JP5548694B2

JP5548694B2 - 抗がん剤の感受性の判定方法

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Publication number: JP5548694B2
Application number: JP2011538507A
Authority: JP
Inventors: 祐介谷川原; 小夜鈴木; 祐介生駒; 章戸西牟田; 哲也鈴木; 伸二杉本
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd; Keio University
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd; Keio University
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: EP2495569A4; EP3081941A1; EP2495569A1; CN105699638A; EP3081941B1; US20120214831A1; CN102597779A; US8765713B2; CN102597779B; WO2011052749A1; CN105699638B; EP2495569B1; JPWO2011052749A1

Description

本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。

抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤には、がんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。

オキサリプラチン（ＳＰ−４−２）−［（１Ｒ，２Ｒ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，２−ｄｉａｍｉｎｅ−κＮ，κＮ’］［ｅｔｈａｎｅｄｉｏａｔｏ（２−）−κＯ¹，κＯ²］ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＵＰＡＣ）は第三世代白金錯体系抗悪性腫瘍薬である。作用機序は先行薬剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）やカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）と同様、ＤＮＡ塩基との架橋形成によるＤＮＡ合成阻害、蛋白合成阻害と考えられているが、ＣＤＤＰやＣＢＤＣＡが無効な大腸癌に対してもオキサリプラチン（Ｌ−ＯＨＰ）は抗腫瘍効果を示し、従来の白金錯体系抗悪性腫瘍薬とは異なる抗腫瘍スペクトルを示す。アメリカでは２００４年１月にフルオロウラシル（５−ＦＵ）／レボホリナート（ＬＶ）との併用で転移性結腸・直腸癌のファーストライン治療として承認されており、日本においても２００５年４月、「治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌」に対するレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用（ＦＯＬＦＯＸ４法）にて薬価収載された。進行再発大腸癌の治療は、１９９０年代前半まで行なわれていた５−ＦＵ／ＬＶ療法での生存率は１０〜１２ヶ月であったのに対し、オキサリプラチンを加えたＦＯＬＦＯＸ療法での生存期間は１９．５ヶ月とほぼ２倍にまで到達している。さらに２００９年８月には、同じくレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用による「結腸癌における術後補助化学療法」が効能・効果として追加され、大腸癌患者での使用拡大と有益性が期待できる薬剤である。

しかし、それでもなお進行再発大腸癌に対するＦＯＬＦＯＸ療法の奏効率は５０％程度であり、換言すれば治療を受けた患者の半数は効果が得られていないことを意味する。また、オキサリプラチンの使用により好中球減少症のほか高頻度の末梢神経障害を呈し、これは致死的副作用ではないものの治療継続を困難にする因子ともなっている。したがって、治療開始前に効果の期待できる患者（レスポンダー）と、効果の期待できない患者（ノンレスポンダー）を予測し、治療反応性を早期に診断できるバイオマーカーにより、有効性と安全性の高い化学療法が実現する。

プラチナベースの化学療法に対する感受性／耐性因子に関する報告は多いが、それらはシスプラチンを対象としたものが多く、構造的・機能的に関連するオキサリプラチンの治療反応性については主に、
１）オキサリプラチンによりもたらされる損傷ＤＮＡの除去・修復能の亢進
２）細胞内におけるオキサリプラチン（活性化体）の不活化（解毒）
３）オキサリプラチンの細胞内蓄積量の低下
などが関与していると考えられている。大腸癌患者を対象にしたオキサリプラチン＋５−ＦＵ併用療法における治療反応性や予後予測因子として１）〜３）と関連する研究が行われている。

１）に関しては、ヌクレオチド除去修復（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ：ＮＥＲ）に重要な役割を果たすＥｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｇｒｏｕｐ１（ＥＲＣＣ１）について、腫瘍内ＥＲＣＣ１遺伝子発現量が予後因子であるとする報告（非特許文献１）や、ＥＲＣＣ１の一塩基多型（ＳＮＰ）の一つであるＣ１１８ＴについてＣ／Ｃホモ接合体を有する患者では、少なくとも１つ以上のＴアレルを有する患者よりも良好な生存率が報告されている（非特許文献２）。ＸｅｒｏｄｅｒｍａｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍＤ（ＸＰＤ、ＥＲＣＣ２としても知られている）ではＬｙｓ７５１Ｇｌｎのアミノ酸変異を伴う遺伝多型が腫瘍縮小率や生存期間に関与するとの報告がなされている（非特許文献２、３）。塩基除去修復（ｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ：ＢＥＲ）においては、アルキル化剤への曝露などにより形成されるＤＮＡ一本鎖切断の効率的な修復に関わると考えられているタンパク質をコードするＸ−ｒａｙｒｅｐａｉｒｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｇｒｏｕｐ１（ＸＲＣＣ１）のＡｒｇ３９９Ｇｌｎのアミノ酸変異を伴う遺伝多型と腫瘍縮小効果との関係が報告されたが（非特許文献４）、同じ患者を対象としたその後の解析により臨床予後には影響しないことが報告されている（非特許文献２）。シスプラチンへの感受性低下にはＤＮＡミスマッチ修復（ＤＮＡｍｉｓｍａｔｃｈｒｅｐａｉｒ：ＭＭＲ）も関与していると考えられているが、ｉｎｖｉｔｒｏの検討ではオキサリプラチンによるＤＮＡ損傷部位の修復にＭＭＲは関与しないことが報告されている（非特許文献５）。

２）に関して、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）は解毒・代謝の第ＩＩ相反応を担う酵素の一つであり、ＤＮＡ白金付加体とｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅとの抱合体形成を触媒することで、薬剤を不活化する。ＧＳＴサブタイプのうち、ＧＳＴＰ１は大腸癌での発現量が高く、Ｉｌｅ１０５Ｖａｌのアミノ酸変異を伴う遺伝多型と生存期間が関連する（生存期間の中央値：Ｉｌｅ／Ｉｌｅ７．９ヶ月、Ｉｌｅ／Ｖａｌ１３．３ヶ月、Ｖａｌ／Ｖａｌ２４．９ヶ月）ことが報告されている（非特許文献６）。

３）に関しては、培養細胞を用いた検討では、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴｓ）がオキサリプラチンの細胞内への輸送と感受性に関与することが報告されている他（非特許文献７）、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂなどの銅や重金属の輸送に関与するトランスポーターと感受性との関連についても報告されている（非特許文献８、９）。ただし、これらの発現とオキサリプラチン治療反応性との関連について臨床的検討は行なわれていない。

ＦＯＬＦＯＸ療法を受けた進行大腸癌患者を対象とした最近の臨床研究においては、ＥＲＣＣ１の遺伝多型（Ａｓｎ１１８Ａｓｎ）とＸＰＤの遺伝多型（Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ）が独立して無増悪期間（ＰＦＳ）と関連することが報告されているが、ＧＳＴＰ１（Ｉｌｅ１０５Ｖａｌ）についてはＰＦＳとの関連は見出されず、オキサリプラチン誘発神経毒性と関連する傾向が認められている（非特許文献１０）。

Ｉｎｖｉｔｒｏの検討では、白金錯体系の先行薬剤であるシスプラチンの耐性関連因子については数多くの報告がなされており、オキサリプラチンについてもＦＡＳ／ＦＡＳＬ、Ｂｃｌ−ｘＬなどのアポトーシス関連因子との関連も報告されている（非特許文献１１、１２）。しかし、オキサリプラチンはシスプラチンとはがん種により異なる治療反応性を示すことに加え、オキサリプラチンの細胞障害活性を担う白金ＤＮＡ付加体に対するがん細胞の細胞応答はほとんど解明されておらず、オキサリプラチンを用いた化学療法に対する治療反応性を予測し得る明確なバイオマーカーは未だ確立されていない。

フルオロウラシルは、１９５７年に開発されたフッ化ピリミジン系抗癌剤であり、今なお消化器癌化学療法の基本となる薬剤である。がん細胞に取り込まれたフルオロウラシルは、活性代謝物ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ−５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦｄＵＭＰ）によるｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）の阻害が惹起するＤＮＡ合成阻害を主たる作用機序とする他、同じく活性代謝物である５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＵＴＰ）によるＲＮＡ機能障害などにより殺細胞効果を発揮する。

フッ化ピリミジン系抗癌剤の治療応答性の予測についてはこれまで多くの研究がなされているが、とくにフルオロウラシルの分解酵素であるｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＤＰＤ）と活性代謝物の標的酵素であるｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）についての報告が多い。フルオロウラシル異化代謝の律速酵素であるＤＰＤを高発現している腫瘍ではフルオロウラシル耐性であることが報告されているが（非特許文献１３）、臨床検体を用いての検証報告は多くはない。ＴＳ発現については、酵素活性、タンパク質及びＲＮＡレベルなどの測定法によらず、その多寡がフッ化ピリミジン系抗癌剤の治療効果規定因子となり得ることが報告されている（非特許文献１４、１５）。しかし、すべての報告において必ずしも一致する結果は得られておらず、さらにフルオロウラシルに対する治療反応性を治療早期に予測する明確なバイオマーカーは知られていない。

また、フルオロウラシル耐性の転移性大腸癌患者において、腫瘍内ＥＲＣＣ１及びＴＳのｍＲＮＡ発現量が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用療法に対する治療反応性予測因子となることも報告されている（非特許文献１６）。しかし最近の、進行性大腸癌患者を対象とした化学療法に対する治療反応性バイオマーカーに関する大規模前向き臨床試験（ＦＯＣＵＳＴｒｉａｌ）の報告では、ＥＲＣＣ１は５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用療法の有意な効果予測因子とはならず、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ−１（Ｔｏｐｏ１）のみが弱い関連を示したのみであった（非特許文献１７）。このことは、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用療法によって高い治療効果が期待できる患者を確実に見出すことができるバイオマーカーは未だ確立されていないことを示している。さらに、一般にがん化学療法の治療スケジュールは長期に渡るため、治療継続中における抗がん剤に対する感受性の経時的モニターは治療継続の是非の判定を可能とし、患者負担や副作用軽減につながるのみならず医療経済の観点からも有用であると考えられる。個々の患者における治療反応性を予測、そして早期に診断して適切な薬剤や治療レジメンを選択する「個別化治療」実現のためには、５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、及び５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の効果予測もしくは治療応答性の早期診断を可能とするバイオマーカーの確立は急務である。

Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９，４２９８−４３０４（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ９１，３４４−３５４（２００４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６１，８６５４−８６５８（２００１）ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．２１，３０７５−３０７９（２００１）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６，４８８１−４８８６（１９９６）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９４，９３６−９４２（２００２）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６６，８８４７−８８５７（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６，２５−３２（２００４）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１０，４６６１−４６６９（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，１２４７−１２５４（２００７）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１１，４７７０−４７７４（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４６１１３−４６１２１（２００４）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ２００４；４０：９３９−９５０．ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔＲｅｖｉｅｗｓ２００２；２８：２７−４７．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００４；２２：５２９−５３６．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００１；１９：４２９８−４３０４．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００８；２６：２６９０−２６９８．

本発明の目的は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。

そこで本発明者らは、ヒトがん細胞株を培養し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いて網羅的に解析することにより、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行なった。５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、及び両者の併用（５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ）に対して高感受性、低感受性を示す２種類のヒト大腸癌細胞に対して、５−ＦＵ単剤、Ｌ−ＯＨＰ単剤、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用にて曝露し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を検討した。その結果、５−ＦＵ曝露後に、高感受性細胞と低感受性細胞において、細胞内発現レベルの異なる経時的変化が認められるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０であることを見出した。
同様に、Ｌ−ＯＨＰ曝露後に、高感受性細胞と低感受性細胞において、細胞内発現レベルの異なる経時的変化が認められるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
さらに、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後に、高感受性細胞と低感受性細胞において、細胞内発現レベルの異なる経時的変化が認められるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０であることを見出した。
また、高感受性細胞と低感受性細胞において、薬剤曝露前の細胞内発現レベルが異なるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該タンパク質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが、５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、或いは５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用療法に対して感受性を有するか否かを判定できること、また、これらの物質の発現変動を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ａという）、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｂという）、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｃという）、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｄという）、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｅという）、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｇという）、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｈという）、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｉという）、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｊという）、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｋという）、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｌという）、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｍという）、及びｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｎという）から選ばれるタンパク質からなる抗がん剤感受性判定マーカーを提供するものである。
また、本発明は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０（以下、タンパク質Ｆという）からなる、フルオロウラシル又はその塩、又はフルオロウラシル又はその塩とオキサリプラチン又はその塩との組み合わせからなる抗がん剤の感受性判定マーカーを提供するものである。
また、本発明は、検体中の上記のタンパク質Ａ〜Ｎを測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、検体中の上記のタンパク質Ａ〜Ｎを測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
さらに本発明は、上記のタンパク質Ａ〜Ｎの発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物を提供するものである。
さらに本発明は、抗がん剤感受性を判定するための上記タンパク質Ａ〜Ｎを提供するものである。

本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤感受性を治療開始前もしくは治療開始後早期に適確に判定できる結果、治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となる。さらに効果が得られない抗がん剤の使用を回避できるため不必要な副作用を回避できる。また、抗がん剤を用いた治療スケジュールは長期に及ぶため、治療継続中においても治療サイクルごとに抗がん剤感受性を判定することにより、そのがんにおける抗がん剤に対する感受性の経時的評価が可能となり、治療を継続すべきか否かの判定ができる。その結果、治療効果の得られない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、患者の負担軽減、医療費の削減にもつながる。
さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。

ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用に対する生存率（％）を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ａの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｂの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｃの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｄの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｅの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｆの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１におけるＬ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｇの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｈの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｉの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｊの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｋの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１におけるウエスタンブロット法を用いたＳ１００Ａ１０の検出を示す図である。ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後のタンパク質Ｍの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。

本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、タンパク質Ａ〜Ｎであり、より詳細には表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）において、陽イオン交換チップを用いてｐＨ４．５の条件で、それぞれ質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ａ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｂ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｃ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｄ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｅ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｆ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｇ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｈ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｉ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｊ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｋ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｌ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｍ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｎ）である。

後記実施例に示すように、タンパク質Ｆは、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０であることが判明している。Ｓ１００Ａ１０は、カルシウム結合ＥＦ−ｈａｎｄモチーフをもつＳ１００タンパク質ファミリーの一員として知られている。さらに、Ｓ１００Ａ１０は、自身のダイマーと、アネキシンＡ２（Ａｎｎｅｘｉｎ−２、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩ、ＬｉｐｏｃｏｒｔｉｎＩＩ、ＣａｌｐａｃｔｉｎＩｈｅａｖｙｃｈａｉｎ、Ｃｈｒｏｍｏｂｉｎｄｉｎ−８、ｐ３６、ＰｒｏｔｅｉｎＩ、ＰｌａｃｅｎｔａｌａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＩＶ、ＰＡＰ−ＩＶ）のダイマーによりヘテロテトラマーを形成することも知られていることから、アネキシンＡ２もＳ１００Ａ１０と同様に、抗がん剤感受性の判定マーカーとして使用できる可能性がある。

タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋは、後記実施例に示すように、培養がん細胞の細胞内タンパク質の発現をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて検討した結果、５−ＦＵ曝露後、５−ＦＵに対して低感受性であるＤＬＤ−１で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、５−ＦＵに対して高感受性であるＨＣＴ１１６では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

タンパク質Ｄ、Ｍは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ曝露後、５−ＦＵに対して高感受性であるＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下が認められた。一方、５−ＦＵに対して低感受性であるＤＬＤ−１では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ｄ、Ｍは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｋは、後記実施例に示すように、Ｌ−ＯＨＰ曝露後、Ｌ−ＯＨＰに対して低感受性であるＤＬＤ−１で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、Ｌ−ＯＨＰに対して高感受性であるＨＣＴ１１６では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｋは、抗がん剤感受性判定マーカー、特にＬ−ＯＨＰの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
なお、タンパク質Ｆ（カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０）がＬ−ＯＨＰの抗がん剤感受性判定マーカーとして利用できることは、本発明者らによる先行出願（ＷＯ２００９／９６１９６号国際公開パンフレット）で既に明らかになっており、今回の実施例でも同様の結果が得られた。

タンパク質Ｄ、Ｍは、後記実施例に示すように、Ｌ−ＯＨＰ曝露後、Ｌ−ＯＨＰに対して高感受性であるＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下が認められた。一方、Ｌ−ＯＨＰに対して低感受性であるＤＬＤ−１では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ｄ、Ｍは、抗がん剤感受性判定マーカー、特にＬ−ＯＨＰの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用に対して低感受性であるＤＬＤ−１で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用に対して高感受性であるＨＣＴ１１６では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。前記のようにタンパク質ＦがＬ−ＯＨＰの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用であることは知られていたが、当該タンパク質Ｆが５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の抗がん剤感受性マーカーとして有用であることは今回初めて得られた知見である。

タンパク質Ｅ、Ｇは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰに対して高感受性であるＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰに対して低感受性であるＤＬＤ−１では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ｅ、Ｇは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

タンパク質Ｄ、Ｍは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰに対して高感受性であるＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下が認められた。一方、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰに対して低感受性であるＤＬＤ−１では顕著な相違は認められなかった。従って、タンパク質Ｄ、Ｍは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

タンパク質Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｎは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用のいずれに対しても高感受性であるＨＣＴ１１６における薬剤曝露前（非曝露時）の細胞内レベルが、上記いずれの薬剤に対しても低感受性であるＤＬＤ−１と比較して有意に高い値を示した。従って、タンパク質Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｎは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用時の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。

本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばオキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎＣ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうちフッ化ピリミジン系抗がん剤、白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にフルオロウラシル、オキサリプラチン又はそれらの塩が好ましい。さらに、フルオロウラシル又はその塩と、オキサリプラチン又はその塩との併用剤において好適に利用することができる。

本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、検体中のタンパク質Ａ〜Ｎを測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者（がん患者）由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。

また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に胃がんや結腸・直腸がんに対して好適に利用できる。

検体中のタンパク質Ａ〜Ｎの測定手段は、例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、免疫学的測定法等により測定可能である。

ここでＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる測定は後記実施例に記載の方法によって行うことができる。また、免疫学的測定法においては、抗タンパク質Ａ〜Ｎ抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。用いる抗タンパク質Ａ〜Ｎ抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。より具体的には、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはウエスタンブロット又はエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ）である。

タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵである場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のこれらのタンパク質濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるタンパク質の濃度が上昇した場合は、そのがんは抗がん剤感受性ではなく、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質の濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。つまり、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋの濃度が投与後早期の段階において所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。
また、投与後早期の段階において、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋの濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｋについて対象とする抗がん剤がＬ−ＯＨＰである場合、また、タンパク質Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｈ〜Ｋについて対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合も上記と同様に抗がん剤に対する感受性を判定することができる。

タンパク質Ｄ、Ｍについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵである場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のタンパク質濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるタンパク質の濃度が低下した場合は、そのがんは抗がん剤感受性であり、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質の濃度が変化しない、もしくは上昇した場合には、そのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。つまり、タンパク質Ｄ、Ｍの濃度が投与後早期の段階において所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。
また、投与後早期の段階において、タンパク質Ｄ、Ｍの濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
タンパク質Ｄ、Ｍについて、対象とする抗がん剤がＬ−ＯＨＰである場合、また、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合も上記と同様に抗がん剤に対する感受性を判定することができる。

タンパク質Ｅ、Ｇについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のこれらのタンパク質濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるタンパク質の濃度が上昇した場合は、そのがんは抗がん剤感受性であり、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質の濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。つまり、タンパク質Ｅ、Ｇの濃度が投与後早期の段階において所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。
また、投与後早期の段階において、タンパク質Ｅ、Ｇの濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。

また、タンパク質Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｎについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前のがん患者由来の生体試料中のこれらのタンパク質濃度を測定し、これらのタンパク質の濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、抗がん剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
また、これらのタンパク質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者を積極的に選出するためのマーカーとしても使用できる。

なお、タンパク質Ｂ、Ｈについて、抗がん剤投与中のマーカーとしては、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質の濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性であると判定でき、抗がん剤投与前のマーカーとしては、所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合には、そのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。抗がん剤の投与中、或いは抗がん剤の投与前でマーカーとしての位置づけが異なるため、その点を留意して使用することが好ましい。

本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のタンパク質Ａ〜Ｎを測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、タンパク質Ａ〜Ｎの測定試薬、測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等が含まれる。当該基準には、タンパク質Ａ〜Ｎの標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。

タンパク質Ａ〜Ｄ、Ｆ、Ｈ〜Ｋ、Ｍについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵである場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてタンパク質の発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でタンパク質の濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、タンパク質の濃度の低下を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。タンパク質Ａ〜Ｄ、Ｇ〜Ｋ、Ｍについて対象とする抗がん剤がＬ−ＯＨＰである場合、また、タンパク質Ａ〜Ｄ、Ｆ、Ｈ〜Ｋ、Ｍについて対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合も上記と同様に抗がん剤感受性亢進剤をスクリーニングすることができる。

タンパク質Ｅ、Ｇについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてタンパク質の発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、タンパク質の濃度の上昇を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。

また、タンパク質Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｎについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰの併用である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてタンパク質の発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の非存在下でタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前において、タンパク質の濃度の上昇を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。

かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎＣ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうちフッ化ピリミジン系抗がん剤、白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にフルオロウラシル、オキサリプラチン又はそれらの塩が好ましい。さらに、フルオロウラシル又はその塩と、オキサリプラチン又はその塩との併用剤を好適に利用することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１
（１）方法
（ａ）使用細胞
ヒト大腸癌細胞株２種類（ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−１）は、ＥＣＡＣＣより入手した。培養は、φ１００ｍｍ／ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）、培地（Ｄ−ＭＥＭ、２ｍＭＧｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下にて行なった。

（ｂ）薬剤
フルオロウラシル（５−ＦＵ）はＳｉｇｍａ社より購入し、オキサリプラチン（Ｌ−ＯＨＰ）原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。

（ｃ）５−ＦＵ、Ｌ−ＯＨＰ、及び５−ＦＵとＬ−ＯＨＰ併用時（５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ）における感受性の評価
２種類の大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１を用い、薬剤曝露２４時間後と４８時間後の細胞生存率をＭＴＳａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６^TMＡＱ_ueous ＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価した。薬剤曝露条件は５−ＦＵ単剤としてＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ、１００００μＭの１１条件、Ｌ−ＯＨＰ単剤としてＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの１１条件を用いた。併用としては５−ＦＵの２μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの４濃度それぞれに、Ｌ−ＯＨＰの０．０１μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの９濃度を加えた３６条件、及び各併用条件と同濃度の５−ＦＵ単剤として４条件とＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）を用いた。感受性の評価は、１回の試験においてそれぞれの細胞株、薬剤曝露時間、薬剤曝露条件について３サンプルずつ測定し、異なる継代数の細胞にて３回実施した。
解析は、ＭＴＳａｓｓａｙの結果から算出した生存率をもとに行った。併用効果の有無の判定は、併用時における生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）と、併用時に用いたのと同濃度での各薬剤の単剤曝露時における生存率とを比較し、双方から有意に生存率が低下していれば併用効果があると判定した。

（ｄ）薬剤曝露実験
前記（ｃ）の結果にもとづき、曝露実験に用いる薬剤濃度は、５−ＦＵ＋Ｌ−ＯＨＰの併用として２μＭ＋１μＭ、２μＭ＋１０μＭ、１００μＭ＋１μＭ、１００μＭ＋１０μＭの４種類、これら併用曝露で用いるのと同じ濃度の各薬剤単独曝露として５−ＦＵは２μＭ、１００μＭ、Ｌ−ＯＨＰは１μＭ、１０μＭ、及びこれらに薬剤フリーのＣｏｎｔｒｏｌを加えた全９条件で曝露実験を行った。薬剤曝露時間は曝露直前（０時間）、４時間、１２時間、２４時間、４８時間の５通りとし、曝露終了時点における細胞数を計測し、細胞内タンパク質を抽出した。

（ｅ）細胞内タンパク質の抽出
ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、ラバーポリスマンにて剥がしてかき集め、細胞懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに移した。４℃にて１，２００×ｇ、１０分間遠心して細胞を集め、上清を除いた後に、細胞数１０００万個あたり２００μＬの細胞溶解バッファー（９ｍｏｌ／ＬＵｒｅａ、２％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ））を加え、氷冷下で超音波破砕処理を行なった後、４℃にて１６，０００×ｇ、２０分間遠心し、上清を液体窒素にて急速凍結後、分析するまで−８０℃にて保存した。上清の一部を用いてタンパク質定量（ＤＣＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を行なった。

（ｆ）タンパク質発現解析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製、細胞内タンパク質の発現解析
細胞溶解バッファー（プロテアーゼインヒビターを除く）にて２．５ｍｇ／ｍＬに調製し、さらに、ｐＨ４．５の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）（以下、バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、同バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、１時間インキュベートして反応させた後、バッファーにて３回洗浄、ｍｉｌｌｉＱ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙａｂｓｏｒｂｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＡＭ：５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃａｃｉｄの飽和溶液）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行なった。
タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）にて行なった。分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ^TM Ｒｅａｄｅｒ（ＭｏｄｅｌＰＣＳ４０００ＰｅｒｓｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、ＭａｓｓＲａｎｇｅ０〜７０，０００Ｄａｌｔｏｎｓ、ＦｏｃｕｓＭａｓｓ８，０００Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ３０００もしくは４０００ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓの条件にて分析を行なった。ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｎ比）２以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ^TM ＤａｔａＭａｎａｇｅｒ３．０を用いて行なった。

（ｇ）候補ピークの選択
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分析の結果、Ｓ／Ｎ比２以上の条件で各サンプルにつき８８〜１４３個のタンパク質ピークを抽出した。まず、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ^TM ＤａｔａＭａｎａｇｅｒ３．０によりピーククラスターを作成した。次に、各条件において、薬剤曝露後に経時的に有意にピーク強度が変化しているピークと、各曝露時間（４、１２、２４、４８時間）において、薬剤曝露条件によってピーク強度が有意に変化しているピークをピックアップした。さらに、両者に共通して検出されるピーク、すなわち曝露時間による発現変化と薬剤条件による発現変化のいずれをも認めるピークを絞り込んだ。

（２）結果
（ａ）ＨＣＴ−１１６及びＤＬＤ−１における薬剤感受性の評価
１００μＭの５−ＦＵにて４８時間曝露後の細胞生存率は、ＨＣＴ１１６で約２４％、ＤＬＤ−１で約４９％となり、ＤＬＤ−１がＨＣＴ１１６に比べ５−ＦＵ低感受性であることが確認された。１μＭのＬ−ＯＨＰにて４８時間曝露後の細胞生存率は、ＨＣＴ１１６で約３７％、ＤＬＤ−１で約８２％となり、ＤＬＤ−１がＨＣＴ１１６に比べＬ−ＯＨＰ低感受性であることが確認された。５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用については、５−ＦＵ２μＭ＋Ｌ−ＯＨＰ１μＭの２４時間曝露後、及び５−ＦＵ１００μＭ＋Ｌ−ＯＨＰ１０μＭの４８時間曝露後において、ＨＣＴ１１６では各々の単剤曝露時よりも併用時において有意に低い細胞生存率を示し併用効果が認められたが、ＤＬＤ１では有意な併用効果は認められなかった。したがって、ＨＣＴ１１６は５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用に対する高感受性細胞、ＤＬＤ−１は低感受性細胞であることが確認された。（図１）。

（ｂ）タンパク質発現解析
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いたプロテオーム解析手法により、５−ＦＵ曝露、あるいはＬ−ＯＨＰ曝露、あるいは５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露に伴う細胞内タンパク質の変動を網羅的に解析した。（１）方法で示した手法により解析した結果、各薬剤曝露後に特徴的な変動を示す以下のタンパク質を見出した。

（５−ＦＵ）
５−ＦＵ曝露後の細胞内タンパク質の経時的変化について解析した結果、
（１）５−ＦＵ曝露後の細胞内レベルが、ＤＬＤ−１でのみ上昇、あるいはＨＣＴ１１６と比較してＤＬＤ−１でより大きな上昇が認められたピーク（図２、図３、図４（ア）、図７（ア）、図９、図１０、図１１（ア）、図１２）
・ｍ／ｚ５，３００〜５，４００（タンパク質Ａ）
・ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）
・ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０（タンパク質Ｃ）
・ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）
・ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）
・ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０（タンパク質Ｉ）
・ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０（タンパク質Ｊ）
・ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０（タンパク質Ｋ）
（２）５−ＦＵ曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下が認められたピーク（図５（ウ）、図１４）
・ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０（タンパク質Ｄ）
・ｍ／ｚ９，１００〜９，２００（タンパク質Ｍ）

（Ｌ−ＯＨＰ）
Ｌ−ＯＨＰ曝露後の細胞内タンパク質の経時的変化について解析した結果、
（１）Ｌ−ＯＨＰ曝露後の細胞内レベルが、ＤＬＤ−１でのみ上昇、あるいはＨＣＴ１１６と比較してＤＬＤ−１でより大きな上昇が認められたピーク（図２、図３、図４（イ）、図７（イ）、図８（ア）、図９、図１０、図１１（ウ）、図１２）
・ｍ／ｚ５，３００〜５，４００（タンパク質Ａ）
・ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）
・ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０（タンパク質Ｃ）
・ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）
・ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０（タンパク質Ｇ）
・ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）
・ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０（タンパク質Ｉ）
・ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０（タンパク質Ｊ）
・ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０（タンパク質Ｋ）
（２）Ｌ−ＯＨＰ曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下を認めたピーク（図５（ア）、図１４）
・ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０（タンパク質Ｄ）
・ｍ／ｚ９，１００〜９，２００（タンパク質Ｍ）

（５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ）
５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後の細胞内タンパク質の経時的変化について解析した結果、
（１）５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ曝露後の細胞内レベルが、ＤＬＤ−１でのみ上昇、あるいはＨＣＴ１１６と比較してＤＬＤ−１でより大きな上昇が認められたピーク（図２、図３、図４（ウ）、図７（ウ）、図９、図１０、図１１（イ）、図１２）
・ｍ／ｚ５，３００〜５，４００（タンパク質Ａ）
・ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）
・ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０（タンパク質Ｃ）
・ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）
・ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）
・ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０（タンパク質Ｉ）
・ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０（タンパク質Ｊ）
・ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０（タンパク質Ｋ）
（２）５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められたピーク（図６、図８（イ））
・ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００（タンパク質Ｅ）
・ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０（タンパク質Ｇ）
（３）５−ＦＵ／Ｌ−ＯＨＰ併用曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの低下が認められたピーク（図５（イ）、図１４）
・ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０（タンパク質Ｄ）
・ｍ／ｚ９，１００〜９，２００（タンパク質Ｍ）

（薬剤曝露前における細胞内レベル）
薬剤曝露前（非曝露時）の細胞内レベルが、ＤＬＤ−１と比較してＨＣＴ１１６で有意に高値を示したピーク
・ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）
・ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０（タンパク質Ｌ）
・ｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０（タンパク質Ｎ）
・ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）
タンパク質Ｂにおける薬剤曝露前の細胞内レベルは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析によるピーク強度（μＡ）（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝２７）として、ＨＣＴ１１６では５５．４±９．２、ＤＬＤ−１では２８．９±６．４、同様にタンパク質Ｌでは、ＨＣＴ１１６
８８．２±２．２、ＤＬＤ−１３２．１±１．３、タンパク質Ｎでは、ＨＣＴ１１６
８５．１±９．３、ＤＬＤ−１５０．６±６．０、タンパク質Ｈでは、ＨＣＴ１１６
１５．５±２．１、ＤＬＤ−１３．８６±１．３４であり、いずれもＨＣＴ１１６における薬剤曝露前（非曝露時）細胞内レベルはＤＬＤ−１よりも有意に高値を示した。

実施例２
実施例１において見出されたすべてのピークに関して、分子量既知の標準物質として、ＩｎｓｕｌｉｎｏｘｉｄｉｚｅｄＢｃｈａｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ）（ｍ／ｚ３４９６．９４＋１Ｈ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ）（ｍ／ｚ５７３３．５１＋１Ｈ）、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ（ｅｑｕｉｎｅ）（ｍ／ｚ１２３６０．９６＋１Ｈ）、Ａｐｏｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（ｅｑｕｉｎｅ）（ｍ／ｚ１６９５２．２７＋１Ｈ）、Ａｌｄｏｒａｓｅ（ｒｅａｂｂｉｔｍｕｓｃｌｅ）（ｍ／ｚ３９２１２．２８＋１Ｈ）を用い、各目的ピークを挟む２種類の標準物質の分子量２点を用いた分子量補正（ｉｎｔｅｒｎａｌｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）によりｍ／ｚの確認を行った。その結果、実施例１において見出されたピークは、それぞれ、ｍ／ｚ５，３００〜５，４００（タンパク質Ａ）、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０（タンパク質Ｃ）、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０（タンパク質Ｄ）、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００（タンパク質Ｅ）、ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０（タンパク質Ｇ）、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０（タンパク質Ｉ）、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０（タンパク質Ｊ）、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０（タンパク質Ｋ）、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０（タンパク質Ｌ）、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００（タンパク質Ｍ）、ｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０（タンパク質Ｎ）の間に検出されることを確認した。

実施例３
実施例１において見出されたすべてのピークに関して、その性質をさらに詳細に調べるために、ｐＨの変化に伴うピーク強度の変化について検討を行った。

（１）方法
（ａ）検討に用いたプロテインチップアレイとバッファー条件
陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、ｐＨ３．０（５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ３．５（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．０（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．５（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．０（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．５（５０ｍＭｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．０（５０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．５（５０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．０（５０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．５（５０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．０（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．５（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．０（５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．５（５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ１０．０（５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ）の１５種類のバッファーを用いた。

（ｂ）ＣＭ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製と分析条件
ＣＭ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製は、（ａ）の各バッファーを用いて実施例１の（１）方法前記（ｆ）に準じて実施した。

（２）結果
ＣＭ１０チップアレイを用いた分析において、ピーク強度の低下を認めるｐＨがそのタンパク質のイオン化が失われる等電点（ｐＩ）付近と判断できる。その結果、実施例１で検出したピークの等電点（ｐＩ）は、
・ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０（タンパク質Ｃ）ではｐＨ３．５〜６．５、
・ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００（タンパク質Ｅ）ではｐＨ４．０〜７．０、
・ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）ではｐＨ７．０〜８．０、
・ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０（タンパク質Ｇ）ではｐＨ４．５〜７．５
・ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｈ）ではｐＨ５．０〜８．０、
・ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０（タンパク質Ｉ）ではｐＨ６．５〜９．５、
・ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０（タンパク質Ｊ）ではｐＨ３．５〜６．５、
・ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０（タンパク質Ｋ）ではｐＨ３．０〜６．５
・ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０（タンパク質Ｌ）ではｐＨ４．５〜７．０
・ｍ／ｚ９，１００〜９，２００（タンパク質Ｍ）ではｐＨ４．５〜７．５
・ｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０（タンパク質Ｎ）ではｐＨ４．５〜７．５
がｐＩ付近に相当すると推定された。ｍ／ｚ５，３００〜５，４００（タンパク質Ａ）、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０（タンパク質Ｂ）、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０（タンパク質Ｄ）では、ピーク強度が低下するｐＨが明確ではなかった。

実施例４
実施例１で見出されたピークについて、実施例２及び３の情報にもとづき、ＴｈｅＥｘＰＡＳｙｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｓｅｒｖｅｒのＴａｇＩｄｅｎｔｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）を用いてデータベース検索を行った。その結果は以下のとおりであった。

データベース検索の結果、ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）では１種類のタンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＳ１００−Ａ１０）のみがヒットした。タンパク質Ｆ（カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０）がＬ−ＯＨＰの抗がん剤感受性判定マーカーとして利用できることは、本発明者らによる先行出願（ＷＯ２００９／９６１９６号国際公開パンフレット）で既に明らかになっているが、今回の実施例により、Ｌ−ＯＨＰ感受性の治療前予測のみならず治療開始後早期に治療反応性を判定するマーカーとなること、また、５−ＦＵ単剤や５−ＦＵとＬ−ＯＨＰの併用時にも使用できるマーカーとなることが確認された。

実施例５
実施例４のデータベース検索の結果、ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）では１種類のタンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＳ１００−Ａ１０）のみがヒットしたことから、ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における発現を確認した。
１）方法
ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１について、実施例１と同様の方法により細胞内タンパク質を抽出後、１００Ｖ定電圧にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動後、ＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行なった後、抗Ｓ１００Ａ１０モノクローナル抗体（ＰｕｒｉｆｉｅｄＭｏｕｓｅＡｎｔｉ−ＡｎｎｅｘｉｎＩＩｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて一次抗体反応を行なった。アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ^TM ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ）により検出した。

（２）結果
実施例１において、ｍ／ｚ１１，０２０〜１１，１２０（タンパク質Ｆ）のＨＣＴ１１６、及びＤＬＤ−１におけるＳ１００Ａ１０の発現は、抗Ｓ１００Ａ１０モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により確認された（図１３）。

Claims

質量分析計において、ｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質からなる、フルオロウラシル、オキサリプラチン、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とオキサリプラチン又はその塩との組み合わせから選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカー。
フルオロウラシル、オキサリプラチン、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とオキサリプラチン又はその塩との組み合わせから選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性を判定する目的で、検体中の、質量分析計において、ｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質を測定する方法。
検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項２記載の測定方法。
検体が、抗がん剤を投与された、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項２又は３記載の測定方法。
検体中の、質量分析計において、ｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の測定方法を実施するためのキット。
質量分析計において、ｍ／ｚ５，３００〜５，４００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ６，１３０〜６，２３０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，０００〜７，０８０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ７，８４０〜７，９２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，９２０〜９，０００のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１２，４４０〜１２，５６０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ１８，２９０〜１８，４７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ２４，６６０〜２４，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ３５，９８０〜３６，２９０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ８，６５０〜８，７５０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ９，１００〜９，２００のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ１１，７６０〜１１，８９０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質の発現変動を指標とする、フルオロウラシル、オキサリプラチン、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とオキサリプラチン又はその塩との組み合わせから選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性亢進剤のスクリーニング方法。
カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０からなる、フルオロウラシル若しくはその塩、又はフルオロウラシル若しくはその塩とオキサリプラチン若しくはその塩との組み合わせからなる抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカー。
フルオロウラシル若しくはその塩、又はフルオロウラシル若しくはその塩とオキサリプラチン若しくはその塩との組み合わせからなる抗がん剤の大腸がん感受性を判定する目的で、検体中のカルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０を測定する方法。
検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項８記載の測定方法。
検体が、抗がん剤を投与された、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項８又は９記載の判定方法。
検体中のカルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載の測定方法を実施するためのキット。
カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ１０の発現変動を指標とする、フルオロウラシル若しくはその塩、又はフルオロウラシル若しくはその塩とオキサリプラチン若しくはその塩との組み合わせからなる抗がん剤の大腸がん感受性亢進剤のスクリーニング方法。