CN117887851A

CN117887851A - Ccdc86作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用

Info

Publication number: CN117887851A
Application number: CN202410065904.6A
Authority: CN
Inventors: 刘羽新; 段昌柱; 吴可佳; 邵月
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2024-01-17
Filing date: 2024-01-17
Publication date: 2024-04-16

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了CCDC86作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用。本发明使用生物信息学方法分析CCDC86在肝癌中的表达以及作为标志物与肝癌患者预后的关系，实验证明CCDC86在肝癌组织中的高表达会导致预后不良，敲低CCDC86后肝癌细胞的增殖能力受到显著抑制，而质粒过表达CCDC86后肝癌细胞的增殖能力则明显增强,研究证明CCDC86可通过RUVBL1靶向Wnt/β‑catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖。本发明通过研究CCDC86与肝癌之间的关系及潜在的作用机制，从而为肝癌的早发现、早治疗以及预后提供新的方向及靶点。

Description

CCDC86作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及CCDC86作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌，是一种病死率极高的消化系统恶性肿瘤，全球发病率位居所有恶性肿瘤的前5位、病死率位列前3位。尽管近年来肝癌的诊断和治疗技术不断进步，但治疗效果仍不理想。

CCDC86(coiled-coildomain-containingprotein86)，又称为Cyclon(cytokine-inducedproteinwith coiled-coildomain)，是一种新型的细胞因子诱导的核磷蛋白，包含一个螺旋结构域，被确定为一种自主的肿瘤生长驱动因子，它与c-MYC合作，在体内促进恶性淋巴瘤的侵袭性生长。

无翅型MMTV整合位点家族成员(winglesstypeMMTVintegrationsitefamily,Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路则被发现在肝细胞再生和肝脏肿瘤发生中发挥重要的调控作用。RUVBL1(RuvB LikeAAAATPase 1)是一种高度保守真核生物ATP酶，主要分布于细胞核和细胞质内,参与DNA的修复、重组和染色体构成，调节转录，细胞生长等生理活动。在功能上RUVBL1可能作为分子伴侣与几个与癌变过程密切相关的转录调节子相互作用，例如β-catenin，c-MYC等。

虽然已有多种分子标记物参与了HCC患者的诊断、治疗和预后，但仍有许多分子蛋白未被探索，有待进一步研究。RNA结合蛋白是一类通过与不同类型的RNA相互结合来发挥作用的蛋白，能够控制核苷酸代谢和基因表达。RNA结合蛋白CCDC86已被证明其功能失调与癌症有关，但其在肝癌发展中的作用未见相关报道。

发明内容

本发明运用生物信息学技术、细胞生物学技术、生物化学与分子生物学技术以及实验动物学技术，验证了CCDC86通过调控RUVBL1激活Wnt/β-catenin信号通路，从而影响肝细胞癌的发展。基于此，本申请提供了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测生物标志物CCDC86表达的试剂在制备用于对肝癌对象进行诊断或预后的产品中的应用。

所述诊断的方法包括：从疑似患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中CCDC86的表达水平，如果较正常对照CCDC86高表达，提示对象为肝癌患者。

所述预后的方法包括：从患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中CCDC86的表达水平，分析表达水平产生风险评分，所述风险评分用于提供对象的肿瘤分级、分期及预后，CCDC86高表达患者预后较差，且总生存期、无病生存期均显著缩短。

本发明的第二方面提供了CCDC86作为靶标在筛选治疗肝癌的药物中的应用。

本发明的第三方面提供了CCDC86和RUVBL1联合共同作为靶点在筛选治疗肝癌的药物中的应用。

所述药物抑制CCDC86和/或RUVBL1的表达，从而促进肝癌细胞凋亡，进而减缓或阻止肝癌发展。

本发明的第四方面提供了CCDC86和/或RUVBL1表达抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述表达抑制剂包括siRNA和/或shRNA，

CCDC86的siRNA的核苷酸序列为：5’-AGCGTCCAAGAAGTTGAATAA-3’；

RUVBL1的siRNA的正义链的核苷酸序列为：5’-GAGAGGCATGTGGCGTCATAGTAGA-3’，RUVBL1的siRNA的反义链的核苷酸序列为：5’-CATGTGGCGTCATAGTAGAATTAAT-3’；

所述shRNA的正义链的核苷酸序列为：

5’-GATCCGAGCGTCCAAGAAGTTGAATAACTCGAGTTATTCAACTTCTTGGACGCTTTTTTTG-3’，

shRNA的反义链的核苷酸序列为：

5’-AATTCAAAAAAAGCGTCCAAGAAGTTGAATAACTCGAGTTATTCAACTTCTTGGACGCTCG-3’。

在上述的应用技术方案中，所述肝癌为肝细胞癌。

在上述的应用技术方案中，CCDC86通过RUVBL1激活Wnt/βcatenin信号通路从而影响肝癌进展。

本发明的有益效果是：

在本发明中，使用生物信息学方法分析CCDC86在肝癌中的表达以及作为生物分子标志物与肝癌患者预后的关系，再进一步验证CCDC86对肝癌细胞系的生物学功能影响。研究发现CCDC86在肝癌组织中的高表达会导致预后不良。功能方面，结合多个肝癌细胞系进行体外实验，发现敲低CCDC86后肝癌细胞的增殖能力受到显著抑制，而质粒过表达CCDC86后肝癌细胞的增殖能力则明显增强。机制方面，CCDC86可通过RUVBL1靶向Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖。本发明通过研究CCDC86与肝癌之间的关系及潜在的作用机制，从而为肝癌的早发现、早治疗以及预后提供新的方向及靶点。

附图说明

图1显示了CCDC86在HCC中表达上调且与预后不良相关：(A)在TCGA数据库中，CCDC86在肝癌样本与肝正常样本中的转录本水平；(B)CCDC86的表达与HCC患者的总生存期与无病生存期的关系用Kaplan-Meier生存曲线描yizhong述；(C)CCDC86的转录本水平与HCC肿瘤的分期与分级显著相关；(D)CCDC86在正常肝细胞和三种肝癌细胞中的表达；(E)在HPA数据库中，CCDC86蛋白在正常肝组织中和LIHC组织中的免疫组化染色。

图2显示了CCDC86在体外促进肝癌细胞增殖：(A)qRT-PCR和westernblot检测CCDC86在肝癌细胞中过表达和敲低的效率；(B-D)CCK-8测定、EdU测定、克隆形成实验用于评估细胞增殖能力(C，比例尺：100μm)；三个独立实验的数据以(A-D)中的平均±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图3显示了CCDC86促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力并介导细胞调亡：(A-B)使用Transwell测定法评估细胞迁移和侵袭能力，比例尺：200μm；(C-D)流式细胞术检测肝癌细胞的调亡能力；三个独立实验的数据以(A-D)中的平均±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4显示了CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路促进HCC的发展：(A)基因组富集分析显示，在TCGA-LIHC数据中高表达CCDC86组在Wnt/β-catenin信号通路集中显著富集；NES：标准化富集分数。FDR：错误发现率；(B)通过Spearman相关分析，CCDC86的表达与Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达成正相关；(C)qRT-PCR分析CCDC86、RUVBL1和Wnt/β-catenin信号通路相关基因的转录水平；(D-E)Westernblot检测过表达或敲低CCDC86后，RUVBL1和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平变化；三个独立实验的数据以(C-E)中的平均±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图5显示了CCDC86通过RUVBL1促进肝癌细胞生长：(A-B)Westernblot检测转染特定质粒后CCDC86、RUVBL1和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平变化；(C-G)CCK-8实验(C)、克隆形成实验(D-E)、EdU实验(F-G)测定转染特定质粒后的肝癌细胞增殖能力；(H-I)Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力，比例尺：200μm；三个独立实验的数据以(A-D)中的平均±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图6显示了CCDC86促进了体内HCC的进展：(A)异种移植肿瘤的代表性图像(n＝5)；(B)每七天计算一次肿瘤后，绘制肿瘤生长曲线(n＝5)；(C)肿瘤重量(n＝5)；(D)异种移植瘤的蛋白质水平；(E)各组荷瘤小鼠观察4周后的代表性图像。

数据以标准±平均值表示*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明的研究路线是：

(1)CCDC86在肝癌组织与正常组织中的表达差异及与临床预后之间的关系

通过整合TCGA数据库与GTEx数据库，分析CCDC86在肝细胞癌(LIHC)与正常样本之间的表达差异，与生存时间、临床分期、病理分级等临床资料的关系并在肝癌细胞内进行验证。

(2)CCDC86在肝癌细胞中的生物学功能

运用细胞计数试剂盒(Cell CountingKit-8,CCK8)、克隆形成实验和Cell-LightTMEdUDNACell ProliferationKit检测过表达或敲低CCDC86后，肝癌细胞的增殖能力；运用transwell检测过表达或敲低CCDC86后，肝癌细胞的迁移和侵袭能力，通过流式细胞术检测过表达或敲低CCDC86后，肝癌细胞的调亡能力。

(3)CCDC86在TCGA数据库的HCC组织中表达量并与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系

在TCGA数据库中，将基于CCDC86平均表达的的HCC病例分为两组，一组高表达CCDC86，另一组低表达CCDC86，并对这些数据进行GSEA富集分析。用Spearman法分析CCDC86与Wnt/β-catenin信号通路相关基因之间的相关性分析。运用qRT-PCR及westernblot检测过表达或敲低CCDC86对Wnt/β-catenin信号通路相关基因的mRNA和蛋白表达量的影响。

(4)挽救实验验证CCDC86上调RUVBL1激活Wnt/β-catenin信号通路以及促进HCC的发展

首先检测转染siRUVBL1的效率；其次，检测了在过表达CCDC86以及同时敲低RUVBL1和过表达CCDC86的Hep3B细胞中、敲低CCDC86以及同时过表达RUVBL1和敲低CCDC86的HepG2细胞中，CCDC86、RUVBL1和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平；运用细胞计数试剂盒(Cell CountingKit-8,CCK8)、克隆形成实验和Cell-LightTMEdUDNACellProliferationKit检测上述处理后肝癌细胞的增殖能力；运用transwell检测上述处理后肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

(5)CCDC86对体内细胞的作用

将过表达或敲低的CCDC86细胞注射进4周龄的裸鼠体内，验证CCDC86是否影响体内HCC的发展。

通过以上研究，得到如下结果：

(1)CCDC86在LIHC中高表达并与LIHC的不良预后相关

对TCGA中的LIHC数据集分析显示，HCC中的CCDC86转录本水平显著升高；Kaplan-Meier生存分析显示，CCDC86过表达与HCC患者的不良预后显著相关；UALCAN数据库分析显示，CCDC86转录本表达水平与肿瘤的分级和分期显著相关；CCDC86在肝癌细胞(Hep3B,HepG2)中的表达水平也显著高于正常肝细胞；HPA数据库显示：CCD86在3个肝脏正常样本中均为中等表达，而在10个肝癌样本中有4个样本为强表达，3个样本为中等表达，3个样本为弱或无表达。

(2)CCDC86在体外促进HCC的发展

qRT-PCR和westernblot实验验证CCDC86过表达或敲低的效率。CCK8、EdU和克隆形成实验表明，过表达CCDC86促进了肝癌细胞的增殖，而敲低CCDC86抑制肝癌细胞的增殖。Transwell实验证明过表达CCDC86会促进肝癌细胞的迁移和侵袭，而敲低CCDC86抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。流式细胞术实验结果显示，敲低CCDC86促进肝癌细胞的调亡。

(3)CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路促进HCC的发展

GSEA结果显示CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路调控HCC的发展，且与Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达均成正相关。在HepG2细胞中敲低CCDC86的表达后，RUVBL1及Wnt/β-catenin信号通路靶基因(TCF7,Cyclin D1andMYC)的表达水平均显著下调，GSK-3β的表达水平显著上调，而β-catenin基因转录水平变化显著性小于上述基因。为了进一步验证CCDC86与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系，我们进行了Western blot实验，结果显示CCDC86过表达显著促进了它们的表达，而CCDC86敲低显著抑制了它们的表达。表明CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路促进HCC进展的重要作用。

(4)CCDC86通过RUVBL1调控Wnt/β-catenin信号通路影响HCC的发展

RUVBL1已被证明对Wnt/β-catenin信号通路具有良好的调控作用。鉴于qRT-PCR和western blot实验结果证明CCDC86过表达显著上调RUVBL1的mRNA和蛋白水平，CCDC86敲低显著下调RUVBL1的mRNA和蛋白水平，我们猜测CCDC86也通过RUVBL1调控Wnt/β-catenin信号通路影响HCC发展。基于此，我们设计了多项挽救实验，westernblot实验结果表明敲低或过表达RUVBL1会挽救过表达或敲低CCDC86造成的Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的变化。CCK-8、克隆形成及EdU实验表明，敲低或过表达RUVBL1会挽救过表达或敲低CCDC86对肝癌细胞增殖的促进或抑制作用。Transwell实验证明敲低或过表达RUVBL1会挽救过表达或敲低CCDC86对肝癌细胞迁移和侵袭的促进或抑制作用。

(5)体内实验证明了CCDC86促进了HCC的发展

用慢病毒构建稳定转染CCDC86过表达和敲低的细胞，我们发现CCDC86敲低组相对于对照组，瘤子体积更小，重量更轻；CCDC86过表达组相对于对照组，瘤子体积更大，重量更重。

具体研究过程如下：

实施例1

1材料

1.1细胞

由中国科学院上海细胞生物学研究所提供正常的肝细胞系(LO2)和人肝癌细胞系(Hep3B和HepG2)。

1.2主要试剂

2方法

2.1细胞培养方法

2.1.1细胞培养

Hep3B和HepG2在含有10％FBS的DMEM中培养，LO2在含有10％FBS的RPMI1640中培养，在37℃下含有5％CO₂的加湿培养箱中培养。3-甲基腺嘌呤(3-MA)用二甲基亚砜(DMSO)稀释，其最终浓度为10μmol/mL。

2.1.2细胞复苏

(1)将细胞从液氮罐中迅速取出，放入密封袋密封后，在37℃水浴锅振荡，迅速融化。

(2)超净工作台紫外照射30min后通风操作，把冻存管中的细胞转移到离心管中，加入4ml含10％FBS的培养基于离心机800rpm离心5min。

(3)弃上清，在含有细胞沉淀的离心管中加入2ml培养基，吹打混匀后，转移到含有培养基的培养皿中。

2.1.3细胞冻存

(1)当细胞的密度达到了70％-80％左右时，用移液枪吸出旧培养基，PBS洗涤细胞3遍，弃去PBS。

(2)加入胰蛋白酶消化细胞，在细胞即将脱落时，弃去胰蛋白酶，加入完全培养基终止消化。

(3)8000rpm离心5min，弃去上清，加入1ml细胞冻存液并转移到标记好的冻存管。置于梯度冻存盒-80℃过夜，再将细胞转移到液氮保存。

2.1.4细胞转染

(1)当细胞密度达到60％左右时，用移液枪吸出旧培养基，加入无血清培养基。按照Lipo2000说明书所推荐的转染体系，配制A液(无血清培养基与质粒混合)和B液(无血清培养基与Lipo2000混合)，A液和B液各自在室温下静置5min，混合后室温孵育20min。

(2)将A液和B液混合液加入细胞培养皿中，摇晃均匀后置于孵箱继续培养。

(3)6h后弃去旧无血清培养基，换成完全培养基继续于孵箱培养。

2.2质粒的提取

2.2.1载体的构建

(1)pL-CMV-CCDC86由北京擎科生物科技有限公司设计合成，pcDNA3.1-h-CCDC86和pCMV-RUVBL1由上海汉恒生物设计合成。以上所有质粒都已经测序验证。

(2)敲低RUVBL1的siRNA和shRNA由上海生工合成，序列如下：

2.2.2单克隆菌落的培养与筛选

将-80℃的菌液在冰上解冻，将菌液进行四区或者五区划线，接种到LB固体培养基上，分离单菌落。接种后倒置LB固体培养基，放于37℃恒温培养箱培养24h。

2.2.3单克隆菌落的扩增

(1)在15ml无菌离心管中倒10ml含有100mg/ml抗生素的LB液体培养基，用枪头挑取活性好的单克隆菌落，并把枪头也打进LB液体培养基中。

(2)拧松瓶盖，将菌液放入恒温摇床，37℃150rpm振荡培养过夜。

2.2.4菌种的保存

(1)过夜后，观察离心管里的液体是否浑浊，若是，则拧紧离心管的盖子。

(2)4000rpm，离心10min，弃上清。

(3)加入700μl甘油吹打均匀，加入1.5ml标记好的无菌EP管中。放入-80℃冰箱保存。

2.2.5质粒的提取

(1)收集扩大培养后的菌液，4000rpm，离心10min，弃上清。

(2)向离心管内加入250μl提前预冷的Solution I。吹打混匀后在涡旋振荡器上振荡混匀。用移液枪将混匀的液体移动至1.5ml EP管中。

(3)向EP管中加入250μl提前预热的Solution II，上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温静置2-4min(不超5min防止质粒受到破坏)至溶液清敏。打开EP管管盖可以看到有拉丝现象，若无拉丝则抽提失败。

(4)在EP管内加入350μl提前预冷的solution III，上下颠倒混匀6-8次至菌液发白。加入之后需要立即混匀，以免局部结块。

(5)13000rpm离心10min，将上清液用移液枪移动至收集管中的吸附柱，静置2min。

(6)12000rpm离心10min，取出吸附柱，倒去收集中的液体，回收管体和吸附柱。

(7)向吸附柱中心加入500μl Buffer HBC,13000rpm离心1min，弃去管中的液体，回收管体和吸附柱。

(8)向吸附柱中心加入700μl DNAwashbuffer后静置1min，12000rpm离心lmin，弃去管中的液体回收管体和吸附柱。

(9)向吸附柱中心加入500μl DNAwashbuffer后静置1min，12000rpm离心lmin，弃去管中的液体回收管体和吸附柱。

(10)空柱离心13000rpm，2min，2-3次。将吸附柱取出，敞口放置于通风处/55℃烘箱4min，后将吸附柱置于新的EP管中。

(11)将吸附柱中心加入预热的，分装于1.5ml EP管中的Elution buffer(EB)/ddH₂O 50μl，室温静置1-2min，后12000rpm离心1min。

(12)弃去吸附柱后，EP管内为质粒，涡旋后测质粒浓度。

2.3细胞RNA的提取

常规方法。

2.4RNA逆转录反应

常规方法，参照试剂说明书。

2.5qPCR反应

PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的Real-Time PCR CFX96仪器中进行。

反应条件为:95℃预变性3min，95℃变性5s，58℃退火34s，4℃60s，重复38个循环。

采用2-ΔΔct法进行定量分析，每个样本设置三个副孔，实验重复三次GADPH作为内参。引物序列如下所示:

2.6Westernblot实验

2.6.1细胞总蛋白的提取

(1)将细胞从培养箱中取出，弃去旧培养基，PBS清洗细胞3次，加入1ml PBS，用细胞刮将细胞从培养皿上刮下置于EP管中，6000g离心3min，弃上清。

(2)向细胞沉淀中加入适量的含PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解15min，再进行超声破碎，样品澄清透亮后停止超声。

(3)4℃，14000rpm离心15min，收集上清。

2.6.2BCA法测蛋白浓度

(1)将BCA试剂盒中的蛋白标准品按照0、2、4、8、12、16、20μl添加到96孔板中，再在相应的孔里加入20、18、16、12、8、4、0μl灭菌蒸馏水，使蛋白标准品浓度分别是0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml。

(2)从上述步骤的蛋白样品中吸取2μl到96孔板中，再加入18μl补平至20μl体系。

(3)按照BCA工作液说明书A液：B液＝50：1配置BCA工作液。

(4)分别在含有蛋白样品的96孔板中每孔加入200μlBCA工作液。

(5)55℃放置15min，15min后酶标仪测定每孔的OD值，制备标准曲线。

(6)根据标准曲线测定样本浓度。加入1/4体积的5X loadingbuffer，配平至同浓度同体积，100℃变性10min，室温冷却后电泳上样或者-20℃保存待用。

2.6.3蛋白质免疫印迹

(1)制胶：按照所需蛋白质的分子大小，根据说明书配置适当浓度的分离胶和浓缩胶。

(2)电泳：将蛋白样品每孔按照30μg上样，在旁边空白孔加入6μl Marker。当样品在浓缩胶时，采用80V进行电泳；当样品在分离胶时，采用120V进行电泳。

(3)转膜：根据蛋白大小计算转膜时间，250mA冰浴转膜。

(4)封闭：转膜结束后，将条带放入封闭液，于低转数摇床室温封闭2-3h。

(5)一抗孵育：封闭后，TBST洗涤条带10min后放入一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜。

(6)二抗孵育：一抗孵育后，TBST洗涤条带三次，每次10min。将条带放入二抗稀释液室温孵育2h。(7)显影：将条带取出，TBST洗涤三次，每次10min。根据ECL说明书制备显影液，滴加于条带上，在化学发光成像仪中进行曝光。

2.7CCK-8实验

(1)一般一个96孔板铺1000个细胞/100μl。

(2)铺板4-6小时细胞贴壁后，加CCK8反应液孵育30min，酶标仪测定OD450nm的吸光度值。

(3)在同一时刻加CCK8反应液，测24h，48h，72h的吸光度值

(4)做0h，24h，48h，72h的折线图

2.8Transwell实验

(1)50μl(1基质胶:9无血清培养基)稀释好的Martigel包被Transwell小室(侵袭)，或者是不包被Transwell小室(迁移)，4℃条件下无菌过夜风干。

(2)用无血清培养基将细胞制备成浓度105/ml的细胞悬液。

(3)上室接种200μl细胞悬液，下室加入500μl完全培养基，放入培养箱培养24h。

(4)24h后，弃上清，下室加入600μl多聚甲醛固定液，上室加入400μl多聚甲醛固定液，固定30min。(5)弃多聚甲醛固定液，下室加入600μl结晶紫，上室加入400μl结晶紫，染色30min。

(6)回收结晶紫，用棉签轻轻擦去上室细胞。

(7)倒置小室过夜风干于倒置显微镜拍照。

2.9EdU实验检测

(1)细胞培养：取转染了48h的细胞，以每孔105个细胞接种于24孔板，以培养至正常阶段。

(2)EdU标记：用细胞完全培养基按10:l的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备50μMEdU培养基。每孔加入300μl 50μMEdU培养基孵育2h，弃培养基。PBS缓冲液清洗细胞2次，每次5min。

(3)细胞固定化：每孔加入200μl 4％多聚甲醛室温孵育30min，弃固定液。每孔加入200μl 2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min。PBS缓冲液清洗细胞2次，每次5min。每孔加入200μl 0.5％TritonX-l00脱色摇床孵育l0min。PBS缓冲液清洗细胞2次，每次5min。

(4)Appllo染色反应液的配置参考

Appllo染色：每孔加入200μl的l xApollo染色反应反，避光、室温、脱色摇床孵育30min，弃染色反应液。每孔加入200μl 0.5％TritonX-l00脱色摇床清洗3次，每次l0min。200μl甲醇清洗2次，每次l0min。PBS缓冲液清洗细胞2次，每次5min。

(5)DNA染色：每孔加入200μl DAPI染色液，室温孵育10min。PBS缓冲液清洗细胞2次，每次5min。(6)封片：使用2μl抗荧光淬灭剂封片，有细胞的一面朝下，在湿盒中保存并于倒置荧光显微镜下采集图像。

2.10克隆形成实验

(1)操作前准备阶段同细胞复苏；

(2)准备好处于对数生长期的各组处理过的肿瘤细胞，分别用胰蛋白酶和完全培养基消

化并吹打获得单细胞悬液；

(3)在6孔板上，每孔铺设2000个细胞，经过细胞计数后，采用8字摇匀法，使细胞均

匀分布，以达到实验的目的。置37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养2～3周(每组

设三个孔，减少实验操作带来的误差，使得实验结果更有说服力)；

(4)期间根据培养液及细胞状态情况，更换完全培养基。当六孔板中出现肉眼可见的克

隆团时,终止实验。倒掉上清液,用PBS缓缓浸洗3次；

(5)每孔加入4％的多聚甲醛600μL，放置4℃冰箱中固定细胞30min。倒掉固定液，每

孔加入600μL1％结晶紫染色液，置于室温染色30min，然后用流水轻柔洗净染色液；

(6)将六孔板轻轻倒扣在吸水纸上，自然风干后拍照记录，使用ImageJ软件对细胞数超

过50个的集落进行计数。使用GraphPadPrism进行数据统计和分析。

2.11细胞凋亡实验

采用Annexin-VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测，具体步骤如下：

(1)各组细胞PBS洗两遍

(2)胰酶消化，弃去胰酶，加入1ml PBS进行重悬，1000rpm离心5min，弃上清。

(3)用100μl1xBinding Buffer将细胞重悬。

(4)加入10μlPI和5μlAnnexin-VF ITC，轻柔混匀后，冰上避光孵育15min。

(5)加入400μl 1xBinding Buffer，混匀后用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

2.12动物实验

2.12.1稳定表达细胞株的构建

(1)带红色荧光的过表达(CCDC86)和相应的对照病毒购自北京擎科生物，敲低(shCCDC86)慢病毒和相应对照病毒购自上海汉恒生物。

(2)将细胞铺于24孔板中，让细胞贴壁后的汇合度为50％左右。

(3)弃旧培养基，向细胞中加入250μl新的完全培养基和以上病毒，令感染复数(MultiplicityofInfection，MOI)为20，随后将细胞放于37℃恒温培养箱中感染4h。

(4)4h后，将两组细胞24孔板的培养基补至500μl，放于37℃恒温培养箱中继续感染。

(5)感染24h后，弃去含病毒的培养基，加入500μl完全培养基，继续培养。

(6)感染48h后，弃培养基，加入嘌呤霉素和完全培养基，使嘌呤霉素终浓度为1μg/ml，再将细胞放入培养箱中继续培养。

(7)每2天进行换液，同时维持嘌呤霉素的浓度。

(8)筛选至无细胞死亡时，倒置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，细胞均带有红色荧光，且WB结果显示CCDC86蛋白过表达或敲低成功，即获得Hep3B和HepG2稳定细胞株。

2.12.2裸鼠皮下成瘤

(1)将两组稳转细胞收集于1.5mlEP管中，并进行计数。

(2)将10只4周龄的BALB/c雌性雄鼠随机分成2组，每组5只。将各组细胞按每只1×10⁷个细胞接种于裸鼠皮下。

(3)接种完成后，每周观察并用游标卡尺测量移植瘤大小。

(4)4周后，将两组裸鼠处死，分离移植瘤，称重并拍照，然后将移植瘤放入4％多聚甲醛中进行固定。

2.13统计学分析

统计软件SPSS22.0用于分析。定量数据显示为平均±标准差(SD)。图形数据是使用GraphPadPrism6.0软件生成的。通过学生t检验、单因素方差分析(ANOVA)和χ2检验评估统计学差异。使用The log-rank检验和Kaplan-Meier法绘制生存曲线和复发曲线。连续变量之间的相关性由Spearman相关性评估。当p<0.05时，被认为差异具有有统计学意义。

3.结果

3.1CCDC86在HCC中表达上调，并与HCC患者的不良预后相关

为了研究CCDC86在HCC中的潜在作用，我们首先通过整合来自GTEx数据库的数据作为正常对照，进行了CCDC86在LIHC肿瘤和正常样本之间的差异表达分析。结果表明，CCDC86转录本水平在HCC中显著增加(图1A)。此外，Kaplan-Meier分析显示，CCDC86高表达的HCC患者的总生存期(overall survival，OS)和无病生存期(disease-free survival，DFS)显著低于CCDC86低表达的患者(图1B)。UALCAN数据库分析确定CCDC86转录本水平与肿瘤分级和分期呈正相关(图1C)。为了研究CCDC86在HCC进展中的作用，我们首先检测了三个肝癌细胞系(Hep3B、Hep G2、Hep G2.2.15)和正常肝细胞(L02细胞；图1D)中CCDC86的mRNA水平，结果显示肝癌细胞系中CCDC86的mRNA水平上调。同时，利用HPA数据库中的临床标本发现CCDC86在正常肝组织中呈中等染色，在肝癌组织中呈高染色(图1E)，提示CCDC86蛋白在肝癌组织中的表达高于正常组织。以上结果表明，CCDC86在HCC中高表达，且与HCC的长期预后相关，可能是HCC中潜在的候选生物标志物。

3.2CCDC86在体外促进肝癌细胞的进展

为了进一步研究CCDC86在HCC中的生物学意义，我们在Hep3B细胞中过表达CCDC86，在HepG2细胞中敲低CCDC86(图2A)。CCK-8实验和克隆形成实验显示，下调CCDC86降低了HepG2细胞的活力，而相反导致了(图2B,D)细胞增殖活力的增加。在EdU实验(图2C)中，CCDC86对生长的影响也得到了类似的结果。这些结果表明CCDC86在体外促进肝癌细胞的增殖。此外，采用Transwell实验研究CCDC86如何影响HCC细胞的迁移和侵袭。结果表明，CCDC86过表达显著提高了Hep3B细胞的迁移和侵袭能力，而CCDC86下调则显著降低了HepG2细胞的迁移和侵袭能力(图3A,B)。流式细胞仪检测结果显示，转染shCCDC86的HepG2细胞凋亡率明显高于转染shNC的HepG2细胞(图3C,D)。总之，这些发现表明CCDC86在体外促进HCC细胞的进展。

3.3CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌的发生发展

为了探明CCDC86促进肝癌发生发展的调控机制，我们利用GSEA分析对CCDC86调控的信号通路进行了预测，分析结果显示CCDC86可能调控Wnt/β-catenin信号通路(图4A)。此外，基于TIMER2.0数据库，我们确定了CCDC86的表达是否与Wnt/β-catenin信号通路的相关基因相关(图4B)。结果表明，CCDC86的表达与WNT3、FZD2、LRP5、GSK-3β、RUVBL1、CTNNB1、TCF7、Cyclin D1(CCND1)和MYC的表达显著正相关。此外，我们用qRT-PCR分析了HepG2细胞在转染shNC或shCCDC86质粒48小时后Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。如图4C所示，qRT-PCR结果显示，CCDC86的shRNA导致RUVBL1和Wnt/β-catenin靶基因(TCF7、CCND1和MYC)的减少，而GSK-3β的表达增加，但CTNNB1表达无变化。为了进一步验证CCDC86与Wnt/β-catenin信号通路蛋白的关系，我们也对结果进行了Westernblot分析。图4D和4E结果显示，CCDC86过表达显著促进β-catenin、RUVBL1、MYC和CCND1的表达，而CCDC86敲低显著抑制(图4D和E)。总的来说，这些数据证明了CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路促进HCC进展的重要作用。

3.4CCDC86通过RUVBL1促进Wnt/β-catenin信号通路和HCC进展

据报道，RUVBL1过去被证明对Wnt/β-catenin信号通路具有良好的调控作用。鉴于qRT-PCR和westernblot(图4C-E)证明CCDC86过表达显著上调RUVBL1的mRNA和蛋白水平，CCDC86敲低显著下调RUVBL1的mRNA和蛋白水平，我们猜测CCDC86是否也通过RUVBL1调控Wnt/β-catenin信号通路促进HCC进展。因此，我们完成了一系列体内挽救实验。Westernblot结果显示，敲低CCDC86降低了RUVBL1及其下游靶基因β-catenin、MYC和CCND1的蛋白水平，而上调CCDC86则增强了这些蛋白的表达水平，并且过表达或敲低CCDC86所引起的效应可以分别被敲低或过表达RUVBL1(图5A和B)所逆转。采用CCK-8法、集落形成实验和Edu胸腺嘧啶核苷类似物掺入实验检测Hep3B和HepG2细胞的增殖情况。结果表明，在Hep3B细胞中敲低RUVBL1可以逆转过表达CCDC86引起的促增殖效应，而在HepG2细胞中过表达RUVBL1可以逆转敲低CCDC86引起的增殖抑制效应(图5C-G)。此外，Transwell迁移和基质胶侵袭实验显示，过表达CCDC86可显著增加Hep3B细胞的迁移和侵袭能力，该效应可被RUVBL1敲低所消除，而抑制CCDC86可降低HepG2细胞的运动能力，该效应可被RUVBL1过表达(图5H和I)所抵消。综上所述，在肝癌中，CCDC86上调RUVBL1表达从而促进Wnt/β-catenin信号传导。

3.5CCDC86在体内促进肝癌细胞成瘤

为了评估CCDC86在体内对HCC生长的影响，我们将稳定过表达CCDC86的Hep3B细胞(CCDC86组)或对照细胞(Vector组)和稳定敲低CCDC86的HepG2细胞(shCCDC86组)或对照细胞(shNC组)皮下注射到裸鼠(图6A和E)中。与对照组相比，CCDC86组肿瘤生长明显加快，而shCCDC86组肿瘤生长明显减慢(图6B)。同样，过表达CCDC86的细胞产生的肿瘤比对照组重，而感染shCCDC866的细胞产生的肿瘤比感染shNC的细胞产生的肿瘤重(图6C)。然后，我们在体内研究了CCDC86对RUVBL1和下游相关蛋白，如β-catenin，CCND1和MYC的影响。与体外观察结果一致，上调CCDC86可上调移植瘤组织中RUVBL1、β-catenin、CCND1和MYC的表达，相反，敲低CCDC86可降低这些蛋白的水平(图6D)。总之，这些结果证实了CCDC86在体内的致癌作用，表明CCDC86通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

4分析

近年来，尽管早期诊断和治疗技术已取得快速进步，改善了患者预后，但肝癌仍保持极高的发病率和致死率。目前肝癌仍然是全球高度难治性且高发性恶性肿瘤之一，每年约有90.5万新增病例和83.0万例死亡病例。细胞稳态失调导致细胞生长和增殖失控是肝癌典型特征之一，但其中复杂的调控网络尚未完全明了。

RNA结合蛋白是一种高度保守和丰富的蛋白质，通过一个或多个球状RNA结合域与RNA结合，并改变结合RNA的功能，包括转录、翻译、剪接、多聚腺苷酸化、稳定性和定位。RNA结合蛋白还可以通过与其他蛋白的直接相互作用或作为带有编码或非编码RNA的支架，形成称为核糖核蛋白复合体的动态蛋白复合体。近年来，RNA结合蛋白在癌症中发挥作用不断被人们关注，其可通过控制RNA的转录后水平进而影响细胞稳态，但其在癌症中的功能和潜在机制仍有待进一步探索。

CCDC86是一种螺旋蛋白，主要表达于男性生殖细胞中。卷曲螺旋蛋白已被证明可以调控肿瘤的增殖、迁移和转移。除此之外，卷曲螺旋蛋白是调控肿瘤细胞凋亡的重要参与因子。既往研究表明，CCDC86与免疫细胞的各种情况有关：由白细胞介素3(IL-3)在小鼠造血细胞系Ba/F3中诱导表达，在小鼠T细胞中，CCDC86诱导死亡受体CD95/Fas的表达，以此激活诱导细胞死亡现象，以及在生发中心选择期间增殖的B细胞中表达。CCDC86 mRNA被发现在人类精神分裂症患者的白细胞及成年猕猴的海马体中表达，包括海马本体(氨角)和齿状回。CCDC86定位于氨角的神经元和星形胶质细胞，而在齿状回中，该蛋白也在未成熟神经元和一小部分增殖细胞中表达。CCDC86在肝癌中的作用尚未有人报导，因此本发明将在肝癌细胞系中进行体外相关实验，探究CCDC86与肝癌之间的关系及作用机制，从而为肝癌的早期诊断及后期治疗提供新的方向及靶点。

在本发明中，我们首先使用生物信息学方法分析CCDC86在肝癌中的表达模式以及作为生物分子标志物与肝癌患者预后的关系。对TCGA-LIHC数据库中的CCDC86转录本的测序数据进行分析，结果表明其在肿瘤和正常组织之间存在表达差异。采用Kaplan-Meier分析方法对TCGA-LIHC数据库中CCDC86与肝癌的预后关系进行探索，结果提示CCDC86高表达组预后较差，且总生存期、无病生存期均显著缩短。UALCAN数据库分析确定CCDC86转录本水平与肿瘤分级和分期呈正相关(图1A-C)。由此推断CCDC86在肝癌中可能是一个促进肿瘤恶性生物学行为进展的潜在标志物。

进一步在肝癌细胞和肝正常细胞中检测CCDC86 mRNA水平的变化，通过HPA数据库确定CCDC86蛋白水平在肝癌患者中显著升高。结合以上分析，我们推断CCDC86高表达可能会促进肝癌细胞的增殖(图1D、E)。本发明为了进一步验证CCDC86与肝癌细胞的功能，将针对CCDC86的质粒载体转染到肝癌细胞系Hep3B中，构建CCDC86过表达模型。体内外功能实验结果显示过表达CCDC86后肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力升高。同样将含CCDC86的敲低质粒转染到HepG2细胞中，构建沉默表达模型。重复以上述实验，得到同样结果。以上数据提示CCDC86在肝癌的发展进程中发挥着促癌的作用。

接下来，我们主要研究CCDC86对肝癌细胞增殖影响的分子机制，我们首先对TCGA-LIHC数据库中CCDC86的不同表达水平进行Hallmark基因集的富集分析，结果显示CCDC86高表达组在Wnt/β-catenin信号通路显著富集。众所周知，Wnt/β-catenin信号通路参与调节细胞周期、细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成等过程，在肝癌中具有广泛的功能，且在肝癌治疗方面具有广泛应用前景。先在肝癌细胞中体外构建CCDC86沉默模型，通过qRT-PCR实验检测CCDC86以及Wnt/β-catenin通路中关键基因的变化，结果显示敲低CCDC86抑制RUVBL1的表达及Wnt/β-catenin信号通路。鉴于RUVBL1实际上是Wnt/β-连环蛋白信号通路的共激活因子，且RUVBL1被发现在OS细胞中促进细胞增殖，同时促进Wnt/βcatenin信号通路。因此，我们假设CCDC86可能通过RUVBL1激活Wnt/βcatenin信号通路。本发明证明了过表达CCDC86可以增加RUVBL1的mRNA和蛋白水平，而敲除CCDC86则表现出相反的效果，且过表达或敲低CCDC86引起的对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用可被敲低或过表达RUVBL1消除，这支持了我们的假设，即CCDC86通过RUVBL1激活Wnt/βcatenin信号通路从而影响肝癌进展。

Claims

1.检测生物标志物CCDC86表达的试剂在制备用于对肝癌对象进行诊断或预后的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断的方法包括：从疑似患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中CCDC86的表达水平，如果较正常对照CCDC86高表达，提示对象为肝癌患者。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预后的方法包括：从患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中CCDC86的表达水平，分析表达水平产生风险评分，所述风险评分用于提供对象的肿瘤分级、分期及预后，CCDC86高表达患者预后较差，且总生存期、无病生存期均显著缩短。

4.CCDC86作为靶标在筛选治疗肝癌的药物中的应用。

5.CCDC86和RUVBL1联合共同作为靶点在筛选治疗肝癌的药物中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述药物抑制CCDC86和/或RUVBL1的表达，从而促进肝癌细胞凋亡，进而减缓或阻止肝癌发展。

7.CCDC86和/或RUVBL1表达抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述表达抑制剂包括siRNA和/或shRNA，

CCDC86的siRNA的核苷酸序列为：5’-AGCGTCCAAGAAGTTGAATAA-3’；

所述shRNA的正义链的核苷酸序列为：

5’-GATCCGAGCGTCCAAGAAGTTGAATAACTCGAGTTATTCAACTTCTTGGACGCTTTTTTTG-3’，shRNA的反义链的核苷酸序列为：

5’-AATTCAAAAAAAGCGTCCAAGAAGTTGAATAACTCGAGTTATTCAACTTCTTGGACGCTCG-3’。

9.根据权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于：所述肝癌为肝细胞癌。

10.根据权利要求4至8任一项所述的应用，其特征在于：CCDC86通过RUVBL1激活Wnt/βcatenin信号通路从而影响肝癌进展。