CN108187053B - 基因krtap20-1的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因KRTAP20‑1的应用。人KRTAP20‑1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用。抑制KRTAP20‑1基因表达的小发卡RNA，所述的小发卡RNA的设计靶点选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7中的任意一条。人KRTAP20‑1基因作为肿瘤诊断指标在制备肿瘤诊断试剂中的应用。该基因与肿瘤的发生发展、细胞增殖、血管生成相关。本发明为进一步研究KRTAP20‑1与肿瘤的关系，以及开发抗肿瘤新药物，开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标提供了一个新的基础。

Description

基因KRTAP20-1的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因KRTAP20-1的应用。
背景技术
目前，临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗，但是，放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。
随着人们在分子水平对肿瘤的生物特性研究的深入，人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤发展进程中的不同层面进行治疗并且已经取得了令人欣喜的效果，一些能够特意地阻断肿瘤生长的生物制剂已逐渐走向临床。
肿瘤在发生进展的过程中形成了特殊的生物学功能，包括无限增殖，对生长抑制基因的逃避，细胞凋亡抑制，诱导血管生成及激活侵袭与转移。在这些生物学特征形成的过程中，相关编码基因扮演着重要的角色。
生物基因靶向治疗是一种具有突破性意义的靶向性生物基因治疗方法，将给肿瘤癌症患者带来新生的希望。这一划时代的生物基因靶向治疗将大大减少患者在治疗中的副作用，减轻痛苦，在提高生活质量的同时，使生命得以有效延长。
发现在肿瘤发生进展过程中起决定性作用的基因，是肿瘤早期诊断，恶性进展评估及预后评估，开发有效生物基因靶向治疗药物的必要条件。
目前国内外在肿瘤相关基因的各方面做了大量的研究工作，并且针对性的开发了相关靶向药物，在肿瘤治疗方面取得了一定的进展，在治疗乳腺癌、肺癌方面疗效尤为突出。但是，对于其他肿瘤的治疗疗效仍然不令人满意，在脑胶质瘤的治疗放面，生物基因靶向治疗还处于空白。
发明内容
本发明目的在于提供基因KRTAP20-1的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明所述的基因KRTAP20-1(keratin associated protein 20-1，KAP20.1)来源于人，仅在Pubmed gene库中有该基因序列的报告，是具有下述基因序列的mRNA:GeneID:337975；位于人染色体21q22.11，外显子1；属于KRTAP20家族.长度:56；质量(Da):6,202。
人KRTAP20-1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用；所述的肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤。
人KRTAP20-1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人KRTAP20-1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人KRTAP20-1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。
将人KRTAP20-1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物具体是指:将KRTAP20-1基因作为RNA干扰作用的靶标,研制能针对该基因的肿瘤治疗药物或制剂,从而降低肿瘤细胞内KRTAP20-1基因的表达水平。
所述将人KRTAP20-1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物具体是指:将人KRTAP20-1基因作为作用对象,对药物进行筛选,以找到可以影响(抑制)人KRTAP20-1基因表达的药物,然后作为肿瘤治疗备选组合物药物。如本发明所述的KRTAP20-1基因的小发卡RNA可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外,诸如抗体药物,小分子药物等也可将人KRTAP20-1基因及其蛋白作为作用对象。
本发明的所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制人KRTAP20-1基因的转录或翻译,或能够特异性抑制人KRTAP20-1基因的表达或活性的分子,从而降低肿瘤细胞人KRTAP20-1基因的表达水平,达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化、存活的目的。
本发明制备或筛选的肿瘤治疗药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药(例如抑制剂)、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等。
本发明的KRTAP20-1基因表达的蛋白，或表达它们的细胞可以作为抗原用来生产抗体，在临床上用于肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等，还可用于KRTAP20-1相关分子机制的研究。所述抗体可以是单克隆抗体，或多克隆抗体，还包括嵌和、单链和人源化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可用现有的方法，如免疫动物、培养杂交瘤方法，制备KRTAP20-1单克隆和多克隆抗体。该抗体可以用于检测本发明KRTAP20-1的存在或水平。
抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA，所述的小发卡RNA的设计靶点选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7中的任意一条。
所述的小发卡RNA优选是由具有下述序列的正义链和反义链组成的任一个互补双链RNA:1、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44
靶序列：GCAACTATTATGGTGGCTATG(SEQ ID NO.1)
正义链:5’CACCGCAACTATTATGGTGGCTATGTTCAAGAGACATAGCCACCATAATAGTTGCTTTTTTG 3’(SEQ ID NO.2)
反义链:5’GATCCAAAAAAGCAACTATTATGGTGGCTATGTCTCTTGAACATAGCCACCATAATAGTTGC 3’(SEQ ID NO.3)
2、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137
靶序列：GCTATGGAAATGGCTACTACT(SEQ ID NO.4)
正义链:5’CACCGCTATGGAAATGGCTACTACTTTCAAGAGAAGTAGTAGCCATTTCCATAGCTTTTTTG 3’(SEQ ID NO.5)
反义链:5’GATCCAAAAAAGCTATGGAAATGGCTACTACTTCTCTTGAAAGTAGTAGCCATTTCCATAGC 3’(SEQ ID NO.6)
3、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243
靶序列：GGATTCTCATGCTGCTCTTGT(SEQ ID NO.7)
正义链:5’CACCGGATTCTCATGCTGCTCTTGTTTCAAGAGAACAAGAGCAGCATGAGAATCCTTTTTTG 3’(SEQ ID NO.8)
反义链:5’GATCCAAAAAAGGATTCTCATGCTGCTCTTGTTCTCTTGAAACAAGAGCAGCATGAGAATCC 3’(SEQ ID NO.9)
一种人KRTAP20-1基因的干扰质粒，包含编码本发明所述抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA。
所述人KRTAP20-1基因的干扰质粒，优选自：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44、pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137、pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243中的任意一种。所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44以pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1为出发质粒，含有抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA shRNA44；所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137以pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1为出发质粒，含有抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA shRNA137；所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243以pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1为出发质粒，含有抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA shRNA243。
一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物的有效成分含有降低肿瘤细胞中KRTAP20-1基因表达的分离的核酸分子、KRTAP20-1编码蛋白的抗体或抑制KRTAP20-1基因编码蛋白活性的小分子化合物；所述的肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤。
所述的降低肿瘤细胞中KRTAP20-1基因表达的分离的核酸分子选自KRTAP20-1基因的反义寡核苷酸或抑制KRTAP20-1表达的小干扰RNA或小发卡RNA、sgRNA。
所述的降低肿瘤细胞中KRTAP20-1基因表达的分离的核酸分子选自本发明所述的抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA。
所述肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤中的任意一种。
上述药物中还可含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或saline(生理盐水)或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂等。
本发明的药物可制成注射液、片剂、胶囊剂、粉剂、膏剂、纳米制剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照基因药物/寡核苷酸药物领域的方法制备。
人KRTAP20-1基因在制备肿瘤诊断试剂中的应用。所述将人KRTAP20-1基因用于制备肿瘤诊断试剂,是指将KRTAP20-1基因表达产物作为肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断试剂的制备。如该基因作为标准品用于制备肿瘤诊断试剂。
人KRTAP20-1基因作为肿瘤诊断指标在制备肿瘤诊断试剂中的应用；所述的肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤。
检测人KRTAP20-1基因表达量的试剂在制备肿瘤诊断试剂中的应用；所述的肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤。
检测人KRTAP20-1基因表达量的引物、探针或基因芯片在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
一种肿瘤诊断试剂，检测人KRTAP20-1基因表达量的引物、探针或基因芯片；所述的肿瘤选自胶质瘤，肺癌，结肠癌，肝癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤。
本发明的KRTAP20-1基因表达的蛋白，或表达它们的细胞可以作为抗原用来生产抗体，在临床上用于肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等，还可用于KRTAP20-1相关分子机制的研究。所述抗体可以是单克隆抗体，或多克隆抗体，还包括嵌和、单链和人源化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可用现有的方法，如免疫动物、培养杂交瘤方法，制备KRTAP20-1单克隆和多克隆抗体。该抗体可以用于检测本发明KRTAP20-1的存在或水平。
有益效果：
本发明的肿瘤相关编码基因KRTAP20-1具有使肿瘤恶化的功能；在小鼠成纤维细胞内稳定高表达KRTAP20-1可以明显导致该细胞的恶性转化；在qPCR检测其在细胞系中的表达结果表明，胶质瘤细胞系中的表达水平显著高于正常转化细胞系；在胶质瘤临床手术组织标本中检测其表达水平结果表明，胶质瘤组织的表达水平，在低级别和高级别的胶质瘤组织中表达量从低到高，呈逐渐上升的趋势，正常组织没有表达。肿瘤相关编码基因KRTAP20-1及其蛋白和KRTAP20-1抗体可用于肿瘤的体外诊断、预后评估。肿瘤相关蛋白KRTAP20-1及其编码基因可以作为抗肿瘤药物的靶标，如用体外表达的KRTAP20-1建立药物筛选模型，筛选可抑制KRTAP20-1表达的药物，如小分子化合物；将KRTAP20-1编码基因构建入腺病毒，逆转录病毒，或慢病毒载体中，感染细胞或实验动物，建立肿瘤的体内外模型等。本发明以KRTAP20-1编码基因为靶标设计的小发卡RNA在导入胶质瘤细胞系中后，能单独引起胶质瘤细胞系的凋亡和生长抑制，因此，其它KRTAP20-1抑制剂，如KRTAP20-1的反义寡核苷酸，均可用于治疗肿瘤。
KRTAP20-1基因与肿瘤的发生发展、细胞增殖、血管生成相关。本发明为进一步研究KRTAP20-1与肿瘤的关系，以及开发抗肿瘤新药物，开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标提供了一个新的基础。
附图说明
图1肿瘤细胞中KRTAP20-1的表达
图2 KRTAP20-1-shRNA抑制24h后U251细胞中KRTAP20-1表达
图3 KRTAP20-1-shRNA抑制48h后U251细胞中KRTAP20-1表达
图4 shRNA抑制U251细胞中KRTAP20-1表达后细胞增殖活力分析
图5 HUVEC细胞与抑制KRTAP20-1表达的U251细胞共培养后的细胞增殖能力分析
a.单独培养HUVEC细胞；b.正常U251细胞与HUVEC细胞共培养组；c.敲除KRTAP20-1的U251细胞与HUVEC细胞共培养组
图6 HUVEC细胞与抑制KRTAP20-1表达的U251细胞共培养后的细胞侵袭能力分析
a.单独培养HUVEC细胞；b.正常U251细胞与HUVEC细胞共培养组；c.敲除KRTAP20-1的U251细胞与HUVEC细胞共培养组
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1、荧光定量PCR法检测肿瘤细胞中KRTAP20-1表达
通过荧光定量PCR法检测肿瘤细胞中KRTAP20-1表达，发现下列肿瘤细胞系中均存在KRTAP20-1表达。
1.1细胞总RNA提取
肿瘤细胞系消化后种植于六孔板中培养24小时。六孔板每孔加入1mL TRIzol试剂，剧烈震荡混匀使其充分裂解，低温放置5min直至裂解液澄清透明，转移至1.5mL EP管内，注意整个裂解过程中要保持低温防止RNA降解。加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置5min后12000g/min离心15min，取上层无色水相400μL至另一EP管。再加入400μL异丙醇，充分混匀后静置10min，然后在4℃以12000g/min离心10min。弃掉上清液，加入1mL 75％的DEPC乙醇洗涤沉淀，再4℃以7400g/min离心5min，弃上清。晾干洗涤沉淀过程中的乙醇，根据沉淀的量加入适量的RNA溶解液溶解RNA沉淀。
1.2逆转录
根据Takara PrimeScript RT Master Mix(Code No.RR036A)逆转录试剂盒说明书操作，反应体系见表1-1。整个过程在冰上进行，注意要防止RNA被RNA酶降解。所有使用的EP管、镊子、枪头等实验器材均需用0.1％DEPC水泡过以灭RNA酶。将反应液混合均匀后置于PCR仪，设置程序为37℃15min，完成逆转录过程。反应结束后设置85℃加热5s以失活逆转录酶，终止反应得到cDNA用于扩增反应。
表1-1.cDNA合成体系
Figure BDA0001590495230000061
Figure BDA0001590495230000071
1.3荧光定量PCR分析
荧光定量PCR引物设计见表1-2，PCR反应体系为15μL，见表1-3。PCR反应体系于Eppendorf荧光定量仪上反应，反应条件为95℃预变性5min，然后95℃10s，58℃40s，72℃15s循环40次，72℃7min终止反应。产物双链DNA通过与SYBR GreenⅠ染料结合进行荧光定量，以GAPDH作为内参基因，mRNA的相对表达量通过公式2-ΔΔCt计算得到：
ΔCt校准样本＝PPAR(Mean Ct)1-参照基因GAPDH(Mean Ct)1
ΔCt待测样本＝PPAR(Mean Ct)2-参照基因GAPDH(Mean Ct)2
ΔΔCt＝ΔCt待测样本–ΔCt校准样本
mRNA相对表达量＝2-ΔΔCt
表1-2.荧光定量PCR引物
Figure BDA0001590495230000072
表1-3.PCR反应体系
Figure BDA0001590495230000073
1.4肿瘤细胞中KRTAP20-1的表达结果
采用荧光定量PCR法分析检测肿瘤细胞系中KRTAP20-1的表达，研究中发现，不同肿瘤细胞系中KRTAP20-1基因表达量不同，见图1。
实施例2、KRTAP20-1-shRNA转染胶质瘤U25细胞实验
2.1构建重组质粒shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)
2.1.1质粒的设计
首先从基因库获得人KRTAP20-1(gene ID：337975)的基因序列，根据RNA干扰序列的设计原则，并使用在线设计软件，设计KRTAP20-1-shRNA干扰序列各3对:shRNA44、shRNA137及shRNA243。经BLAST比对确定其特异性，最后交由上海吉玛制药技术有限公司构建shRNA。阳性对照和阴性对照亦由上海吉玛设计并合成。
1、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44
靶序列：GCAACTATTATGGTGGCTATG
正义链:5’CACCGCAACTATTATGGTGGCTATGTTCAAGAGACATAGCCACCATAATAGTTGCTTTTTTG 3’
反义链:5’GATCCAAAAAAGCAACTATTATGGTGGCTATGTCTCTTGAACATAGCCACCATAATAGTTGC 3’
2、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137
靶序列：GCTATGGAAATGGCTACTACT
正义链:5’CACCGCTATGGAAATGGCTACTACTTTCAAGAGAAGTAGTAGCCATTTCCATAGCTTTTTTG 3’
反义链:5’GATCCAAAAAAGCTATGGAAATGGCTACTACTTCTCTTGAAAGTAGTAGCCATTTCCATAGC 3’
3、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243
靶序列：GGATTCTCATGCTGCTCTTGT
正义链:5’CACCGGATTCTCATGCTGCTCTTGTTTCAAGAGAACAAGAGCAGCATGAGAATCCTTTTTTG 3’
反义链:5’GATCCAAAAAAGGATTCTCATGCTGCTCTTGTTCTCTTGAAACAAGAGCAGCATGAGAATCC 3’
4、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-shNC
靶序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT
正义链:5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3’
反义链:5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’
5、载体名称：pGPU6/GFP/Neo-homo-GAPDH
靶序列：GTATGACAACAGCCTCAAG
正义链:5’-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3’
反义链:5’-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3’
2.1.2转染方法
(1)将U251细胞，以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，无双抗培养液培养，待细胞汇合度约为80％时转染；
(2)吸取10μl shRNA(0.4ug/ul)于250μl的
Figure BDA0001590495230000091
I低血清培养基中，混匀，室温下静置5min；
(3)根据说明书推荐剂量，另吸取10μl LipofectamineTM 2000于250μl
Figure BDA0001590495230000092
I低血清培养基中，混匀后在室温下孵育5min；
(4)混合稀释好的的shRNA和LipofectamineTM 2000，室温下孵育20min，以保证转染复合物shRNA-LipofectamineTM 2000的形成。
(5)将shRNA-LipofectamineTM 2000复合物加入到6孔板中，轻轻混合，37℃、5％CO2培养箱培养；
(6)6h后更换为完全培养液，荧光倒置显微镜下观察，细胞计数，根据公式①计算转染效率。
Figure BDA0001590495230000093
2.1.3有效序列筛选
荧光定量PCR法检测U251细胞转染质粒后KRTAP20-1的表达量，筛选出KRTAP20-1抑制效果最好的shRNA序列以及抑制效果最好的时间点。
如图2所示，表明在三个KRTAP20-1-shRNA分别转染后24h后，U251细胞中KRTAP20-1的表达量。
如图3所示，表明在三个KRTAP20-1-shRNA分别转染后48h后，U251细胞中KRTAP20-1的表达量。
从筛选结果可以看出，KRTAP20-1-shRNA137、KRTAP20-1-shRNA243的抑制效果较好；抑制的最佳时间为24小时。
2.1.4MTT细胞增殖实验:
(1)将KRTAP20-1-shRNA转染U251，后24小时后收集细胞，调整细胞悬浮浓度，以1×107/孔传入96孔板，每组重复3个孔，100μL/孔，置于5％CO2，37℃孵育箱培养；
(2)培养48h后，每孔加20μL MTT(5mg/mL)，37℃孵育；
(3)4h后，弃去孔中培养液，拍干，每孔加入150μL DMSO，小心震摇，使紫蓝色甲瓒结晶完全溶解；
(4)在酶联免疫检测仪上测各孔的OD值，检测波长570nm，根据公式②计算相对存活率：
Cell viability(％)＝(OD treatment/OD control)×100％ ②
(5)实验结果如图4所示，表明U251细胞在KRTAP20-1-shRNA转染后，细胞增殖能力明显下降。
实施例3、KRTAP20-1-shRNA转染胶质瘤U251细胞促进HUVEC细胞侵袭、增殖实验
利用Transwell共培养系统对胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞进行共培养，采用侵袭力测定法和MTT法检测在不同状态的胶质瘤细胞作用下血管内皮细胞侵袭力和增殖活性的变化，观察胶质瘤细胞敲除KRTAP20-1后，对血管内皮细胞侵袭性生长及细胞活力的影响。
3.1细胞分组：
a.单独培养HUVEC细胞；b.正常U251细胞与HUVEC细胞共培养组；c.敲除KRTAP20-1的U251细胞与HUVEC细胞共培养组。
3.2应用Transwell小室间接共培养：
HUVECs接种于Transwell培养板下室，U251细胞加入Transwell培养板上室；共培养48小时后，冷PBS洗涤下室HUVECs两遍，0.25％Trypsin消化，收集细胞。用于细胞侵袭、增殖实验分析。
3.3侵袭性分析：
应用Transwell小室检测各组HUVEC细胞的侵袭性，分析KRTAP20-1对细胞共培养后，HUVECs细胞侵袭性的影响。
(1)取共培养后收集的HUVEC细胞，用无血清培养基重悬细胞、计数，调整细胞密度至0.8-1.2×106/ml。
(2)将600ul培养基加入Transwell下层小室。
(3)将200ul无血清HUVECs细胞悬液加入Transwell上层小室。
(4)37℃、5％C02饱和湿度孵育箱中培养。
(5)48小时后，取出Transwell小室，转移至预先加入4％多聚甲醛的24孔细胞培养板中，室温固定30分钟。
(6)取出Transwell小室，用棉签轻擦小室上层的非迁移细胞，转移至预先加入0.1％结晶紫的24孔细胞培养板中，确保小室滤膜浸没在结晶紫中，室温染色30分钟。
(7)取出Transwell小室，用PBS轻轻冲洗小室，显微镜下观察，随机取6个视野细胞计数，记录结果。
3.4MTT法检测细胞增殖能力：
取共培养后收集的HUVEC细胞用培养液制备单细胞悬液(2×l05/mL)接种至96孔板上，每组接种6孔，每孔接种2×104细胞。在37℃，5％CO2培养48h，每孔加入MTT试剂20μl，37℃孵育4小时，加入异丙醇，酶标仪测定，检测波长550nm，参比波长为655nm。实验结果用相对细胞存活率表示，相对细胞存活率越低放射敏感性越高。
相对存活率(％)＝【实验孔A值/未照射对照孔A值】×100％。
3.5实验结果：
HUVEC细胞与抑制KRTAP20-1表达的U251细胞共培养后，HUVEC细胞的增殖(图5)、侵袭(图6)能力均下降，提示KRTAP20-1可促进胶质瘤细胞诱导血管内皮细胞的增殖，对胶质瘤血管生成具有促进作用。
以上实施例说明，KRTAP20-1在肿瘤细胞的生长增殖及血管生成中发挥重要作用，在肿瘤细胞中降低或去除KRTAP20-1的表达会抑制肿瘤细胞的生长及血管生成。
序列表
<110> 南京脑科医院
<120> 基因KRTAP20-1的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gcaactatta tggtggctat g 21
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccgcaact attatggtgg ctatgttcaa gagacatagc caccataata gttgcttttt 60
tg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatccaaaaa agcaactatt atggtggcta tgtctcttga acatagccac cataatagtt 60
gc 62
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
gctatggaaa tggctactac t 21
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgctatg gaaatggcta ctactttcaa gagaagtagt agccatttcc atagcttttt 60
tg 62
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatccaaaaa agctatggaa atggctacta cttctcttga aagtagtagc catttccata 60
gc 62
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
ggattctcat gctgctcttg t 21
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccggattc tcatgctgct cttgtttcaa gagaacaaga gcagcatgag aatccttttt 60
tg 62
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatccaaaaa aggattctca tgctgctctt gttctcttga aacaagagca gcatgagaat 60
cc 62

Claims (3)

1.抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA在制备胶质瘤治疗药物中的应用，其特征在于所述的小发卡RNA的设计靶点选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7中的任意一条;所述的小发卡RNA选自由具有下述序列的正义链和反义链组成的任一个互补双链RNA:shRNA44：正义链：SEQ ID NO.2，反义链: SEQ ID NO.3；shRNA137：正义链: SEQ ID NO.5，反义链: SEQ ID NO.6；shRNA243：正义链: SEQ ID NO.8，反义链: SEQ ID NO.9。
2.一种人KRTAP20-1基因的干扰质粒在制备胶质瘤治疗药物中的应用，其特征在于所述的人KRTAP20-1基因的干扰质粒选自 ： pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44、pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137、pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243中的任意一种；所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-44含有权利要求1中所述的shRNA44；所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-137含有权利要求1中所述的shRNA137；所述的pGPU6/GFP/Neo-KRTAP20-1-Homo-243中含有权利要求1中所述的shRNA243。
3.一种用于治疗胶质瘤的药物组合物在制备胶质瘤治疗药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物的有效成分含有权利要求1中所述的抑制KRTAP20-1基因表达的小发卡RNA或权利要求2中所述的人KRTAP20-1基因的干扰质粒。
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CN102597779A (zh) * 2009-10-30 2012-07-18 学校法人庆应义塾 抗癌剂感受性的判定方法
US20150299807A1 (en) * 2012-11-21 2015-10-22 The Johns Hopkins University Genomic classifiers for non-invasive identification of high grade prostate cancer with metastatic potential

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