancer drug sensitivity enhancing agents.
  • an anticancer agent and a test substance are added or administered to a cancer cell line or a cancer-bearing animal, and PHB, ANXA5, ANXA1, TALDO, C1QBP, IPYR in a biological sample derived from the cancer cell line or the cancer-bearing animal, Based on the step of measuring the expression level of one or more molecules selected from CRBP1 and COX5A at the gene level or protein level, and the variation in the expression level, the cancer cell line or the cancer-bearing animal against the anticancer agent By performing the step of selecting a test substance that enhances sensitivity, the agent for enhancing sensitivity to the anticancer agent can be screened.
  • the expression variation of these proteins can be used as an index.
  • Drug sensitizers can be screened. That is, substances that suppress the expression of these proteins in vitro or in vivo enhance the sensitivity to anticancer agents.
  • substances that reduce the concentration of these proteins in the presence of anticancer agents in various cancer cell lines are substances that increase the sensitivity of the cancer cell lines to the anticancer drugs (anti Anti-sensitivity agent).
  • substances that reduce the concentration of these proteins before and after administration of anticancer drugs in cancer-bearing animals are substances that increase the sensitivity of the cancer-bearing animals to the anticancer drugs (enhanced anticancer drug sensitivity). Agent).
  • cancer drug sensitivity enhancing agents can be screened. That is, substances that increase the expression of these proteins in vitro or in vivo enhance anticancer drug sensitivity.
  • substances that increase the concentration of these proteins in the presence of anticancer drugs in various cancer cell lines are substances that increase the sensitivity of the cancer cell lines to the anticancer drugs (anti Anti-sensitivity agent).
  • substances that increase the concentration of these proteins before and after administration of anticancer drugs in cancer-bearing animals are substances that increase the sensitivity of the cancer-bearing animals to the anticancer drugs (enhanced anticancer drug sensitivity). Agent).
  • the combined form of the anticancer agent sensitivity-enhancing agent and the anticancer agent targeted for sensitivity enhancement may be a single composition containing both of these components. There may be. In addition, these components may be different administration routes.
  • Anticancer agents to be used here are the same as described above, and are oxaliplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, thiotepa, melphalan, busulfan.
  • Test example 1 Measurement of oxaliplatin sensitivity of human colon cancer cell lines (1) Method (a) Cells used Nine types of human colon cancer cell lines (SW480, Ls174T, Lovo, SW620, HCT116, HCT15, HT29, DLD-1 and WiDr) Obtained from the following (Table 1). The culture was performed under conditions of ⁇ 100 mm / Tissue Culture Dish (IWAKI), medium (D-MEM, 2 mM Glutamine, 10% Fetal Bovine Serum), 37 ° C., 5% CO 2 .
  • IWAKI Tissue Culture Dish
  • D-MEM 2 mM Glutamine, 10% Fetal Bovine Serum
  • (C) Method for measuring susceptibility of human colon cancer cell line to oxaliplatin The nine types of human colon cancer cell lines were seeded on a 96-well plate at 1500 cells / well, and oxaliplatin was added 24 hours later. The cell viability 48 hours after drug exposure was evaluated with MTS assay (CellTiter96 TM AQueousOneSolution Cell Proliferation Assay, Promega), and the IC 50 value was determined from the absorbance.
  • MTS assay CellTiter96 TM AQueousOneSolution Cell Proliferation Assay, Promega
  • As drug exposure conditions 11 conditions of Control (0 ⁇ M), 0.001 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M, and 1000 ⁇ M were used. Sensitivity was evaluated by measuring three samples for each cell line, drug exposure time, and drug exposure condition in one test, and performing three
  • Example 1 Search for biomarkers for predicting oxaliplatin sensitivity by 2D-DIGE (1) Cells used SW480, Ls174T and Lovo classified as oxaliplatin highly sensitive strains in Test Example 1, and HT29, DLD-1 classified as oxaliplatin hyposensitive strains And WiDr were used.
  • Table 3 shows the samples applied to each gel.
  • the internal standard used was a mixture of all cell lysates in equal amounts.
  • 50 ⁇ g (12 ⁇ L) of the protein sample labeled in (3) was placed in a 1.5 mL microtube and mixed.
  • a 150 ⁇ g solution of each sample was adjusted to 450 ⁇ L with a swelling solution (2M thiourea, 7M urea, 4% CHAPS, 2% Pharmaceutically pH 3-10, 1% Destreak Reagent), and centrifuged at 13,000 ⁇ rpm for 10 minutes.
  • 450 ⁇ L of the sample supernatant was added to each strip holder, and Immunobiline DryStripping pH 3-10NL, 24 cm (GE Healthcare) was placed on the strip holder, and then isoelectric focusing was performed using Ettan IPGphor2.
  • Table 4 shows the conditions for isoelectric focusing.
  • SDS-PAGE (second dimension) A 24 cm 15% acrylamide gel was prepared for SDS-PAGE.
  • First-dimensioned Immunobiline Dry Strip is placed in a 10 cm dish and filled with equilibration buffer A (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 0.25% DTT, BPB) for 15 minutes. Equilibrated with shaking.
  • Equilibration buffer B 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 4.5% iodoacetamide, BPB was used for equilibration with shaking for 15 minutes.
  • Example 2 Correlation between expression levels of 6 proteins in colorectal cancer cell lines and IC 50 values Expression levels in 9 types of colorectal cancer cell lines used in Test Example 1 for 6 proteins identified in Example 1 And the IC 50 value calculated in Test Example 1 was confirmed.
  • Example 3 Search for biomarkers for predicting oxaliplatin sensitivity using SELDI-TOF MS (1) Method (a) Cells used: SW480, Ls174T and Lovo classified as oxaliplatin high sensitive strains in Test Example 1, and oxaliplatin low sensitive strains Classified HT29, DLD-1 and WiDr were used.
  • Candidate protein A which was found when CM10 was used as a chip, had an increased expression level in the oxaliplatin high-sensitivity strain compared to the low-sensitivity strain, as shown in FIG.
  • the expression level of candidate protein B found when Q10 was used as a chip was higher in the oxaliplatin high-sensitivity strain than in the low-sensitivity strain.
  • protein B was estimated from the molecular weight and isoelectric point obtained by SELDI-TOF MS analysis using a database (Swiss Prot; Swiss Bioinformatics Organization), and cytochrome c Oxygenase subunit Va (COX5A) (molecular weight 12,501, isoelectric point 4.88) was estimated as candidate protein B.
  • Example 4 Analysis of candidate protein A by two-dimensional electrophoresis
  • analysis by two-dimensional electrophoresis was further performed.
  • SW480 which is a high-sensitivity strain of oxaliplatin
  • WiDr which is a low-sensitivity strain
  • intracellular protein was extracted in the same manner as in Example 2, (1) method (b) extraction of intracellular protein, and 5 mg / mL And stored at ⁇ 80 ° C. until analysis.
  • 50 ⁇ g of cell lysate was adjusted to 125 ⁇ L with a swelling solution (2M thiourea, 7M urea, 4% CHAPS, 2% Pharmaceutical pH 3-10, 1% Destreak Reagent).
  • the prepared sample solution is centrifuged at 13,000 ⁇ rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant is added to Immobiline DryStripe gel (pH 3 to 10 non-linear, 13 cm, GE Healthcare Bioscience) to swell the gel. After that, isoelectric focusing was performed. Table 7 shows the electrophoresis conditions.
  • Immobiline DryStripe gel is placed in a 10 mL tube and equilibrated with buffer A (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 0.25% DTT, BPB). Equilibrated with full shaking for 15 minutes. Equilibration buffer B (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 4.5% iodoacetamide, BPB) was used for equilibration with shaking for 15 minutes. Immobiline Dry Strip gel after equilibration was electrophoresed at a constant current of 20 mA.
  • buffer A 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 0.25% DTT, BPB
  • Equilibration buffer B 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 1% SDS, 4.5% iodoacetamide
  • the gel 10-20%, 16 ⁇ 16 cm polyacrylamide gradient gel (Biocraft) was used. Next, in order to collect the obtained spots, the gel was silver-stained with PlusOne Silver Staining Kit, Protein (GE Healthcare). Spot collection by silver staining was performed in the same manner as in Example 1 (6) Spot collection. Based on the information (molecular weight and isoelectric point) on candidate protein A obtained in Example 3, the molecular weight on a gel developed by two-dimensional electrophoresis is 10,000 to 30,000 Da, and the pH is about 4.5 to 6. Spots separated in the range of 5 (within the frame in FIG. 12) were targeted, and 8 spots with different expression levels were selected from these when SW480 and WiDr were compared, and these spots were collected.
  • the collected spots are digested with in-gel trypsin according to a known method, and then analyzed (MS / MS measurement) using LCMS-IT-TOF (liquid chromatograph mass spectrometer, Shimadzu). MASCOT database search was performed on the results.
  • CRBP1 Cellular retinol binding protein 1 (molecular weight 15,850, isoelectric point 4.99) was identified. This was presumed to be candidate protein A because the molecular weight and isoelectric point almost coincided.
  • Example 5 Confirmation of protein expression by Western blot (1) Confirmation of CRBP1 Extraction of intracellular proteins of high-sensitivity and low-sensitivity strains of oxaliplatin by the same method as (1) method (b) extraction of intracellular proteins in Example 2 Thereafter, a protein amount of 50 ⁇ g per lane was applied to a 15% polyacrylamide gel, and SDS-PAGE was performed at a constant current of 20 mA.
  • the protein was blotted onto a PVDF membrane using a drive blotting system (iBlot TM, invitrogen), blocked, and then anti-CRBP1 monoclonal antibody (sc-53989, santa cruz) ( ⁇ 1/200)
  • the protein was subjected to a primary antibody reaction using an anti-GAPDH monoclonal antibody (Ambion) ( ⁇ 1/10000).
  • an anti-GAPDH monoclonal antibody ⁇ 1/10000
  • the reaction substrate After the alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody ( ⁇ 1/20000) secondary antibody reaction, the reaction substrate and emit light adding CDP-Star T M chemiluminescent substrate as, Lumino image analyzer (LAS-4000mini, Fuji Film ). Blocking reagent, secondary antibody and reaction substrate using Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit (WesternBreeze T M, invitrogen).
  • Example 6 Changes in oxaliplatin sensitivity of human colorectal cancer cell lines by introduction of siRNA (1) Method (a) Cells used Ls174T as an oxaliplatin hypersensitive strain of 9 types of colorectal cancer cell lines described in Test Example 1, HCT116 was used as the hyposensitive strain with HT29 and DLD-1.
  • IPYR siRNA The results are shown in Table 14. Ls174T, in which IPYR was knocked out by siRNA introduction, had a decreased IC 50 value and increased sensitivity to oxaliplatin as compared to Control siRNA. This result was consistent with the result of Example 2 showing that IPYR was expressed in a high-sensitivity oxaliplatin strain with a low expression level and was expressed in a low-sensitivity strain with a high expression level.

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Abstract

　新たな抗がん剤感受性判定マーカーの提供。　ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。

Description

抗がん剤の感受性の判定マーカー
　本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその利用に関する。
　抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤には、がんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
　オキサリプラチン（ＳＰ－４－２）－［（１Ｒ，２Ｒ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ－κＮ，κＮ'］［ｅｔｈａｎｅｄｉｏａｔｏ（２－）－κＯ1，κＯ2］ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＵＰＡＣ）は第三世代白金錯体系抗悪性腫瘍薬である。作用機序は先行薬剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）やカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）と同様、ＤＮＡ塩基との架橋形成によるＤＮＡ合成阻害、蛋白合成阻害と考えられているが、ＣＤＤＰやＣＢＤＣＡが無効な大腸癌に対してもオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）は抗腫瘍効果を示し、従来の白金錯体系抗悪性腫瘍薬とは異なる抗腫瘍スペクトルを示す。アメリカでは２００４年１月にフルオロウラシル（５－ＦＵ）／レボホリナート（ＬＶ）との併用で転移性結腸・直腸癌のファーストライン治療として承認されており、日本においても２００５年４月、「治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌」に対するレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用（ＦＯＬＦＯＸ４法）にて薬価収載された。進行再発大腸癌の治療は、１９９０年代前半まで行われていた５－ＦＵ／ＬＶ療法での生存率は１０～１２ヶ月であったのに対し、オキサリプラチンを加えたＦＯＬＦＯＸ療法での生存期間は１９．５ヶ月とほぼ２倍にまで到達している。さらに２００９年８月には、同じくレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用による「結腸癌における術後補助化学療法」が効能・効果として追加され、大腸癌患者での使用拡大と有益性が期待できる薬剤である。
　しかし、それでもなお進行再発大腸癌に対するＦＯＬＦＯＸ療法の奏効率は５０％程度であり、換言すれば治療を受けた患者の半数は効果が得られていないことを意味する。また、オキサリプラチンの使用により好中球減少症のほか高頻度の末梢神経障害を呈し、これは致死的副作用ではないものの治療継続を困難にする因子ともなっている。したがって、治療開始前に効果の期待できる患者（レスポンダー）と、効果の期待できない患者（ノンレスポンダー）を予測し、治療反応性を早期に診断できるバイオマーカーにより、有効性と安全性の高い化学療法が実現する。
　さらに、一般にがん化学療法の治療スケジュールは長期に渡るため、治療継続中における抗がん剤に対する感受性の経時的モニターは治療継続の是非の判定を可能とし、患者負担や副作用軽減につながるのみならず医療経済の観点からも有用であると考えられる。個々の患者における治療反応性を予測、そして早期に診断して適切な薬剤や治療レジメンを選択する「個別化治療」実現のためには、オキサリプラチン等の抗がん剤の効果予測もしくは治療応答性の早期診断を可能とするバイオマーカーの確立は急務である。
　かかる観点から本発明者らは、複数のヒトがん細胞株を培養し、これらのがん細胞株の薬剤感受性を測定し、これら薬剤感受性の異なる細胞株に薬剤を曝露し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を用いて網羅的に解析し、薬剤感受性と比較解析することにより、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行い、いくつかのマーカーを報告した（特許文献１～３）。
国際公開第２００９／０９６１９６号 国際公開第２０１１／０５２７４８号 国際公開第２０１１／０５２７４９号
　しかしながら、先に報告したマーカーは、いまだ抗がん剤の感受性判定マーカーとして実用化されておらず、さらに新たなマーカーの開発が望まれている。
　従って、本発明の課題は、さらに新たな抗がん剤感受性判定マーカーを提供することにある。
　そこで本発明者は、まず、がん細胞株を抗がん剤（オキサリプラチン：Ｌ－ＯＨＰ）に対する感受性の程度によって高感受性、中感受性及び低感受性の３種に分類し、高感受性細胞株と低感受性細胞株において発現しているタンパク質の発現量に差のあるタンパク質を二次元ディファレンシャル電気泳動（２Ｄ－ＤＩＧＥ）で検討した。その結果、高感受性細胞株と低感受性細胞株において、細胞内発現レベルの異なるスポットを見出し、そのスポットをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで解析し、データベース検索することで、１０種のタンパク質を同定した。次に、高感受性、中感受性及び低感受性の３種の細胞株でのこれらのタンパク質の発現量と抗がん剤に対するＩＣ50値との相関を確認したところ、Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ（ＰＨＢ）、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ａ５（ＡＮＸＡ５）、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ａ１（ＡＮＸＡ１）、Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ（ＴＡＬＤＯ）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　１Ｑ　ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ１ＱＢＰ）、及びＩｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＩＰＹＲ）の６タンパク質で高い相関が確認されることを見出した。
　また、高感受性細胞株と低感受性細胞株において発現しているタンパク質の発現量に差のあるタンパク質を表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）で検討した。なお、発現量に差のあるタンパク質を広く探索するために、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにおいては、陽イオン用、陰イオン用両方のチップを使用し、マトリックスとして高分子用のＳＰＡ（ＥＡＭ：５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ　ａｃｉｄの飽和溶液）と低分子用のＣＨＣＡ（α―シアノ―４―ヒドロキシケイ皮酸）を用いて検討した。また、細胞内タンパク質抽出工程では、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるためにラバーポリスマンで剥がさずそのまま細胞溶解液を用い細胞内タンパク質を抽出した。その結果、高感受性細胞株と低感受性細胞株において、細胞内発現量に違いのあったタンパク質について推定される分子量及び等電点の情報を得た。これらのタンパク質をデータベース検索することで、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　５Ａ（ＣＯＸ５Ａ）を同定した。また、高感受性細胞株および低感受性細胞株の細胞抽出液の二次元電気泳動を行い、推定される分子量及び等電点の範囲にあり、かつ発現量に差のあるスポットを見出し、そのスポットをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで解析し、データベースで検索することで、Ｒｅｔｉｎｏｌ‐ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＣＲＢＰ１）を同定した。
　かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該タンパク質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが、抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、これら物質の発現変動を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１６〕の発明を提供するものである。
〔１〕ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。
〔２〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔３〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔１〕又は〔２〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔４〕がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法。
〔５〕さらに、前記測定結果を対照レベルと比較することにより、当該がん患者の抗がん剤に対する感受性を判定する工程を含む〔４〕記載の判定方法。
〔６〕生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である〔４〕又は〔５〕記載の判定方法。
〔７〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔４〕～〔６〕のいずれかに記載の判定方法。
〔８〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔４〕～〔７〕のいずれかに記載の判定方法。
〔９〕がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする〔４〕～〔８〕のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
〔１０〕抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
〔１１〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１０〕記載のスクリーニング方法。
〔１２〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔１０〕又は〔１１〕記載のスクリーニング方法。
〔１３〕〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
〔１４〕〔１３〕記載の感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合わせてなるがん治療用組成物。
〔１５〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１４〕記載のがん治療組成物。
〔１６〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩である〔１４〕又は〔１５〕記載のがん治療用組成物。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤感受性を治療開始前もしくは治療開始後早期に適確に判定できる結果、治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となる。さらに効果が得られない抗がん剤の使用を回避できるため不必要な副作用を回避できる。また、抗がん剤を用いた治療スケジュールは長期に及ぶため、治療継続中においても治療サイクルごとに抗がん剤感受性を判定することにより、そのがんに対する抗がん剤の感受性の経時的評価が可能となり、治療を継続すべきか否かの判定ができる。その結果、治療効果の得られない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、患者の負担軽減、医療費の削減にもつながる。
　さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。
２Ｄ－ＤＩＧＥの結果を示す。図中の枠は、選び出した１６スポットを示す。 ＰＨＢの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 Ｃ１ＱＢＰの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 ＡＮＸＡ５の発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 ＡＮＸＡ１の発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 ＴＡＬＤＯの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 ＩＰＹＲの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。 候補タンパク質ＡのＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ結果を示す。 候補タンパク質Ａの等電点の予測を示す。 候補タンパク質ＢのＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ結果を示す。 候補タンパク質Ｂの等電点の予測を示す。 ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで推定された分子量と等電点を同定するために行ったＬ－ＯＨＰ高感受性株と低感受性株に対する二次元電気泳動の結果を示す。 ｍ／ｚ　１５，８５０（ＣＲＢＰ１）のウエスタンブロットとＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの各種ピーク強度解析結果の比較を示す。 ｍ／ｚ　１２，５０６（ＣＯＸ５Ａ）のウエスタンブロットとＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの各種ピーク強度解析結果の比較を示す。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａの８種のタンパク質である。これらタンパク質は、後記実施例に示すように、抗がん剤に高感受性の細胞株と低感受性の細胞株において発現しているタンパク質の発現量の差を２Ｄ－ＤＩＧＥ又はＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて検討した結果、ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａの４タンパク質では、高感受性株で発現量が増大していることが判明した。また、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲの４タンパク質では、低感受性株で発現量が増大していることが判明した。従って、これら８タンパク質は、抗がん剤感受性判定マーカー、特にオキサリプラチンの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　ＰＨＢは、がん抑制遺伝子であること（特開平５-２７１２９４号公報）、前立腺がんマーカーとして使用できること（特開２０１２-１９６２１１号公報）は知られているが、抗がん剤の感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＰＨＢの濃度が上昇することは全く知られていない。
　ＡＮＸＡ５およびＡＮＸＡ１は、泌尿生殖管、腸管のがんの診断等に使用され得る（特表２００８-５４５６３４号公報）が、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１の濃度が上昇することは全く知られていない。
　ＴＡＬＤＯは、がんマーカーについての報告はなく、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＴＡＬＤＯの濃度が上昇することは全く知られていない。
　Ｃ１ＱＢＰは、腎細胞がんの診断マーカーとして使用できること（特表２００６-５１４５５４号公報）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣ１ＱＢＰの濃度が上昇することは全く知られていない。
　ＩＰＹＲは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで結腸直腸がんを診断する方法に使用できること（特表２００８-５０２８８９号公報）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＩＰＹＲの濃度が上昇することは全く知られていない。
　ＣＲＢＰ１は、乳がんや大腸がんにおいてレチノールによる細胞増殖抑制作用を助長すること（Ｋａｌｅａｇａｓｉｏｇｌｕ　Ｆ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（１９９３）４３（４）：４８７－９０）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣＲＢＰ１の濃度が上昇することは全く知られていない。
　ＣＯＸ５Ａは、マウス大腸がんモデルにおいて、癌細胞でその発現が正常細胞に比べて低いこと（Ｙａｓｕｉ　Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｃａｒｃｉｎｏｇ（２００９）８：１０）は知られている。また、前記特許文献３の段落（００６８）にて、ＣＯＸ５Ａは、タンパク質Ｇの候補の一つとして挙がっている。しかし、特許文献３においてタンパク質Ｇは、抗がん剤低感受性細胞株で高感受性株に比べてその濃度が上昇しており、本願とは逆の結果を示しているので、特許文献３のタンパク質ＧはＣＯＸ５Ａでないと考えられる。このため、ＣＯＸ５Ａが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣＯＸ５Ａの濃度が上昇することは全く知られていないと言える。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばオキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン又はその塩が好ましい。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、がん患者由来の生体試料（検体）中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定すること、詳細にはさらに当該測定結果を対照レベル（標準濃度、抗がん剤投与前の本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの濃度等）と比較すること、により行うことができる。
　ここで、がん患者としては、がんを有する被験者又はがんを有していた被験者が包含される。生体試料としては、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
　また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に胃がん、膵がん及び大腸がん（結腸・直腸がん）に対して好適に利用でき、特に大腸がんに好適に利用できる。
　検体中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子の測定手段は、例えば電気泳動法（２Ｄ－ＤＩＧＥなど）、質量分析法（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなど）、免疫学的測定法（イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡなど）等により測定可能である。
　ここで２Ｄ－ＤＩＧＥ及びＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる測定は後記実施例に記載の方法によって行うことができる。また、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどの質量分析法による測定は、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子を、常法に従って定量分析することによって測定することができる。また、免疫学的測定法においては、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子に対する抗体を用いる測定法が好ましい。用いるＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子に対する抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。より具体的には、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはウエスタンブロット又はエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ）である。
　ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲは、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前又は投与後早期の段階において、がん患者由来の生体試料中のＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及び／又はＩＰＹＲの量、例えば濃度を測定すればよい。濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性であると判定できるため、これら抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。一方、濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が行われたり、続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できるのに加え、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
　ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａは、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前又は投与後早期の段階において、がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及び／又はＣＯＸ５Ａの量、例えば濃度を測定すればよい。濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性であると判定できるため、これら抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。一方、濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が行われたり、続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できるのに加え、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
　本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子を測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の測定試薬、及びプロトコール（測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等）が含まれる。当該基準には、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
　また、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現変動を指標とすることにより抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能となる。
　すなわち、がん細胞株又は担癌動物に抗がん剤及び試験物質を添加又は投与し、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現量を遺伝子レベル又はタンパク質レベルで測定する工程、及び当該発現量の変動に基づいて、前記がん細胞株又は担癌動物の前記抗がん剤に対する感受性を亢進する試験物質を選択する工程を行うことにより、前記抗がん剤に対する感受性亢進剤をスクリーニングすることができる。
　例えば、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲについて、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてこれらのタンパク質の発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でこれらのタンパク質の濃度を低下させる物質は、当該がん細胞株の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ　ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、これらのタンパク質の濃度を低下させる物質は、当該担癌動物の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　また、例えば、ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａについて、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてこれらのタンパク質の発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でこれらのタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該がん細胞株の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ　ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、これらのタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該担癌動物の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
　ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン又はその塩が好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
試験例１
ヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定
（１）方法
（ａ）使用細胞
　ヒト大腸癌細胞株９種類（ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１及びＷｉＤｒ）は、以下（表１）より入手した。
　培養は、φ１００ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）、培地（Ｄ－ＭＥＭ、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ｂ）薬剤
　オキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）原末は、和光純薬工業および株式会社ヤクルト本社より入手した。
（ｃ）ヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定方法
　前記９種類のヒト大腸癌細胞株を、９６ｗｅｌｌプレートに１５００個／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後にオキサリプラチンを添加した。薬剤曝露４８時間後の細胞生存率をＭＴＳ　ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TM　ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価し、吸光度からＩＣ50値を求めた。薬剤曝露条件はＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの１１条件を用いた。感受性の評価は、１回の試験においてそれぞれの細胞株、薬剤曝露時間、薬剤曝露条件について３サンプルずつ測定し、異なる継代数の細胞にて３回実施した。解析は、ＭＴＳ　ａｓｓａｙの結果から算出した生存率をもとに行った。
（２）結果
　ＩＣ50値は、表２に示す値となった。表２より、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏをオキサリプラチン高感受性株、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１５をオキサリプラチン中感受性株、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１及びＷｉＤｒをオキサリプラチン低感受性株と分類した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１
２Ｄ－ＤＩＧＥによるオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
（１）使用細胞
　試験例１にてオキサリプラチン高感受性株として分類したＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏ、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したＨＴ２９、ＤＬＤ-１及びＷｉＤｒを使用した。
（２）細胞内タンパク質抽出方法
　ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液（２Ｍ　ｔｈｉｏｕｒｅａ，　７Ｍ　Ｕｒｅａ，　４％　ＣＨＡＰＳ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ９）を加え細胞を溶解し、１．５ｍＬマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。２Ｄ　Ｑｕａｎｔ　ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で５ｍｇ／ｍＬに調製した後、分注して分析するまで－８０℃にて保存した。
（３）ＣｙＤｙｅTM　ＤＩＧＥ　Ｆｌｏｕｒ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｄｙｅｓによるタンパク質の標識
　ＣｙＤｙｅ　ＤＩＧＥ　ｆｌｕｏｒｓ，ｍｉｎｉｍａｌ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞内タンパク質を標識した。それぞれの細胞溶解液５０μｇに対し４００ｐｍｏｌの試薬（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）で標識し、十分に混和した。遠心機で軽く遠心し、４℃暗所で３０分間静置した。１０ｍＭリジンを添加し反応を停止した。溶液を混和し、軽く遠心して４℃暗所で１０分間静置した。使用まで－８０℃にて保存した。
（４）等電点電気泳動（一次元目）
　各ゲルにアプライしたサンプルを表３に示す。
　内部標準は全ての細胞溶解液を等量ずつ混和したものを使用した。
　それぞれのゲル用に、（３）で標識したタンパク質サンプルを５０μｇ（１２μＬ）ずつ１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、混和した。３６μＬの２ｘサンプルバッファー（２Ｍ　ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ　ｕｒｅａ、４％　ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３－１０、２％　Ｄｅｓｔｒｅａｋ　Ｒｅａｇｅｎｔ）を混和したタンパク質サンプルに添加し、氷上で１０分間静置した。各サンプル１５０μｇ溶液を膨潤液（２Ｍ　ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ　ｕｒｅａ、４％　ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３－１０、１％　Ｄｅｓｔｒｅａｋ　Ｒｅａｇｅｎｔ）で４５０μＬに調整し、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心した。各ストリップホルダーにサンプルの上清を４５０μＬ加え、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｐＨ３－１０ＮＬ，２４ｃｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をストリップホルダーに設置した後、Ｅｔｔａｎ　ＩＰＧｐｈｏｒ２を使用して、等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動の条件を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（二次元目）
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に２４ｃｍの１５％アクリルアミドゲルを作成した。一次元目泳動済みのＩｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐを１０ｃｍ　ｄｉｓｈに入れ、平衡化バッファーＡ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８、６Ｍ　Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．２５％ＤＴＴ、ＢＰＢ）で満たし１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化バッファーＢ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８、６Ｍ　Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、４．５％ヨードアセトアミド、ＢＰＢ）に変え１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化したＩｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐをＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルに設置し、泳動層（Ｔｒｉｓ/Ｔｒｉｃｉｎ/ＳＤＳ　ｂｕｆｆｅｒ）にて７ｍＡで泳動した。
　Ｔｙｐｈｏｏｎ　Ｔｒｉｏ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で撮影し、ＤｅＣｙｄｅｒ　２Ｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｖｅｒ６．５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析し、Ｐ＜０．００１で、かつ、発現量の差が１．３倍以上のスポットを解析した。
（６）スポットの回収
　標識していない内部標準１５０μｇを（４）、（５）同様に二次元電気泳動した。
　次に（５）で得られたスポットを回収するために、ゲルをＰｌｕｓＯｎｅTM　Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で銀染色した。
　まず、ゲルにＦｉｘｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０％　Ｅｔｈａｎｏｌ、１０％　Ｇｌａｃｉａｌ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を２５０ｍＬ添加し、６０分間静置した。この作業を２回繰り返し、ゲルを固定した。固定したゲルに、Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０％　Ｅｔｈａｎｏｌ、４％　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｔｈｉｏｓｕｌｐｈａｔｅ（５％　ｗ/ｖ）、６．８％　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ）を２５０ｍＬ添加して１２０分間静置することでゲルを増感させ、Ｍｉｌｌｉ－ＱTM水により、８分間洗浄し、当該洗浄を５回繰り返した。洗浄したゲルに、Ｓｉｌｖｅｒ　ｓｏｌｕｔｏｎ　（１０％　Ｓｉｌｖｅｒ　ｎｉｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２．５％　ｗ/ｖ））を２５０ｍＬ添加して６０分間銀反応させ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水にて１分間洗浄し、当該洗浄を４回繰り返した。洗浄後のゲルにＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｓｏｌｕｉｏｎ（２．５％Ｓｏｄｉｕｍ　ｃａｒｂｏｎａｔｅ、０．０８％　ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（３７％　ｗ/ｖ））を２５０ｍＬ添加して、２～５分間現像し、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．４６％　ＥＤＴＡ－Ｎａ２・２Ｈ2Ｏ）を２５０ｍＬ添加して、４５分間静置し、反応を止めた。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で３０分間洗浄し、当該洗浄を２回繰り返した後、解析する目的のスポットをスポットペッカー（Ｇｅｎｅ　Ｗｏｒｌｄ）で採取し、１．５ｍＬマイクロチューブに４スポットずつ移した。
（７）スポットの解析
　（６）までの操作で回収された１６スポット（図１の枠）について、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析（ＭＳ／ＭＳ測定）を行い、得られた結果についてＭＡＳＣＯＴデータベース検索を行った。
　データベース検索の結果、Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ（ＰＨＢ）、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ａ５（ＡＮＸＡ５）、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ａ１（ＡＮＸＡ１）、Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ（ＴＡＬＤＯ）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　１Ｑ　ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ１ＱＢＰ）、及びＩｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＩＰＹＲ）の６種類が同定された。
実施例２
　６タンパク質の大腸癌細胞株中での発現量とＩＣ50値との相関
　実施例１にて同定された６タンパク質について、試験例１にて使用した９種類の大腸癌細胞株中での発現量と試験例１で算出したＩＣ50値との相関を確認した。
（１）方法
（ａ）使用細胞
試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株を使用した。
（ｂ）細胞内タンパク質の抽出
　ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液（９Ｍ　Ｕｒｅａ，　２％　ＣＨＡＰＳ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ９）を加え細胞を溶解し、１．５ｍＬマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。ＢＣＡ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で５ｍｇ／ｍＬに調製した後、分注して分析するまで－８０℃にて保存した。
（ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ
　１０％アクリルアミドゲルに試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株をそれぞれ１０μＬ/Ｌａｎｅ（５０μｇ/Ｌａｎｅ）添加し、泳動層（Ｔｒｉｓ/Ｇｌｙｃｉｎ/ＳＤＳ　ｂｕｆｆｅｒ）にて、１枚２０ｍＭでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。セミドライ式ブロッター（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い１枚当たり７２ｍＡ、３０分間にて、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にｔｒａｎｓｆｅｒを行い、５％　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ／ＴＢＳ－Ｔ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　Ｔｗｅｅｎ２０）を用い室温で一時間ｂｌｏｋｋｉｎｇし、表５に示した一次抗体を添加し、４℃、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔで反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄後、表６に示す二次抗体を添加し、室温で一時間振盪させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、ＥＬＣ　Ｐｒｉｍｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を反応させ、ＬＡＳ４０００　ｍｉｎｉ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で撮影し解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）結果
　ＰＨＢ及びＣ１ＱＢＰは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が多く、低感受性株で発現量が少なく、高い正の相関を示した（図２、図３）。
　ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が少なく、低感受性株で発現量が多く、高い負の相関を示した（図４～図７）。
実施例３
ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いたオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
（１）方法
（ａ）使用細胞
　試験例１にてオキサリプラチン高感受性株として分類したＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏ、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したＨＴ２９、ＤＬＤ-１及びＷｉＤｒを使用した。
（ｂ）細胞内タンパク質の抽出
　実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出、と同様の方法で行った。
（ｃ）タンパク質発現解析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製、細胞内タンパク質の発現解析
　細胞溶解バッファーをｐＨ４の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（以下、ｐＨ４バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、ｐＨ４バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、３０分インキュベートして反応させた後、ｐＨ４バッファーにて３回洗浄、ｍｉｌｌｉＱ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（高分子側の確認用としてＳＰＡ（ＥＡＭ：５０％ ＡＣＮ／０．５％ ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄの飽和溶液）を、低分子側の確認用としてＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）を使用）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
　また、前記同様に、ｐＨ８の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ）（以下、ｐＨ８バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、ｐＨ８バッファーにて前処理した陰イオン交換チップアレイ（Ｑ１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、１時間インキュベートして反応させた後、ｐＨ８バッファーにて３回洗浄、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＡＭ及びＣＨＣＡを使用）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
　タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）にて行った。分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐT M Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ＰＣＳ４０００ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。
　マトリックスとしてＳＰＡを使用した場合、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ １０，０００～５０，０００ Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ １８，０００ Ｄａｌｔｏｎ,Ｅｎｅｒｇｙ４，０００ ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ の条件にて分析を行った。
　マトリックスとしてＣＨＣＡを使用した場合、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ ２，０００～２０，０００ Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ ７，７００ Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ １，５００ ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ の条件にて分析を行った。
　ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｎ比）５以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ T M Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒ ３．０ を用いて行った。
（ｄ）候補ピークの選択
　オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際に、ｐ＜０．００１で発現量に違いのあったピークを最終的に２種類抽出した（候補タンパク質Ａ及びＢ）。また、ｐＨの変動による発現量の変動から候補タンパク質Ａ及びＢの等電点を推定した。
（２）結果
　チップとしてＣＭ１０を使用した際に見出された候補タンパク質Ａは、図８に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Ａは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のｐ値は、ｐ＝７．９×１０-6であり、ｍ／ｚ　１５８４７Ｄａ、等電点（ＰＩ）４．５～５．５（図９）であった。
　また、チップとしてＱ１０を使用した際に見出された候補タンパク質Ｂは、図１０に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Ｂは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のｐ値は、ｐ＝１．０×１０-4であり、ｍ／ｚ　１２５０６Ｄａ、等電点（ＰＩ）４．０～５．０（図１１）であった。
　前記で得られた候補タンパク質Ｂについて、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ解析で得られた分子量と等電点から、データベース（Ｓｗｉｓｓ　Ｐｒｏｔ；スイス生物情報科学機構）を使用してタンパク質Ｂを推測した結果、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｖａ（ＣＯＸ５Ａ）（分子量１２，５０１、等電点４．８８）が候補タンパク質Ｂと推定された。
実施例４
候補タンパク質Ａの二次元電気泳動による解析
　候補タンパク質Ａの同定を目的として、さらに二次元電気泳動による解析を行った。
　オキサリプラチン高感受性株であるＳＷ４８０及び低感受性株であるＷｉＤｒを用いて、実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で細胞内タンパク質を抽出し、５ｍｇ／ｍＬに調整した後、分析するまで－８０℃にて保存した。
　細胞溶解液５０μｇを膨潤液（２Ｍ　ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ　ｕｒｅａ、４％　ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３－１０、１％　Ｄｅｓｔｒｅａｋ　Ｒｅａｇｅｎｔ）で１２５μＬに調整した。調整したサンプル溶液を４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｇｅｌ（ｐＨ３～１０　ｎｏｎ―ｌｉｎｅａｒ、１３ｃｍ、ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス）に添加し、ゲルの膨潤を行った後、等電点電気泳動を行った。電気泳動の条件を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　等電点電気泳動終了後、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｇｅｌを１０ｍＬチューブに入れ、平衡化バッファーＡ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８、６Ｍ　Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．２５％ＤＴＴ、ＢＰＢ）で満たし１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化バッファーＢ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８、６Ｍ　Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、４．５％ヨードアセトアミド、ＢＰＢ）に変え１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化の終了したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ ｇｅｌを２０ｍＡの定電流にて電気泳動を行った。ゲルは１０～２０％、１６×１６ｃｍポリアクリルアミドグラジェントゲル（バイオクラフト）を用いた。
　次に得られたスポットを回収するために、ゲルをＰｌｕｓＯｎｅ　ＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で銀染色した。銀染色によるスポットの回収は、実施例１（６）スポットの回収、と同様の方法で行った。
　実施例３で得られた候補タンパク質Ａに関する情報（分子量及び等電点）に基づき、二次元電気泳動にて展開したゲル上の分子量１０，０００～３０，０００Ｄａ及び、およそｐＨ４．５～６．５の範囲に分離されたスポット（図１２の枠内）を対象とし、これらの中からＳＷ４８０とＷｉＤｒを比較した際に発現量に差のある８スポットを選択し、これらのスポットを回収した。
　回収したスポットについて、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析（ＭＳ／ＭＳ測定）を行い、得られた結果についてＭＡＳＣＯＴデータベース検索を行った。
　データベース検索の結果、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｔｉｎｏｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＣＲＢＰ１）（分子量１５，８５０、等電点４．９９）が同定された。これは、分子量、等電点ともにほぼ一致することから、候補タンパク質Ａと推定された。
実施例５
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔによるタンパク質発現の確認
（１）ＣＲＢＰ１の確認
　実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株の細胞内タンパク質を抽出後、１５％ポリアクリルアミドゲルに１レーンあたりタンパク量５０μｇをａｐｐｌｙし、２０ｍＡ定電流にてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。泳動後、ドライブロッティングシステム（ｉＢｌｏｔＴＭ 、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行った後、抗ＣＲＢＰ１モノクローナル抗体（ｓｃ－５３９８９、ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ）（×１／２００）を、内在性タンパク質については抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｍｂｉｏｎ）（×１／１００００）を用いて一次抗体反応を行った。アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（×１／２００００）と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてＣＤＰ－ＳｔａｒT M ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ、富士フィルム）により検出した。ブロッキング試薬、二次抗体および反応基質はＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅT M 、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
　オキサリプラチン高感受性株におけるＣＲＢＰ１の発現は、抗ＣＲＢＰ１抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された（図１３）。
（２）ＣＯＸ５Ａの確認
　一次抗体として、抗ＣＯＸ５Ａモノクローナル抗体（ｓｃ－３７６９０７、ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ）（×１／２００添加）を使用した以外は、前記（１）ＣＲＢＰ１の確認と同様の方法で行った。その結果、オキサリプラチン高感受性株におけるＣＯＸ５Ａの発現は、抗ＣＯＸ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された（図１４）。
実施例６
ｓｉＲＮＡの導入によるヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の変化
（１）方法
（ａ）使用細胞
　試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株のオキサリプラチン高感受性株としてＬｓ１７４Ｔを、中感受性株としてＨＣＴ１１６を、低感受性株としてＨＴ２９及びＤＬＤ－１を使用した。
（ｂ）薬剤
　試験例１記載のオキサリプラチン原末を使用した。
（ｃ）ヒト大腸癌細胞株へのｓｉＲＮＡの導入
　前記ヒト大腸癌細胞株を、６ｗｅｌｌのプレートに１×１０5個／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地（Wako, 044-29765）に交換した。１ｗｅｌｌあたり、１５０ｐｍｏｌの表８に示した各ｓｉＲＮＡを２５０μＬ Ｏｐｔｉ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｎｏ．３１９９８５）に溶解した溶液、及び４．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．１３７７８－１５０）と２５０μＬ Ｏｐｔｉ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｎｏ．３１９９８５）を混合した溶液を混合し、１０～２０分間インキュベートした。インキュベート後、ヒト大腸癌細胞株を培養した６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに５００μＬずつ添加し、添加して４～６時間後に各ｗｅｌｌを、血清を添加したＤＭＥＭ培地（Wako, 044-29765）に交換した。ｓｉＲＮＡ添加後２４時間後に細胞を回収した。
　また、使用したヒト大腸癌細胞株と導入したｓｉＲＮＡの組み合わせを表９に示した。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡは、life technologies社のNo. 4390843を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（ｄ）ｓｉＲＮＡを導入したヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定方法
　試験例１（１）（ｃ）記載の方法で、ｓｉＲＮＡを導入したヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定（ＩＣ50値の測定）を行った。
（２）結果
（ａ）ＰＨＢ　ｓｉＲＮＡ
　結果を表１０に示す。ｓｉＲＮＡ導入により、ＰＨＢをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、ＰＨＢがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例２の結果とも一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（ｂ）ＡＮＸＡ５　ｓｉＲＮＡ
　結果を表１１に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＡＮＸＡ５をノックアウトしたＨＣＴ１１６、ＨＴ２９の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＡＮＸＡ５がオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（ｃ）ＴＡＬＤＯ　ｓｉＲＮＡ
　結果を表１２に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＴＡＬＤＯをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＴＡＬＤＯがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（ｄ）Ｃ１ＱＢＰ　ｓｉＲＮＡ
　結果を表１３に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＣ１ＱＢＰをノックアウトしたＨＣＴ１１６は、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、Ｃ１ＱＢＰがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例２の結果とも一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（ｅ）ＩＰＹＲ　ｓｉＲＮＡ
　結果を表１４に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＩＰＹＲをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔは、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＩＰＹＲがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

Claims (16)

  1. 　ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。
  2. 　抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項１記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  3. 　抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項１又は２記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  4. 　がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法。
  5. 　さらに、前記測定結果を対照レベルと比較することにより、当該がん患者の抗がん剤に対する感受性を判定する工程を含む請求項４記載の判定方法。
  6. 　生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である請求項４又は５記載の判定方法。
  7. 　抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項４～６のいずれかに記載の判定方法。
  8. 　抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項４～７のいずれかに記載の判定方法。
  9. 　がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項４～８のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
  10. 　抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
  11. 　抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項１０記載のスクリーニング方法。
  12. 　抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項１０又は１１記載のスクリーニング方法。
  13. 　請求項１０～１２のいずれかに記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
  14. 　請求項１３記載の感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合わせてなるがん治療用組成物。
  15. 　抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項１４記載のがん治療組成物。
  16. 　抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩である請求項１４又は１５記載のがん治療用組成物。
PCT/JP2015/073868 2014-08-26 2015-08-25 抗がん剤の感受性の判定マーカー WO2016031816A1 (ja)

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